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5. MICROSCOPA. TINCIONES BACTERIANAS 5.1. INTRODUCCIN La microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio, gracias al cual se pueden visualizar las bacterias. El ojo humano no es capaz de discriminar ms all de 0,1 mm. El microscopio ptico tiene como lmite de poder de resolucin unos 0,20 microns. Estn a su alcance estructuras celulares como cromosomas, nucleolos, cloroplastos, mitocondrias. El microscopio electrnico, que tiene un poder de resolucin del orden de 4 Angstrom (C), es capaz de visualizar la estructura de las membranas, ribosomas, etc. 5.2. EL MICROSCOPIO PTICO En microscopa nos podemos encontrar un microscopio simple, que no es ms que una lente biconvexa o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayores aumentos. Todo microscopio compuesto constar de: Un sistema ptico que aumenta la imagen. Un sistema de visualizacin que amplifica adecuadamente dicha imagen. 5.2.1. Contraste. Absorcin diferencial de la luz entre la muestra y el medio. El grado de contraste se puede mejorar, aumentndolo mediante tcnicas de tincin. 5.2.2. Amplificacin. La amplificacin de la imagen en un microscopio se obtiene mediante dos sistemas de lentes: Un primer sistema de lentes situado ms cerca de la muestra, el objetivo que aumenta la imagen real. El segundo sistema de lentes, que se sita ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano, es la lente ocular, que se encargar de ampliar esa imagen real originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. Los microscopios en la mayora de laboratorios de microbiologa presentan los objetivos siguientes: objetivos secos, de x4, x10, x40 objetivos de inmersin, x100 aumentos. La amplificacin total de un microscopio ptico se obtiene multiplicando la ampliacin del objetivo, por la ampliacin del ocular.

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5.2.3 Poder de resolucin. El poder de resolucin de una lente es la capacidad que sta presenta para poder observar dos puntos adyacentes como distintos y separados.El poder de resolucin en un microscopio est en funcin de la longitud de onda () de la luz empleada y de las caractersticas del sistema de lentes, llamado apertura numrica.

Fig. 5.1 El lmite o poder de resolucin de un microscopio (d) es la distancia mnima entre dos puntos que permite distinguirlos uno de otro. Se expresa como: d = 0,5 / N sen   = longitud de onda de la luz empleada Nsen  = apertura numrica (medida del tamao del cono de luz refractada por la preparacin que admite el objetivo) N, es el ndice de refraccin del medio (aire/aceite de inmersin) que hay entre la muestra y la lente del objetivo , es la mitad del ngulo que forma el cono de la lente del objetivo.

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Cuanto ms pequeo sea el poder de resolucin de un microscopio, ms capacidad de amplificacin tendr. Esto se consigue aumentando la apertura numrica (para microscopio ptico, 1,25 es un valor normal de apertura numrica, 1,4 es un valor mximo). La apertura numrica depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Como que el ndice de refraccin del aire es menor que el del vidrio, los rayos luminosos se refractan cuando pasan del portaobjetos al aire. La mayora de los rayos luminosos que han atravesado la muestra se desvan en un ngulo tan grande que se pierden. El aceite de inmersin (N = 1,56) tiene, aproximadamente, el mismo ndice de refraccin que el vidrio. Si ponemos una gota de aceite entre la preparacin y el objetivo, la mayora de los rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, aumentando la resolucin del microscopio y observndose una imagen ms clara. (Naire = 1) No se ha de utilizar nunca aceite de inmersin con objetivos secos. La distancia a la muestra es mayor y los rayos refractados son recogidos por estas lentes. La resolucin podra aumentarse tambin, disminuyendo la longitud de onda de la luz, empleando luz ultravioleta. En este caso al no ser nuestro ojo sensible a tales radiaciones, la observacin no puede ser vista y es necesario utilizar una placa fotogrfica, adems comporta tambin utilizar lentes de cuarzo y modificar la parte ptica del microscopio. Sin embargo el microscopio ptico debido a la misma naturaleza de la luz y de su longitud de onda no puede superar un cierto poder de resolucin. El lmite de resolucin con onda corta ( = 426 nm) es de 200 nm = 0,2 . Al utilizar en el microscopio electrnico haces de electrones de longitud de onda corta se consiguen mayores resoluciones con lo que se supera el problema resolutivo del microscopio ptico pasando de 2.000 C a 5 C, adems consigue un mayor poder amplificador. 5.2.4. Estructura de un microscopio Un microscopio se divide en dos partes, el soporte y el sistema ptico. I. Soporte. En los modelos modernos el soporte es una pieza fija en la que nicamente la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Las partes principales son: a) La base, que normalmente alberga la fuente de iluminacin (lmpara incandescente halgena). En determinados modelos la base incorpora adems un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. b) El brazo soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares (mono o binocular) y el revlver portaobjetivos. En el brazo se dispone tambin el mecanismo de anclaje de la platina dotado del correspondiente sistema de enfocado de la preparacin. c) La platina es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin. Presenta un orificio central por donde pasa la luz y est equipada con un sistema de fijacin de la preparacin y de desplazamiento en cruz, lo que permite posicionar cmodamente la zona de la preparacin que hay que observar. En su parte inferior se dispone el sistema de fijacin del condensador.

