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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.7: C12C

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ESPAA

3/08 C12C 3/10 A61K 35/78

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TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 02758454 .9 86 Fecha de presentacin : 09.08.2002 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1414937 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 06.05.2004

T3

54 Ttulo: Extractos de lpulo, procedimiento para su preparacin y su utilizacin.

30 Prioridad: 10.08.2001 DE 101 39 479

73 Titular/es: Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. KG.

Willmar-Schwabe-Strasse, 4 76227 Karlsruhe, DE

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Erdelmeier, Clemens y

16.10.2005

Koch, Egon

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Lehmann Novo, Mara Isabel

16.10.2005

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Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid

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DESCRIPCIN Extractos de lpulo, procedimiento para su preparacin y su utilizacin.
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El presente invento se reere extractos de lpulo, al procedimiento para su preparacin y a la utilizacin de extractos de lpulo para la prolaxis y la terapia de estados patolgicos provocados por una deciencia de estrgenos o por disregulaciones del metabolismo de las hormonas sexuales, especialmente del metabolismo de los estrgenos. La mayor importancia del lpulo se encuentra, tanto ahora como antes, en su utilizacin en la produccin de cerveza. En virtud de sus sustancias amargas y aromticas, es decisivo para el sabor de la cerveza. Adems de esto, debido a sus propiedades antimicrobianas, estas sustancias tienen una cierta importancia en el caso de la conservacin de la cerveza. El material de reconocimiento en relacin al lpulo existente a los comienzos de los aos ochenta condujo a una monografa positiva por la Comisin E del entonces Ministerio de Sanidad del estado federal alemn (Banz. del 5. diciembre 1985 y, respectivamente 13. marzo 1990). Con ello, est fundamentalmente autorizada la utilizacin del lpulo en el caso de trastornos del sueo, agitacin y estados de ansiedad. Y desde hace mucho tiempo el lpulo posee un signicado medicinal como sedante suave en la medicina popular. Responsables de este efecto son probablemente los cidos - y -pcricos sensibles a la oxidacin. A estas sustancias componentes se les atribuy hace poco tiempo propiedades de captadores de radicales, as como propiedades inhibidoras de la peroxidacin lipdica. (M. Tagashita et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59, 740-742 (1995). En el documento EP 0 677 289 A2 se describen, adems, composiciones farmacuticas para el tratamiento de la osteoporosis, que contienen compuestos del grupo de los cidos -pcricos y los cidos -isopcricos. En los ltimos aos, junto a los cidos - y -pcricos (J. Hlzl, Zeitschrift fr Phytotherapie 13, 155-161 (1992) se examinaron tambin, de forma incrementada, los componentes fenlicos del lpulo y, junto al xantohumol 1 conocido ya desde hace tiempo, se encontraron en la planta del lpulo numerosos compuestos ms del tipo de las avonas (J. F. Stevens et al., Phytochemistry 44, 1575-1585 (1997), J. F. Stevens et al., J. Chromat. A 832 (1-2), 97-107 (1999)). Se trata en este caso, en primera lnea, de avonoides isoprenilados tales como, por ejemplo, 6- u 8-prenilnaringenina 2 y 3, as como isoxantohumol 4. Stevens et al., (Photochemistry 53, 759-775 (2000)) examinaron tambin la quimiotaxonoma de especies de lpulo y taxa.

