Biorremediaççao de Oleo Diesel

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Instituto de Geocincias e Cincias Exatas Campus de Rio Claro
AVALIAO DO POTENCIAL DE BIORREMEDIAO DE SOLOS E DE GUAS SUBTERRNEAS CONTAMINADOS COM LEO DIESEL
Adriano Pinto Mariano
Orientador: Prof. Dr. Daniel Marcos Bonotto Co-orientadora: Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis
Tese de Doutorado elaborada junto ao Programa de Ps-Graduao em Geocincias e Meio Ambiente, para obteno do Ttulo de Doutor em Geocincias e Meio Ambiente.
Rio Claro (SP) Dezembro/2006
551.49 Mariano, Adriano Pinto M333a Avaliao do potencial de biorremediao de solos e de guas subterrneas contaminados com leo diesel / Adriano Pinto Mariano. Rio Claro : [s.n.], 2006 162 f. : il., tabs. Tese (doutorado) Universidade Estadual Paulista, Instituto de Geocincias e Cincias Exatas Orientador: Daniel Marcos Bonotto 1. guas subterrneas. 2. Biorremediao. 3. Postos de combustveis. 4. Vinhaa. 5. Biossurfactante. I. Ttulo.
Ficha Catalogrfica elaborada pela STATI Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP
Comisso examinadora
Prof. Dr. Daniel Marcos Bonotto Unesp/IGCE/Rio Claro
Prof. Dr. Carlos Renato Corso Unesp/IB/Rio Claro
Prof. Dr. Bruno Coraucci Filho Unicamp/FEC/Campinas
Profa. Dra. Cassiana Maria Reganhan Coneglian Unicamp/Ceset/Limeira
Dra. Aurora Mariana Garcia de Frana Souza Cetesb/Piracicaba
Adriano Pinto Mariano
Rio Claro, 13 de Dezembro de 2006.
Resultado: Aprovado com Louvor
Ao meu pai
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La utopa est en el horizonte. Camino dos pasos, ella se aleja dos pasos y el horizonte se corre diez pasos ms all. Entonces para que sirve la utopa? Para eso, sirve para caminar (Eduardo Galeano)
On ne voit bien qu'avec le coeur. L'essentiel est invisible pour les yeux (Saint-Exupry)
We live in a world where we have to hide in order to make love, while violence is practiced in broad daylight (John Lennon)
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Daniel Marcos Bonotto por toda confiana depositada em mim em todas as etapas desse trabalho. Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis, no apenas pela orientao, mas tambm por todo seu carinho, apoio e oportunidades. Um exemplo a ser seguido. Universidade Estadual Paulista (UNESP). Ao Instituto de Geocincias e Cincias Exatas (IGCE). Ao Instituto de Biocincias (IB) e ao Departamento de Bioqumica e Microbiologia Aplicada, pela infraestrutura oferecida. Ao Programa de Formao de Recursos Humanos (PRH-05) da Agncia Nacional do Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis, pela bolsa de estudos, por todo apoio financeiro e pelos cursos oferecidos. Ao Prof. Dr. Dimas Dias Brito, coordenador do PRH-05, pela bolsa de estudos e confiana. Aos membros das bancas de Exame de Qualificao (Dr. Lus Tadeu Furlan e Dra. Aurora Mariana G. de Frana Souza) e de defesa de Tese (Prof. Dr. Carlos Renato Corso, Prof. Dr. Bruno Coraucci Filho, Profa. Dra. Cassiana Maria R. Coneglian e Dra. Aurora Mariana G. de Frana Souza) pelas sugestes e correes. Geoinform Pesquisas Geolgicas S/C Ltda e aos proprietrios dos postos de combustveis pelo acesso s reas de estudo. Usina Santa Lucia pelo fornecimento de vinhaa. Petrobras pelo fornecimento de material biolgico. Ao Prof. Dr. Jonas Contiero pelo uso das instalaes do Laboratrio de Microbiologia Industrial (LMI). Dra. Ana Paula de A. G. Kataoka pelo material biolgico.
Ao Laboratrio de Qumica Ambiental do Instituto de Qumica da USP de So Carlos (IQSC) pelas anlises cromatogrficas. Biloga Renata de Melo Peixoto pelas instrues relativas ao indicador DCPIP. Aos professores Edrio Dino Bidia, Jos Carlos Marconato e Sandra Mara Martins Franchetti, pela oportunidade de trabalho como professor bolsista e pela orientao e ajuda. Ao Bruce Tessari por sua ajuda nos trabalhos de campo e pela amizade. Aos tcnicos e funcionrios do Departamento de Bioqumica e Microbiologia Aplicada, ngela (tcnica), Ins, Maria Luiza, Beto, ngela (secretria), Nega, Ronaldo, pela ajuda e amizade. Ao Zito, pelas anlises de toxicidade, dicas e amizade. Ao Jos Maria Cazonatto, secretrio do PRH-05, pela ajuda e amizade. Maria Paula, minha grande amiga, parceira de trabalho e congressos. Ao amigo Srgio Crivelaro pela ajuda e, claro, por sua amizade. Aos bolsistas do PRH-05, companheiros de cursos, de congressos, de sala. Michely Perez pelo seu carinho e pela grande ajuda na coleta de solo. Aos amigos Edi, Di, Allan e meu irmo, pelos momentos de descontrao. Emma-Jane Toovey, fonte de inspirao no momento mais importante desse trabalho. E por fim, mas o mais importante, minha famlia, pelo apoio incondicional.
SUMRIO
ndice.......................................................................................................... i ndice de Tabelas....................................................................................... iii ndice de Figuras........................................................................................ iv Resumo....................................................................................................... vi Abstract...................................................................................................... vii 1 Introduo e Objetivos.......................................................................... 1 2 - Reviso da Literatura............................................................................. 7 3 - Material e Mtodos................................................................................ 45 4 - Resultados e Discusso......................................................................... 70 5 - Concluses............................................................................................. 123 6 - Referncias Bibliogrficas.................................................................... 125
NDICE
1 INTRODUO E OBJETIVOS................................................................................................................... 1 1.1 Introduo............................................................................................................................................ 1 1.2 Objetivos............................................................................................................................................. 5 2 REVISO DA LITERATURA...................................................................................................................... 2.1 Combustveis derivados do petrleo .................................................................................................. 2.2 Hidrocarbonetos como fonte de contaminao da subsuperfcie........................................................ 2.2.1 Origens e conseqncias........................................................................................................ 2.2.2 Dinmica dos hidrocarbonetos em subsolo .......................................................................... 2.3 Tcnicas de remediao aplicadas a reas contaminadas.................................................................... 2.3.1 Conceitos envolvidos na biorremediao.............................................................................. 2.3.1.1 Ao dos microrganismos.................................................................................... 2.3.1.2 Processos de biorremediao in situ................................................................. 2.3.1.3 Caracterizao do local para implementao da biorremediao in situ.......... 2.3.1.4 Condies hidrogeolgicas que influenciam a biorremediao ...................... 2.4 Biodegradabilidade dos hidrocarbonetos BTEX................................................................................. 2.5 Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos............................................................................. 2.6 Mtodos de avaliao da biodegradao em laboratrio..................................................................... 2.7 Processo de intemperizao do leo diesel......................................................................................... 2.8 Produo de biossurfactantes utilizando-se matrias primas alternativas........................................... 2.9 Vinhaa................................................................................................................................................ 3 MATERIAL E MTODOS............................................................................................................................ 3.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB.................. 3.1.1 Descrio da rea................................................................................................................... 3.1.2 Amostragem de gua subterrnea.......................................................................................... 3.1.3 Anlises fsico-qumicas........................................................................................................ 3.1.4 Anlises microbiolgicas....................................................................................................... 3.2 Amostragem de solo nos postos de combustveis............................................................................... 3.2.1 Postos de combustveis ASP e SB......................................................................................... 3.2.2 Posto de combustveis RC..................................................................................................... 3.3 Anlises realizadas nos solos.............................................................................................................. 3.3.1 Caracterizao fsico-qumica............................................................................................... 3.3.2 Anlise cromatogrfica.......................................................................................................... 3.3.3 Contagem de bactrias heterotrficas totais.......................................................................... 3.4 Respirometria...................................................................................................................................... 3.5 Avaliao de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas ao solo ASP...................................... 3.5.1 Preparo do inculo................................................................................................................. 3.5.2 Testes de toxicidade aguda.................................................................................................... 3.6 Avaliao da tcnica de bioaumento aplicada a solos......................................................................... 3.6.1 Microrganismos..................................................................................................................... 3.6.2 Preparo dos inculos.............................................................................................................. 3.7 Avaliao do efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas............. 3.7.1 Caracterizao da vinhaa..................................................................................................... 3.7.2 Experimento respiromtrico.................................................................................................. 3.7.3 Experimentos com gua subterrnea................ .................................................................... 3.8 Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado.................................. 7 7 8 8 10 13 16 16 17 27 28 30 34 38 40 42 43 45 45 45 47 48 49 50 50 50 51 51 52 52 52 55 55 56 56 58 58 59 59 59 60 62
3.8.1 Microrganismos..................................................................................................................... 3.8.2 Preparo dos inculos.............................................................................................................. 3.8.3 Preparo do teste...................................................................................................................... 3.8.4 Experimento respiromtrico.................................................................................................. 3.8.5 Composio dos leos diesel................................................................................................. 3.9 Produo de biossurfactante utilizando-se leo diesel intemperizado................................................ 3.9.1 Preparo dos inculos.............................................................................................................. 3.9.2 Condies de cultivo.............................................................................................................. 3.9.3 Medidas de tenso superficial................................................................................................ 3.9.4 Verificao de bioemulsificadores........................................................................................ 3.9.5 Aplicao de ultrasom........................................................................................................... 4 - RESULTADOS E DISCUSSO..................................................................................................................... 4.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB.................. 4.2 Caracterizao das amostras de solos.................................................................................................. 4.3 Avaliao de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas ao solo ASP...................................... 4.4 Avaliao da tcnica de bioaumento aplicada a solos......................................................................... 4.4.1 Teste de biodegradabilidade do leo diesel........................................................................... 4.4.2 Experimentos respiromtricos............................................................................................... 4.5 Avaliao do efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas............. 4.5.1 Experimento respiromtrico.................................................................................................. 4.5.2 Experimentos com gua subterrnea..................................................................................... 4.6 Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado.................................. 4.6.1 Composio dos leos diesel................................................................................................. 4.6.2 - Teste de biodegradabilidade: indicador redox DCPIP........................................................... 4.6.3 Experimento respiromtrico.................................................................................................. 4.7 Produo de biossurfactante utilizando-se leo diesel intemperizado................................................
63 64 65 65 66 66 66 66 67 67 68 70 70 76 77 84 84 85 100 101 106 110 110 114 116 120
5 CONCLUSES............................................................................................................................................... 123 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................................................... 125
ii
NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona no saturada.................................................. Tabela 2.2 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona saturada......................................................... Tabela 3.1 Experimento respiromtrico. Condies experimentais geradas pelo Planejamento Fatorial Completo - 23. Tempo de incubao de 55 dias. ............................................................................. Tabela 3.2 Experimento respiromtrico: Parte 1 solos ASP e SB. Tempo de incubao de 57 dias............... Tabela 3.3 Experimento respiromtrico: Parte 2 solo RC. Tempo de incubao de 92 dias........................... Tabela 3.4 Experimento respiromtrico: Parte 3 solo ASP (bioaumento com o inculo comercial EM). Tempo de incubao de 48 dias. ...................................................................................................... Tabela 3.5 Experimento respiromtrico: adio de vinhaa ao solo. Tempos de incubao de 48 dias (tratamentos 1 6) e 47 dias (tratamentos 7 10) .......................................................................... Tabela 3.6 Experimento com gua subterrnea simulando condio no aerada............................................... Tabela 3.7 Experimento com gua subterrnea simulando condio aerada...................................................... Tabela 3.8 Experimento respiromtrico: Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado (ASP) ....................................................................................................................... Tabela 3.9 Resumo das condies experimentais (produo de biossurfactante)............................................... Tabela 4.1 Parmetros fsicos e qumicos avaliados nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006.................................................................................................................... Tabela 4.2 Concentrao de BTEX nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006.................................................................................................................................... Tabela 4.3 Concentrao de hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPA) nas amostras de gua subterrnea coletadas em abril de 2006 nos poos de monitoramento SB1; SB2 e SB3................. Tabela 4.4 Caracterizao das amostras de solos................................................................................................ Tabela 4.5 Valores de pH e consumo de nitrognio e fsforo no final do experimento respiromtrico............ Tabela 4.6 Teste de toxicidade aguda empregando Daphnia similis.................................................................. Tabela 4.7 Teste de biodegradabilidade do leo diesel usando o indicador DCPIP.......................................... Tabela 4.8 Concentrao de hidrocarbonetos nos solos ASP e SB.................................................................... Tabela 4.9 Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos experimentos 1 ao 6. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%)..................................................................... Tabela 4.10 Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos experimentos com o solo RC. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%)...................................................... Tabela 4.11 Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos experimentos com o solo ASP (parte 3). Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%).......................... Tabela 4.12 Valores de pH, nitrognio e fsforo nos experimentos respiromtricos......................................... Tabela 4.13 Caracterizao fsico-qumica da vinhaa....................................................................................... Tabela 4.14 Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos experimentos. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%)........................................................................... Tabela 4.15 Valores de pH, e contedo de nitrognio e potssio no experimento respiromtrico..................... Tabela 4.16 Experimento com a gua subterrnea condio no aerada......................................................... Tabela 4.17 Experimento com a gua subterrnea condio no aerada concentrao de BTEX (g.L-1).. Tabela 4.18 Experimento com a gua subterrnea condio no aerada concentrao de HPA (g.L-1)..... Tabela 4.19 Experimento com a gua subterrnea condio aerada.............................................................. 15 15 55 56 57 58 60 61 62 65 69 70 71 72 77 83 84 85 90 91 95 99 100 100 105 106 107 108 108 109 109 110 111 112 112 115 116
Tabela 4.20 Experimento com a gua subterrnea condio aerada concentrao de BTEX (g.L-1)........ Tabela 4.21 Experimento com a gua subterrnea condio aerada concentrao de HPA (g.L-1).......... Tabela 4.22 Concentrao de BTEX nos leos diesel........................................................................................ Tabela 4.23 Concentrao de HPA nos leos diesel........................................................................................... Tabela 4.24 Concentrao de HTP nos leos diesel........................................................................................... Tabela 4.25 Teste de biodegradabilidade (DCPIP) em tubos de ensaio............................................................. Tabela 4.26 Teste de biodegradabilidade (DCPIP) em frascos erlenmeyer ....................................................... Tabela 4.27 Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) do experimento respiromtrico 1. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%)............................................... 120 Tabela 4.28 Medidas de tenso superficial....................................................................................................... 121
iii
NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1 Diferentes fases presentes na zonas insaturada e saturada do solo (Fonte: GUIGUER, 2000)......... Figura 2.2 Evoluo da contaminao por hidrocarbonetos de combustveis em subsuperfcie (Fonte: USEPA, 2003b) .................................................................................................................. Figura 3.1 Mapa da rea e localizao dos poos de monitoramento (Posto SB)............................................. Figura 3.2 Coleta de amostra de gua subterrnea com amostrador bailer descartvel (posto SB)................... Figura 3.3 Realizao da sondagem com trado rotativo manual (Posto SB)...................................................... Figura 3.4 Coleta de solo no posto RC............................................................................................................... Figura 3.5 Esquema de um respirmetro de Bartha e Pramer............................................................................ Figura 3.6 Respirmetros de Bartha e Pramer.................................................................................................... Figura 3.7 Experimento com gua subterrnea (condio no aerada) ............................................................. Figura 3.8 Experimento com gua subterrnea (condio aerada) .................................................................... Figura 3.9 Fase livre (leo diesel) na gua subterrnea do posto ASP............................................................... Figura 3.10 Tensimetro Krss K6..................................................................................................................... Figura 4.1 Diagrama de Piper efetuado a partir de dados obtidos com a coleta de amostras de gua subterrnea realizada em Abril de 2005 (2 coleta)........................................................................ Figura 4.2 Contagem de bactrias heterotrficas totais nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006. ........................................................................................................ Figura 4.3 Produo acumulada de CO2 durante a incubao. Cada barra de erro representa 1 desvio padro de trs rplicas................................................................................................................................... Figura 4.4 Produo diria de CO2 durante a incubao.................................................................................... Figura 4.5 Eficincia de biodegradao os experimentos obtida atravs de dados respiromtricos. Cada barra de erro representa 1 desvio padro de trs rplicas............................................................ Figura 4.6 Diagrama de Pareto gerado a partir das condies experimentais.................................................... Figura 4.7 Eficincia de remoo de hidrocarbonetos........................................................................................ Figura 4.8 Populao de bactrias heterotrficas totais presentes no solo nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico.............................................................................................................. Figura 4.9 Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 1) ............................... Figura 4.10 Produo acumulada de CO2 durante incubao dos tratamentos (ASP parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas................................................... Figura 4.11 Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (SB parte 1) ............................. Figura 4.12 Produo acumulada de CO2 durante incubao dos tratamentos (SB parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas................................................. Figura 4.13 Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (ASP parte 1) Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas............ Figura 4.14 Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (SB parte 1) Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas............... Figura 4.15 Anlise cromatogrfica (HTP) no tempo final dos tratamentos com os solos ASP (1 ao 3) e SB (4 ao 5). Fatores de diluio: 50x (1; 2 e 3); 20x (4 e 6); 10x (5)................. Figura 4.16 Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (RC parte 2)................................ Figura 4.17 Produo acumulada de CO2 durante a incubao dos tratamentos (RC parte 2). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.................................................. Figura 4.18 Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (RC parte 2). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.................. Figura 4.19 Anlise cromatogrfica (HTP) nos tempos inicial e final dos tratamentos com o solo RC (8 ao 11). Fatores de diluio: 20x (inicial e 8); 10x (9 ao 12).............................................................. Figura 4.20 Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 3)........................... Figura 4.21 Produo acumulada de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 3). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas....................................................................... Figura 4.22 Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (ASP parte 3). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas................................. Figura 4.23 Contagem de bactrias heterotrficas totais no incio e final dos experimentos respiromtricos... Figura 4.24 Anlise cromatogrfica (HTP) no incio e final dos tratamentos com o solo ASP (13 e 14). Fatores de diluio: 10x (inicial); 1x (13 e 14)................................................................................ Figura 4.25 Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 1 (solo RC) e 2 (solo RC + vinhaa) 11 13 47 48 50 51 53 53 61 62 63 67 73 75 77 77 79 79 82 83 86 86 87 87 88 89 92 93 93 94 95 97 97 98 98 99 102
iv
Figura 4.26 Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 3 (solo RC + leo diesel intemperizado) e 4 (solo RC + leo diesel intemperizado + vinhaa). .......................................... Figura 4.27 Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 5 (solo RC + leo diesel comercial) e 6 (solo RC + leo diesel comercial + vinhaa)............................................................................ Figura 4.28 Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 7 (solo ASP) e 8 (solo ASP + vinhaa) .......................................................................................................................................... Figura 4.29 Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 9 (solo SB) e 10 (solo SB+ vinhaa) Figura 4.30 Contagem de bactrias heterotrficas totais nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico................................................................................................................................. Figura 4.31 Anlise cromatogrfica (BTEX) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: 1x....................................................................................................................... Figura 4.32 Anlise cromatogrfica (HPA) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: respectivamente:1x e 10x................................................................................... Figura 4.33 Anlise cromatogrfica (HTP) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: 50x.................................................................................................................................... Figura 4.34 Descolorao do indicador redox DCPIP durante teste de biodegradabilidade do leo diesel comercial pela bactria P. aeruginosa LBI (frasco 2). Frasco 1: controle do substrato (sem inculo) ..........................................................................................................................................
