Virologa Clnica

BACTERIFAGOS
INTRODUCCION Los bacterifagos son ubicuos y pueden ser encontrados en diversas poblaciones de bacterias, tanto en el suelo como en la flora intestinal de los animales. Uno de los ambientes ms poblados por bacterifagos y otros virus es el agua de mar, donde se estima que puede haber en torno a 109 partculas virales por mililitro, pudiendo estar infectadas por bacterifagos el 70% de las bacterias marinas. Existen muchas similaridades entre los bacterifagos y los virus de clulas animales. As, los bacterifagos pueden ser visualizados como sistemas modelo de los virus de clulas animales. Adems es necesario el conocimiento previo del ciclo de vida del bacterifago para entender uno de los mecanismos por los cuale s los genes bacterianos pueden transferirse de una bacteria a otra. Alguna vez se pens que el uso de los bacterifagos podra ser una va efectiva para tratar las infecciones bacterianas, pero pronto se hizo aparente que los bacterifagos son removidos rpidamente del cuerpo as que resultaron de poco valor clnico. Sin embargo, los bacterifagos son tiles en el diagnstico de laboratorio para la identificacin de bacterias patgenas (fago-tipificacin). Aunque la fago-tipificacin no se usa en el laboratorio clnico de rutina, s se usa en los laboratorios de referencia con propsitos epidemiolgicos. Recientemente, se ha desarrollado un nuevo inters en el posible uso de los bacterifagos para el tratamiento de infecciones bacterianas y en la profilaxis. De manera que la decisin de si los bacterifagos sern usados en la medicina clnica o no, an est por ser determinada. Definicin: Los bacterifagos (fagos) son parsitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de las bacterias, haciendo uso de algunas o todas sus maquinarias biosintticas (p. ej., los virus que infectan bacterias). Los bacterifagos (-del griego (phageton), alimento/ingestin) son virus que infectan exclusivamente a bacterias. Al igual que los virus que infectan clulas eucariotas (eu - verdadero, carion ncleo), los bacterifagos estn constituidos por una cubierta proteica o cpside en cuyo interior est contenido su material gentico, que puede ser DNA (cido Desoxirribonucleico) o RNA (cido Ribonucleico) de simple o doble cadena, circular o lineal (en el 95% de los fagos conocidos es DNA de doble cadena), de 5.000 a 500.000 pares de bases. El tamao de los bacterifagos oscila entre 20 y 200 nm aproximadamente.

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HISTORIA En 1913 el ba terilogo britnico Frederick Twort descubri un agente bacterioltico que infectaba y mataba a las bacterias, pero no fue capa de saber qu era exactamente dicho agente. Independientemente, el microbilogo canadiense Flix d'Herelle anunci el 3 de septiembre de 1917 su descubrimiento de "un invisible antagonista microbiano del bacilo de la disentera", al cual llam bacterifago.

Frederick Twort

Flix d'Herelle

COMPOSICIN Y ESTR CTURA DEL BACTERIFAGO 1) Composicin: Aunque diferentes bacterifagos pueden contener diferentes materiales todos ellos contienen cido nuclico y protena. Dependiendo del fago, el cido nuclico puede ser ya DNA o ya RNA pero no ambos y puede existir en varias formas. Los cidos nuclicos de los fagos a menudo contienen bases raras o modificadas. Estas bases modificadas protegen a los cidos nuclecos del fago de las endonucleasas que cortan los cidos nuclicos del husped durante la infeccin. El tama o de los cidos nuclecos vara dependiendo del fago. Los fagos ms simples solo tienen suficiente cido nucleico para codificar un promedio de 3 5 productos gnicos, mientras que los fagos ms complejos, pueden codificar para ms de 100 productos gnicos. El nmero de protenas de diferentes clases y la cantidad de cada una de ellas en la partcula del fago variar dependiendo de la clase de fago que se trate. El fago mas simple posee varias copias de solo una o dos diferentes protenas, mientras que los ma s

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complejos podran poseer muchos tipos de protenas diferentes. La funcin de las protenas durante la infeccin es proteger al cido nucleico de las nucleasas de su medio ambiente.

bacterifago pero solo contiene uno de ellos.

que pueden contener lo

Lo cido nucleco

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2) Estructura: Los bacterifagos vienen en muchas diferentes formas y tama os. Las caractersticas bsicas estructurales de los bacterifagos se ilustran en la Figura 1, la cual muestra al fago denominado T4.

Figura 1 Estructura del bacteri ago T4 a. Tamao: T4 est entre los fagos ms grandes, tiene aproximadamente 200 nm de largo y 80 100 nm de ancho. Otros fagos son ms pequeos. La mayora de los fagos estn entre un rango de 24-200 nm de longitud. b. Cabeza o Cpside: Los fagos clsicos poseen una estructura a manera de cabeza y pueden variar de tamao y forma. Algunos son icosadricos (20 caras) otros son filamentosos. La cabeza o cpside est compuesta de muchas copias de una o ms protenas diferentes. Al interior de la cabeza se encuentra el cido nucleico. La cabeza acta como una cubierta protectora para el cido nucleico.