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d) El macromtrico y el micromtrico permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con el objetivo de menor aumento (x10), mientras que el micromtrico permite afinar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).

Fig. 5.2 II. Sistema ptico. El Sistema ptico est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Como se indica ms adelante, tanto oculares como objetivos no son lentes simples, sino conjuntos que funcionan como una nica lente que aumenta considerablemente la calidad de la imagen. Un microscopio convencional posee tres sistemas de lentes: a) El condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparacin. Concentra los rayos de luz en un punto o foco, que, para una observacin ptima, debe hacerse coincidir con el plano de la muestra. Incorpora tambin un diafragma tipo iris que permite ajustar la cantidad de luz que llega a la preparacin y acta de un modo muy eficaz sobre el contrastado de la preparacin (mayores aumentos requieren ms iluminacin, es decir, mayor apertura del diafragma).

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b) Los objetivos proporcionan una imagen ampliada de proyeccin real e invertida que se forma en el plano focal anterior del ocular. Los objetivos estn montados sobre un dispositivo portaobjetos giratorio de revlver. En bacteriologa se hace uso frecuentemente del objetivo de inmersin (normalmente de 100 aumentos), que acostumbra presentar grabada una raya negra o la inscripcin Inm. Este objetivo debe ser empleado incluyendo entre l y la preparacin aceite de inmersin para microscopa. c) El ocular aumenta a modo de lupa la imagen real proyectada por el objetivo y permite que sea percibida por el ojo. Lleva grabado el nmero de aumentos. Para evitar los defectos pticos de tipo aberracin cromtica1 y esfrica2 inherentes a las lentes nicas, tanto el ocular como los objetivos estn formados por sistemas o conjuntos de lentes cuyo diseo reduce al mximo estos defectos. La disposicin correcta del condensador es de gran importancia a la hora de obtener una imagen clara y contrastada. Cuando se emplean grandes aumentos, es fundamental conseguir una iluminacin ptima; en este caso es necesario realizar un centrado tanto de la fuente de la luz como del condensador, adems de un correcto diafragmado. Informacin objetivos Longitud del tubo: Distancia que media entre la superficie de conexin del objetivo en el revolver y el extremo del tubo en el cual se introduce el ocular. Nmero de campo: Dimetro en nanmetros (nm) del campo de visin que puede ser observado a travs del ocular. Distancia de trabajo: Es el espacio entre la lente frontal del objetivo y la superficie superior del cubreobjetos, cuando est enfocada la imagen de una muestra. A mayor aumento de objetivo, menor distancia de trabajo. Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos estn codificados por un anillo de color de la siguiente forma: 1 x negro 2 x castao 4 x, 5 x rojo 10 x amarillo 20 x verde 40 x, 50 x azul claro 60 x azul cobalto 100 x blanco

Los objetivos de inmersin en aceite llevan una marca de identificacin que es un anillo negro.

aberracin cromtica. Se producen irisaciones (anillos coloreados) en torno a los objetos que estn en el campo del microscopio.
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aberracin esfrica. No logran enfocar simultneamente todo el campo del microscopio, lo que produce imgenes borrosas.