102 103 103 104 104 113 113 114
116 Figura 4.35 Produo diria de CO2 durante a incubao (experimento 1). ..................................................... 117 Figura 4.36 Produo acumulada de CO2 (experimento 1) durante a incubao. Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.................................................................................. 118 Figura 4.37 Produo diria de CO2 durante a incubao: 48 dias (experimento 1) e 92 dias (experimento 2) 118 Figura 4.38 Produo acumulada de CO2 nos experimentos 1 (48 dias) e 2 (92 dias) durante incubao. Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.................................................... 119 Figura 4.39 Contagem de bactrias heterotrficas totais nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico 1.............................................................................................................................. 120
Resumo
Nesta pesquisa foram temas de estudo diversos aspectos relacionados tcnica de biorremediao de solos e guas subterrneas contaminados com hidrocarbonetos. A partir de amostras de solo e gua subterrnea coletadas em diferentes postos de combustveis, avaliouse a biorremediao natural da gua subterrnea em local onde ocorreu vazamento de leo diesel, mediante o monitoramento de indicadores geoqumicos durante 2 anos. Diferentes tcnicas de biorremediao (bioestimulao com a adio de nutrientes e de um surfactante e bioaumento (injeo de microrganismos)) foram comparadas quando aplicadas isoladas e em conjunto a solos contaminados com leo diesel e comparou-se a capacidade de diferentes microrganismos em biodegradar leo diesel comercial e intemperizado. Conciliando a biorremediao com a prtica atual no gerenciamento ambiental de reutilizao de resduos, avaliou-se o efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas contaminados com leo diesel e investigou-se a capacidade de diferentes culturas de bactrias em utilizarem leo diesel intemperizado como matria prima para produo de biossurfactante. O mtodo respiromtrico de Bartha e Pramer foi utilizado nos experimentos em que foi averiguada a biodegradao em solos e, no caso da gua subterrnea, frascos de DBO e reatores aerados. Experimentos de biodegradabilidade dos leos diesel foram realizados com a tcnica do indicador redox DCPIP e o monitoramento da produo de biossurfactantes foi realizado com medidas de tenso superficial, segundo o mtodo do anel de De Nuy, empregando-se o tensimetro Krss K6. A partir do monitoramento dos indicadores geoqumicos, foi possvel identificar fatores que corroboram a eficincia da tcnica de biorremediao natural para o tratamento da gua subterrnea na rea de estudo. Os experimentos respiromtricos demonstraram a importncia do balanceamento nutricional e que nenhum ganho em termos de aumento de eficincia de biodegradao foi obtido com a tcnica do bioaumento. O uso da vinhaa em processos de biorremediao mostrou-se ineficiente nas condies estudadas. Os resultados com os experimentos de biodegradabilidade demonstram a importncia de se considerar o efeito de intemperizao dos poluentes na determinao acurada de taxas de biodegradao. Finalmente, no foi possvel, nas condies estudadas, constatar a produo de biossurfactantes utilizando-se leo diesel intemperizado como matria prima. Palavras chaves: biorremediao, postos de combustveis, leo diesel, vinhaa,
biossurfactante.
vi
Abstract
In this research, different aspects related to the bioremediation technique of soils and groundwaters contaminated with hydrocarbons were considered. From soil and groundwater samples collected at different petrol stations, the natural bioremediation of the groundwater, where a diesel oil leakage took place, was evaluated by monitoring geochemical indicators for 2 years. Different bioremediation techniques (biostimulation with addition of nutrients and a surfactant and bioaugmentation (injection of microorganisms)) were compared when applied individually or grouped to contaminated soils with diesel oil and the capability of different microorganisms to biodegrade commercial and weathered diesel oil was compared. Considering the current environmental management practice of reusing residues, the effects of the vinasse in the bioremediation of soils and groundwaters contaminated with diesel oil was evaluated and the capability of different bacterial cultures to use weathered diesel oil as raw material to produce biosurfactant was investigated. The Bartha & Pramer respirometric method was employed in the biodegradation experiments with soils, and, in the case of the groundwater, BOD flasks and aerated reactors. The experiments testing the biodegradability of diesel oils were carried out using the DCPIP redox indicator technique and the monitoring of the biosurfactant production by superficial tension measurements, according to the De Nuy ring method, and employing the Krss K6 tensiometer. From the monitoring of the geochemical indicators, it was possible to identify factors that support the efficiency of the natural bioremediation technique for the treatment of the groundwater at the area of study. The respirometric experiments demonstrated the importance of the soil nutritional balance and that no gain in terms of increasing the biodegradation efficiency was obtained with the bioaugmentation technique. The use of the vinasse in bioremediation processes showed to be inefficient at the studied conditions. The results from the biodegradability experiments demonstrate the importance of considering the weathering effect of the pollutants to determine accurately the biodegradation rates. Finally, it was not possible, at the studied conditions, verify the biosurfactant production using weathered diesel oil as raw material.
Key words: Bioremediation, petrol stations, diesel oil, vinasse, biosurfactant
vii
1 - INTRODUO E OBJETIVOS
1.1 - Introduo
A forte industrializao e o desenvolvimento econmico experimentados pelo Brasil principalmente a partir da dcada de 70, exigiram grande estruturao de toda a cadeia produtiva dos derivados do petrleo, desde novas descobertas de campos de petrleo passando pela formao de vrios plos petroqumicos e o aumento das redes de distribuio, a ponta dessa cadeia. Em 2004, segundo a Agncia Nacional do Petrleo (ANP, 2005), no Brasil existiam 13 refinarias, 48 terminais aquavirios e 26 terminais terrestres, 485 bases de distribuio, 179 distribuidoras, 33.620 postos de revenda e uma comercializao de aproximadamente 230 mil m3/dia dos principais derivados de petrleo. Diante de toda essa estrutura logstica da produo e comercializao do petrleo e de seus derivados, as preocupaes relacionadas ao potencial de contaminao de solos e guas subterrneas, principalmente por vazamentos de tanques de armazenamento subterrneos em postos de combustveis, vm crescendo. Segundo o rgo de controle ambiental paulista, a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB), em 2005 os vazamentos em postos de combustveis foram responsveis por 73 % dos casos de reas contaminadas no Estado de So Paulo, o que corresponde a 1596 reas (CETESB, 2006). Devido ao crescente nmero de descobertas de casos de vazamentos em postos de combustveis, as contaminaes de solos por hidrocarbonetos derivados de petrleo tm sido alvo de inmeras pesquisas e constitui um desafio para os profissionais que atuam no saneamento ambiental, em funo da complexidade dos fenmenos geoqumicos e bioqumicos que so catalisados a partir de sua insero no subsolo. Alm disso, tem sido
Introduo e Objetivos
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motivo de preocupao e repercusso na sociedade, pois essas contaminaes com substncias txicas podem atingir as guas subterrneas, que esto sendo ou sero usadas como fonte de abastecimento para consumo humano. Quando o combustvel atinge o solo, seus componentes separam-se em trs fases: dissolvida, lquida e gasosa. Uma pequena frao dos componentes da mistura se dissolve na gua do lenol fretico, uma segunda poro retida nos espaos porosos do solo na sua forma lquida pura como saturao residual e outra parte dos contaminantes passveis de evaporao do origem contaminao atmosfrica (NADIM et al., 1999). Portanto, uma vez estabelecida a contaminao, esta poder atuar em trs nveis diferentes: solo, gua subterrnea e atmosfera. Assim, a tarefa de avaliao da extenso, dinmica, concentrao das contaminaes, anlise de riscos e possveis estratgias de remediao torna-se complexa. Essa complexidade tambm se deve ao fato desses contaminantes representarem uma ampla composio de produtos com propriedades diferentes, sendo que a maioria caracterizase pela baixa solubilidade e relativa pouca persistncia no solo. No caso de combustveis como a gasolina e o leo diesel, os hidrocarbonetos monoaromticos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos, chamados coletivamente como compostos BTEX, so os constituintes que tm maior solubilidade em gua e, portanto, so os contaminantes com maior potencial de poluir o lenol fretico. Dentre os BTEX, o benzeno considerado o mais txico. Para o benzeno, o padro de potabilidade para gua de abastecimento pblico de 5 g/l (BRASIL, LEIS, etc., 2004). Este produto em exposies crnicas pode causar leucopenia, cncer, vertigens, tremores e afetar o sistema nervoso central (PENNER, 2000). A interao dos hidrocarbonetos com o fluxo fretico, com os argilo-minerais e com a matria orgnica presentes no solo complexa do ponto de vista fsico e qumico. Mais ainda, sendo produtos orgnicos de possvel converso, as aes biolgicas que se deflagram no terreno a partir da sua presena so significativas e alteram o comportamento dos contaminantes ao longo do tempo. Assim, aos profissionais que se apresentam para investigar uma contaminao por hidrocarbonetos com essas caractersticas e a partir dessas anlises proporem e executarem uma estratgia de remediao eficaz, impe-se um desafio que transcende a especialidade do geotcnico ou do gelogo. O problema, tratado na sua escala devida, tipicamente multidisciplinar e exige o domnio dos processos qumicos e biolgicos que esto inerentemente associados (AZAMBUJA et al., 2000). Diante desse cenrio, atualmente inmeras pesquisas relacionadas remediao de reas atingidas por hidrocarbonetos so realizadas com a finalidade de restaurar a qualidade 2
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dos solos e das guas subterrneas contaminadas. Vrios mtodos podem ser empregados para remover hidrocarbonetos do solo e gua subterrnea tais como extrao de vapor do solo, bombeamento e biorremediao. No h uma regra geral que determine o melhor tratamento de uma rea contaminada especfica. Cada caso deve ser analisado individualmente, avaliando suas particularidades. Tratamentos fsicos separam os contaminantes do solo sem destru-los ou modificlos quimicamente, mas apresentam muitas limitaes, destacando-se o custo alto. Quando os hidrocarbonetos percolam o solo, grande quantidade permanece sorvida na matriz (aproximadamente 50%) com isso diminuindo a eficincia de remoo. Processos biolgicos, por outro lado, so uma tecnologia promissora para remover esses contaminantes principalmente devido simplicidade e eficincia de custo quando comparados a outras alternativas (ALEXANDER, 1994). Biorremediao pode ser considerada como uma nova tecnologia para tratar locais contaminados mediante o uso de agentes biolgicos capazes de modificar ou decompor poluentes alvos. Estratgias de biorremediao incluem: a utilizao de microrganismos autctones, ou seja, do prprio local, sem qualquer interferncia de tecnologias ativas de remediao (biorremediao intrnseca ou natural); a adio de agentes estimulantes como nutrientes, oxignio e biossurfactantes (bioestimulao); e a inoculao de consrcios microbianos enriquecidos (bioaumento) (BENTO et al., 2003). O benefcio desses processos a mineralizao do poluente, isto , a transformao em gs carbnico, gua e biomassa. Recentemente, o interesse em utilizar a estratgia da atenuao natural monitorada (que inclui alm da biodegradao outros processos como adveco, diluio, disperso, soro e volatilizao) como tcnica de tratamento de guas subterrneas contaminadas com hidrocarbonetos crescente em oposio a tcnicas ativas de engenharia como a tecnologia de bombeamento e tratamento (pump-and-treat) (WALT e McNAB Jr., 1999). A biorremediao natural mostra-se interessante devido principalmente aos baixos custos, por ser uma tcnica com mnima interveno (BHUPATHIRAJU et al., 2002). A verificao da ocorrncia da biorremediao natural exige a caracterizao da geologia, hidrologia e ecologia microbiana locais, e tambm o conhecimento de processos biogeoqumicos. Para a biodegradao dos hidrocarbonetos essencial uma reao de oxireduo, em que o hidrocarboneto oxidado (doador de eltron) e um aceptor de eltron reduzido. Existem diferentes compostos que podem agir como aceptores de eltrons, entre eles o oxignio (O2), o nitrato (NO3-), os xidos de Fe (III), o sulfato (SO4-2). Assim, mediante 3
