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Nombre Del Programa: Frecuencia De Aislamientos De Micoplasma Y Ureaplasma Asesor: Dr. Jos Antonio Rivera Tapia Introduccin Los micoplasmas (forma de hongo) y ureaplasmas pertenecen a la clase Mollicute (piel suave) (Tabla 1), que comprende cuatro rdenes, cinco familias, ocho gneros y ms de 150 especies conocidas. Los Mollicute son eubacterias que han evolucionado de clulas tipo clostridiales (Clostridium) (1). Los Mollicutes son ms pequeos que las bacterias convencionales tanto en dimensin celular como en tamao genmico, hacindolos los organismos de vida libre ms pequeos conocidos (2). El tamao de su genoma puede variar de menos de 600 kpb hasta 2 200 kpb, con valores que pueden coincidir entre gneros de Mollicutes. Los tamaos en el genoma son variables no solo dentro del mismo gnero sino tambin entre cepas de las mismas especies. Una de las razones de esta variabilidad en el genoma de los mollicutes es la frecuente ocurrencia de elementos repetitivos, consistentes en segmentos de genes de protenas, diferentes en tamao y nmero, o secuencias de insercin (IS Insertion Sequence). El genoma micoplasma como caracterstica tiene bajo contenido de G+C. (3). Son contenidos por una membrana celular de tres capas, y no poseen pared celular. Carecen de pared celular que los previene de teirse ante la tcnica Gram (1), son incapaces de sintetizar peptidoglucano o sus precursores qumicos, lo que les confiere su alto pleomorfismo. (4) lo que les otorga una resistencia intrnseca a algunas familias de antibiticos (5). Tienen una limitada capacidad biosinttica, lo que explica la existencia parastica o saproftica de estos organismos, su sensibilidad a las condiciones del medio, y sus fastidiosos requerimientos para el crecimiento pueden complicar la deteccin por cultivo, as que requieren de un medio de crecimiento enriquecido con precursores de cidos nuclicos (1). Requieren adems de colesterol para su crecimiento, algunos
hidrolizan urea, otros, oxidan cidos grasos de cadenas cortas a travs de la betaoxidasa o degradan azcares durante sus procesos glucolticos (6). Tabla 1. (Tomada de referencia 6) Clasificacin de los micoplasmas Mollicutes Mycoplasmatales Mycoplasmataceae Acholeplasmataceae Spiroplasmataceae Mycoplasma Acholeplasma Spiroplasma Ureaplasma
Las tpicas colonias de micoplasmas varan en dimetro de 15 300 m. Las colonias de algunas especies, tal como M. hominis, a menudo exhiben una apariencia de huevo frito, debido a la diferencia en el crecimiento ms profundo en el centro de la colonia y siendo ms superficial en la periferia (figura 1), mientras otras, como M. pneumoniae, producen colonias esfricas. Otras colonias de especies de micoplasmas, como aquellas producidas por U. urealyticum (conocidos comnmente como ureaplasmas) son tpicamente mucho ms pequeas (15 a 60 m en dimetro) (1). Los Mollicutes tienen diferentes hbitats incluyendo insectos, plantas, animales y humanos. Los Mollicutes han sido estudiados en diferentes aspectos como en su interaccin con el sistema inmune, la activacin de macrfagos, la induccin de citocinas y la evasin de la respuesta inmune por componentes de superficie, estos estudios han conducido a un mejor entendimiento de su patogenicidad. Algunos micoplasmas humanos son capaces de penetrar las clulas hospederas y son considerados como cofactores del SIDA (7).
Figura 1. Colonias tpicas de micoplasmas en agar Eaton. Las indicadas con una flecha presentan ms claramente la forma de huevo frito.
Mycoplasma orale, Mycoplasma buccale, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pirum, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma penetrans, entre otros; tienen como sitios de colonizacin primario orofaringe y el tracto genitourinario. Sin embargo, se ha observado que pueden tener un sitio secundario de colonizacin como la vagina, crvix, articulaciones artrticas, ndulos linfticos, abscesos de tubo ovrico, sangre, rin y cerebro, uretra, fluido amnitico, septicemia neonatal, en linfocitos de sangre de pacientes con SIDA y en orina (6).