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Una y otra vez se observ, que en el caso de las recolectoras de lpulo, se presentaban perturbaciones de la menstruacin que se atribuyeron a sustancias estrgenas en el lpulo, pero sin que estos efectos pudieran atribuirse de manera clara a uno o a varios componentes. Entre tanto, se pudo conrmar esta actividad estrgena del lpulo. As,
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se demostr que la 8-prenilnaringenina 3 es esencialmente responsable de estos efectos (S. R. Milligan et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252 (1999)). La actividad estrgena in vitro de este compuesto qued demostrada en su relativa anidad de unin a receptores de estrgenos y se ensay, especialmente con ayuda de la estimulacin de la fosfatasa alcalina en clulas Ishikawa -Var-I. Se comprob en este caso, que la 8-prenilnaringenina era esencialmente ms activa que los toestrgenos conocidos hasta ahora, tales como cumestrol, genistena o daidazena, y slo actuaba de un modo un poco ms dbil que el 17-estradiol. Milligan et al., (J. Endocrin. Metabol. 85, 4912-4915 (2000)) informaron tambin sobre la unin de diferentes componentes fenlicos del lpulo a un receptor humano de estrgenos expresado a partir de clulas de levadura. En este caso, de nuevo la 8-prenilnaringenina mostraba la actividad estrgena ms fuerte. Propiedades estrgenas ms dbiles mostraban la 6-prenilnaringenina, 6,8-diprenilnaringenina y la 8geranilnaringenina. Miyamoto et al., (Planta Med. 64, 516-519 (1988)) pudieron demostrar que la 8-prenilnaringenina normalizaba el peso del tero y la densidad sea en ratas ovariectomizadas. Adems, en el documento JP 08 165238 (ref. CA 125:158632) se describe la actividad estrgeno-agonstica de una serie de derivados de avona 8-prenilizados, entre ellos tambin la 8-prenilnaringenina. En estudios ms recientes se pudo demostrar que algunos avonoides del lpulo, especialmente el xantohumol 1, pueden actuar sobre el metabolismo de las clulas. Estn en condiciones de inuir positivamente sobre reacciones enzimticas que juegan un importante papel en la formacin de clulas tumorales. Con ello, estos compuestos se pueden considerar como agentes preventivos del cncer (Tagung der deutschen Gesellschaft fr Hopfenforschung, Stand der Kentnisse zum Hopfeninhaltsstoff Xanthohumol, (congreso de la sociedad alemana para la investigacin del lpulo, estado de conocimientos del componente del lpulo xantohumol) 24. marzo 1998, Aschheim). Miranda et al., (Food Chem. Tox. 37(4), 271-285(1999)) informan sobre la fuerte actividad antiproliferativa del xantohumol 1 y del iso-xantohumol 4 en clulas cancergenas mamarias MCF-7 humanas, as como en lneas celulares de cncer de intestino grueso HAT-29 y de ovario A-2780. Adems de esto, se pudo demostrar que el xantohumol 1 inuye inhibiendo la osteoporosis. Su utilizacin como agente teraputico contra la osteoporosis se describe en el documento EP 0 679 396 B1. Aunque los inventores hablan a favor de las propiedades estrgenas del xantohumol, sin embargo stas no se demuestran. Por el contrario, S. R. Milligan et al., (Pharm. Pharmacol. Lett. 7, 83-86 (1997)) llegaron a la conclusin unvoca de que la actividad inhibidora de la osteoporosis del xantohumol se basa en un efecto estrgeno, puesto que no pudieron determinar actividades correspondientes ni en la lnea celular humana, Ishikava, del carcinoma de endometrio ni en un ensayo del gen reportero de la levadura (S.R. Milligan et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 84, 2249-2252 (1999)). En contra de estas investigaciones, en el presente invento se demuestra que xantohumol 1 e isoxantohumol 4 se unen con actividad comparable a los receptores de estrgenos alfa y beta. Kumai y Okamoto (Toxicology Letters 21, 203-207 (1984)) informaron sobre fracciones de carbohidratos de elevado peso molecular a partir de extractos de lpulo puramente acuosos, los cuales reducan el peso del ovario de ratas jvenes tratadas previamente con gonadotropina PMS. Okamoto y Kumai (Acta Endocrinologica 127, 371-377 (1992)) conrmaron estos descubrimientos en virtud de la observacin de niveles reducidos de LH en sangre y de 17estradiol, causados por la administracin de extractos de lpulo puramente acuosos. En el documento DE 199 39 350 A1 se describe un extracto de lpulo con un contenido incrementado en xantohumol. Este extracto debe aadirse a la cerveza as como a bebidas refrescantes que contienen jugo de frutas. Sobre la presencia de naringeninas prenilizadas en este extracto no se sabe nada. Conforme al ejemplo de realizacin, el xantohumol se extrae del lpulo con etanol al 50% en peso. Pero esto no conduce a una extraccin ptima del xantohumol, puesto que esto ocurre solamente con etanol de elevada concentracin (>80%) en peso) con elevada recuperacin en el extracto. En el documento WO 83/00701 A1 se reivindica un procedimiento para la obtencin de sustancias con actividad estrgena a partir de lpulo, caracterizado porque primero se prepara un extracto en dixido de carbono a partir de lpulo bajo la adicin de agua como agente de arrastre y, a continuacin, se obtienen las sustancias con actividad estrgena mediante extraccin con ter o mediante procedimientos cromatogrcos. Adems, se reivindica la utilizacin de estas sustancias como aditivo para piensos, para agentes cosmticos o como aditivo para baos (sales de bao). Sobre la naturaleza de estas sustancias con actividad estrgena no se dan datos algunos. En el documento WO 01/30961 A1 se reivindica un procedimiento para la obtencin de aditivos estables para la fabricacin de cerveza, caracterizado porque el residuo del orujo de lpulo procedente de la extraccin con dixido de carbono, se extrae con un disolvente polar, preferentemente agua caliente, a continuacin se acidica el extracto, se lava con un disolvente no polar, preferentemente hexano, y -eventualmente despus del secado- se utiliza como aditivo para la fabricacin de cerveza. El orujo restante se desecha. El presente invento tiene como misin poner a disposicin extractos vegetales que sean adecuados para la preparacin de medicamentos para la prolaxis y la terapia de estados patolgicos, causados por una deciencia de estrgenos o por disregulaciones del metabolismo de las hormonas sexuales, especialmente del metabolismo de los estrgenos.
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Una misin ms del invento es la puesta a disposicin de un procedimiento para la preparacin de estos extractos, as como de los preparados farmacutico que los comprenden, los cuales son adecuados para el tratamiento de los estados patolgicos anteriormente citados.
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Estos cometidos se solucionan conforme al invento por el extracto de lpulo conforme a las reivindicaciones 1 y 2, los procedimientos conforme a las reivindicaciones 3-12, el preparado farmacutico conforme a la reivindicacin 13, as como la utilizacin de los extractos o del preparado farmacutico conforme a las reivindicaciones 14-16.
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El presente invento se basa, entre otras cosas, en el sorprendente descubrimiento de que a partir de la droga del lpulo, despus de la separacin de materiales de carga liplos e hidrlos, se obtiene extractos que contienen, igual que antes, los cidos pcricos del lpulo de tipo oroglucinol, al mismo tiempo calconas y avonas libres o ligadas, tales como xantohumol, isoxantohumol, as como 6- y 8-prenilnaringenina que, por el contrario, se obtienen en forma enriquecida. Especialmente sorprendente es el hecho de que el contenido en 6- y 8-prenilnaringenina depende de la temperatura de la extraccin previa con agua (vase el Ejemplo 3) y que se puede aumentar aproximadamente por un factor 2. La Figura 1 representa la dependencia de la concentracin de los componentes analizados, con la temperatura de la extraccin previa con agua.