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o acompanhamento da evoluo espacial e temporal da concentrao desses indicadores geoqumicos presentes na gua subterrnea, possvel verificar como est ocorrendo a biorremediao natural de um local contaminado. Alm dos aceptores de eltrons, outras variveis podem ser relacionadas a processos biolgicos, como o pH e o potencial redox (VROBLESKY e CHAPELLE, 1994; BORDEN et al., 1995; CORSEUIL e ALVAREZ, 1996; WALT e McNAB, 1999; AZADPOUR-KEELEY et al., 1999; KAO e WANG, 2000; SILVA et al., 2002; BHUPATHIRAJU et al., 2002; RLING e VERSEVEL, 2002; HUNKELER et al., 2002, CHEON e LEE, 2004). Como limitaes da biorremediao natural so apontadas principalmente o longo tempo necessrio, o risco da pluma de contaminao no ser atenuada antes de atingir pontos de captao para abastecimento de gua (CORSEUIL e MARINS, 1997) e a aprovao pelo rgo ambiental. Neste contexto, um dos objetivos desta tese foi avaliar a biorremediao natural da gua subterrnea em um posto de combustveis, onde ocorreu vazamento de leo diesel e conseqente contaminao do solo e da gua subterrnea, mediante o monitoramento de indicadores geoqumicos. Outro ponto abordado nessa tese foi a busca de meios para acelerar a biodegradao do leo diesel presente no solo e gua subterrnea de postos de combustveis, mediante experimentos laboratoriais. A eficincia da biorremediao est associada a uma populao microbiana adaptada ao consumo dos contaminantes e como esta pode ser enriquecida e mantida no ambiente. De acordo com vrios trabalhos (KATAOKA, 2001; MULLIGAN et al., 2001; BENTO et al., 2003; RAHMAN et al., 2003), a inoculao de bactrias com habilidade em biodegradar hidrocarbonetos pode reduzir o tempo de tratamento, contudo muitos estudos mostram que esta tcnica ineficiente (APS, 1989 e 1990; TRINDADE et al. 2002; PALA et al., 2002). Assim, um dos objetivos desse trabalho foi investigar a eficincia da tcnica do bioaumento quando aplicada a solos contaminados com leo diesel. Ainda em relao tcnica do bioaumento, a avaliao preliminar da capacidade dos microrganismos em degradar os poluentes o primeiro passo a ser tomado no desenvolvimento de um projeto de biorremediao baseado nessa tcnica. Contudo, nessa fase, muitos estudos so realizados com a simulao de contaminaes, onde, por exemplo, combustvel comercial adicionado ao solo ou gua subterrnea. Esta metodologia pode resultar em concluses erradas, uma vez que os poluentes tm suas caractersticas alteradas por mecanismos fsico-qumicos e biolgicos quando expostos por longos perodos s condies ambientais, o chamado efeito de intemperizao. Assim, nessa pesquisa avaliou-se 4
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a capacidade de diferentes microrganismos em degradar leo diesel comercial em comparao a outro intemperizado que estava presente na gua subterrnea de um posto de combustveis. Finalmente, outro objetivo deste trabalho foi estudar meios de conciliar a biorremediao com uma prtica atual no gerenciamento ambiental que a reutilizao de resduos. A vinhaa um resduo gerado na indstria sucro-alcooleira, cuja disposio representa uma grande preocupao ambiental devido principalmente ao grande volume gerado. Atualmente no Brasil, a disposio desse resduo feita com a sua aplicao em plantaes, um processo chamado ferti-irrigao, como um substituinte parcial ou total de fertilizantes minerais. Considerando que a produo de etanol no Brasil est em expanso devido a uma crescente demanda interna e internacional por fontes alternativas de energia e que o solo tem uma capacidade de suporte limitada para receber a vinhaa, a busca de alternativas para tratar ou reutilizar a vinhaa crucial. Com isso, objetivando agregar mais uma possibilidade de uso da vinhaa, este trabalho investigou o potencial do uso da vinhaa como um agente estimulador da biorremediao, devido principalmente a sua composio nutricional. Outro resduo o prprio combustvel coletado aps um vazamento, como o leo diesel presente em grande volume na gua subterrnea em um dos postos de combustveis aqui considerados. A proposta de reutilizao avaliada foi o emprego do leo diesel como matria prima na produo de biossurfactantes. A viabilidade comercial dos biossurfactantes ainda limitada pelos altos custos de produo, associados a mtodos ineficientes de recuperao e ao uso de matrias primas de alto valor (NITSCHKE e PASTORE, 2002), assim, atualmente, muitos estudos relacionados aos biossurfactantes referem-se busca de fontes de matrias primas alternativas como uma das possibilidades de reduo de custos de produo.
1.2 - Objetivos
Sumarizando, este trabalho possui os seguintes objetivos: - Avaliar a biorremediao natural da gua subterrnea em um posto de combustveis, onde ocorreu vazamento de leo diesel e conseqente contaminao do solo e da gua subterrnea, mediante o monitoramento de indicadores geoqumicos e tambm a realizao de testes em laboratrio como suporte para a determinao do potencial de remoo de poluentes pelos microrganismos presentes na rea;
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- comparar diferentes tcnicas de biorremediao (bioestimulao com a adio de nutrientes e de um surfactante e bioaumento) aplicadas isoladas e em conjunto a solo contaminado com leo diesel;
- avaliar a eficincia da tcnica do bioaumento aplicada a diferentes solos contaminados com leo diesel;
- avaliar o efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas contaminados com leo diesel;
- comparar a capacidade de diferentes microrganismos em biodegradar leo diesel comercial e intemperizado;
- investigar a capacidade de diferentes culturas de bactrias em utilizarem leo diesel intemperizado como matria prima para produo de biossurfactante.
2 - REVISO DA LITERATURA
A reviso da literatura enfocou-se em trabalhos concernentes ao entendimento dos mecanismos de transporte de contaminantes orgnicos em solos e guas subterrneas, bem como s tcnicas de remediao de reas impactadas. Maior nfase dada tcnica de biorremediao e biodegradabilidade de hidrocarbonetos presentes em combustveis derivados do petrleo, devido ao tema do estudo abordado nesta pesquisa.
2.1 Combustveis derivados do petrleo

O petrleo uma mistura complexa de compostos orgnicos, na maior parte alcanos e hidrocarbonetos aromticos, com pequenas quantidades de compostos como oxignio, nitrognio e enxofre (FETTER, 1993). O processamento inicial de beneficiamento do petrleo envolve sua separao por destilao em uma srie de fraes caracterizadas pelos intervalos de temperatura e presso. Alm da destilao, numerosos processos de refinaria so utilizados para otimizar a obteno de certos produtos desejados. As fraes destiladas do petrleo podem ser classificadas em trs grupos de acordo com o nmero de tomos de carbono nas molculas (USEPA, 2003a): as gasolinas (4 a 12 tomos de carbono), os destilados mdios (9 a 20 tomos de carbono) e leos combustveis pesados (mais de 14 tomos de carbono). No Brasil, cerca de 20% do petrleo processado convertido em gasolina automotiva e 36% em leo diesel (MME-DNC, 1995). A gasolina uma mistura complexa de hidrocarbonetos hidrofbicos relativamente volteis. Os hidrocarbonetos tpicos so os compostos alifticos (alcanos, cicloalcanos, alcenos), aromticos e aditivos (FERREIRA e ZUQUETTE, 1998). Dentre os aditivos, os oxigenados como o etanol tem a funo de
Reviso da Literatura
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aumentar o ndice de octanagem da gasolina automotiva e reduzir a poluio atmosfrica. O leo diesel composto principalmente por hidrocarbonetos de cadeias simples, no ramificadas. Em relao gasolina, o leo diesel apresenta molculas com tamanho maiores de cadeias, o que confere a este combustvel maior massa especfica, menor volatilidade e menor solubilidade em gua.
2.2 Hidrocarbonetos como fonte de contaminao da subsuperfcie

2.2.1 Origens e conseqncias As preocupaes relacionadas ao potencial de contaminao de solos e guas por vazamento/derramamento de combustveis vm crescendo, sendo diversas as origens: acidentes envolvendo o transporte de combustveis por navios, caminhes ou dutos e principalmente devido a vazamentos provenientes de tanques de armazenamento subterrneos, os quais esto sujeitos a fortes processos corrosivos (SPILBORGHS, 1997). Como no Estado de So Paulo ocorreu um nmero elevado de instalaes de postos de combustveis na dcada de 70, de se supor que a vida til dos tanques de armazenamento, que no passado era estimada entre 20 e 25 anos, se extinguiu, o que pode contribuir para o aumento da ocorrncia de vazamentos. Em funo do nmero elevado de casos de vazamentos, o licenciamento ambiental dos postos de combustveis tornou-se obrigatrio, tendo a CETESB elaborado uma srie de documentos no sentido de orientar e padronizar os trabalhos nessa rea (CETESB, 2006). Pearson e Oudijk (1993) citam as principais causas de vazamentos relacionados aos sistemas de armazenamento subterrneos de combustveis (SASC) encontrados nos postos de combustveis: - Os tanques so freqentemente instalados sem nenhum cuidado, podendo provocar algum tipo de dano nas paredes; - Os tanques normalmente no sofrem nenhum tipo de manuteno, permitindo, assim, que a corroso se instale e comprometa a integridade do material. Tanques que ficam em contato direto com o solo tambm iro corroer mais rapidamente por causa da umidade e precipitao; - Quando os tanques ficam vazios ou parcialmente vazios, o lado de dentro do tanque pode corroer rapidamente;
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- Os SASC so freqentemente instalados sem a proteo catdica, e detectores de vazamentos; - Os tanques so normalmente construdos de parede simples, sem revestimento com material anti-corrosivo; - Quando os tanques so instalados em solos pedregosos e so cobertos com enchimentos reiterados ou com entulhos de construo, permitem rachaduras por pedras, que se expandem dentro de poucos anos; - Oscilaes do nvel fretico provocam condies mais favorveis para a corroso dos tanques e suas conexes quando so instalados na altura ou abaixo do nvel fretico. gua subterrnea com pH cido pode acelerar a corroso do tanque. Os problemas gerados pela contaminao do solo e da gua subterrnea por hidrocarbonetos so vrios. Sanches (1998) aponta trs problemas principais: existncia de riscos segurana das pessoas e das propriedades, riscos sade pblica e dos ecossistemas e restries ao desenvolvimento urbano e imobilirio. Segundo Gibotti (1999), a ocorrncia de vazamentos de hidrocarbonetos configura perigo constante de incndio ou exploso nos locais atingidos. Vapores de gasolina podem explodir sem ignio previa ao atingirem concentraes da ordem de 14.000 ppm no ar, quando a mistura de combustvel mais comburente suficiente para que haja combusto espontnea. Alm disso, alguns dos compostos orgnicos presentes na composio da gasolina e do leo diesel so cientificamente comprovados como carcinognicos. Dentre os BTEX o benzeno considerado o mais txico, podendo em exposies crnicas causar danos medula ssea, leucemia e cncer de fgado. O valor estimado da dosagem mnima letal (LDL) para humanos de 194 mg.Kg-1 (STOKSTAD, 2004). Alm destes problemas, importante ressaltar que a recuperao de reas contaminadas uma tarefa complexa e bastante demorada, e em alguns casos no se consegue atingir os limites permitidos pela legislao ou pelos rgos ambientais (MANCINI, 2002). Outro fator complicador o custo que, segundo um consultor em artigo na Revista Meio Ambiente Industrial (n.40, p.94, 2003), pode variar entre R$ 50 a 100 mil reais, um valor consideravelmente alto para o setor de revendedores de combustveis. Os custos so dependentes do tipo de contaminante, das caractersticas do local e da amplitude da rea. Com o objetivo de diminuir os riscos de contaminao de corpos dgua subterrneos e superficiais, do solo e ar, e os riscos de incndio e exploses, o Conselho Nacional do Meio
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Ambiente (CONAMA) estabeleceu a Resoluo no 273 de 29 de novembro de 2000, que estipula uma srie de requisitos que devem ser atendidos pelas empresas que integram o setor de combustvel no Brasil, entre eles a obrigatoriedade do licenciamento ambiental e a certificao dos equipamentos de acordo com as normas da ABNT e do Inmetro.
2.2.2 Dinmica dos hidrocarbonetos em subsolo Os hidrocarbonetos ao serem liberados para o ambiente atravs de vazamentos em tanques subterrneos migram verticalmente pela zona no saturada sob a influncia das foras gravitacional e capilar. Alguma expanso horizontal tambm ocorrer devido atrao das foras capilares (DEHAINI, 2001 apud MANCINI, 2002). O termo foras capilares refere-se s foras que influenciam o movimento dos hidrocarbonetos em fase lquida pelos interstcios do solo ou poros. Essas foras dependem de: a) caso o solo esteja molhado com gua ou com hidrocarbonetos em fase lquida; b) as propriedades fsicas e qumicas dos hidrocarbonetos em fase lquida; c) as caractersticas do solo (GUIGUER, 2000). O escoamento dos hidrocarbonetos em meio saturado sempre bifsico por serem compostos orgnicos que apresentam baixa miscibilidade em gua. A fase composta pelos hidrocarbonetos recebe a denominao de NAPL (non-aqueous phase liquid) ou fase lquida no aquosa. De acordo com a densidade do hidrocarboneto existem dois tipos de NAPLs (GUIGUER, 2000): LNAPL (light non-aqueous phase liquid ou fase lquida no aquosa leve) caracterizada por possuir densidade menor que a gua. Os hidrocarbonetos com essa caracterstica esto comumente associados com a produo, refino e distribuio de produtos do petrleo, por exemplo, a gasolina, o leo diesel e o querosene. DNAPL (dense non-aqueous phase liquid ou fase lquida no aquosa densa) caracterizada por possuir densidade maior que a gua. Os hidrocarbonetos com essa caracterstica esto relacionados principalmente s atividades industriais, onde so utilizados, por exemplo, hidrocarbonetos clorados, PCBs (bifenilas poli-cloradas), antraceno, pireno, 1,1,1-TCE e fenol. O transporte dos hidrocarbonetos no solo caracterizado pela formao de quatro fases distintas que regulam o processo de migrao do produto: fase lquida residual, fase lquida livre, fase dissolvida e fase vapor (Figura 2.1). A partio entre as fases determinada 10
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pelos fenmenos da dissoluo, volatilizao e adsoro (USEPA, 2003b). A fase lquida residual pode existir no solo como resduos lquidos relativamente imveis, adsorvidos ou retidos entre os slidos do solo. O lquido livre no residual que passa pelo solo chamado de fase lquida livre, que quando atinge o nvel dgua subterrneo passa a flutuar sobre o mesmo. Hidrocarbonetos em fase dissolvida podem estar presentes na superfcie slida do solo formando pelculas, ou na gua do solo; quando atingem o nvel dgua subterrneo formam a chamada pluma de contaminao. Os hidrocarbonetos em fase de vapor podem existir como componentes do vapor do solo, podendo tambm se condensar e adsorver-se na superfcie slida ou dissolver-se na gua do solo (GUIGUER, 2000).