Cabeza

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c. Cola: Muchos, aunque no todos los fagos muestran una cola unida a la cabeza del fago. La cola es un tubo hueco a travs del cual el cido nucleico pasa durante la infeccin. El tamao de la cola puede variar y algunos fagos ni siquiera la tienen. En los fagos ms complejos como T4, la cola se rodea de una cortina contrctil durante la infeccin de la bacteria. Al extremo de la cola los fagos ms complejos como T4 presentan una placa en la base y una o mas fibras unidas a ella. Esta placa de base y las fibras de la cola estn involucradas en la unin de los fagos a la clula bacteriana. No todos los fagos tienen placas de base ni fibras de la cola, En tales casos existen otras estructuras que se ven asociadas en la unin de partcula del fago a la bacteria.

Representacin esquemtica de las estructuras de algunos bacterifagos.

III. INFECCIN DE LAS CLULAS HUSPED
La nica funcin que poseen los virus y que comparten con el resto de los seres vivos es la de reproducirse o generar copias de s mismos, necesitando utilizar la materia, la energa y la maquinaria de la clula husped, por lo que se les considera parsitos obligados. No poseen metabolismo ni organizacin celular, por lo que se les sita en el lmite entre lo vivo y lo inerte.

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Secuencia de la infeccin de las clulas husped:

A. Adsorcin El primer paso en el proceso de infeccin es la adsorcin del fago a la clula bacteriana. La cola del fago se fija a los receptores especficos de la pared bacteriana (intervienen en esa fijacin los filamentos caudales y la placa basal) otros se fijan con los spikes (protenas que tienen en su envoltura). Ciertos enzimas situados en la placa basal debilitan la pared de la bacteria.
Este paso es reversible est mediado por las fibras de la cola o por alguna estructura anloga en aquellos fagos que carecen de las mismas. Las fibras de la cola se unen a receptores especficos en la clula bacteriana y la especificidad del husped del fago (p. ej., la bacteria que es capaz de infectar) se determina usualmente por el tipo de fibras de la cola que un fago posee. La naturaleza del receptor bacteriano vara en las diferentes bacterias. Los ejemplos incluyen protenas sobre la superficie externa de la bacteria, LPS, cidos teicoicos, pili y lipoprotenas. Estos receptores estn en la bacteria para otros propsitos y los fagos han evolucionado de manera que son capaces de usar estos receptores para llevar a cabo la infeccin. Por ello, cada fago solo podr infectar

ciertas bacterias segn sus receptores. Puesto que los fagos no son mviles, dependen de encuentros al azar con los receptores adecuados en solucin para poder infectar una bacteria.

B. Unin irreversible La unin del fago con la bacteria va las fibras de la cola es de naturaleza dbil y es reversible. La unin irreversible del fago con la bacteria est mediada por uno o ms componentes de la placa de la base. Los fagos que carecen placas de la base tienen otras formas de unirse estrechamente a la clula bacteriana. C. Contraccin de la cortina La unin irreversible del fago a la bacteria da como resultado la contraccin de la cortina (para aquellos fagos que la presentan) y la fibra hueca que es la cola se ve empujada a travs de la envoltura bacteriana. Los fagos que no tienen cortinas contrctiles usan otros mecanismos para introducir la partcula del fago al interior de la envoltura bacteriana. Algunos fagos tienen enzimas digestivas que degradan varios componentes de la envoltura bacteriana. D. Inyeccin del cido Nucleico Cuando el fago ha logrado atravesar la envoltura bacteriana el cido nucleico que se encuentra en la cabeza pasa a travs de la cola hueca y penetra la clula bacteriana. Usualmente el nico componente del fago que realmente penetra la clula es el cido nucleico. Los remanentes del fago permanecen en el exterior de la bacteria. Hay algunas excepciones para esta regla. Esto es diferente de los virus animales, en los cuales la mayora de las partculas virales normalmente se

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introducen en la clula. Esta diferencia se debe probablemente a la incapacidad de la bacteria para envolver a la bacteria a fin de endocitar materiales.