Es muy comn que contaminen cultivos celulares. La infeccin por micoplasmas puede privar a las clulas hospederas de arginina, un aminocido esencial, el cual, los micoplasmas usan como fuente de energa, y alteran la incorporacin de precursores de cidos nuclicos en las clulas del husped. (8). Antecedentes En 1898 Nocard y Roux describieron a los micoplasmas, demostrando que la pleuroneumona en ganado vacuno era causada por organismos que pasan filtros que retenan bacterias. Estos investigadores desarrollaron un medio de agar enriquecido que soportaba el crecimiento colonial de estos microorganismos (6). Desde principios del siglo XX se han descrito cuadros de neumonas atpicas, donde el cuadro clnico se diferencia significativamente del producido por bacterias como Streptococcus pneumoniae. En 1944, se describi por primera vez la existencia de un microorganismo, conocido durante aos con el nombre de agente Eaton (en honor quien lo aisl por primera vez), que era capaz de producir cuadros de neumonas atpicas en humanos. Casi dos dcadas despus, se determin que este agente corresponda a una bacteria de la familia de los Mycoplasmataceae siendo denominado posteriormente como Mycoplasma pneumoniae (9). El trmino micoplasma es el nombre generalmente usado para un grupo de microorganismos, anteriormente conocidos como organismos tipo pleuroneumona (pleuropneumonia like organisms, por sus siglas en ingles PPLO). Este grupo carece de pared celular e incluye el gnero Mycoplasma (que requiere de esteroles), el gnero Acholeplasma (que no requiere esteroles) y las cepas T (que requieren urea) (10). Justificacin Este programa de servicio social se realiz en el laboratorio de micoplasmas del Centro de Investigaciones Microbiolgicas del Instituto de Ciencias de la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla (ICUAP-BUAP) a cargo del Dr. Jos Antonio Rivera Tapia. El programa de servicio social, beneficia a la comunidad mdica y cientfica,
proporcionando un panorama general de la presencia de micoplasmas y ureaplasmas en un una poblacin de individuos de la ciudad de Puebla. En muchas ocasiones estos microorganismos han sido menospreciados por poseer una morfologa simple y caractersticas distintas al resto de las bacterias. Y a pesar de esto son causantes de infecciones en articulaciones, infecciones respiratorias e infecciones genitourinarias en adultos, as como otros padecimientos en neonatos, si estas infecciones no son tratadas adecuada y oportunamente pueden presentar graves complicaciones. Objetivo Determinar en qu proporcin/porcentaje se aslan (casos positivos) de infecciones por micoplasmas y ureaplasmas en una poblacin de la ciudad de Puebla. Materiales y Mtodos Se analizaron 342 muestras clnicas. De estas, 186 fueron de exudados genitales (vaginales y vulvares) y uretrales, mientras 156 de exudados farngeos, que estuvieron congeladas en caldo Eaton o caldo Urea por un lapso de 3 a 6 aos. Se descongelaron y sembraron 5 l de cada muestra en su respectivo agar Eaton o Urea, siendo revisados diariamente para corroborar la siembra mediante microscopia estereoscpica. A su vez, se tomaron 500 l de cada muestra y se resuspendieron en caldo Eaton o Urea en tubos de ensaye con tapn de goma. Ambos tipos de siembra fueron incubadas por un promedio de 15 das a 37 C. Ocho das despus de incubadas, presentasen o no el vire del indicador de pH se realiz una segunda resiembra de cada muestra en un nuevo medio slido. Resultados De las 156 muestras farngeas, 28 (17.9%) resultaron positivas para micoplasmas durante la primera siembra, 20 (12.82%) fueron positivas para la segunda resiembra. As mismo, de las 186 muestras genitales, resultaron positivas 39 (20.96%) en la primera siembra, y 53 (28.49%) en la segunda resiembra.
De acuerdo con los resultados de Camacho et al. (2009), Samra et al. (1994) y Trum et al. (1998), el porcentaje de casos positivos en aislamientos de Mollicutes en faringe y tracto urogenital, oscila en un 64% de las muestras analizadas (5). Durante la revisin y registro de los cultivos en medio slido, muchas de las muestras presentaron una morfologa distinta en las colonias a la tpicamente descrita de huevo frito. Como puede observarse en la figura 2, estas colonias, si pudiera llamrseles as, presentes en un medio Eaton slido, tienen una forma de espiral. Estos crecimientos, fueron descartados como contaminantes en el medio, ya que fueron incubados por un promedio de 20 das, y nunca variaron en su morfologa de espiral, adems de que se presentaron en repetidas ocasiones en varios de los cultivos de distintas muestras.