Figura 2.1 - Diferentes fases presentes nas zonas insaturada e saturada (Fonte: GUIGUER, 2000).
O transporte da LNAPL atravs das zonas no saturadas e saturadas depende da quantidade de hidrocarbonetos liberados ao meio. Um pequeno volume de LNAPL flui pela zona no saturada at atingir o estado de saturao residual, em razo do desenvolvimento de
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um sistema de quatro fases como resultado da entrada de LNAPL nesta zona, com a seguinte ordem de grau de molhabilidade: gua > LNAPL > ar (FERREIRA e ZUQUETTE, 1998). A gua de infiltrao dissolve os componentes solveis presentes na LNAPL, tais como o benzeno, o tolueno e os xilenos, e os transporta at a zona saturada. Esses contaminantes formam uma pluma que se distribui por difuso e adveco. Muitas das substncias tendem a ser volteis, assim o gs sofre partio de modo que uma parte fica retida no solo e outra migra para o ar, sendo transportados para outras partes do aqfero por difuso molecular. Os volteis movem-se primeiramente pela zona saturada e finalmente entram na camada superficial do solo onde, dependendo das condies fsico-qumicas retornam para a fase lquida por condensao. Esses processos so responsveis pelo transporte de contaminantes atravs de reas bastante extensas (FERREIRA e ZUQUETTE, 1998). Quando um grande volume de hidrocarbonetos liberado, estes se deslocam no sentido da franja capilar prximo zona saturada. Os componentes solveis da LNAPL atravessam adiante ultrapassando os componentes menos solveis. No topo da franja capilar, onde a gua satura um grande volume de poros, o material acumulado causa uma reduo na permeabilidade relativa da LNAPL. Impedida de mover-se para baixo, a LNAPL tende a se espalhar sobre o topo da franja capilar. O acmulo de um volume suficiente de LNAPL no topo da franja capilar faz com que a mesma comece a fluir na mesma direo da gua subsuperficial. Em razo de sua baixa densidade, a LNAPL flutua prxima ao nvel da gua subsuperficial, na zona de capilaridade. Por causa desses mecanismos alguns produtos tais como a gasolina, querosene e alguns outros leos so encontrados como produtos livres sobre o topo da franja capilar (FERREIRA e ZUQUETTE, 1998). Os grandes derrames geram um fornecimento contnuo de hidrocarbonetos para a zona no saturada, favorecendo uma condutividade hidrulica progressiva e contnua e formando uma depresso de interface zona saturada LNAPL, onde os hidrocarbonetos se acumulam. No caso de remoo ou esgotamento da fonte de contaminao, os hidrocarbonetos presentes na zona no saturada continuam a migrar para nveis mais profundos, estacionando quando a concentrao de hidrocarbonetos atinge o nvel de saturao residual e no pode mais avanar. Caso contrrio, continua a mover-se para baixo recarregando a depresso localizada sobre o nvel da gua subsuperficial, produzindo um espalhamento lateral maior sobre a franja capilar. A Figura 2.2 ilustra o caminho percorrido
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pelo combustvel liberado de um tanque subterrneo at atingir a franja capilar e a formao de uma pluma de contaminao.
Figura 2.2 - Evoluo da contaminao por hidrocarbonetos de combustveis em subsuperfcie (Fonte: USEPA, 2003b).
2.3 Tcnicas de remediao aplicadas a reas contaminadas

Atualmente, existe uma preocupao e conscientizao da sociedade em relao qualidade ambiental, a populao vem tornando-se mais crtica e participativa, exigindo atuaes cada vez maiores das autoridades. Desta forma, em funo da crescente demanda em
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relao ao gerenciamento de reas contaminadas, avanos significativos ocorreram nas ltimas dcadas nos estudos que visavam recuperao ambiental (SPILBORGHS, 1997). Por esse motivo, diversas tecnologias de remediao tm sido desenvolvidas e consolidadas principalmente pelos pases desenvolvidos. O Brasil, hoje mais preocupado com seus locais contaminados, comea a desenvolver suas prprias tecnologias e tambm a adaptar as tecnologias j estabelecidas s nossas condies ambientais. O Estado de So Paulo, em funo de sua intensa industrializao, apresenta uma situao mais crtica em relao a esta questo. Desta forma, a CETESB tem desenvolvido manuais e adaptado legislaes, principalmente normas Holandesas (CETESB, 1996), com vistas ao controle das reas suspeitas de contaminao e comprovadamente contaminadas. Neste sentido, destaca-se o Manual de Gerenciamento de reas Contaminadas1, que tem por funo fornecer informaes e metodologias a serem utilizadas na soluo dos problemas gerados por reas contaminadas, desde a investigao preliminar at a proposio de tcnicas de remediao. Muitas opes ou combinaes de opes esto disponveis para restaurar a qualidade do solo e da gua subterrnea. A seleo de tecnologias a serem utilizadas baseia-se fundamentalmente no conhecimento das caractersticas fsico-qumicas do contaminante, volume vazado, tempo de vazamento, caracterizao geolgica e hidrogeolgica do local, anlise do meio fsico superficial e subterrneo e extenso da pluma contaminante (SPILBORGHS, 1997). Segundo a USEPA (1991), um plano tpico de remediao possui quatro fases principais: conteno do produto livre e produto dissolvido; remoo do produto livre; remoo do produto dissolvido; remoo do produto adsorvido.
A conteno e a remoo do produto livre geralmente realizada atravs de sistemas de poos ou trincheiras de bombeamento e para a remoo do produto adsorvido ao solo na zona no saturada e dissolvido na gua subterrnea existem diferentes tcnicas (Tabelas 2.1 e 2.2). A remediao da zona no saturada tem por objetivo evitar a contaminao da zona saturada. A zona no saturada considerada uma fonte secundria de contaminao, onde os
Documento em fase de concluso disponvel na pgina da CETESB na internet (www.cetesb.sp.gov.br).
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processos de infiltrao promoveriam a lixiviao e o transporte de poluentes para o aqfero (BITTON e GERBA, 1984; USEPA, 1990 e CHAPELLE, 1993). As tcnicas de remediao da zona no saturada e da saturada podem ser realizadas ex situ, ou seja, atravs da retirada do material contaminado para posterior tratamento ou in situ, quando o material no retirado.
Tabela 2.1 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona no saturada
lavagem de solo (soil wash) Tratamentos ex situ: incinerao biorremediao: - reatores (slurry phase) - sistemas de tratamento de resduos no solo (p.e. landfarming, biopilhas)
Tratamentos in situ:
lavagem de solo (soil flushing) extrao de compostos orgnicos volteis (SVE, bioventing) biorremediao
Tabela 2.2 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona saturada
carvo ativado Tratamentos ex situ: coluna de aerao (air stripping) biorremediao
Tratamentos in situ:
bombeamento e tratamento (pump and treat) tratamentos qumicos (injeo de oxidantes, barreiras reativas, etc.) extrao de compostos orgnicos volteis (air sparging, bioventing) biorremediao
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No Estado de So Paulo verifica-se que o bombeamento e tratamento e a recuperao de fase livre so as tcnicas mais empregadas no tratamento das guas subterrneas, enquanto que a extrao de vapores e a remoo de solo/resduo destacam-se como as tcnicas mais utilizadas para os solos, segundo dados da CETESB (2006). Segundo o Engo Elton Gloeden da Cetesb em entrevista concedida para a revista Meio Ambiente Industrial (n. 56, p.18, 2005) no Brasil, a tcnica de biorremediao ainda pouco utilizada, porm, pode ser promissora e eficiente se utilizada nas reas contaminadas. Este um mtodo que pode ser aproveitado no mercado brasileiro, pois, o pas apresenta solos e temperaturas favorveis. A respeito da estruturao de projetos de remediao, h uma vasta disponibilidade de textos publicados, por exemplo: USEPA (1990, 1991), Nyer (1992), Fetter (1993), Norris (1994), Boulding (1995), Spilborghs (1997), Palma e Zuquette (1998) e Clu-in (2004). A seguir, alguns conceitos relacionados tcnica de biorremediao so revistos. 2.3.1 Conceitos envolvidos na biorremediao 2.3.1.1 Ao dos microrganismos A tecnologia da biorremediao baseada em processos nos quais ocorrem reaes bioqumicas mediadas por microrganismos. Em geral, um composto orgnico quando oxidado perde eltrons para um aceptor final de eltrons, que reduzido (ganha eltrons). O oxignio comumente atua como aceptor final de eltrons quando presente e a oxidao de compostos orgnicos com a reduo do oxignio molecular chamado de respirao aerbia heterotrfica. No entanto, quando o oxignio no est presente, microrganismos podem usar compostos orgnicos ou ons inorgnicos como aceptores finais de eltrons alternativos, condies estas chamadas de anaerbias. A biodegradao anaerbia pode ocorrer pela desnitrificao, reduo do ferro, reduo do sulfato ou condies metanognicas (CORDAZZO, 2000). Nas condies subsuperficiais encontram-se populaes de microrganismos, as quais geralmente so formadas por bactrias, fungos, algas e protozorios (GHIORSE e WILSON, 1988). As bactrias na zona saturada variam com as caractersticas especficas geoqumicas e hidrogeolgicas do aqfero, sendo que, de maneira geral, embora existam bactrias anaerbias, as que predominam so as bactrias aerbias (CHAPELLE, 1993). Os principais mecanismos de biotransformao de contaminantes orgnicos em gua subterrnea so 16
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efetuados nos biofilmes, que so bactrias e polmeros extracelulares aderidos subsuperfcie e que obtm energia e nutrientes durante o fluxo da gua subterrnea (BITTON e GERBA, 1984). A estrutura qumica dos poluentes orgnicos tem uma profunda influncia na habilidade dos microrganismos metabolizarem estas molculas, especialmente com respeito s taxas e extenso da biodegradao. Alguns compostos orgnicos so rapidamente biodegradados enquanto outros so recalcitrantes (no biodegradveis). Hidrocarbonetos com baixo a mdio peso molecular e lcoois so exemplos de compostos facilmente biodegradveis. Compostos xenobiticos (compostos qumicos fabricados pelo homem), especialmente hidrocarbonetos halogenados, tendem a ser resistentes biodegradao. Geralmente, compostos ramificados e polinucleados so mais difceis para degradar que molculas monoaromticas ou com cadeias simples, e aumentando o grau de halogenao da molcula, diminui-se a biodegradabilidade (ALEXANDER, 1965 apud ATLAS, 1997). A comunidade microbiana envolvida na degradao de compostos xenobiticos pode ser dividida em dois grupos: os microrganismos primrios e os secundrios. Os primrios so aqueles capazes de metabolizar o substrato principal fornecido ao sistema, enquanto os secundrios no utilizam o substrato principal, porm, os produtos liberados pelos microrganismos primrios. Este processo denominado cometabolismo (BULL e SLATER, 1982 apud GRADY, 1985). Maiores detalhes a respeito do metabolismo dos microrganismos que degradam hidrocarbonetos podem ser encontrados em Alexander (1994), Kataoka (2001) e Melo (1997). 2.3.1.2 Processos de biorremediao in situ Biorremediao in situ realizada no prprio local, sem que haja remoo de material contaminado. Isto evita custos e distrbios ambientais associados com o movimento de solos e guas que esto contaminados para outros locais destinados ao tratamento. Os produtos finais de uma biorremediao efetiva so gua e gs carbnico, que no apresentam toxicidade e podem ser incorporados ao ambiente sem prejuzo aos organismos vivos. De acordo com parmetros como origem dos microrganismos, adio ou no de nutrientes, a biorremedio in situ pode ser realizada atravs de trs processos: biorremediao intrnseca, bioestimulao e bioaumento (bioaugmentation) (ATLAS, 1997).