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Fig. 5.3

Nomenclatura de los objetivos

5.2.5. Manejo y uso del microscopio 1. Compruebe que las lentes del ocular y los objetivos estn limpias. De no ser as, limpiarlas con papel de fumar. Si el objetivo estuviera muy sucio, se puede humedecer el papel con un poco de alcohol. No tocar las lentes con los dedos. 2. Coloque la preparacin sobre la pletina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento est en posicin de empleo. 3. Para bacteriologa, ilumine la preparacin bajando casi totalmente el condensador, con el diafragma abierto totalmente. 4. Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfoque: a. Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el macromtrico. No haga esta operacin mirando por el ocular, pues correra el riesgo de "clavar" el objetivo en la preparacin con el consiguiente destrozo de ambos. b. Suba el tubo lentamente con el macromtrico observando por el ocular hasta que obtenga un enfoque ntido. 5. Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). suba ligeramente el condensador. La imagen debe de estar casi enfocada; afine el enfoque con el micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo x10. 6. Empleo del objetivo de inmersin

a. Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el objetivo de x40. b. Coloque una gota mnima de aceite de inmersin sobre el punto de luz. c. Termine de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite. d. Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. La preparacin debera estar prcticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con el objetivo de x40. De no ser as, es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto partiendo del objetivo de x10. Recuerde que la distancia de trabajo desde la lente frontal del objetivo de inmersin a la preparacin es mnima, por lo que el riesgo de accidente es ahora mximo. e. Una vez que haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no puede volver a colocar el objetivo de x40 sobre ese campo, pues correra el riesgo de mancharlo de aceite.

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f. Finalizada la observacin de una preparacin y antes de retirarla de la platina, se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa. Nunca retirar la preparacin con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. g. Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente empleando papel de fumar. Compruebe tambin que el objetivo de x40 est perfectamente limpio. h. Limpiar los portas con solucin jabonosa. Aclararlos abundantemente y dejarlos guardados en un recipiente cerrado con disolucin eter-alcohol 1:1. i. Limpiar con rapidez cualquier suciedad que caiga en el microscopio. j. Guardar el microscopio con el revolver en posicin "sin objetivo" o con el objetivo de menor aumento. Recoger los cables elctricos y colocar en el armario segn las normas indicadas. k. Para desplazar el microscopio, sujetar la columna con una mano y el pie con la otra. l. No forzar los engranajes que mueven la pletina. 5.3. TIPOS DE MICROSCOPA PTICA En general, para el trabajo diario, el instrumento de uso ms comn es el microscopio de campo luminoso (microscopio ptico). Los otros tipos son utilizados con fines especiales o trabajos de investigacin. A. Microscopa de campo luminoso (microscopio ptico). Esta basada en los principios expuestos en los apartados anteriores. B. Microscopa de campo oscuro. Es un microscopio ptico donde aparecer un efecto producido por la tcnica del campo oscuro, que consiste en un fondo negro sobre el cual se ven los objetos intensamente iluminados. Esto se obtiene al equipar al microscopio con un condensador especial que dirige la luz desde la fuente luminosa por una trayectoria tal que slo los haces de luz que tropiezan con los objetos de la muestra se dirigen al objetivo. C. Microscopa de luz ultravioleta. El microscopio de luz ultravioleta permite un poder de resolucin mejor, ya que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 180 a 400 nm frente a la de 400 a 700 nm del espectro visible. las imgenes del microscopio ultravioleta pueden ser visualizadas por el ojo humano gracias a un tubo convertidor de imagen que se registrar sobre un plano fotogrfico o televisin sensible a la luz ultravioleta. D. Microscopa de fluorescencia. Existen sustancias en la naturaleza que son capaces de absorber la energa de las ondas ultravioletas y emitirla como ondas visibles de mayor longitud de onda. De ah que existan materiales que a la luz ordinaria presentan un color y a la luz ultravioleta otro distinto y ms intenso. Este tipo de materiales se denominan fluorescentes. Basndose en esta propiedad, la microscopa de fluorescencia consistir en teir previamente el microorganismo con un colorante fluorescente y observarlo al microscopio con luz ultravioleta. E. Microscopa de contraste de fases. Es uno de los mejores mtodos para la visualizacin de microorganismos vivos. Las preparaciones de la muestra se iluminan de manera controlada mediante objetivos especiales de contraste de fase de la luz, con lo que se puede distinguir ndices de refraccin similares. Establecer un contraste de fase hace diferenciar estructuras que tienen ndice de refraccin muy prximo, las cuales no se apreciaran con el microscopio convencional. Se recurre a un dispositivo

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de iluminacin segn el cual una porcin del haz luminoso es tratada de un modo distinto al resto; posteriormente se recombinan ambos en tales condiciones que producen por interferencia grandes aumentos en el contraste de las clulas o estructuras intracelulares, que difieren ligeramente en su ndice de refraccin respecto al de su entorno. 5.4. MICROSCOPA ELECTRNICA Poder de resolucin
Rayos  Longitud de onda () 0,01 nm Rayos X UV 1 nm <400 nm Visible 400-700nm IR >700 nm Micro ondas 0.1-7 cm TV 1m FM 10 m AM 1 Km