Figura 2. Crecimientos o colonias observados en medio Eaton. B - Ampliacin de A. C Crecimiento en forma de espiral.
Conclusin Los resultados obtenidos en este proyecto, no concuerdan con otros trabajos realizados tanto en sta como en otras regiones geogrficas. Se piensa, que debido al tiempo en congelacin de las muestras analizadas, los micoplasmas presentes pudieron adaptarse a las bajas condiciones de temperatura, modificando su tasa metablica, retardando su tiempo de crecimiento e incluso tal vez adoptando esa forma en espiral en sus colonias, para verificar esto, se recomienda continuar resembrando y analizando frecuentemente las muestras que presentaron estas peculiares formas para intentar revertir a la forma tpica de las colonias de micoplasmas, tambin podra corroborarse su presencia mediante un anlisis de PCR.
Referencias
1. Mycoplasma and Ureaplasma. K. B. Waites & D. Taylor-Robinson. 1999. p. 782- 794. In:
P. R. Murray; E. J. Baron; M. A. Pfaller; F. C. Tenover & R. H. Yolken (ed.). Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D. C.
2. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. S. Razin, D. Yogev, & Y. Naot.
R. R. Arenas, L. Cedillo-Ramrez & J. A. Rivera-Tapia. 2009. p. 6 10. Enf. Inf. Microbiol. Vol. 29, No. 1.
4. Micoplasmas y su Importancia Mdica. J. A. Rivera-Tapia, M. L. Cedillo-Ramrez, M.
p. 140 146. Neumologa Peditrica. Vol. 2, No. 3. 7. Cell Biology of the Mycoplasmas. J. Maniloff & H. J. Morowitz. 1972. p. 263 290. Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 36, No. 3.
8. Viabilidad de Micoplasmas de Inters Mdico en Presencia de Diferentes
Antibiticos. J. A Rivera-Tapia, O. R. Arenas, M. R. S. Olea & C. R. Mndez. 2003. p. 97 100. Rev. Fac. Med. UNAM. Vol. 46, No. 3.
9. Formacin de Biopelculas por Micoplasmas de Importancia Mdica. G. F. Garca, L.
Cedillo-Ramrez, J. A. Rivera-Tapia. 2009. p. 12-19. Univ. Med. Bogot (Colombia), Vol. 50, No. 1.
Y. Wang, I. W. Yang, D. W. Hsueh, W. J. Yang, T. H. Wang & H. S Wang. 2003. p. 250 258. Chang Gung Med J. Vol. 26, No. 4.
ANEXOS Agar Eaton 0.7 g de base para micoplasmas 1.3 g de agar 0.5 g de dextrosa 65 ml de agua destilada Mezclar en un matraz y calentarse hasta disolver el agar por completo. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Una vez estril se adicionan: 10 ml de dializado de levadura 25 ml de suero de caballo 1 ml de inhibidor VCN (vancomicina, colistina y nistatina) 0.12 g de penicilina Vaciar en cajas de petri. Someter a prueba de esterilidad durante 24 horas a 37 C Caldo Eaton 2 g de base para micoplasmas 0.5 g de dextrosa 65 ml de agua destilada 0.5 ml de rojo de fenol Mezclar en un matraz. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Una vez estril se adicionan: 10 ml de dializad de levadura 25 ml de suero de caballo 1 ml de inhibidor VCN (vancomicina, colistina y nistatina) 0.12 g de penicilina Someter a prueba de esterilidad durante 24 horas a 37 C
Agar Urea 0.7 g de base para micoplasmas 1.3 g de agar 65 ml de agua destilada Mezclar en un matraz y calentarse hasta disolver el agar por completo. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Una vez estril se adicionan: 10 ml de dializado de levadura 25 ml de suero de caballo 5 ml de urea al 10% 1 ml de inhibidor VCN (vancomicina, colistina y nistatina) 0.12 g de penicilina Vaciar en cajas de petri. Someter a prueba de esterilidad durante 24 horas a 37 C Caldo urea 2 g de base para micoplasmas 65 ml de agua destilada 0.5 ml de rojo de fenol Mezclar en un matraz y calentarse hasta disolver el agar por completo. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Una vez estril se adicionan: 10 ml de dializado de levadura 25 ml de suero de caballo 5 ml de urea al 10% 1 ml de inhibidor VCN (vancomicina, colistina y nistatina) 0.12 g de penicilina Someter a prueba de esterilidad durante 24 horas a 37 C