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- Biorremediao intrnseca (natural) Uma nova abordagem para a descontaminao de solos e guas subterrneas, chamada de remediao natural vem, recentemente, ganhando aceitao, principalmente em locais contaminados por derramamentos de derivados de petrleo, como o que acontece em postos de combustveis. A remediao natural uma estratgia de gerenciamento que se baseia nos processos naturais de atenuao para remover ou conter os contaminantes dissolvidos na gua. A atenuao natural refere-se aos processos fsicos, qumicos e biolgicos que facilitam o processo de remediao de maneira global (WIEDEMEIR, 1996). Dados obtidos em pesquisas de campo de vrios pesquisadores (BARKER et al., 1987; CHIANG et al., 1989; CHAPELLE, 1994; DAVIS e KLIER, 1994) tm comprovado que a atenuao natural limita o deslocamento dos contaminantes e, portanto, diminui a contaminao ao meio ambiente. A remediao natural no uma alternativa de nenhuma ao de tratamento, mas uma forma de minimizar os riscos para a sade humana e para o meio ambiente, monitorando-se o deslocamento da pluma e assegurando-se de que os pontos receptores (poos de abastecimento de gua, rios, lagos) no sero contaminados (CORSEUIL e MARINS, 1998). Aps a contaminao do lenol fretico, os contaminantes se dispersaro em forma de pluma e iro deslocar-se, entretanto, o movimento da pluma pode ser atenuado por processos de diluio, disperso, adsoro, volatilizao e biodegradao. O processo que envolve as reaes qumicas promovidas por microrganismos chamado de biorremediao intrnseca ou natural, cujo conceito bsico o uso da capacidade de microrganismos autctones em degradar contaminantes que tenham sido derramados em subsuperfcie sem qualquer interferncia de tecnologias ativas de remediao (BORDEN et al., 1995). Dependendo das condies hidrogeolgicas do local contaminado, a taxa da reao de biodegradao ser mais rpida ou mais lenta, assim, a determinao da taxa de transformao de grande importncia para se prever at onde a pluma ir se deslocar. Quando a taxa de biodegradao for igual ou maior do que a taxa de deslocamento dos contaminantes, a pluma deixar de se deslocar e diminuir de tamanho. Neste caso, se a fonte receptora no fosse atingida, no haveria a necessidade de implantao de tecnologias ativas de remediao, e a remediao natural seria a opo mais econmica de recuperao da rea. Para que se possa demonstrar que a remediao natural uma forma adequada de descontaminao de hidrocarbonetos, necessrio que se faa uma completa caracterizao hidrogeolgica da rea contaminada, que se determine a magnitude e extenso da 18
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contaminao e que se demonstre que a pluma no ir migrar para regies de risco potencial. Para tal, necessrio que se determine as taxas de migrao e reduo de tamanho da pluma por meio de estudos de campo e de laboratrio. No entanto, se o processo natural de atenuao no evitar o deslocamento da pluma at locais de risco, tecnologias que aceleram a transformao dos contaminantes devem ser implantadas (CORSEUIL e MARINS, 1997). A biodegradao de hidrocarbonetos essencialmente uma reao de oxi-reduo onde o hidrocarboneto oxidado (doador de eltrons) e um aceptor de eltrons reduzido. H vrios compostos que podem agir como aceptores de eltrons, tais como o oxignio (O2), nitrato (NO3-), xidos de ferro (p.e. Fe(OH)3), sulfato (SO42-), gua (H2O) e dixido de carbono (CO2). A seguinte seqncia de preferncia de utilizao desses aceptores foi observada: oxignio > nitrato > xidos de ferro > sulfato > gua. Esta seqncia reflete a diminuio do potencial de oxidao dos aceptores. Em geral, a cintica de oxidao dos hidrocarbonetos mais rpida para aceptores de eltrons com potenciais de oxidao mais altos (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). O monitoramento da biorremediao intrnseca baseado em um acompanhamento da evoluo temporal e espacial da concentrao de indicadores geoqumicos (p.e., pH, Eh, OD, temperatura, aceptores de eltrons) na gua subterrnea. Resultados desse monitoramento podem ser usados para identificar fatores que podem controlar a taxa de biodegradao bem como identificar o processo microbiolgico de respirao (aerbia ou anaerbia) em diferentes pores da pluma de hidrocarbonetos dissolvidos. A diminuio da concentrao de oxignio dissolvido (OD) na gua e um aumento da concentrao de dixido de carbono so indicativos de um processo aerbio de biodegradao, enquanto que a produo de ons Fe2+ ou diminuio de ons nitrato indicam a presena de processos anaerbios. Um declnio do potencial redox (Eh) de valores positivos para negativos reflete a mudana de condies oxidantes (favorveis aos microrganismos aerbios) para condies redutoras (melhores condies aos processos anaerbios, que so mais lentos que os aerbios). Um aumento nos valores de pH pode ser creditado ao consumo de ons H+ durante a reduo de ons frricos ou do nitrato (BORDEN et al., 1995). Os processos aerbios e anaerbios de biodegradao so melhor apresentados a seguir: - Biodegradao aerbia Quase todos os hidrocarbonetos do petrleo so biodegradados sob condies aerbias. Oxignio um cosubstrato para a enzima que pode inicializar o metabolismo do hidrocarboneto e por fim utilizado como aceptor final de eltrons para a gerao de energia 19
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(YOUNG, 1984). Em muitos casos, a maior limitao na biodegradao aerbia em subsuperfcie a baixa solubilidade do oxignio em gua. Por exemplo, a mineralizao aerbia do tolueno (C6H5-CH3) representada pela seguinte equao: C6H5-CH3 + 9 O2 7 CO2 + 4 H2O (2.1)
A gua saturada com ar contm de 6 a 12 ppm de oxignio dissolvido. Por exemplo, a completa converso do tolueno (e muitos outros hidrocarbonetos) para CO2 e H2O requer aproximadamente 3 g de O2 por grama de hidrocarboneto. Usando-se essa taxa, o O2 presente na gua pode resultar na biodegradao de 2 a 4 ppm de hidrocarboneto atravs de processo estritamente aerbio. Se a concentrao de hidrocarboneto for maior que essa, a biodegradao deve ser incompleta ou deve acontecer mais vagarosamente por processo anaerbio (BROWN et al., 1994). A extenso da biodegradao aerbia controlada pela quantidade de contaminantes, a taxa de transferncia de oxignio para a subsuperfcie e o contedo original de oxignio no aqfero (BORDEN, 1994). Os tempos de meia vida, por exemplo, do tolueno, podem variar entre 1 e 20 dias, dependendo da concentrao microbiolgica ativa (ALVAREZ et al., 1991; CHEN et al., 1992; CHIANG et al., 1989; WEBER e CORSEUIL, 1994), chegando a valores fora dessa faixa se tambm ocorrerem limitaes de transferncia de massa (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). - Biodegradao utilizando o nitrato Quando a quantidade de oxignio diminui e nitrato est presente (ou outras formas oxidadas de nitrognio), alguns microrganismos anaerbios facultativos utilizam nitrato (NO3-) ao invs de oxignio como aceptor final de eltrons. Para o tolueno, este processo pode ser aproximado pela seguinte equao: C6H5-CH3 + 7,2 H+ + 7,2 NO3- 7 CO2 + 7,6 H2O + 3,6 N2 (2.2)
Os tempos de meia vida para o tolueno sob condies desnitrificantes so maiores que em condies aerbias, tipicamente variando de 20 a 50 dias (ALVAREZ et al., 1994; HUTCHINS et al., 1991b), mas podem ser mais curtos se a concentrao inicial de desnitrificantes exceder 1 mg/l (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). Nas ltimas dcadas, pesquisadores descobriram que tolueno, etilbenzeno, xilenos, naftaleno e uma variedade de outros compostos podem ser biodegradados usando nitrato como aceptor final de eltrons (KUHN et al., 1988; HUTCHINS et al., 1991a; MIHELCIC e LUTHY, 1991). Atualmente, h algumas controvrsias sobre a biodegradabilidade do 20
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benzeno sob condies desnitrificantes. Vrios trabalhos indicam o benzeno como sendo recalcitrante (no biodegradvel) sob estas condies (HUTCHINS et al., 1991a; KUHN et al., 1988; SILVA et al., 2002) enquanto outros estudos indicam que o benzeno degradado (MAJOR et al., 1988; KUKOR e OLSEN, 1989). - Biodegradao utilizando o on frrico Uma vez que as quantidades de oxignio e nitrato reduzem, os microrganismos podem utilizar o on frrico (FeIII) como aceptor de eltrons. Grandes quantidades de ferro na forma frrica esto presentes em sedimentos de muitos aqferos e esta pode ser uma potencial fonte desse composto para a biodegradao. O ferro pode estar presente tanto em minerais cristalinos ou amorfos. As formas que so mais facilmente reduzidas so as formas amorfas e pouco cristalinas de hidrxidos, oxi-hidrxidos, e xidos de Fe (III) (LOVLEY, 1991). A reao hipottica da oxidao do tolueno com a reduo do Fe (III) na forma de hidrxido frrico (Fe (OH)3) pode ser representada pela seguinte equao: C6H5-CH3 + 36 Fe (OH)3 + 72 H+ 7 CO2 + 36 Fe+2 + 94 H2O (2.3)
A reduo do Fe (III) resulta em elevadas concentraes de on Fe (II) dissolvidos em aqferos contaminados. Lovley et al. (1989) descobriram que em um aqfero contaminado por um derramamento de leo cru, a remoo seletiva de benzeno, tolueno e xilenos da pluma foi acompanhada por uma acumulao de Fe (II) dissolvido e diminuio de xidos de Fe (III) nos sedimentos contaminados. Embora o exato mecanismo de reduo microbiolgica dos ons frricos seja minimamente quantificado, as evidncias disponveis sugerem que a reduo do ferro um importante mecanismo na biodegradao de hidrocarbonetos dissolvidos (BORDEN et al., 1995). Vrios microrganismos foram identificados por apresentarem a capacidade de utilizao do on frrico como aceptor de eltrons na oxidao de compostos aromticos incluindo o tolueno, fenol, p-cresol e benzoato (LOVLEY e LONERGAN, 1990; LOVLEY et al., 1989). - Biodegradao utilizando outros aceptores Pesquisas demonstram que uma ampla variedade de compostos orgnicos pode ser biodegradada pela ao de microrganismos redutores de sulfato e/ou metanognicos (geradores de metano). Estes compostos incluem ismeros de cresol (SMOLENSKI e SUFLITA, 1987), hidrocarbonetos mono e poliaromticos (BERRY et al., 1987), 21
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alquilbenzenos (GRBIC-GALIC e VOGEL, 1987) e hidrocarbonetos insaturados (SCHINK, 1985). Redutores de sulfato podem potencialmente biodegradar o tolueno usando sulfato atravs da reao representada na seguinte equao (BELLER et al., 1992): C6H5-CH3 + 4,5 SO4-2 + 3 H2O 2,25 H2S + 2,25 HS- + 7 HCO3-1 + 0,25 H+ (2.4)
Este processo relativamente lento e, quando ocorre, usualmente acontece no centro da pluma, longe das bordas no contaminadas (aerbias) da gua subterrnea (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). Um consrcio metanognico (grupo de microrganismos que geram metano) pode potencialmente biodegradar o tolueno (processo lento) usando gua como aceptor de eltrons mediante a reao representada na seguinte equao: C6H5-CH3 + 5 H2O 4,5 CH4 + 2,5 CO2 (2.5)
Atualmente, poucos estudos de campo tm examinado o efeito dos mecanismos metanognicos e os redutores de sulfato na biodegradao de hidrocarbonetos dissolvidos na gua subterrnea. Enquanto h vrios estudos sobre a biodegradao do tolueno via reduo do sulfato (BELLER et al., 1992) e metanogenises (GRBIC-GALIC e VOGEL, 1987), a extenso e significncia da biodegradao de hidrocarbonetos em aqferos rasos por esses processos so minimamente quantificadas. Esta falta de informao deve ser causada parcialmente pelas caractersticas desses microrganismos. Consrcios sulfato-redutores e metanognicos so conhecidos por serem sensveis a variaes das condies ambientais como a temperatura, nutrientes inorgnicos (nitrognio, fsforo e traos de metais), contaminantes e pH (ZEHNDER, 1978). Um no balanceamento em qualquer desses fatores pode reduzir a taxa e a extenso da biodegradao anaerbia (BORDEN et al., 1995). - Bioestimulao A bioestimulao de populaes de microrganismos autctones com o objetivo de aumentar as taxas de biodegradao freqentemente empregada em projetos de biorremediao (ATLAS, 1997). Para se utilizar o processo de bioestimulao, deve-se demonstrar que existe no local contaminado uma populao natural de microrganismos capazes de biodegradar os contaminantes presentes e que as condies ambientais so insuficientes para se obter altas taxas de atividade microbiolgica dessa populao. Medidas das propriedades fsicas e qumicas de amostras do local podem revelar as limitaes fsico22
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qumicas para a atividade microbiolgica, a qual pode ento ser modelada para indicar os fatores crticos limitantes (RAMASWAMI e LUTHY, 1997). Algumas limitaes naturais comuns biodegradao de poluentes so: altos nveis de concentrao de poluentes, falta de oxignio, pH desfavorvel, falta de nutrientes minerais, baixa umidade e temperaturas desfavorveis. Uma variedade de mtodos que modificam as condies ambientais podem ser utilizados para melhorar as taxas das atividades biodegradadoras da populao microbiolgica autctone. Uma vez que as condies naturais limitantes so corrigidas, a distribuio natural existente de microrganismos permite, em muitos casos, um enriquecimento espontneo de microrganismos apropriados. A disponibilidade de oxignio molecular tem um profundo efeito na biodegradao de vrios compostos. Limitao de oxignio um problema freqente na biorremediao in situ de hidrocarbonetos e outros poluentes que so biodegradados em condies aerbias. O fornecimento de oxignio para a gua subterrnea pode ser efetuado de vrias formas. O uso de difusores de ar comprimido limitado, pois, esse mtodo no fornece oxignio acima de 8-10 ppm. Esses valores podem ser elevados para 40-50 ppm se for utilizado oxignio puro, porm, alm de ser anti-econmico, nessas concentraes o oxignio pode ser perdido da soluo antes de ser utilizado pelos microrganismos (BROWN et al., 1994). A adio de solues diludas de perxido de hidrognio com formulaes apropriadas e estveis pode ser usado como fonte de oxignio para a biodegradao de hidrocarbonetos (API, 1987; BERWANGER e BARKER, 1988; BROWN et al., 1994; BROWN et al., 1985; THOMAS et al., 1987; YANIGA e SMITH, 1984). Para se evitar a formao de bolso de gs e a toxicidade microbiolgica, a concentrao prtica de perxido de hidrognio na gua injetada mantida aproximadamente em 100 ppm (BROWN et al., 1994; YANIGA e SMITH, 1984). A biorremediao in situ baseada na injeo de ar extensivamente usada no tratamento da gua subterrnea (BRUBAKER, 1995; HINCHEE, 1994). Air sparging uma tecnologia que pode ser utilizada para remover compostos volteis da subsuperfcie ou para induzir a biodegradao aerbia na zona vadosa (bioventing) ou na saturada (biosparging). Durante o air sparging, ar injetado na zona saturada, usualmente abaixo da zona contaminada. Compostos volteis dissolvidos na gua subterrnea e sorvidos nas partculas do solo so particionados para a fase advectiva de ar e so transportados para a zona vadosa. Os
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compostos volatilizados podem ento ser coletados da zona vadosa por um sistema de extrao de vapores. O air sparging pode ser muito efetivo em providenciar oxignio para microrganismos aerbios. Estes microrganismos so naturalmente encontrados nas reas contaminadas e so freqentemente capazes de oxidar uma ampla gama de compostos orgnicos, incluindo compostos semivolteis, que no so removidos por volatilizao. Alm disto, microrganismos aerbios tm demonstrado capacidade em oxidar compostos halogenados como os mono e poliaromticos halogenados. Enquanto a disponibilidade de oxignio pode limitar severamente a biodegradao de hidrocarbonetos, outros compostos so mais rapidamente degradados sob condies anaerbias. Consideraes termodinmicas e experincias prticas indicam que a desclorao de hidrocarbonetos halogenados favorecida em condies anaerbias (SUFLITA et al., 1982). Para a biorremediao de compostos altamente clorados, tratamentos alternando condies anaerbias e aerbias podem ser a melhor soluo prtica (ABRAMOWICZ, 1990; UNTERMAN, 1996). A concentrao de vrios nutrientes tambm pode limitar as taxas de biodegradao. Os microrganismos necessitam dos macronutrientes para sintetizar componentes celulares, como o nitrognio para aminocidos e enzimas, o fsforo para o ATP e o DNA, enxofre para algumas protenas e coenzimas, clcio para estabilizar a parede celular e magnsio para estabilizar os ribossomos. Uma razo de C:N:P de 30:5:1 geralmente suficiente para assegurar o crescimento microbiano no aqfero (PAUL e CLARK, 1989). Microrganismos tambm necessitam de micronutrientes para realizar certas atividades enzimticas. Em geral, os minerais do aqfero contm quantidade suficiente desses nutrientes para suportar a atividade microbiana. Apesar disso, anlises geoqumicas e ensaios laboratoriais de biodegradao devem ser feitos para verificar se a quantidade de nutrientes inorgnicos presentes suficiente para o sucesso da biorremediao (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). Microrganismos requerem principalmente nitrognio e fsforo para incremento de biomassa, assim, a disponibilidade desses nutrientes na rea contaminada um fator crtico para a biodegradao. Sob condies onde a deficincia de nutrientes limita a biodegradao dos hidrocarbonetos, os efeitos benficos da fertilizao com esses nutrientes tm sido demonstrados (PRITCHARD e COSTA, 1991). As formas de fsforo mais utilizadas para recuperao de aqferos so os sais de ortofosfato e polifostato. Em relao ao nitrognio, as formas mais utilizadas so os sais de amnio (cloreto de amnio), pois, essa forma a mais utilizada no metabolismo microbiano (CASARINI e SPILBORGHS, 1992). 24
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O transporte de nutrientes bem como de outras substncias que devem ser levadas at um aqfero contaminado, freqentemente tem sido o fator limitante para o processo de biorremediao (THOMAS e WARD, 1989). Normalmente essas solues so introduzidas no aqfero por meio de tcnicas convencionais de injeo (WARD et al., 1988). Entretanto, a hidrogeologia do aqfero geralmente dificulta esse transporte fazendo com que ele no ocorra de maneira uniforme (MERCER e COHEN, 1990). Devlin e Barker (1994) descreveram em seu estudo em sistema semi-passivo para introduzir solues no aqfero, de maneira que as solues injetadas consigam se misturar e se espalhar completamente pela gua do aqfero. Dey (1991) remediou um aqfero arenoso contaminado com 31800 L de gasolina proveniente de vazamento de tanque de armazenamento subterrneo. O vazamento contaminou 1530 m3 de solo, atingindo tambm a gua subterrnea. Para a remediao do local foi usado um plano integrado utilizando as tecnologias de extrao de orgnicos volteis (bioventing) com adio de nitrognio e fsforo para biodegradar os hidrocarbonetos adsorvidos e para remediar a gua subterrnea foi utilizada uma tecnologia ex-situ atravs de uma coluna de aerao (air stripping). A operao no sistema integrado durou 18 meses e no final obteve-se uma remoo de 15300 Kg de gasolina representando 73 % do total vazado. A extrao de hidrocarbonetos volteis combinada com o bioventing removeu grande parcela dos hidrocarbonetos poucos solveis retidos no solo. Segundo Wilson e Brown (1989), o sistema de injeo de nutrientes e oxignio deve ser projetado visando transferncia de massa para dentro e para fora da rea contaminada. Assim, o sistema pode ser passivo, onde existe apenas um poo de injeo de nutrientes e oxignio na pluma de contaminao ou dinmico, onde existem poos de injeo e extrao sendo os nutrientes e o oxidante misturados em tanques na superfcie. A vantagem do sistema dinmico que se pode criar um gradiente hidrulico para se controlar o fluxo de nutrientes e conter a pluma de contaminao. De acordo com Corseuil (1994), outro fator que deve ser considerado como limitante da biorremediao a presena de biomassa autctone insuficiente para a degradao dos contaminantes. Baixas populaes de microrganismos tipicamente presentes em sistemas subsuperficiais podem resultar em significantes perodos de retardos antes do incio mensurvel da biodegradao, mesmo em condies favorveis de oxignio e nutrientes. O autor observou que estes retardos, os perodos para o desenvolvimento da populao, variaram inversamente com o nmero de microrganismos contaminante-especficos 25
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inicialmente presentes no solo do aqfero, o que sugere a necessidade da obteno de concentraes crticas de biomassa. Embora esta ltima afirmao no seja novidade, ela raramente abordada de forma adequada em aplicaes de biotecnologia para a remediao subsuperficial in-situ. Estas aplicaes geralmente focalizam o estabelecimento de condies apropriadas de receptor de eltrons e de nutrientes, e assumem um desenvolvimento garantido de suficientes populaes microbianas. Esta pode no ser uma prtica apropriada e mais ateno deve ser dada possvel necessidade de se aumentar as populaes microbianas autctones para assegurar que as concentraes de biomassa sejam suficientemente altas para a confirmao das taxas de degradao do contaminante. - Bioaumento (bioaugmentation) A introduo de microrganismos no indgenos (alctones) pode ser considerada em locais, onde aps a contagem das bactrias heterotrficas totais e fungos, foi identificada uma insuficincia de microrganismos indgenos (autctones) para a biodegradao do resduo perigoso em questo, mesmo aps a tentativa da bioestimulao (SPILBORGHS, 1997). O bioaumento um processo de biorremediao que utiliza microrganismos alctones muitas vezes encontrados em produtos biotecnolgicos comercializados. Esse processo necessrio quando um local contaminado no possui ou possui em quantidades insuficientes os requisitos necessrios para que o processo de degradao ocorra. Assim, essa tcnica tem como objetivo acelerar ou estimular a biodegradao atravs da intensificao do crescimento microbiano tanto quanto tambm pela otimizao do ambiente em questo. O bioaumento, quando bem utilizado, pode acelerar a biodegradao do contaminante, devendo, entretanto, serem considerados os seguintes aspectos: Aprovao do rgo ambiental: o produto biotecnolgico antes de sua utilizao deve ser identificado, caracterizado e testado em sua toxicidade e ecotoxicidade, bem como comprovada a sua eficincia e inocuidade ao ambiente. No Estado de So Paulo, a CETESB homologou norma tcnica especfica para esta avaliao (CETESB, 1994a) e no mbito federal foi publicada uma legislao especifica (BRASIL, LEIS, etc., 1995), constituindo a CTNBIO (Comisso Tcnica Nacional de Biosegurana) que define os critrios para utilizao de microrganismos geneticamente modificados. A Resoluo Conama 314 de 2002 disciplina o registro de produtos com a finalidade de biorremediar solos afetados por vazamentos de petrleo e seus derivados.