El uso de ondas de radio para visualizar objetos pequeos, sera un desastre (como una regla de 1 Km para medir el dimetro de una canica). El "criterio Rayleigh" establece el lmite de resolucin, esto es, la distancia ms corta que se puede observar con una onda viene limitada  por el valor el valor medio de 2 . Para la luz visible unos 300 nm que es efectivamente el lmite de resolucin con los microscopios pticos. Microscopio electrnico de transmisin (TEM) El microscopio electrnico utiliza un haz de electrones. El poder de resolucin es por ello 1.000 veces mayor al del microscopio ptico ( electrones = 0,0036 C). La fuente emisora de electrones es un filamento de Tungsteno sometido a un potencial de 30150 Kv. El flujo de electrones se dirigen hacia la muestra. El haz emergente se somete a la accin de campos electromagnticos que amplifican la imagen igual que las lentes en un microscopio ptico. Una lente proyectora lleva la imagen a una pantalla fluorescente (tipo TV) que brilla al recibir los impactos de los electrones. El TEM viene limitado por: a) Slo permite trabajar en muestras de espesores muy delgados y exentos de materiales que dispersen o absorban electrones (en especial tomos pesados de Fe o Pb). b) Trabaja en vaco (no permite estudiar procesos fisiolgicos). Microscopa electrnica de barrido (MEB) 1. Los electrones no se transmiten desde abajo como en el TEM, si no que inciden desde arriba sobre la muestra, por lo que no hay limitacin en el grosor de esta. 2. Proceso de secado de la muestra (eliminacin de agua) 3. Recubrimiento de la muestra con una capa de metal (Au o Pt) 4. Se irradia la superficie de la muestra con un haz muy estrecho de electrones. La muestra desprende electrones secundarios (de baja energa) que se recogen sobre una placa cargada positivamente que produce una seal elctrica proporcional al nmero de electrones. Estas intensidades elctricas dependen de la forma y composicin qumica del objeto irradiado. Las seales se registran en un monitor de TV. 5. Tiene menor resolucin que el TEM pero da bastante impresin de tridimensionalidad.

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Microscopa por efecto tnel Desde los aos 80 se viene desarrollando una tcnica (premio Nobel) consistente en establecer una corriente o flujo de electrones entre una punta extremadamente fina de unos pocos nanmetros de dimetro, que se puede aproximar hasta casi 1 nm del objeto. Se puede explorar as los ms pequeos detalles de la superficie de un objeto y estudiar tomo por tomo su estructura. Especial aplicacin en microelectrnica y el estudio de molculas de ADN. 5.5. 5.5.1. OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS EN VIVO

1. Examen en fresco: cultivo de protozoos a. Mtodo entre portaobjetos y cubreobjetos. Se prepara un portaobjetos (porta) y un cubreobjetos (cubre) perfectamente limpios y desengrasados. En el porta se depositara una gota de agua destilada . Con el asa de siembra se tomar un poco de muestra de el microorganismo y se realizar una resuspensin de sta en la gota. Se intentar extender la muestra con el fin de homogeneizar la mezcla, colocando con cuidado sobre la suspensin un cubre formando inicialmente un ngulo de 45 evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensin. Observar al microscopio inicialmente con objetivo de 40 aumentos.

b. Mtodo de gota pendiente en porta excavado Se utilizar en este caso un cubre adecuadamente limpio y desengrasado en el que se colocar en el centro una gota de la suspensin microbiana con una asa de siembra. Se colocar vaselina en los bordes del microtubo del porta excavado. El cubre se invertir sobre el porta excavado perfectamente limpio, colocndolo encima del rea cncava del porta. La vaselina adherir el cubre al porta formando una cmara que evitar su evaporacin, as como corrientes de aire. Se invertir la preparacin. Se observar al microscopio con objetivo inicialmente de 40 aumentos.