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Un extracto de este tipo se puede obtener por extraccin unitaria o mltiple con un alcano(C5 -C7 ) o con CO2 supercrtico (etapa de desengrasado), subsiguiente extraccin del residuo de la droga con agua y, despus, subsiguiente extraccin del residuo de la droga con un disolvente de polaridad media, seleccionado del grupo constituido por alcoholes, alcoholes acuosos, cetonas, cetonas acuosas, steres y, eventualmente ulterior distribucin lquido-lquido. Sorprendentemente, los cidos pcricos del lpulo no pasan completamente al extracto liplo, sino slo en parte, mientras que por otro lado, en el caso de la extraccin con agua, las calconas y avonas permanecen casi totalmente en el residuo de la droga. Por ello, es posible obtener un extracto de lpulo que contiene todas las sustancias componentes farmacolgicamente relevantes (cidos pcricos, calconas, avonas) en una proporcin equilibrada. Debido a esta composicin favorable a base de varios principios activos teraputicos, este extracto se puede administrar de forma ideal en estados patolgicos provocados por una deciencia de estrgenos o por otras disregulaciones hormonales. Los extractos de lpulo conformes al invento son adecuados para la prolaxis y el tratamiento de dolencias que corren paralelas con el climaterio o la postmenopausia en la mujer, que abarcan sntomas tales como, entre otros, sofocos, depresiones, estados de ansiedad, confusin mental, insomnio, as como serios problemas de salud dependientes de la postmenopausia tales como osteoporosis, enfermedades cardacas y circulatorias, ataques cerebrovasculares, demencia y enfermedades tumorales. Otras enfermedades que se basan en una disregulacin del metabolismo de las hormonas sexuales y que pueden ser tratadas con el extracto conforme al invento son, por ejemplo, amenorrea, ciclos anovulatorios, menometrorragia, dolencias premenstruales y depresiones post parto. Igualmente, estos extractos se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades dependientes de las hormonas sexuales en el caso del hombre, tales como, por ejemplo, la hiperplasia benigna de prstata o el carcinoma de prstata. La sorprendente elevada actividad estrgena de los extractos de lpulo conformes al invento se demostr tanto con un ensayo competitivo de unin al receptor para receptores humanos de estrgenos alfa y beta, como tambin en un ensayo recombinante con levadura en comparacin con la actividad del 17-estradiol. En contraposicin con esto, los extractos de lpulo estndar convencionales muestran, a igual dosis, una actividad sensiblemente ms dbil o ninguna actividad. La Figura 2 muestra la actividad de un extracto comparativo y de dos extractos de lpulo conformes al invento en un ensayo del gen reportero de la levadura.