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Os microrganismos aplicados devem atuar em sinergismo com as espcies autctones, sem interferir nos processos biogeoqumicos naturais. Leavitt e Brown (1994) fizeram um estudo comparativo entre a bioestimulao e o
bioaumento para um caso de tratamento de solo contaminado com leo cru, empregando, em um caso, microrganismos autctones e, no outro, cultura comercial com mistura recomendada de nutrientes. Concluram que, para algumas aplicaes, a bioestimulao de microrganismos autctones a melhor escolha, considerando custo e desempenho. Bento et al. (2003) avaliaram a biodegradao de hidrocarbonetos de petrleo em solos contaminados com leo diesel atravs da biorremediao intrnseca, bioestimulao e bioaumento. O bioaumento apresentou a maior degradao e a biorremediao intrnseca foi mais efetiva do que a bioestimulao. O melhor desempenho para a biorremediao do solo contaminado com diesel foi obtido quando foram adicionados microrganismos prselecionados do prprio ambiente contaminado. Segundo a Applied Biotreatment Association (APS, 1989 e 1990) o bioaumento no tem se mostrado necessrio nem til para tratamento de locais contaminados com hidrocarbonetos de petrleo, pois, estes locais j apresentam populaes suficientes de microrganismos autctones capazes de biodegradar essas substncias. Atualmente vrias misturas comerciais de microrganismos so vendidas com esse objetivo, contudo, a baixa eficincia desse processo e o alto custo no justificam essa prtica. A utilizao de produtos biotecnolgicos no deve ser interpretada como a soluo de todos os problemas de poluio, sendo que os processos convencionais, como os j estabelecidos, devem ser os mais utilizados quando o contaminante degradvel e no txico. Esta biotecnologia est sendo desenvolvida com vista aos contaminantes recalcitrantes e complexos, como organoclorados e pesticidas, ou casos especficos onde um resultado mais rpido necessrio (SPILBORGHS, 1997; MACHADO, 1998; SILVA, 1999 e MATHEUS, 2003). 2.3.1.3 Caracterizao do local para implementao da biorremediao in situ Para o projeto e implantao do plano de biorremediao in situ, o local deve ser caracterizado do ponto de vista fsico, qumico e biolgico. Muitas dessas caractersticas so genricas para todos os processos de biorremediao (USEPA, 1992).
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- Caractersticas fsicas distribuio espacial da contaminao, especialmente a distribuio da fase no aquosa (NAPL), a origem do resduo e a geometria da pluma; hidrogeologia, direo e velocidade do fluxo da gua subterrnea, heterogeneidades e zonas impermeveis do sedimento; temperatura. - Caractersticas qumicas composio da contaminao, incluindo contaminantes que no sejam hidrocarbonetos, mas que podem interferir no processo; qualidade da gua subterrnea, especialmente o potencial redox, receptores de eltrons, pH e produtos de degradao; propriedades de adsoro do sedimento. - Caractersticas biolgicas presena de microrganismos viveis, especialmente degradadores de
hidrocarbonetos, em zonas contaminadas e no contaminadas; potencial de biodegradao e taxas de degradao.
2.3.1.4 Condies hidrogeolgicas que influenciam a biorremediao A seguir so listadas algumas condies hidrogeolgicas que devem ser analisadas antes da implementao da biorremediao (USEPA, 1992). - Permeabilidade do solo e materiais de subsuperfcie Quanto maior a permeabilidade mais fcil a distribuio dos nutrientes e do receptor de eltrons no solo contaminado e na gua subterrnea. Evidentemente, estas condies tendem a ampliar a extenso da contaminao.
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- Tipo de solo Como a permeabilidade, o tipo de solo afeta o grau de adsoro de contaminantes e nutrientes. Areia e cascalho so os materiais mais favorveis para o transporte de nutrientes; argilas so os menos favorveis. - Profundidade do nvel dgua A profundidade do nvel dgua no deve ser considerada tanto como um fator favorvel ou desfavorvel biodegradao, mas pode interferir em sistemas de bombeamento da fase livre e injeo de nutrientes. - Concentrao de minerais Os nutrientes bsicos exigidos para o desenvolvimento microbiano so o nitrognio, fsforo, enxofre e, em baixo nvel, diversos metais (Fe, Mn, etc.), podendo variar de acordo com o poluente. De qualquer forma, a dissoluo da rocha matriz geralmente libera alguns minerais, portanto, improvvel que estes estejam completamente ausentes (McNABB e DUMLAP, 1975 apud SPILBORGHS, 1997). Alguns metais pesados podem estar presentes em aqferos em concentraes suficientemente altas para inibir a atividade microbiolgica. Por exemplo, no incomum a presena de metais pesados potencialmente txicos como Pb, Hg, Cd e Cr. Quantidades traos destes metais so necessrias para os objetivos nutricionais dos microrganismos, mas estes metais podem ser prejudiciais vida microbiana se presentes na gua subterrnea em concentraes maiores que 1 mg/L. Embora a gasolina brasileira no tenha chumbo, anlises geoqumicas com amostras representativas do aqfero devem ser realizadas para verificar a ausncia dessas substncias inibitrias (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). - Potencial Redox (Eh) A concentrao de oxignio um dos parmetros mais importantes dentro dos processos microbiolgicos, o qual usualmente medido atravs do potencial redox (Eh, em mV). O potencial redox do solo afetado pela profundidade abaixo da superfcie e a taxa de difuso de oxignio, que determinada pelo tamanho e nmero de poros preenchidos por ar, que funo da textura, pH, teor de gua no solo, presena de carbono orgnico e microrganismos (CASARINI e SPILBORGHS, 1992). Os microrganismos aerbios do solo e
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aqfero requerem um potencial redox em torno de 800 mV para as suas reaes, enquanto que os anaerbios requerem Eh de 240 mV (a 25oC e pH 7) (BITTON e GERBA, 1984). - pH Enzimas so polmeros de aminocidos e suas atividades requerem um grau de protonao adequado dos aminocidos. Este processo controlado pelo pH. O pH timo para a ao dos microrganismos usualmente prximo da neutralidade, mas muitos microrganismos presentes em aqferos podem agir sem prejuzos de suas funes para valores de pH entre 5 e 9 (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). A gua subterrnea tipicamente bem tamponada dentro destes limites, assim, os requerimentos microbiolgicos referentes ao pH so geralmente atendidos (CHAPELLE, 1993). Contudo, em locais onde o pH tem sido alterado pela ao do homem, a biodegradabilidade comumente prejudicada. - temperatura A temperatura um dos fatores ambientais mais importantes que influenciam a atividade e a sobrevivncia dos microrganismos (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). Baixas temperaturas diminuem a fluidez e a permeabilidade da membrana celular, que controla o transporte de nutrientes (e contaminantes) entre o meio exterior e o interior da clula microbiana. Altas temperaturas so associadas com atividades enzimticas mais altas e taxas de biodegradao mais rpidas, at um valor que especfico de cada espcie. Nesta faixa, por exemplo, a taxa de biodegradao dos BTEX pode triplicar em funo de um aumento de temperatura em 10 C (CORSEUIL e WEBER, 1994). Se a temperatura aumenta muito acima do valor timo, protenas, enzimas e cidos nuclicos tornam-se desnaturados e inativos. A temperatura dos primeiros 10 m de subsuperfcie pode variar sazonalmente; contudo, entre 10 e 100 m de profundidade, a temperatura se aproxima da mdia anual da regio (LEE et al., 1988). As guas subterrneas no Brasil tipicamente variam entre 20 a 25 C, que so valores muito favorveis biorremediao.
2.4 Biodegradabilidade dos hidrocarbonetos BTEX

Os BTEX esto presentes em combustveis como a gasolina e em menor quantidade no leo diesel. Estes compostos apresentam maior solubilidade em gua que os outros constituintes de combustveis automotivos, portanto, so os contaminantes que estaro em maior quantidade na gua subterrnea quando os poluentes atingirem o lenol fretico, e 30
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devido aos efeitos malficos sade humana causados por esses compostos de fundamental importncia estudar a capacidade de microrganismos promoverem a sua degradao. A habilidade de microrganismos degradarem BTEX conhecida desde 1908, quando Stormer isolou a bactria Bacillus hexabovorum que apresentou capacidade de crescer aerobiamente em meio contendo tolueno e xileno. A existncia de degradadores de BTEX fato largamente aceito, alm disso, estes microrganismos esto amplamente distribudos. A capacidade de microrganismos naturais do solo em degradar BTEX foi primeiro demonstrada por Gray e Thornton em 1928. Estes pesquisadores encontraram, entre 245 espcies de bactrias presentes em amostras de solos no contaminados, 146 capazes de degradar hidrocarbonetos (GIBSON e SUBRAMANIAM, 1984 apud CORSEUIL e ALVAREZ, 1996). Na biodegradao do BTEX, como de outras substncias, necessrio que haja uma induo de enzimas degradadoras apropriadas. Este processo envolve a ativao de regies especficas do genoma bacteriano. Quando alguns substratos alvos esto presentes, as bactrias iniciam reaes bioqumicas em cascata que resultam na transcrio de genes (plasmdios) que codificam a sntese das enzimas necessrias para degradar o composto alvo. Com relao degradao do BTEX, muitas enzimas requerem induo, e o indutor (p.e. tolueno) deve estar presente em concentraes mais altas que o limite mnimo de induo (LINKFIELD et al., 1989). Em geral esse limite bastante baixo e a induo de enzimas dificilmente um fator limitante na biorremediao de BTEX. Alm disto, contaminaes de BTEX so geralmente descobertas vrios anos aps a ocorrncia do vazamento, e significante aclimatao microbiolgica e induo de enzimas pode ocorrer durante este perodo (CHAPELLE, 1993). Alguns estudos com Pseudomonas putida identificaram vias metablicas dedicadas aos componentes benzeno, tolueno e p-xileno. Lee et al. (1994) provaram que a via de metabolizao do tolueno, codificada pelo plasmdio TOL, em misturas desses compostos, no utiliza o benzeno como substrato. A degradao do tolueno iniciada com uma oxidao e podem ser formados cinco diferentes produtos de oxidao por P. putida contendo tolueno 2,3-dioxigenase, uma enzima que oxida o anel aromtico do tolueno incorporando 1 tomo de oxignio molecular. Nesta reao, tolueno cis-dihidrodiol, um intermedirio formado, convertido no ciclo de Krebs (PARALES et al., 2000). Xilenos podem tambm sofrer a mesma reao oxidativa para o benzil-lcool e ento para um intermedirio do ciclo de Krebs. Somente a via codificada pelo plasmdio TOD pode utilizar benzeno como substrato. 31
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Nos ensaios de biodegradao de Otenio (2000), foi testada a ao da bactria Pseudomonas putida CCMI 852, isolada de uma estao de tratamento de esgoto domstico, sobre benzeno, tolueno e xilenos, individualmente e suas misturas. Os resultados confirmaram a caracterizao genotpica da bactria, avaliando a presena do plasmdio TOL, que possibilita o metabolismo de tolueno e xilenos e suas misturas, e no metabolismo do benzeno. O trabalho ainda concluiu que a presena do benzeno nas misturas inibe a ao da bactria sobre os substratos tolueno e xilenos. Quando clulas bacterianas foram expostas a misturas de compostos aromticos presentes em concentraes iguais, as vias de degradao foram modificadas substancialmente, comparando-se com os dados obtidos quando os substratos estavam individualizados. Os compostos BTEX foram degradados na seguinte seqncia: etilbenzeno, tolueno, benzeno e xilenos (DEEB e ALVAREZ-COHEN, 1999). Substratos facilmente biodegradveis presentes em adio ao BTEX podem ser utilizados preferencialmente e com isso limitar a induo de enzimas degradadoras de BTEX. Este pode ser um fato importante no Brasil, onde a gasolina automotiva contem 22% de etanol, um substrato facilmente degradvel. Neste caso, uma fase inicial de adaptao (fase lag) pode ser observada, durante a qual o etanol degradado antes que qualquer biodegradao significante de BTEX ocorra. Para Corseuil e Marins (1997) e Barker et al. (1987), todos os lcoois primrios podem ser biodegradados em preferncia ao BTEX e consumir o oxignio disponvel, alm de ser txico ou inibitrio ao crescimento dos microrganismos degradadores de BTEX. Hubbard et al. (1994) realizaram experimentos com trs tipos de combustveis: (1) 100% gasolina para o controle, (2) 10% MTBE e 90% gasolina e (3) 85% metanol e 15% gasolina, que foram adicionados gua subterrnea. Ao final de 16 semanas de experimento, 93% e 88% dos BTEX foram degradados no controle e na pluma de gasolina com MTBE, respectivamente, ao passo que apenas 69% dos BTEX na pluma de metanol com gasolina desapareceram. Concordando com a experincia anterior, Santos (1996) verificou a degradao preferencial do etanol por parte dos microrganismos, com isso retardando a degradao dos compostos BTEX. Em seu experimento, uma amostra do contaminante puro foi totalmente consumida em menos de quatro dias, ao passo que misturado a uma grande concentrao de etanol (300 mg/l), em doze dias no foi verificado biodegradao significativa.