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Fig. 5.4 Resultados Estos mtodos son utilizados para identificar a los microorganismos como mviles o inmviles, as como para observar su morfologa y, a veces, su distribucin. Es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se producen cuando se desplaza el medio lquido y hace que todas las bacterias sigan la corriente en dicha direccin. El sellado con vaselina evita precisamente ese problema. 2. Tincin vital Fundamento: Tcnica intermedia entre examen en fresco y las tcnicas de tincin con fijacin previa, consistente en el empleo de colorantes a diluciones muy altas para que no resulten txicos para las bacterias, evitando as la muerte de los grmenes. Rojo neutro en solucin acuosa al 1: 1000 Azul de metileno en solucin acuosa al 1:1.000 1:500 Procedimiento : Se colocar sobre el porta limpio y desengrasado una gota de la suspensin del microorganismo problema junto con otra del colorante utilizado. Mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

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5.6. TINCIONES BACTERIANAS 5.6.1. Preparacin de un frotis (o extensin) bacteriano 1. Extensin. Colocar una pequea gota de agua destilada en el porta. Con el asa de Kolle transferir una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido a la gota. Remover la mezcla con el asa hasta formar una suspensin homognea y extenderla, bien con la propia asa, o bien, con la ayuda del borde de otro porta produciendo la extensin del inculo. ( Si el material de partida es un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los pasos 1 y 2, basta con realizar directamente la extensin) 2. Fijacin. Es imprescindible para que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio, permitir la evaporacin espontnea del porta, ayudndose con la llama del mechero de manera muy leve (en ningn caso el porta debe quemar al tacto). Si el porta alcanza una temperatura excesiva a la llama, las clulas pueden deformarse o romperse. a. Por calor. (Bacterias procedentes de medio slido) Pasar 2-3 veces el porta por la llama durante un segundo. Dejar enfriar el porta entre los pases. . b. Con metanol ( bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Retirar de inmediato el exceso de metanol del porta, golpendolo con suavidad por su canto contra un papel de filtro en la mesa de trabajo. Esperar a que el metanol se evapore completamente. (La fijacin por calor de bacterias que se hallan en su propio medio de cultivo, no da buen resultado, pues la capa de materia orgnica que contiene las bacterias, una vez realizada la extensin, tiende a despegarse con facilidad en los lavados posteriores. Mecanismo de accin de los colorantes: Qumica: Se fundamenta en las reacciones cido-base. Los colorantes son sales orgnicas cuya estructura fundamental es un anillo bencnico con distintos radicales. El radical coloreado o cromatforo suele se de tipo: nitroso (-NO2), azo (-N=N-), alqueno (C=C-), ciano (-C=N-). Cuanto mayor sea el nmero de radicales cromforos, mayor ser el poder colorante de la solucin. El radical no coloreado o auxocromo es de tipo hidroxilo (-OH), amino (-NH2), metilo (CH3) y no tiene capacidad tintorial (dan estabilidad al colorante y pueden facilitar la accin del radical cromforo). Dependiendo de la carga del radical cromforo los colorantes se clasifican en bsicos, cidos o neutros. En bacteriologa es especialmente frecuente la utilizacin de colorantes bsicos (radicales cromforos positivos) como la fucsina bsica, cristal violeta o azul de metileno; ello es debido a la gran basofilia de los componentes nucleares ricos en ADN y componentes citoplasmticos ricos en ARN.

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5.6.2. TINCIN SIMPLE Objetivo Observar la morfologa de la bacteria Observar la agregacin o tipo de distribucin bacteriana Fundamento Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes celulares, ya que las clulas bacterianas en medios a pH neutros suelen presentar una dbil carga negativa. As pues, la bacteria cargada negativamente se combinar con los iones positivos de los colorantes bsicos, como por ejemplo, el azul de metileno, cristal violeta, fucsina fenicada, de tal forma que la bacteria quedar coloreada. Esto explica porqu en las tinciones simples los colorantes utilizados suelen ser de tipo bsico. Como colorantes cidos se utilizan la eosina y la nigrosina; pero los iones negativos de estos colorantes no podrn teir la clula y se depositarn alrededor de esta: son las tinciones negativas. Con este tipo de tincin se consigue una imagen ms real del tamao y la forma celular.

Fig. 5.5 Procedimiento: 1. Preparar un frotis de: a. Mucosa bucal (eucariota) b. Muestra laboratorio (E. coli, Staphylococcus epidermidis, ...) 2. Cubrir el frotis con abundante colorante azul de metileno. Dejar actuar 2 min. 3. Lavar las preparaciones con agua corriente para eliminar el exceso de colorante Para ello, inclinar el porta y aplicar el chorro de agua corriente en su parte superior permitiendo que resbale sobre el frotis. No dirigir el agua directamente sobre el frotis, pues podra arrastrar parte de l consigo. 4. Esperar hasta que el lquido se evapore. Este proceso se puede acelerar procediendo al secado del porta por simple presin entre dos papeles de filtro (en ningn caso frotar el porta). 5. Observar la preparacin en el microscopio con el objetivo de inmersin. 6. Seleccionar un buen campo de observacin y dibujarlo ilustrando la morfologa y agrupacin de las clulas.

