EXPERIMENTO 2

METODOS CUANTITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS

REQUISITOS Repasar las estructuras de los 20 L- aminocidos (AA), que forman las protenas y las caractersticas de las protenas.

OBJETIVOS Identificar por mtodos colorimetritos los 20 L- aminocidos (AA), que forman las protenas, basados en las reacciones de los grupos R

1. FUNDAMENTOS Por la estructura peptdica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes originndose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de las protenas. Por presentarse variaciones en la composicin de los aminocidos de las diferentes protenas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reaccin, ntimamente relacionado con la naturaleza de la protena analizada. 1.1 1.1.1 Fundamentos qumicos de las pruebas. Prueba de la ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno).

Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparicin de un color violceo o amarillo. Debido a que las protenas y los aminocidos, poseen esta caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloracin caracterstica, aparentemente debido a una oxidacin y reduccin intramolecular de la ninhidrina en presencia de amonaco. Los aminocidos porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rpidamente a amarillo. La reaccin se muestra en la figura 1 27

Figura 1 Reaccin de la prueba de la ninhidrina

CO C CO OH R + H H C OOH Ninhidrina 2 H 2O Aminocido N CH

OH

CO C CO N

R CH C OOH

CO C CO

H N

R C C OOH

(BASE DE SCHIFF) R CO C CO N H2 H
+

C H

H 2O O C O2

(2-amino-1,3-dicetohidrindeno)

CO C CO Ninhidrina

CO H + NH2 2 H2O CO C

OH OH

(2-amino-1,3-dicetohidrindeno)

CO C HN CO C

OC OC

(Ninhidrina-dicetohidrindeno) color violeta

1.1.2

Prueba de Biuret

Es una prueba general para polipptidos y protenas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparicin de una coloracin violeta. La formacin de un complejo de coordinacin entre los cationes cpricos en medio alcalino con las uniones peptdicas. 28

Figura 2 Reaccin de la prueba de Biuret

OH CO NH CO NH 2 OH
1.1.3 Prueba de coagulacin:

OH Cu NH2 HN K K
2H N

NH2

CO

OC

OH

Es una prueba para identificar: albminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la formacin de un cogulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reaccin, se cree que ocurre cierta deshidratacin de la molcula proteica. 1.1.4 Prueba de Sulfato de amonio: Las protenas, como otros coloide son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio[NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitacin se debe a la neutralizacin y deshidratacin de la molcula, seguida de agregacin y precipitacin. 1.1.5 Prueba xantoprotica: Es una reaccin que reconoce los aminocidos que poseen el grupo bencnico (tirosina, fenilalanina, triptfano). Las protenas que tienen en su composicin estos aminocidos tambin darn la reaccin. La positividad se reconoce por la aparicin de un color amarillo o verde debido a la formacin de nitrocompuestos. 1.1.6 Prueba de los grupos SH:

Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contiene, se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris. La figura siguiente muestra dicha reaccin. 29

Figura 3. Reaccin de la prueba de los grupos SH

CH2 CHNH2 COOH

CH2 CHNH2 COOH 2 NaOH

CH2OH CHNH2 SNa2 + COOH (Serina

(Lanteonina) O SNa2 + H3C H3C C O O O Pb

SPb + 2 CH3COONa

(Acetato de plomo)
1.1.7

(Negro)

Prueba de Sakaguchi:

Es una prueba para identificar arginina y se usa para identificar protenas ya que casi todas las protenas poseen ese aminocido. El desarrollo de un color rojo marca la reaccin positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la arginina. (Figura 4) Figura 4 Grupo guanidina

NH H 2N C NH (Grupo guanidina)
1.1.8 Prueba de Hopkins-Cole: Es para identificar el triptfano y las protenas que lo contienen. La positividad se reconoce por la aparicin de un anillo color violeta-rojizo. La reaccin es la siguiente (figura 4) 30

Figura 5 Reaccin de la prueba de Hopkins-Cole

O CH2 N (Triptfano) H2O H2SO4 O NH CH2 C H (alfa-iminoglioaxil-beta-indolproponico)