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Corseuil e Kulkamp (2003) investigaram a atenuao natural em um derramamento controlado de etanol e diesel. Resultados mostraram que o etanol presente na gua subterrnea agia como consumidor de aceptores de eltrons e nutrientes que poderiam estar disponveis para a bioatenuao dos compostos mono e poliaromricos. Indicadores geoqumicos mostraram que degradao aerbia, reduo de ferro e metanognese eram os principais processos biolgicos responsveis pela degradao do etanol. Enquanto o etanol estava sendo degradado, a concentrao aquosa de BTEX e PAHs ainda estava aumentando perto da fonte do vazamento. Degradao preferencial do etanol foi indicada pelo aumento da concentrao de acetato e diminuio do pH em uma ordem de magnitude. A presena de grande quantidade de metano aps 540 dias de contaminao mostra que as plumas de BTEX e PAHs podem ter uma longa fase lag antes da biodegradao e tornar-se o mecanismo de atenuao desses compostos. Esta fase lag na rea contaminada antes da biodegradao dependente no somente da taxa de degradao do etanol, mas tambm de seus subprodutos acetato e metano. Chiang et al. (1989), num estudo de biodegradao aerbia de BTEX num aqfero arenoso raso, reforaram a idia de que a quantidade de BTEX na gua subterrnea est diretamente relacionada com a disponibilidade de oxignio dissolvido. Observaram que quando a concentrao de oxignio dissolvido era maior que 0,9 ppm a concentrao de BTEX estava ausente. Spilborghs (1997) verificou em sistema de microcosmo o comportamento de um vazamento de gasolina na subsuperfcie. Atravs do sistema de biorremediao air sparging todos os compostos BTX foram degradados num perodo mximo de 126 dias. As concentraes iniciais desses compostos eram de 289 mg/L de benzeno, 308 mg/L de tolueno e 230 mg/L de xilenos. O tolueno foi biodegradado mais rapidamente (98 dias) seguido do benzeno (112 dias) e finalmente os xilenos. Outras pesquisas tambm foram realizadas analisando-se a biodegradao de BTEX em condies anaerbias. Hutchins et al. (1991c) num estudo de otimizao da degradao de BTEX sob condies desnitrificantes, efetuaram testes em laboratrio com amostras vindas de um aqfero da cidade de Traverse, em Michigam. Neste estudo foram criados microcosmos onde foram adicionadas diferentes concentraes de nitrato e nutrientes a substratos com um ou mais hidrocarbonetos. Os resultados mostraram que tolueno, etilbenzeno, m-xileno e pxileno foram degradados at concentraes abaixo de 5 g/L quando presentes como nica fonte de substrato. O ismero o-xileno foi recalcitrante quando presente como nica fonte de 33
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substrato, mas foi degradado vagarosamente na presena de outros hidrocarbonetos. O benzeno no foi degradado dentro de 1 ano, mesmo quando em combinao com tolueno, fenol ou catecol. Esse estudo mostrou uma variedade de condies ambientais com taxas relativamente independentes das concentraes de nutrientes. Entretanto, os dados mostraram que o benzeno recalcitrante sob condio estritamente anaerbia. Uma avaliao da biorremediao usando oxignio, nitrato ou xido nitroso como receptor de eltrons (HUTCHINS et al., 1991b) foi efetuada em microcosmos preparados com material de aqfero contaminado com hidrocarbonetos monoaromticos. Os resultados mostraram que benzeno e alquilbenzeno foram degradados dentro de 7 dias sob condies aerbias, enquanto que somente o alquilbenzeno foi tambm degradado na presena de nitrato e xido nitroso. Hutchins et al. (1992) estudaram em laboratrio a biodegradao de BTEX em colunas preenchidas com material de aqfero sob condies microaeroflicas e de desnitrificao. Foram estudadas trs colunas, a primeira sob condio microaerfila, a segunda sob condio microaerfila mais nitrato e a terceira somente com nitrato. Os resultados mostraram que os alquilbenzenos podem ser degradados sob condio de desnitrificao, sempre que o ambiente for microaerfilo. O benzeno pode ser degradado sob condio microaerfila, mas se mostrou recalcitrante no tratamento apenas com nitrato. No foi apresentado nenhum efeito adverso com a adio de nitrato em ambientes microaerfilos, indicando que a mistura oxignio/nitrato pode ser usada para a biorremediao de aqferos contaminados com BTEX. Os resultados mostraram que o nitrato foi necessrio para uma boa remoo de TEX embora alguma remoo ocorra sem adio de nitrato.
2.5 Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos

Os microrganismos so os principais agentes responsveis pela ciclagem do carbono na natureza. Em muitos ecossistemas existe uma comunidade autctone de microrganismos capazes de degradar hidrocarbonetos (hidrocarbonoclsticos) (KATAOKA, 2001). Os primeiros estudos da utilizao de hidrocarbonetos por microrganismos foram realizados por Sohnger e Kaserer em 1906 (BUSHNELL e HAAS, 1941). Em 1913, Sohnger relatou que gasolina, querosene, parafina e leo de parafina poderiam ser oxidadas a CO2, gua e traos de cidos orgnicos por microrganismos. Os microrganismos estudados pertenciam principalmente aos gneros Mycobacterium e Pseudomonas.
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Gray e Thornton (1928) isolaram vrios organismos capazes de decompor compostos aromticos como naftaleno, tolueno, cresol e fenol pertencentes aos seguintes gneros: Micrococcus, Mycobacterium, Bacterium, Bacillus e Spirillum. A habilidade em degradar hidrocarbonetos no restrita a apenas alguns gneros de microrganismos, pois, vrios grupos de bactrias, fungos e actinomicetos tm mostrado possuir essa capacidade (KATAOKA, 2001). Zobell (1946a), em uma extensa reviso sobre a ao dos microrganismos nos hidrocarbonetos, descreveu que muitas espcies tm a habilidade de utilizar hidrocarbonetos como nica fonte de carbono e energia e que estes microrganismos esto amplamente distribudos na natureza. Observou o autor que mais de 100 espcies de 30 gneros microbianos foram capazes de utilizar hidrocarbonetos. Komagata et al. (1964) examinaram cerca de 500 espcies de leveduras quanto capacidade de utilizar hidrocarbonetos. Destas, 56 espcies possuam esta capacidade, sendo que a maioria delas pertencia ao gnero Candida. Ahearn et al. (1971) isolaram espcies de Candida, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sacharomyces, Sporobolomyces e Trichosporom, todas capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Gutnick e Rosenberg (1977) postularam 3 caractersticas essenciais para a utilizao de hidrocarbonetos pelos microrganismos: um sistema eficiente de absoro de hidrocarbonetos com stios especiais de ligao e/ou produo de substncias emulsificantes para o transporte do hidrocarboneto ao interior da clula; enzimas oxigenases especficas; especificidade induzida resposta positiva do organismo ao hidrocarboneto.
Deste modo, os vrios meios que os microrganismos tm desenvolvido a fim de solucionar estes trs problemas provavelmente contribuem para o fato de mais de 200 espcies diferentes terem sido descritas com capacidade de utilizao de hidrocarbonetos (KATAOKA, 2001). Leahy e Colwell (1990) citam os seguintes gneros de bactrias como os mais importantes: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas. Kadri et al. (1986), Shamshoom et al. (1990), Sorkhoh et al. (1990), Al-Hadhrami et al. (1995), estudando a distribuio de bactrias que
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degradam hidrocarbonetos, identificaram: Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Bacillus sp., Escherichia coli, Flavobacterium sp., Klebsiella cepacia, Micrococcus luteus, Moraxella phenylpiruvica, Nocardia sp., Ochrobactrum anthropi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp., Proteus mirabilis, Vibrio sp., Rhodococcus sp., Streptomyces sp., Vibrio fisheri e Xanthomonas maltophilia. Em uma reviso sobre estudos ecolgicos de bactrias que degradam
hidrocarbonetos, Rosemberg e Gutnick (1981) verificaram que estes microrganismos esto potencialmente localizados em todas as reas naturais, embora apresentem grandes variaes em suas concentraes celulares. Nestes estudos, os pesquisadores investigaram a relao entre bactrias degradadoras de hidrocarbonetos e o total de bactrias heterotrficas no solo. Seus trabalhos demonstraram que a variabilidade dos microrganismos degradadores de hidrocarbonetos encontradas em um ecossistema particular mudou de acordo com o perodo em que se realizou a amostragem e a extenso da poluio com o resduo. Pinholt et al. (1979) verificaram que a populao de bactrias hidrocarbonoclsticas variou de 106 a 107 por grama de solo seco, concordando com os resultados apresentados por Jensen (1975) e Raymond et al. (1976). O autor concluiu ainda que pela restrita quantidade de biomassa de fungos e dada a resposta bacteriana aos hidrocarbonetos, h indicao de maior atividade das bactrias na decomposio dos hidrocarbonetos. Venkateswaram e Harayama (1995), atravs do enriquecimento de culturas, isolaram uma populao bacteriana capaz de degradar petrleo bruto, verificando que 28-51% da frao saturada e 0-18% da frao aromtica presentes foram biodegradadas por uma cultura mista. Contudo, quando as culturas foram colocadas puras, nenhuma delas apresentou melhor degradao do que quando estavam consorciadas. As espcies isoladas foram Acinetobacter sp., Pseudomonas vesicularis, Pseudomonas diminuta, Moraxella sp. , Sphingobacterium sp. e Ochrobactrum sp.. Em uma cultura mista, o produto metablico pode ser degradado por uma outra espcie e o ataque de outros microrganismos pode levar a uma completa degradao do produto, mesmo que dentro da comunidade no exista um microrganismo capaz de degrad-lo totalmente (KATAOKA, 2001). Deste modo, estudos realizados com cultura mista possuem vantagens sobre estudos realizados com cultura pura. A primeira e mais importante que a capacidade biodegradativa de uma comunidade muito maior quantitativa e qualitativamente. Segundo, a resistncia da
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comunidade a substncias txicas pode ser muito maior porque h uma maior probabilidade de que um organismo que possa detoxific-las esteja presente, e finalmente, o fato de que a mineralizao de compostos xenobiticos algumas vezes requer a unio da atividade de mltiplas enzimas (GRADY, 1985). Entretanto, devido a grande dificuldade de anlise de misturas complexas, a maioria dos trabalhos realizados sobre microrganismos que degradam hidrocarbonetos tm sido realizados envolvendo o crescimento de um nico microrganismo sobre um nico hidrocarboneto ou uma classe de hidrocarbonetos relacionados (KATAOKA, 2001). Alm das bactrias, os fungos representam importante papel na degradao dos hidrocarbonetos no solo, suas enzimas extracelulares podem proporcionar substratos para o crescimento de bactrias atravs da hidrlise de polmeros e tambm importantes metablitos secundrios. O mecanismo da degradao de hidrocarbonetos por fungos tm sido menos estudado, mas provavelmente envolve oxigenases induzveis similares as apresentadas por Mycobacterium e Nocardia (RUDD et al., 1996). A habilidade dos fungos em utilizar hidrocarbonetos ocorre principalmente em duas ordens: Mucorales e Moniliales. Os gneros Aspergillus e Penicillium possuem muitas espcies que assimilam hidrocarbonetos, contudo, esta caracterstica uma propriedade individual da espcie e no necessariamente uma caracterstica particular do gnero (RISERROBERTS, 1992). Ao contrrio das bactrias e leveduras que mostram decrscimo na capacidade de degradao de alcanos com o aumento da cadeia do composto, os fungos filamentosos parecem ser mais hbeis em degradar ou transformar hidrocarbonetos de estrutura complexa e de cadeia longa. Entretanto, o metabolismo dos fungos geralmente resulta numa degradao incompleta que necessita da associao de bactrias para alcanar a completa oxidao do composto (RISER-ROBERTS, 1992). De acordo com Atlas (1995), durante a biodegradao de hidrocarbonetos aromticos por bactrias h a formao de cis-diols, enquanto que durante a biodegradao por fungos formam-se trans-diols. Uma vez que muitos trans-diols so potentes carcinognicos e que os cis-diols no so ativos biologicamente, a biodegradao de hidrocarbonetos aromticos por bactrias resulta em sua detoxificao sem produo de carcingenos potenciais. Atualmente, grande ateno tem sido dada biodegradao de hidrocarbonetos por fungos da podrido branca da madeira. Dentre estes, Phanaerochaete chrysosporium tem sido
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usado como organismo modelo na maioria destes estudos. Embora o substrato natural degradado por este fungo seja a lignina, o complexo enzimtico por ele secretado pode degradar grande variedade de poluentes recalcitrantes. Esta habilidade tem sido explicada pela similaridade estrutural destes poluentes por pores da estrutura da lignina e a baixa especificidade das ligninases produzidas por P. chrysosporium (BRODKORB e LEGGE, 1992). Algumas cianobactrias e algas tambm possuem a capacidade de utilizar hidrocarbonetos, dentre elas destacando-se os gneros: Oscillatoria, Microcoleus, Anabaena, Nostoc, Chlorella, Chlamydomonas e Ulva (ATLAS, 1981). Pelos trabalhos anteriormente mencionados, pode-se afirmar que microrganismos que degradam hidrocarbonetos tm sido isolados de todos os tipos de ambientes nos quais foram pesquisados, parecendo provvel que qualquer ambiente possa ter ao menos uma pequena populao destes organismos (BAZYLINSKI et al., 1989) e que esta populao aumenta aps a adio destes compostos no solo (PINHOLT et al., 1979). Assim, a proporo de microrganismo hidrocarbonoclsticos dentro da comunidade microbiana depende do grau de exposio do ambiente ao poluente. De acordo com Riser-Roberts (1992), em ecossistemas no poludos, estes microrganismos constituem menos de 1 % da comunidade microbiana e em ecossistemas poludos podem chegar a constituir 100 % da comunidade. Le Petit et al. (1977) verificaram que 10 % do total de bactrias isoladas de um efluente de refinaria de petrleo eram bactrias hidrocarbonoclsticas e que somente 4 % dessas bactrias foram isoladas em uma rea no poluda.