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5.6.3. TINCIN NEGATIVA Fundamento Las cpsulas son estructuras (capas mucosas) situadas alrededor de la pared celular de algunas bacterias que confieren a stas una cierta resistencia (son consideradas como un factor de virulencia). Su espesor es variable y su composicin de polisacridos o polipptidos. Por su elevado contenido en agua se tie dbilmente con los colorantes bsicos, sin embargo, se pueden observar directamente mediante tincin negativa con tinta china. Este colorante est compuesto por partculas finas de carbn suspendidas en agua formando un autntico coloide. Las partculas son demasiado grandes para penetrar a travs de la matriz de la cpsula, por lo que slo se teir el medio circundante. Tambin se utilizan colorantes cidos (cargados negativamente). Los microorganismos, cargados negativamente, no van a captar el colorante, quedando claros y brillantes sobre un fondo tenido oscuro. Este mtodo es menos utilizado en bacteriologa que otras tcnicas de tincin, pero proporciona una visin muy exacta de las clulas bacterianas y se consigue una imagen ms real de su forma y tamao, ademas de permitirnos observar si presentan o no cpsulas. PROCEDIMIENTO: (la tcnica no requiere fijacin) 1. Colocar una gota de agua en un porta limpio y desengrasado. 2. Tomar con el asa de siembra una pequea cantidad de muestra cryptococcus sp. y mezclarla con la gota de agua. 3. Aadir una gota de solucin de tinta china. 4. Mezclar cuidadosamente con el asa de siembra. 5. Colocar suavemente un cubreobjetos, evitando formar burbujas de aire. 6. Colocar "porta" y "cubre" en un papel absorbente doblado por la mitad, presionar con los dedos sobre el cubre, de forma que el papel absorba el exceso de suspensin. 7. Observar con objetivo (x 40) y de inmersin

Fig. 5.6 Tincin negativa

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5.6.4 TINCIONES DIFERENCIALES A. TINCIN GRAM Objetivo Diferenciar dos grandes grupos de eubacterias (Gram+, Gram-) en funcin de la distinta composicin de su pared bacteriana. Visualizar su morfologa y disposicin. Fundamento Esta tincin fue desarrollada por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realizan para cualquier identificacin bacteriana. El distinto comportamiento en la tincin Gram es debido a la distinta composicin de la pared de las clulas bacterianas. Gram (+) se tien de violeta. Mono estratificada. Esta formada por una gruesa capa, amorfa y densa de mucopolisacridos (murena, etc.). Esta densa capa evita la extraccin del complejo cristal-violeta-yodo por el disolvente (alcohol o acetona) Gram (-) pared multiestratificada de mayor complejidad. Se tien de rosa con el colorante de contraste (safranina). Esta formada por una capa de murena ms delgada (tan slo un 10 % de la estructura) y encima de ella una capa de lpidos y glucolpidos. La decoloracin con alcohol incrementa la porosidad por arrastre de lpidos, aumentando la tincin diferencial.

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Fig. 5.7

Tincin Gram

La tincin de Gram requiere el uso de cuatro soluciones: 1. Primer colorante. El ms utilizado es el cristal violeta. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas tindolas a todas de azul. 2. Solucin mordiente. Algunos colorantes slo se depositan sobre determinadas estructuras cuando stas han sido sometidas a la accin de un mordiente, formndose lo que se conoce con el nombre de "laca". El mordiente por si mismo no tiene color. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el primer colorante y las clulas. Suele emplearse una disolucin de yodo (Lugol). 3. Agente decolorante, Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol (alcoholacetona 1:1) que decolorar solamente un tipo de bacterias (las Gram -)que sern teidas con el colorante de contraste o segundo colorante.