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Conforme al invento, se prepara un extracto de lpulo con un contenido incrementado, frente a extractos convencionales especialmente extractos acuoso-alcohlicos, en calconas y avonas libres y/o ligadas, especialmente 6- y 8prenilnaringenina, xantohumol e isohantohumol, el cual contiene, adems, simultneamente, cidos - y eventualmente -pcricos (humulon y, respectivamente, lupulon y sus derivados).
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Ulteriormente se pone a disposicin conforme al invento un procedimiento para la preparacin de estos extractos de lpulo, que abarca las etapas:
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(a) extraccin unitaria o mltiple de una droga de lpulo con un alcano(C5 -C7 ) o CO2 supercrtico, y separacin del residuo de la droga de la solucin de extraccin; (b) extraccin unitaria o mltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (a) con agua a una temperatura en el intervalo de 60 a 95C, y separacin del residuo de la droga;

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(c) extraccin unitaria o mltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (b) con un disolvente seleccionado del grupo constituido por 80-96% (p/p) de etanol, metanol, metanol acuoso, acetona, acetona acuosa y acetato de etilo, as como ltracin de la solucin de extraccin obtenida; y (d) separacin del disolvente de las soluciones de extraccin reunidas, obtenidas en la etapa (c) y secado del residuo obtenido. La relacin entre droga y disolvente se sita en cada etapa de extraccin en el intervalo de aproximadamente 1 : 7 hasta aproximadamente 1 : 12.
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La extraccin con un alcano (C5 -C7 ) o con CO2 supercrtico en la etapa (a) se lleva a cabo una, dos o tres veces, especialmente tres veces. La extraccin con CO2 supercrtico es particularmente preferida.
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El alcano (C5 -C7 ) en la etapa (a) es preferentemente un n-alcano(C5 -C7 ) del grupo constituido por n-pentano, nhexano y n-heptano, siendo muy particularmente preferido n-heptano.
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La extraccin en la etapa (b) se lleva a cabo preferentemente a 90C, pudiendo ser de una a varias horas la duracin de la extraccin. El disolvente en la etapa (c) se selecciona preferentemente del grupo constituido por 74 a 99% (p/p) de metanol, respectivamente 60 a 99% (p/p) de acetona y 92% (p/p) de etanol.

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El extracto (seco) de lpulo conforme al invento se caracteriza por un contenido en cidos -pcricos de al menos 0,5%, preferentemente al menos 0,8% y, en especial al menos 1%, en xantohumol al menos 2%, preferentemente al menos 3% y en especial al menos 4%, y en avonas prenilizadas de al menos 0,5%, preferentemente al menos 0,7%. Las avonas prenilizadas abarcan preferentemente 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol. El xantohumol en el sentido del presente invento no se cuenta entre las avonas prenilizadas. Los datos porcentuales se reeren al peso del extracto seco de lpulo. Los extractos obtenidos se puede elaborar junto con habituales coadyuvantes farmacuticos tolerables para dar preparados farmacuticos tales como cpsulas, comprimidos peliculares y grageas. Como coadyuvantes farmacuticos se utilizan los habituales agentes de relleno, aglomerantes, disgregantes y de revestimiento para tabletas peliculares y grageas, as como aceites y grasas como masas de relleno para cpsulas de gelatina blanda. Los extractos conformes al invento se pueden utilizar para la prolaxis y terapia de estados patolgicos provocados por una deciencia de estrgenos o por otras disregulaciones hormonales tales como dolencias del climaterio, enfermedades cancergenas dependientes de las hormonas sexuales, hiperplasia benigna de prstata, osteoporosis, enfermedad de Alzheimer y enfermedades cardiovasculares. En el caso de enfermedades cancergenas dependientes de las hormonas sexuales, los extractos conformes al invento se pueden utilizar para la prolaxis y terapia de cncer de mama, cncer de tero y cncer de prstata. La dosicacin de los extractos conformes al invento se sita en el intervalo de 0,005 g a 2 g de extracto 1 a 4 veces al da, preferentemente en el intervalo de 0,02 a 1 g 1 a 2 veces al da. La dosicacin en el caso aislado depende del cuadro patolgico y de las circunstancias individuales del paciente y puede ser adaptado por el facultativo que trata el caso de forma correspondiente a las necesidades individuales. Los ejemplos citados a continuacin ilustran el invento y no deben ser considerados como limitativos. Todos los datos porcentuales, en caso de que no se indique de otro modo, se reeren al peso. Ejemplo comparativo 1 Preparacin de un extracto en etanol al 96%, sin desengrasado previo