IV. CICLO DE MULTIPLICACIN DEL FAGO

Los fagos pueden generar el ciclo ltico o el ciclo lisognico, aunque muy pocos son capaces de llevar a cabo ambos. En el ciclo ltico, las clulas hospedadoras del fago son lisadas (destruidas) tras la replicacin y encapsulacin de las partculas virales, de forma que los nuevos virus quedan libres para llevar a cabo una nueva infeccin. Por el contrario, en el ciclo lisognico no se produce la lisis inmediata de la clula. El genoma del fago puede integrase en el ADN cromosmico de la bacteria hospedadora, replicndose a la vez que lo hace la bacteria o bien puede mantenerse estable en forma de plsmido, replicndose de forma independiente a la replicacin bacteriana. En cualquier caso, el genoma del fago se transmitir a toda la progenie de la bacteria originalmente infectada. El fago queda as en estado de latencia hasta que las condiciones del medio se vean deterioradas: disminucin de nutrientes, aumento de agentes mutagnicos, etc. En este momento, los fagos endgenos o profagos se activan y dan lugar al ciclo ltico que termina con la lisis celular.

A. Fagos Lticos o Virulentos 1. Definicin: Los fagos lticos o virulentos son fagos que solo pueden multiplicarse en bacterias y matan a la clula debido a la lisis, al trmino del ciclo de vida. 2. Ciclo de replicacin viral a. Periodo de eclipse Durante la fase de eclipse las partculas de fago no infeccioso se pueden encontrar ya sea en el interior o en el exterior de la clula bacteriana. Aparentemente no le pasa nada a la bacteria pero en realidad el virus interrumpe el metabolismo bacteriano. En un corto espacio de tiempo, que pueden llegar a ser minutos, el ADN bacteriano es degradado y los genes virales se encargan de

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reconducir el metabolismo utilizando los componentes de la bacteria para realizar copia de los capsmeros y sntesis del cido nucleico. El cido nucleico del fago se apodera de la maquinaria biosinttica del husped y se elaboran los mRNAs y las protenas fago especficas. Existe una expresin ordenada de la sntesis macromolecular dirigida por el fago, tal como se observa en las infecciones por virus animales. Los mRNAs tempranos codifican para las protenas tempranas, las cuales se necesitan para la sntesis del DNA de fagos y para apagar la biosntesis del DNA, RNA y protenas del husped. En algunos casos las protenas tempranas literalmente degradan el cromosoma del husped. Luego de que el DNA del fago se sintetiza, entonces los mRNAs y las protenas tardas se fabrican. Las protenas tardas son las protenas estructurales que conforman al fago, tambin son las protenas necesarias para causar la lisis de la clula bacteriana. Posteriormente, las protenas

helper se encargarn de ensamblar las nuevas partculas virales.

b. Fase de acumulacin intracelular En esta fase el cido nucleico y las protenas estructurales de que estn hechos, se ensamblan y las partculas infecciosas se acumulan dentro de la clula. Todo el proceso puede durar unos 15 minutos.

c. Lisis y Fase de liberacin Despus de un tiempo la bacteria empieza a sufrir lisis y los fagos intracelulares se liberan al medio. El nmero de partculas liberadas por bacteria infectada puede ser tan alto como 1000. La protena que lleva a cabo la lisis

es la endolisina, una enzima capaz de romper las molculas de peptidoglicano de la pared bacteriana.

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3. Ensayos para determinar fagos lticos.

a. Ensayo en placa Los fagos lticos se cuentan mediante ensayos de formacin de placas. Una placa se define como el rea clara que resulta de la lisis de bacterias. (Cada placa se origina de un solo fago infeccioso). A la partcula infecciosa que da origen a la placa se le llama una unidad formadora de placa (ufp o en ingls pfu).

B. Fago lisognico o Temperado

No siempre se produce la lisis inmediata de la clula. Hay fagos atemperados o atenuados que se integran en el ADN bacteriano por entrecruzamiento de dos regiones idnticas del fago y de la bacteria, del mismo modo a como ocurre en los plsmidos. Estos fagos integrados se denominan profagos, y se replican pasivamente con el ADN de la bacteria. Las bacterias capaces de establecer esa relacin con los fagos atenuados se denominan lisognicas. El ADN del profago puede permanecer en forma latente durante varias generaciones de la bacteria, hasta que un estmulo induzca la separacin del profago que iniciar un ciclo ltico tpico. Mientras la clula posea el ADN profago ser inmune frente a infecciones de este mismo virus. Otros virus que no son bacterifagos pueden tambin tener ciclos lisognicos.

1. Definicin Los fagos lisognicos o temperados son aquellos que bien pueden multiplicarse via el ciclo ltico o entran en un estado quiescente en la clula. En este estado quiescente la mayora de los genes del fago no se transcriben; el genoma del fago existe en un estado reprimido. Al DNA del fago en este estado reprimido se le conoce como profago porque no es un fago pero posee el potencial para producir fagos. En la mayora de los casos el DNA de fago realmente se integra en el cromosoma del husped y se replica junto con el 9

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cromosoma del husped y se transmite a las clulas hijas. La clula que alberga un profago no se ve negativamente afectada por la presencia del profago y el estado lisognico puede persistir indefinidamente. A la clula que alberga un profago se le conoce como lisgena.