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4. (Gram - ) La eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares, aumenta la porosidad. El complejo CV-I (cristal violeta-Yodo) se separa de la clula. 5. (Gram +) Se deshidratan las paredes celulares, se contraen los poros y disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I se fija. 6. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por ejemplo, la safranina. Este distinto comportamiento frente a la decoloracin es dependiente de la composicin de la pared bacteriana , hecho que servir para clasificarlas como Gram+, aquellas que no han sido decoloradas y que por lo tanto quedan teidas con el cristal violeta de color azul violceo (cuando un colorante se une a una estructura , sta ya no puede ser teida por otro), o como Gram- (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teidas con el colorante de contraste, la safranina; por lo tanto, su color es rosa-rojo). Es recomendable trabajar con cultivos en fase exponencial 18-24 h. Las bacterias Gram positivas en fase estacionaria pueden aparecer como Gram negativas. Agua altamente clorada puede debilitar la coloracin de contraste. Paso Primer colorante Mordiente Decoloracin Segundo colorante Procedimiento 1. Preparar 3 portas con frotis bacteriano de cultivos en fase exponencial de: a. Staphylococcus epidermidis b. Escherichia coli c. mezcla de ambos 2. Fijar las muestras y dejar enfriar antes de proceder a su tincin. 3. Teir con cristal violeta (2 min). Lavar con agua corriente el exceso de colorante 4. Cubrir con Lugol (2 min). Lavar con agua corriente el exceso de Lugol 5. Decolorar con etanol hasta que la muestra deje de perder color (unos 10 seg). Lavar con abundante agua corriente para eliminar el resto del disolvente 6. Teir con safranina (2 min). 7. Lavar con agua corriente para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. 8. Examinar al microscopio con objetivo de inmersin. 9. Dibujar la morfologa y el color que toman los distintos tipos bacterianos en estudio. Tcnica cristal violeta 2 Lugol 2 alcohol-acetona 10" safranina 2 Resultado Gram+ se tien violeta se fija coloracin permanecen violetas permanecen violetas Gramse tien violeta se fija coloracin se decoloran se tien de rojo/rosa

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B. TINCIN CIDO-RESISTENTE (Ziehl-Neelsen) Fundamento. La mayora de las eubacterias se encuentran englobadas en dos grandes grupos segn la tincin Gram; sin embargo, algunas bacterias de los grupos Micobacteria y Actinomicetos no pueden ser clasificadas por aquella tincin. Para poder observar y diferenciar con detalle estos grupos bacterianos, se utiliza la tincin cido-alcohol resistente. Esta tincin demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teidas de resistir a la decoloracin por cidos y alcoholes. Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de componentes lipoideos y creos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy hidrfobo, de tal forma que este tipo de bacterias presentarn grandes dificultades a la hora de teirse con los colorantes convencionales que no pueden penetrar en el interior de las bacterias. De ah que se necesiten, para este tipo de tinciones, colorantes altamente concentrados as como la presencia de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; de tal forma que, siguiendo tales instrucciones, una vez que dichas bacterias han quedado teidas, su decoloracin posterior no es posible, resistiendo incluso a decoloraciones cido-alcohlicas. Dicha tincin se emplea principalmente para el diagnstico y estudio de enfermedades producidas por bacterias cido resistentes, como son la tuberculosis y la lepra. La tincin Ziehl-Neelsen requiere tres colorantes: 1. Tincin con mezcla de fucsina-fenol: capaz de teir de color rojo las clulas en caliente. El fenol facilita la penetracin de la fucsina en la envoltura celular. 2. Decolorante orgnico: mezcla de cido y alcohol (HCl 0,36 N en etanol). 3. Colorante de contraste: azul de metileno Las bacterias cido-alcohol resistentes, tras la unin de la fucsina, resisten el tratamiento orgnico y se vern teidas de rosa. El resto de las bacterias se decolorarn y se contrastarn con azul de metileno. Procedimiento: 1. Preparar un frotis de cultivos en fase exponencial de Mycobacterium phlei y Staphylococcus epidermidis. 2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no sobresalga del portaobjetos. 3. Teir con fucsina fenicada cubriendo el porta durante 2 min. 4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la preparacin del fuego. Aadir ms colorante y repetir la operacin 4 veces. 5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante. 6. Decolorar con la solucin cido-alcohlica hasta color rosa claro (unos 30 seg). 7. lavar con agua corriente para detener la decoloracin. 8. Teir con azul de metileno(0,3 %) durante 1 2 min. sin necesidad de calentar. 9. Lavar con agua corriente el exceso de colorante. Secar la preparacin 10. Examinar al microscopio con objetivo de inmersin. 11. Dibujar la morfologa y el color que toman los distintos tipos bacterianos en estudio.