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50 g de la droga de lpulo (clase Hallertauer Magnum) se mezclaron con 500 g de etanol al 96% (p/p) y se fragmentaron con un aparato Ultraturrax. Se extrajo a 60C durante 1 h. A continuacin, se ltr por un ltro Seitz 1500. La droga se extrajo otras 2 veces ms de la misma manera. Las soluciones de extraccin reunidas se liberaron del etanol en el evaporador rotatorio y se secaron durante una noche en la estufa de secado al vaco a 50C. A partir de la masa seca se determina el contenido en sustancias componentes caractersticas por el mtodo de HPLC siguiente. Este mtodo HPLC se aplica tambin para la determinacin de las sustancias componentes en los dems ejemplos. Columna LiChrospher 100 5 m. 250 x 4 mm A: 1000 ml de agua bidestilada/3 ml de cido fosfrico (85%)/2 ml de trietilamina B: 1000 ml de acetonitrilo / 3 ml de cido fosfrico (85%) / 2 ml de trietilamina / 60 ml de agua bidestilada 40% de B sobre 70% B en 30 min; 70% de B sobre 100% de B en 10 min 1,2 ml/min Diodenarray

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Eluyente

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Gradiente Flujo

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Deteccin

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Rendimiento (extracto de etanol al 96% (p/p): 18,38 g => 36,8% Contenido HPLC en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en xantohumol: Contenido HPLC en 6- y 8-prenilnaringeninas, as como en isoxantohumol: Ejemplo 1a Preparacin de un extracto de lpulo (extraccin con CO2 y, a continuacin, extraccin previa con agua a 90C)
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19,8% 4,2% 1,3% inferior al lmite de deteccin(<0,01%)

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Extraccin en serie con CO2 supercrtico, agua y etanol al 92% (p/p): 80,6 g de una droga de lpulo (clase Hallertauer Magnum), que antes se haba extrado previamente con CO2 supercrtico (condiciones: trituracin a 10 mm de tamao de grano, extraccin con CO2 a 250 bar/50C, separacin del extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 960 g de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin durante 1 h a 90C. A continuacin, el extracto acuoso se separ por ltracin por un Supra ltro 1500 de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente hmedo, se extrajo despus, en cada caso 2 veces, con 800 g de etanol al 92% (p/p) durante 1 hora a 60C en cada caso. Se separ despus por un Supra ltro 1500 de Seitz y la solucin de extraccin se separ del etanol en el evaporador rotatorio con una temperatura del bao de agua de 55-65C, y se sec en la estufa de secado a 60C. Rendimientos: Residuo de la extraccin con agua: 18,96 g (23,5%) Residuo de la extraccin con EtOH al 92% (p/p): 9,83 g (12,2%)

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Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p): Contenido en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en xantohumol: Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina Contenido en isoxantohumol Ejemplo 1b Preparacin de un extracto de lpulo (extraccin con CO2 y, a continuacin, extraccin previa con agua a 90C)
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2% 0,5% 5,83% 0,63% 0,21% 0,42%

Extraccin en serie con CO2 supercrtico, agua y etanol al 92% (p/p): 504,26 g de una droga de lpulo (clase Hallertauer Magnum), que antes se haba extrado previamente con CO2 super-crtico (condiciones: trituracin a 10 mm de tamao de grano, extraccin con CO2 a 250 bar/50C, separacin del extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 6 kg de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin durante 1 h a 90C. A continuacin, el extracto acuoso se separ por ltracin por un Supra ltro 1500 de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente hmedo, se extrajo despus, en cada caso 2 veces, con 5 kg de etanol al 92% (p/p) durante 1 hora a 60C en cada caso. Se separ despus por un Supra ltro 1500 de Seitz y la solucin de extraccin se separ del etanol en el evaporador rotatorio con una temperatura del bao de agua de 55-65C, y se sec en la estufa de secado a 60C. Rendimientos: Residuo de la extraccin con agua: 105,9 g (21%)