1.1.9 Prueba de Milln:

CH NH2

COOH +

COOH (Acido g

O C H

C COOH

La reaccin es debida a la presencia del grupo hidroxifenlico (-C6H4OH) en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico no sustituido en la posicin 3,5, como la tirosina, fenol y timol, dan positiva la reaccin. El mecanismo de la reaccin es poco conocido, posiblemente se deba a la formacin del complejo oxido de mercurio y fenol. 2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Materiales Tubos de ensayo, mechero y pinzas de madera

31

2.2 Mtodos Prueba Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Volumen

2.21. P. Ninhidrina: (Hidrato de Sustancia problema tricetohidrindeno al 0.1 %) Reactivo ninhidrina Calentar hasta ebullicin por 1 min. Deje enfriar y observe 2.2.2. Sustancia problema P. Biuret: NaOH al 10 % Mezclar e ir aadiendo gota a gota el sulfato cprico al 0.5 % (CuSO4), agitando despus de cada adicin, hasta la aparicin de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica la reaccin positiva. 2.2.3. Sustancia problema P. Coagulacin cido actico al 30 % (CH3COOH) Solucin saturada de Cloruro de sodio (NaCl) Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. En el caso de la albmina o la globulina se presenta un enturbamiento mas o menos intenso que persiste al enfriamiento, tambin puede observarse pequeos grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro. 2.2.4. P. Sulfato de Sustancia problema amonio (NH4SO4) Solucin de Sulfato de amonio al 50 % Mezclar bien Dejar en reposo durante 10 min.. Observe si se forma un precipitado. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 min., observar. La reaccin positiva se manifiesta por la formacin de un precipitado, dependiendo directamente de la concentracin de albmina presente en la muestra. 2.2.5. P. Xantoprotica Sustancia problema cido ntrico concentrado (HNO3) Mezclar bien Calentar a la llama y observar

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

2 ml 4 gotas 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 0.5 ml

32

Prueba 2.2.6. P. Grupos SH

Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH) Acetato de Plomo Mezclar bien Calentar a la llama por 4 min. Mezclando continuamente y observar Sustancia problema Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH) Naftol Hipoclorito de sodio al 2 % Mezcal bien y observar. Sustancia problema Reactivo de Hopkins- Cole (Preparacin: 10 mg de magnesio en 250 ml de cido oxlico, se completa a 1litro con agua destilada) cido sulfrico concentrado (H2SO4), se deja caer lentamente por las paredes del tubo, observar.

Volumen 1 ml 1 ml 1 ml

2.2.7. P. Sakaguchi

2 ml 5 gotas 8 gotas 10 gotas 1 ml

2.2.8. P. Hopkins-Cole

3 ml 1 ml 2 ml 2.2.9. P. Milln

Sustancia problema Reactivo de Milln (Preparacin: Hg y HNO3 En una proporcin de 1:3, diluir con 2 volmenes de agua la solucin resultante.

4 gotas

3. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

AUTO-EVALUACIN. Diga cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas. Cuales son las aplicaciones prcticas de las pruebas. Para el siguiente pentapptido, diga cuales pruebas y porque sern positivas. (ALAVAL-GLY-GLU-LYS) Defina los siguientes trminos: aminocidos, protenas, anlisis cualitativo, cuantitativo. Dibuje los 20 L- - AA y clasifquelos segn la polaridad de sus grupos -R. Efectu un enlace peptdico.