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5.6.5. TINCIN ESTRUCTURALES A - TINCIN DE ESPORAS Fundamento. Slo algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endsporas. Su enorme importancia se debe a su resistencia al calor. Mientras que calentando a 80 durante 10 min (pasteurizacin) mueren todas las bacterias y las propias formas vegetativas de las formadoras de esporas, las endsporas termorresistentes soportan en algunos casos incluso la coccin durante horas. La esporulacin se inicia en el interior de la bacteria con una concentracin de material proteico (la espora contiene casi toda la materia seca de la clula materna, pero en 1/10 de su volumen). Se forma una doble capa envolvente que representa el 50 % de peso y volumen en la espora madura. La esporulacin se produce cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. En general las esporas, se tien muy dificilmente, requiriendo determinados colorantes muy concentrados as como la presencia de calor que facilite su penetracin; pero, ahora bien, una vez teidas es muy difcil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder demostrar la presencia de stas. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1. Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2. Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endsporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua , y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante. Procedimiento Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. 1. Preparar frotis bacteriano de Bacillus sp. 2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no sobresalga del portaobjetos. 3. Teir con verde de malaquita cubriendo el porta durante 2 min 4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la preparacin del fuego. Aadir ms colorante y repetir la operacin 4 veces. 5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante.

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6. 7. 8. 9.

Teir con safranina 2-3 min y lavar con agua corriente. Secar la preparacin. Observar la preparacin al microscopio con objetivo de inmersin. Dibujar y anotar la disposicin y la morfologa de las endsporas. Clasificar el tipo de endsporas segn la fig.5.8

Fig. 5.8 Interpretacin de los resultados La posicin y la morfologa de la endspora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. Las tres bacterias de la fig. 5.8 difieren en la disposicin y morfologa de las endsporas. B. sphaericus posee una endspora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. B.thuringiensis tiene localizada la endspora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado huso. B.subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante.

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Fig. 5.9

Tipos de protozoos y su tamao aproximado en micras ()

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5.7. CUESTIONARIO MICROSCOPA Cuestionario uso del microscopio 1. Nombrar los elementos que forman el sistema ptico del microscopio. 2. Nombrar los elementos que forman el sistema mecnico del microscopio 3. Porqu todo lo que se quiere observar en el microscopio tiene que ser transparente. 4. De que elementos depende la correcta iluminacin de la preparacin 5. Porqu utilizamos aceite de inmersin 6. Interpreta ayudndote en la fig. 5.3 los datos que figuran en los objetivos de tu microscopio. (monocular y binocular).

Cuestionario Tinciones bacterianas 1. Qu es un examen en fresco? Qu funcin desempea el uso de la silicona? 2. Seala las ventajas y desventajas de la tincin simple respecto al examen en fresco. 3. Explica qu significan en microscopa las siguientes expresiones: a) Extensin 4. b) Fijacin

En que difiere la extensin segn provenga la muestra de un cultivo slido o lquido

5. Cmo y porqu se debe realizar la fijacin con metanol, en caso de cultivos provenientes de medio lquido? 6. Qu problemas acarrea el calentar el porta en exceso durante el proceso de la fijacin?.

7. Con los resultados de una tincin simple se puede saber si la muestra es un cultivo puro? 8. Que diferencias existen entre la tincin simple y la tincin negativa en cuanto a: a. b. Morfologa que nos permiten observar Tipo de colorantes, cidos o bsicos que se emplean.

9. Qu diferencias estructurales hay entre Gram+ y Gram-? 10. Tincin cido-resistente: a. Para que tipo de bacterias est indicado este tipo de tincin. b. Acta alguna sustancia como mordiente?

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11. Que es la esporognesis. En qu circunstancias se produce? 12. Qu significa: "la clula vegetativa se lisa" 13. Qu funcin desempea el "colorante de contraste" en las tinciones bacterianas?. 14. Completar la siguiente tabla: Tincin
T. Simple T. Negativa T. Gram T. c. Resist T. de Esporas T. de Cpsulas Primer colorante Mordiente Decoloraci n Colorante de contraste Resultado Positivo Negativo

1. Las 4 imgenes corresponden a los campos que se observan en las cuatro etapas de una tincin Gramm.

a. Ordenar la secuencia de campos tal como se producen. b. Explicar a que etapa corresponde cada uno. c. Que operacin se realiza en cada etapa y como se manifiesta en cada tipo de bacteria segn la clase de pared celular que posea.