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Residuo de la extraccin con EtOH al 92% (p/p): 63,37 g (13,8%) Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

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Contenido en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en xantohumol:
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1% 0,5% 4,41%

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Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina Contenido en isoxantohumol
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0,49% 0,15% 0,6%

Ejemplo 2 Preparacin de un extracto de lpulo (extraccin con CO2 y, a continuacin, extraccin previa con agua a 60C)

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Extraccin en serie con CO2 supercrtico, agua y etanol al 92% (p/p): 80,36 g de una droga de lpulo (clase Hallertauer Magnum), que antes se haba extrado previamente con CO2 super-crtico (condiciones: trituracin a 10 mm de tamao de grano, extraccin con CO2 a 250 bar/50C, separacin del extracto con un rendimiento del 30%), se extrajeron con 964 g de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin durante 1 h a 60C. A continuacin, el extracto acuoso se separ por ltracin por un Supra ltro 1500 de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente hmedo, se extrajo despus, en cada caso 2 veces, con 800 g de etanol al 92% (p/p), primero durante 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin durante 1 hora en cada caso a 60C. Se separ despus por un Supra ltro 1500 de Seitz y la solucin de extraccin se separ del etanol en el evaporador rotatorio con una temperatura del bao de agua de 55-65C, y se sec en la estufa de secado a 60C. Rendimientos: Residuo de la extraccin con agua: 17,91 g (22%)

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Residuo de la extraccin con EtOH al 92% (p/p): 9,95 g (12,4%) Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p): Contenido en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en cidos -pcricos del lpulo: Contenido HPLC en xantohumol: Contenido HPLC en 6-prenilnaringenina Contenido HPLC en 8-prenilnaringenina Contenido en isoxantohumol Ejemplo 3 Preparacin de un extracto de lpulo (extraccin con n-heptano y, a continuacin, con agua a 90C) 1,58% 0% 6,1% 0,4% 0,09% 0,21%

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247,6 g de droga de lpulo (clase Hallertauer Magnum), se extrajeron con 7 veces su peso de n-heptano, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin durante 1 h. Despus de separar por ltracin la solucin de extraccin con heptano por un Supra ltro 1500 de Seitz, se extrajo una segunda vez de igual manera. Despus, el residuo de la droga obtenido se liber del heptano en la estufa de secado. El residuo seco de la droga (205 g) se mezcl acto seguido con 12 veces su peso con agua y se mantuvo durante 1 hora a 90C. Despus de volvi a separar por ltracin y el residuo de la droga, aun ligeramente hmedo, se extrajo dos veces bajo agitacin a 60C con 10 veces su cantidad en peso de etanol al 92% (p/p). Se ltr por un ltro Supra 1500 de Seitz y la solucin de extraccin se liber del etanol en el evaporador rotatorio a una temperatura del bao de agua de 55-65C, y se sec a 60C en la estufa de secado. Rendimientos: Extracto de heptano: 26,4 g (10,7%) Extracto con agua: 41,1 g /16,6%)

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Extracto con etanol al 92% (p/p): 52,0 g (21,0%) Contenidos HPLC (referidos al extracto de EtOH al 92% (p/p):

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cidos alfa- pcricos: cidos beta-pcricos: xantohumol: 6-prenilnaringenina: 8-prenilnaringenina: isoxantohumol:

0,86% 0,05% 3,3% 0,45% 0,13% 0,25%

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Ejemplo 4 Dependencia del contenido en 6-prenil-, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol con la temperatura de la extraccin previa con agua
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Extraccin: aproximadamente 80 g de una droga de lpulo extrada previamente con CO2 se extrajeron con 12 veces su peso de agua, primero 5 min en el Ultra-Turrax, despus, bajo agitacin, 1 hora a 60, 70, 80, 90 y 95C. A continuacin, el extracto de agua se separ por ltracin por un ltro Supra 1500 de Seitz. El residuo de la droga, aun ligeramente hmedo, se extrajo dos veces con 800 g de etanol al 92% (p/p) primero durante 5 min en el Ultra-Turrax, despus bajo agitacin 1 hora a 60C en cada caso. Se ltr despus por un ltro Supra 1500 de Seitz y la solucin de extraccin se liber del etanol en el evaporador rotatorio a una temperatura del bao de agua de 55-65C, y se sec a 60C en la estufa de secado. Los resultados representados grcamente en la Figura 1 muestran una dependencia clara de la concentracin de las sustancias componentes prenilizadas, analizadas, con la temperatura de la extraccin previa con agua. Ejemplo 5 Examen de los extractos de lpulo en cuanto a actividad estrgena