2. Eventos que conducen a la lisogenia El fago prototipo: Lambda

a. Circularizacin del cromosoma del fago- El DNA de Lambda una molcula lineal de doble cadena con pequeas regiones de cadena sencilla en los extremos 5. Estas cadenas sencillas de los extremos son complementarias (extemos cohesivos) de manera que pueden aparearse y producir una molcula circular. En la clula, los extremos libres del crculo se pueden ligar para formar un crculo covalentemente cerrado. b. Recombinacin Sitio-especfico Un evento de recombinacin catalizado por una enzima codificada por el fago, ocurre entre un sitio particular en el DNA del fago circularizado y un sitio particular en el cromosoma del husped. El resultado es la integracin del DNA del fago en el cromosoma del husped. c. Represin del genoma del fago Una protena codificada por el fago, la llamaremos el represor es una protena que presenta afinidad y se une con un sitio particular en el DNA del fago que llamaremos el operador y apaga la transcripcin de la mayora de los genes del fago, EXCEPTO la del gene que da lugar al represor. El resultado es un genoma del fago pero reprimido estable el cual est integrado dentro del cromosoma de la clula husped. Cada fago temperado so lamente reprimir la expresin de su propio DNA y no la de otro fago, as que la represin es muy especfica (inmunidad a la superinfeccin con el mismo fago).

3. Eventos que conducen a la terminacin de la Lisogenia

En cualquier momento en que la bacteria lisognica quede expuesta a condiciones adversas, el estado lisognico puede ser terminado. Este proceso se le llama induccin. Las condiciones que favorecen la terminacin del estado lisognico incluyen: desecacin, exposicin al la luz UV o radiacin ionizante, exposicin a qumicos mutagnicos, etc. Las condiciones adversas que conducen a la produccin de proteasas (protena recA) la cual destruye a la protena llamada represor. Esto a su vez conduce a la expresin de los genes del fago, al proceso inverso al proceso de integracin, llamado escisin y al proceso de multiplicacin ltica.

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i
Ci l Li
 

4. Ci l L i
 

i
  

La deci i de lambda de ent ar en el cicl ltico o en el ciclo li ognico cuando este penetra en la clula inicialmente est determinada por la concentraci n dentro de la clula, tanto del represor, como de otra protena del fago llamada cro. La protena cro del fago, apaga la sntesis del represor y por lo tanto previene el establecimiento de la lisogenia. Las condiciones ambientales que favorecen la producci n de cro conducirn al ciclo ltico mientras que aquellas que favorecen la producci n del represor favorecern la lisogenia.
 

5. Importancia de la Li ogenia a. Modelo de la transformaci n por virus animales La lisogenia es un sistema modelo para la transformaci n que llevan a cabo los virus de clulas animales. b. Conversi n Lisognica Cuando la clula est lisogeni ada ocasionalmente hay genes extra que el fago lleva y que se empiezan a expresar en la clula. Estos genes pueden cambiar las propiedades de la clula bacteriana. Este proceso se le llama conversi n lisognica o conversi n por fago. Esto puede tener importancia clnica, por ej. Se ha demostrado que los fagos lisognicos llevan genes que pueden modificar al antgeno O de Salmonella, el cual es uno de los antgenos principales ante los cuales est dirigida la respuesta inmune. La producci n de toxina por Corynebacterium diphtheriae est mediada por un gen que es acarreado por un fago. Solo aquellas cepas que se han convertido por lisogenia son pat genos. Terapia fgica
Los fagos cumplen un papel de gran importancia en la biologa molecular al ser utilizados como vectores de clonaci n para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener como resultado bibliotecas genmicas. Hay una biblioteca de bsqueda de fagos especficos y sus usos teraputicos en el Instituto Tbilisi, en la Repblica de Georgia. La terapia fgica ha sido utilizada desde la dcada de 1940 en la ex Unin Sovitica como una alternativa a los antibiticos para tratar infecciones bacterianas, ya que eliminar bacterias es lo que los fagos hacen mejor. El desarrollo de cepas bacterianas resistentes a mltiples drogas ha conducido a
     

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investigadores en medicina a reconsiderar a los fagos como una alternativa al uso de antibiticos.

Otros usos
En agosto de 2006, la FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos aprob el uso t genes. de bacterifagos en ciertas carnes con el fin de acabar con la bacteria Listeri

Bacterifagos modelo
A continuacin se presenta una lista de los bacterifagos ms ampliamente estudiados:
y y y y y y y y y y y y y

Fago - Lisgeno Fago T4 (169 a 170 kpb, 200 nm de tamao) Fago T7 Fago R17 Fago M13 - Fagmido Fago MS2 (23-25 nm de tamao) Fago G4 Fago P1 Fago P2 Fago N4 Fago 6 Fago P22 Fago 29

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