33

2.3

Marcha analtica SUSTANCIA DESCONOCIDA Prueba Ninhidrina (-) incolora No es protena ni aminocido (+) Violeta o amarillo claro protena, polipptido o aminocido (+) Rojo o amarillo fuerte Hidroxiprolina o prolina

Prueba Biuret (-) Azul o amarillo aminocidos P. Xantoprotica (+) Violeta Protenas y polipptidos P. Coagulacin

(-) Incoloro Otros aminocidos

(+) Amarillo, naranja o verde Tirosina, fenilalanina o triptfano

(-) No cuagula Histonas, protaminas o polipptidos

(+) Cuagula Albminas o glubulinas P. Sulfato de amonio

P. Hopkins-Cole

(+) Azul o violeta Triptfano

(-) Incoloro Tirosina o Fenilalanina P. Milln

(+) Precipita Globulinas

(-) No Precipita Albminas

Grupo SH

(+) Rojo Tirosina

(-) Incoloro Fenilalanina (-) Incolora Otros aminocidos (+) Rojo Arginina 34

P. Sakaguchi (-) Incoloro otros aminocidos

(+) Negro o gris Cistena, cistina, metionina

4. ANEXO ESTRUCTURA Y ALGUNAS PROPIEDADES DE LOS AMINOACIDOS 4.1 Aminocidos no polares: Grupo R pKa' pKa' pKa' Nombre + Abreviacin R -COOH -NH3 PM Alanina, Ala (A) 89 Valina, Val (V) 117 Leucina, Leu (L) 131 Isoleucina, Ile (I) 131 Prolina, Pro (P) 115 CH3 CH3 CH CH3 CH3 CH CH3 CH3 CH2 CH CH3 2,34 9,69

pI

6,00

2,32

9,62

5,96

2,36

9,60

5,98

CH2

2,36

9,60

6,02

1,99 N H COO
-

10,60

6,30

Metionina, Met (M) 149 Fenilalanina, Phe F 165 Triptofano, Trp (W) 204

CH3

S CH2

CH2

2,28

9,21

5,74

CH2

1,83

9,13

5,48

CH2 N H

2,83

9,39

5,89

35

4.2

Aminocidos polares: Grupo R Nombre Abreviacin PM Glicina, Gly (G) 75 Serina, Ser (S) 105 Treonina, Thr (T) 119 Cisteina, Cys (C) 121 Tirosina, Tyr (Y) 181 Asparagina, Asn (N) 132 Glutamina, Gln (Q) 146 H

pKa' -COOH 2,34

pKa' -NH3+ 9,60

pKa' R

pI

5,97

CH2

OH

2,21

9,15

5,68

CH3

CH2

OH

2,63

10,43

5.,0

CH2

SH

1,71

10,78

8,33

5,07

2,20 HO CH2

9,11

10,07 5,66

O NH2 O NH2 C CH 2 CH2 C CH2

2,02

8,80

5,41

2,17

9,13

5,65

36

4.3

Aminocidos acdicos: Grupo R pKa' -COOH 2,09 pKa' pKa' R -NH3+ 9,82 3,86 pHI

Nombre Abreviacin PM Acido Asprtico, Asp (D) 133 Acido Glutmico, Glu (E) 147 4.4

O
-

2,7

O C CH2 O 2,19 CH2 9,67 4,25 3,22

O C CH 2

Aminocidos Bsicos: Grupo R pKa' -COOH 2,18 pKa' pKa' R -NH3+ 8,95 pI

Nombre Abreviacin PM Lisina, Lys (K) 146 Arginina, Arg (R) 174 Histidina, His (H) 155 NH3
+

CH2CH2CH2CH2
+

10,53 9,74

NH2 NH2

C NH CH2CH2CH2

2,17

9,04

12,48 10,76

CH2 HN
+

1,82

9,17

6,00

7,8

NH

37

5.

INFORME 2 (PRUEBAS CUALITATIVAS PARA AMINOCIDOS Y PROTEINAS) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo Informe Definitiva

Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada

1. Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. En la casilla N0 Muestra, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para reportar la positividad o negatividad de la reaccin. Sobre la base de los resultados de sus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema y escribir la composicin mas resaltante en las casillas correspondientes. N0 Muestra P. Ninhidrina P. Biuret P. Coagulacin P. Sulfato amonio P. Xantoprotica P. Grupos SH P. Sakaguchi P. Hopkins-Cole P. Milln Nombre de la muestra problema Composicin de la sustancia identificada

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas. 38