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Para el examen de las sustancias componentes individuales de un extracto comparativo y de un extracto conforme al invento en cuanto a interacciones con el receptor de estrgenos humano alfa (ER-) y respectivamente beta (ER-), se llev a cabo un ensayo competitivo de ligamiento al receptor. En este caso se liga primeramente estradiol marcado radiactivamente al receptor humano de estrgenos y, a continuacin, se trata con la sustancia de ensayo a analizar. Se suprime en este caso la parte de estradiol marcado, correspondiente a la potencia estrgena de la muestra. El estradiol en exceso se separa por lavado despus de la unin del complejo a hidroxilapatita. Los receptores de estrgenos ER- y ER- se adquirieron comercialmente como receptores humanos recombinantes. Las tandas de ensayo se componan en cada caso de 1000 l de tampn TEDG (Tris 10mM, EDTA 1,5 mM, 10% de glicerol, pH 7,5), 5 l de receptor (200 nM), 10 l de estradiol 3H y 10 l de etanol(valor de control), 10 l de dietilestilestrol (100 mM, control positivo) o 10 l de extracto o, respectivamente, sustancia componente del extracto. Las tandas se mezclan cuidadosamente y se incuban en la oscuridad durante aproximadamente 16 horas a la temperatura ambiente. Despus de la incubacin se aaden 250 l de hidroxilapatita (HAP), para adsorber las protenas. Durante una fase de incubacin de 15 minutos se mezclan las tandas a mano cada cinco minutos. El precipitado se separa rigurosamente a 10.000 rpm durante algunos segundos y el residuo se separa con pipeta. El grnulo (pellet) se lava, en cada caso, tres veces con 1000 l de tampn TEDG y para la medicin se mezcla con 1000 l de etanol, se forma una suspensin y se traslada a un vial para centelleo. Tras la adicin de 9 ml de lquido de centelleo (Ready Safe, Beckmann) tiene lugar una medicin sobre toda la ventana 3 H en un contador-beta Beckmann. La caracterizacin de las capacidades de ligamiento de las sustancias de ensayo tiene lugar a travs de la determinacin de los valores DE50 a partir de las curvas de dosis-actividad de la supresin de estradiol. Los resultados se recogen en la Tabla 1 y demuestran para todas las sustancias componentes ensayadas potentes interacciones con los dos receptores de estrgenos. De manera sorprendente, el extracto conforme al invento result ser esencialmente ms fuertemente activo que lo que cabra esperar de las actividades de cada uno de los componentes. En contraposicin con esto, el extracto comparativo mostr una actividad en los dos receptores que se situaba al menos en 10 veces menos al del extracto conforme al invento. TABLA 1

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Ligamiento de sustancias componentes de un extracto conforme al invento y de un extracto comparativo al receptoralfa de estrgenos (ER-) y, respectivamente, receptor-beta de estrgenos (ER-), humanos

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El examen de extractos en cuanto a propiedades estrgenas se efectu, adems, con un ensayo del gen reportero (Reporter-gen-Assay) utilizando clulas de levadura (Sacharomyces). Las clulas son estables con el receptor de estrgenos humano y un plsmido de expresin, el cual contiene un elemento de respuesta al estrgeno y transfecta el gen de la enzima -galactosidasa. Todas las muestras se disolvieron en una concentracin de 20 mg/ml en DMSO y se aadieron sin diluir o despus de diluidas con DMSO en relaciones 1/10, 1/100 o 1/1000 en un volumen de 1 l para 100 l de medio de cultivo en placas de fondo plano para microtitulacin de 96 pocillos. A continuacin se aadieron 100 l de suspensin de levadura y el sustrato cromognico rojo de clorofenol--D-galactopiranosida. En cada placa se prepararon para el control pocillos en los que slo se haba vertido medio de cultivo o, respectivamente de disolvente, o las que contenan las concentraciones estndar de 1-estradiol. Las clulas de levadura se incubaron durante 72 h a 32C y, despus, se midi la absorcin del medio a 540 nm en un fotmetro para placas de microtitulacin. En parte, las muestras se examinaron, dos veces. Resultados
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Muestra Extracto de etanol al 96% (p/p) conforme al ejemplo comparativo

Actividad inactivo activo activo

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Extracto de etanol al 92% (p/p) conforme al Ejemplo 1a Extracto de etanol al 92% (p/p) conforme al ejemplo 2

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Los resultados del ensayo se representan en la Figura 2. Como activos se caracterizan en este caso aquellos extractos cuya actividad en comparacin con la curva estndar del 17-estradiol se situaba de forma signicativa por encima de los valores Background (corresponde aproximadamente al 10% de la estimulacin mxima).

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REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la obtencin de un extracto de lpulo, que abarca las etapas:
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(a) extraccin unitaria o mltiple de una droga de lpulo con un alcano(C5 -C7 ) o CO2 supercrtico, y separacin del residuo de la droga de la solucin de extraccin; (b) extraccin unitaria o mltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (a) con agua a una temperatura en el intervalo de 60 a 95C, y separacin del residuo de la droga; (c) extraccin unitaria o mltiple del residuo de la droga procedente de la etapa (b) con un disolvente seleccionado del grupo constituido por 80-96% (p/p) de etanol, metanol, metanol acuoso, acetona, acetona acuosa y acetato de etilo, as como ltracin de la solucin de extraccin obtenida; y

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(d) separacin del disolvente de las soluciones de extraccin reunidas, obtenidas en la etapa (c) y secado del residuo obtenido. 2. Procedimiento conforme a la reivindicacin 1, en donde en la etapa (a) se extrae una, dos o tres veces.

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3. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el disolvente en la etapa (a) se selecciona del grupo constituido por n-pentano, n-hexano y n-heptano. 4. Procedimiento conforme a la reivindicacin 3, en donde el disolvente en la etapa (a) es n-heptano.

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5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la extraccin en la etapa (b) tiene lugar aproximadamente a 90C. 6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el disolvente en la etapa (c) se selecciona del grupo constituido por etanol al 92% (p/p), metanol al 74-99% (p/p) y acetona al 60-99% (p/p). 7. Procedimiento conforme a la reivindicacin 1, en donde el disolvente en la etapa (a) es n-heptano y, el disolvente en la etapa (c) es etanol al 92% (p/p).

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8. Procedimiento conforme a la reivindicacin 1, en donde el disolvente en la etapa (a) es CO2 supercrtico, y el disolvente en la etapa (c) es etanol al 92% (p/p). 9. Extracto de lpulo obtenible segn el procedimiento segn una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por un contenido en cidos -pcricos de al menos 0,5%, en xantohumol de al menos 2% y en avonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,5%. 10. Extracto de lpulo segn la reivindicacin 9, caracterizado por un contenido en cidos -pcricos de al menos 0,8%, en xantohumol de al menos 3% y en avonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenil-naringenina e isoxantohumol, de al menos 0,7%.

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11. Preparado farmacutico que abarca un extracto de lpulo caracterizado por un contenido en cidos -pcricos de al menos 0,5%, en xantohumol de al menos 2% y en avonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,5%, y los habituales coadyuvantes farmacuticos tolerables. 12. Preparado farmacutico segn la reivindicacin 11, que abarca un extracto de lpulo caracterizado por un contenido en cidos -pcricos de al menos 0,8%, en xantohumol de al menos 3% y en avonas prenilizadas, seleccionadas del grupo que abarca 6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina e isoxantohumol, de al menos 0,7%. 13. Utilizacin de un extracto de lpulo tal como se dene en la reivindicacin 9 o 10, o de un preparado farmacutico segn la reivindicacin 11 0 12 para la preparacin de un medicamento para la prolaxis y terapia de estados patolgicos provocados por una deciencia de estrgenos o por una disregulacin del metabolismo de las hormonas sexuales, especialmente del metabolismo de los estrgenos, seleccionados del grupo constituido por molestias climatricas, hiperplasia benigna de prstata, osteoporosis, enfermedad de Alzheimer y enfermedades cardio-circulatorias. 14. Utilizacin de un extracto de lpulo tal como se dene en la reivindicacin 9 o 10, o de un preparado farmacutico segn la reivindicacin 11 o 12 para la preparacin de un medicamento para la prolaxis de enfermedades cancergenas dependientes de las hormonas sexuales. 15. Utilizacin segn la reivindicacin 14, seleccionndose las enfermedades cancergenas dependientes de las hormonas sexuales del grupo de cncer de mama, cncer de prstata y cncer de tero.

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