2.6 Mtodos de avaliao da biodegradao em laboratrio

Para demonstrar que uma tecnologia de biorremediao potencialmente til, importante verificar a biodegradao dos poluentes sob condies controladas. Isto geralmente no possvel de se obter in situ, assim, esta verificao deve ser obtida atravs de experimentos laboratoriais, os quais demonstram o potencial que um determinado tratamento pode ter em estimular a remoo de xenobiticos de um local contaminado (BAILEY et al., 1973). Experimentos laboratoriais que mais se aproximam das condies reais do ambiente so provavelmente os mais capazes de produzirem resultados relevantes (BERTRAND et al., 1983). Em muitos casos, isto envolve o uso de amostras coletadas no campo que contenham populaes microbianas autctones. Em tais experimentos importante incluir controles que possam diferenciar fatores abiticos como a evaporao e a fotodegradao das taxas de 38
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biodegradao. Os experimentos no excluem a necessidade de demonstraes em campo, contudo so crticos para se estabelecer a credibilidade cientfica de uma determinada estratgia de biorremediao (ATLAS, 1997). Os parmetros tipicamente medidos em testes laboratoriais da eficincia da biodegradao incluem a contagem de microrganismos heterotrficos totais, contagem de microrganismos degradadores de um ou de vrios substratos especficos, medidas da taxa de respirao microbiana (consumo de oxignio e/ou produo de dixido de carbono) e a determinao das taxas de degradao (desaparecimento de poluentes individualmente e/ou na totalidade) (SONG et al., 1990; BALBA et al., 1998; OH et al., 2000; KATAOKA, 2001). A presena de grande populao de microrganismos heterotrficos totais no apresenta necessariamente correlao direta com a biodegradao, porm, a quantificao da frao da comunidade que degrada o resduo de interesse tem sido utilizada como um dos mtodos mais comuns para o monitoramento de poluio ambiental com hidrocarbonetos (KATAOKA, 2001). Song e Bartha (1990), estudando o efeito da adio de combustvel de avio sobre a comunidade microbiana do solo, verificaram que, aps 2 semanas, cerca de 90% dos microrganismos heterotrficos do solo eram degradadores de hidrocarbonetos, ainda que a porcentagem inicial destes microrganismos representasse somente 0,01% da populao de heterotrficos aerbios. Os mtodos respiromtricos (consumo de oxignio e/ou produo de dixido de carbono) podem ser utilizados como um primeiro teste para se avaliar a pronta ou inerente biodegradabilidade de poluentes em solo ou gua. Estes testes so geralmente conduzidos sob condies timas com respeito umidade, temperatura, nutrientes minerais, inoculao microbiana e aerao (se o teste aerbio). Testes que obtm uma converso de 30 % (CETESB, 1990) ou 50 a 60% (ATLAS, 1997) a CO2 dentro de um especfico perodo de tempo, indicam que, sob condies apropriadas, os poluentes sero biodegradados pelos microrganismos. Uma possvel maneira de se conduzir experimentos respiromtricos atravs do respirmetro de Bartha & Pramer, cujo mtodo utilizado na determinao da taxa de biodegradao da matria orgnica contida em resduos presentes em solos (CETESB, 1990). Kataoka (2001), utilizando o respirmetro de Bartha & Pramer, avaliou a biodegradao de borra oleosa, um resduo proveniente de refinaria de petrleo, em solo de landfarming. Esta mesma metodologia foi utilizada em Siviero (1999), Souza (2000), Siviero et al. (2000),
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Inazaki et al. (2004), Crivelaro (2005), Hencklein (2005), Guerra e Angelis (2005) e Mariano et al. (2005, 2006a, b e c). Freijer et al. (1996), avaliando a produo de CO2 como um parmetro da biodegradao de hidrocarbonetos, concluram que para contedos de hidrocarbonetos maiores que 1,0 g/kg de solo, a produo de CO2 est fortemente relacionada ao consumo de hidrocarbonetos, entretanto, para contedos menores que 1,0 g/kg de solo, a produo de CO2 aumentava abruptamente, isto provavelmente devido menor disponibilidade de hidrocarbonetos, o que ocasionou aumento relativo da mineralizao da biomassa morta, proporcionando diminuio na poro da mineralizao de hidrocarbonetos em relao produo total de CO2. Indubitavelmente, a medida mais direta da eficincia da biodegradao o monitoramento da taxa de consumo dos poluentes. A caracterizao dos componentes individuais de uma classe especfica de hidrocarbonetos exige o uso da cromatografia lquida de alta preciso (CLAE) ou cromatografia gasosa (CG) acoplada a um detector (p.ex., o espectrmetro de massa (CG-EM)) (FERRARI, 1996). Segundo Blackburn et al. (1993), a combinao das tcnicas CG/EM o mtodo mais eficaz para a quantificao de um resduo oleoso, pois, combina a resoluo do ponto de ebulio com informaes sobre o tipo de molcula dos compostos. Outro detector muito utilizado na determinao dos BTEX e PAHs o detector de ionizao por chama (FID) (CETESB, 2003).
2.7 Processo de intemperizao do leo diesel

A composio de um produto quando lanado ao meio ambiente comea a transformar-se quase imediatamente por causa de inmeros processos bioqumicos e fsicos. A geoqumica relacionada a hidrocarbonetos descrita em detalhes por Kaplan et al. (1997). De acordo com os pesquisadores, os hidrocarbonetos lanados ao meio ambiente esto sujeitos a reaes biticas e abiticas no solo e na gua subterrnea. Estes processos atuam juntos, com uma taxa de transformao relacionada com a composio qumica do combustvel e fatores ambientais locais, incluindo temperatura, umidade do solo e contedo de nutrientes e oxignio. A granulometria do solo tambm e um importante parmetro para controlar os processos de intemperizao. A maioria das reaes abiticas inclui a hidrlise, a desidrogenao, a oxidao e a polimerizao (LYMAN et al., 1992). Estas reaes ocorrem comitantemente com as transformaes microbianas ao longo do perfil do solo. A intemperizao bitica de hidrocarbonetos consiste em dois mecanismos independentes: 40
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absoro microbiana (BAUGHMAN e PARIS, 1981) e regime metablico (SINGER e FINNERTY, 1984). Estas transformaes so provveis de acontecerem em etapas, produzindo lcoois, fenis, aldedos e cidos carboxlicos, em seqncia. A biodegradao o principal processo de intemperizao de destilados mdios, como o leo diesel (KAPLAN et al., 1997). O leo diesel contem de 2000 a 4000 hidrocarbonetos que compem uma mistura de compostos de cadeias lineares e ramificadas, cicloalcanos e compostos aromticos obtidos da destilao da frao mdia do petrleo (GALLEGO et al., 2001). Alguns desses compostos podem ser usados como indicadores na avaliao da intemperizao do leo diesel. Mudanas na razo das concentraes de hidrocarbonetos como benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) so devidas principalmente a processos de evaporao e dissoluo. Estes compostos so caracterizados pela alta presso de vapor e relativa solubilidade em gua. Benzeno e tolueno dissolvem preferencialmente na gua subterrnea quando comparados com o etilbenzeno e os xilenos, os quais tm menor solubilidade e so mais recalcitrantes biodegradao (KAPLAN et al., 1997). Os hidrocarbonetos poliaromticos (HPA) so outra ferramenta til no
monitoramento das alteraes ambientais. Alguns dos HPA presentes no leo diesel esto entre os menos afetados pela intemperizao. Estes compostos semi-volteis com baixa solubilidade e caractersticas recalcitrantes podem persistir por um longo perodo no ambiente. O processo de intemperizao tambm pode ser avaliado analisando os hidrocarbonetos totais de petrleo (HTP). Neste caso, perfis cromatogrficos de um leo diesel inalterado, geralmente apresenta um resoluo satisfatria para n-alcanos e alguns isoprenides como o pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) e o fitano (2,6,10,14tetrametilhexadecano). Entretanto, a maior frao do leo diesel no caracterizada porque a maioria dos componentes no podem ser resolvidos e estes aparecem nos cromatogramas como uma lombada, que chamada de mistura complexa no resolvida (MCNR), a qual presumidamente inclui alcanos ramificados e cclicos e produtos das transformaes (MARCHAL et al., 2003; BREGNARD et al., 1996). Os hidrocarbonetos resolvidos so chamados hidrocarbonetos totais resolvidos (HTR) e os HTP so a soma dos HTR com a MCNR. Os HTR so hidrocarbonetos no degradados, e aparecem como picos nos cromatogramas.
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Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos usualmente degradam alcanos ramificados e compostos isoprenides em velocidades menores que os alcanos de cadeias lineares. Portanto, a razo de alcanos lineares em relao aos compostos altamente ramificados pode refletir a extenso de degradao do leo diesel causada por microrganismos (BALBA et al., 1998). Nos cromatogramas a lombada correspondente MCNR torna-se maior e os picos dos HTR diminuem devido biodegradao.
2.8 Produo de biossurfactantes utilizando-se matrias primas alternativas

Os surfactantes so uma ampla classe de molculas anfipticas (com domnio polar e apolar) que so capazes de diminuir as tenses superficial e/ou interfacial entre gases, lquidos e slidos com uma grande variedade de aplicaes, tanto industriais como na limpeza de locais contaminados com hidrocarbonetos. Contudo, surfactantes sintticos mostram alta toxicidade, baixa biodegradabilidade e eficincia somente em faixas pequenas de pH e temperatura. Devido a essas limitaes, o interesse pelos biossurfactantes (surfactantes de origem microbiana), produzido por certas bactrias, leveduras e fungos, tem aumentado devido baixa toxicidade, natureza biodegradvel e eficincia em valores de temperatura, pH e salinidade extremos e seu papel na recuperao de ecossistemas pela acelerao da biodegradao dos hidrocarbonetos provenientes de vazamentos. Alm disso, alguns biossurfactantes apresentam capacidades anti-fngicas, anti-virais e de soro de metais e so usados na indstria do petrleo para aumentar a recuperao do petrleo (OLIVEIRA et al., 2005; PRUTHI e CAMEOTRA, 1997). Contudo, a viabilidade comercial dos biossurfactantes ainda limitada pelos altos custos de produo, associados a mtodos ineficientes de recuperao e ao uso de matrias primas de alto valor (protenas) (NITSCHKE e PASTORE, 2002). Estes custos podem ser significantemente minimizados com o desenvolvimento de processos mais eficientes e o uso de matrias primas de baixo custo, que correspondem de 10 a 30% do custo total (CAMEOTRA e MAKKAR, 1998).
-1
Os
biossurfacantes
podem
ser
produzidos
comercialmente em nveis de at 100 g.L , como reportado para os raminolipidios produzidos por Pseudomonas (MAIER e SOBERON-CHAVEZ, 2000). A combinao desse nvel de produo com o uso de matrias primas de baixo custo como resduos orgnicos, pode diminuir o custo dos biossurfactantes a patamares competitivos em relao ao surfactante sinttico (MAKKAR e CAMEOTRA, 2002). Substratos alternativos para a produo de biossurfactantes tm sido sugeridos (KOSARIC et al., 1984; MERCAD, 1994; MAKKAR e 42
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CAMEOTRA, 2002), especialmente resduos agrcolas miscveis em gua como o soro de leite, manipueira (gua derivada da prensagem de mandioca) ou resduos de destilarias (BABU et al., 1996; PATEL e DESAI, 1997; DANIEL et al., 1998 e 1999; COPPEDE et al., 2005; LIMA et al., 2005, NITSCHKE e PASTORE, 2006). No entanto, poucos exemplos so encontrados do uso de resduos hidrofbicos como o leo residual de frituras (HABA et al., 2000; JACKISCH-MATSURA e DURRANT, 2005), leo lubrificante usado (MERCAD et al., 1996) e borra oleosa de refinarias de petrleo (PIRLLO, 2006). Assim, muitos estudos relacionados aos biossurfactantes, atualmente, referem-se busca de fontes de matrias primas alternativas como uma das possibilidades de diminuio de custos de produo (MARIANO et al., 2006d).
2.9 - Vinhaa
A vinhaa um subproduto do processo de destilao do lcool, cuja disposio representa um importante problema ambiental principalmente devido ao grande volume gerado e sua alta demanda biolgica de oxignio (DBO). Em mdia, para produzir um litro de lcool, 10 a 15 litros de vinhaa so produzidos, dependendo da qualidade da cana e do processo industrial (CORTEZ et al., 1992), o que corresponde a aproximadamente 170 bilhes de litros por ano desse resduo no Brasil (AGRIANUAL, 2004). Considerando que cada 2 litros de vinhaa so equivalentes ao esgoto domstico gerado por uma pessoa por dia (LUKSSEMBERG et al., 1980 apud GONALVES e SILVA, 2000), a produo anual de vinhaa corresponde a uma quantidade de esgoto domstico produzido por uma populao estimada de 232 milhes de pessoas durante um ano. Este resduo um liquido mbar claro consistindo basicamente de gua (93%), slidos orgnicos e minerais (7%). Sua composio qumica varivel, dependendo, entre outros fatores, da disponibilidade de gua, caractersticas da cana de acar e dos processos de fermentao e destilao empregados (FERRAZ et al., 1986). A vinhaa apresenta alta turbidez e pH baixo, com altos nveis de matria orgnica (principalmente glicerol, um fonte de carbono solvel), potssio, clcio e quantidades moderadas de nitrognio e fsforo (RODELLA et al., 1983; TAUK, 1987; GMEZ e RODRGUEZ, 2000). No Brasil freqente a disposio da vinhaa nos campos agrcolas, um processo chamado ferti-irrigao, como um substituto parcial ou total de fertilizantes minerais, principalmente potssio. Este procedimento mais aceitvel ambientalmente que o antigo meio de disposio, quando a vinhaa era descartada nos rios prximos s usinas, e tem uma boa receptibilidade pelas usinas devido a sua simplicidade tcnica e vantagens econmicas 43
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(CORAZZA, 1999). No Estado de So Paulo, onde a maior parte das plantaes de cana se localiza, este procedimento controlado por uma legislao especfica que determina como calcular a dosagem de vinhaa no solo (CETESB, 2005b). A adio de vinhaa em taxas adequadas tem demonstrado aumentar o rendimento na produo da cana de acar, contudo, a longo prazo, a aplicao intensiva da vinhaa pode aumentar a salinidade do solo (CORAZZA, 1999), afetar a qualidade da cana e contaminar a gua subterrnea (GONALVES e SILVA, 2000). Alguns trabalhos mostram que a vinhaa pode modificar temporariamente algumas caractersticas qumicas e biolgicas do solo, como pH, carbono orgnico, acidez trocvel (CAMARGO et al., 1987) e a atividade microbiana e biomassa (MINHONI e CERRI, 1987). Ramalho e Sobrinho (2001) verificaram que o uso da vinhaa em larga escala no altera significantemente a concentrao de metais pesados no solo. Fontes (1988), Cardoso (1988) e Itamar (1987) observaram que a vinhaa aumenta as concentraes de clcio, magnsio, matria orgnica e principalmente potssio, causando uma elevao da condutividade eltrica do solo. Considerando que a produo de etanol no Brasil est em expanso devido a crescente demanda interna e internacional por fontes alternativas de energia e que o solo tem uma capacidade de suporte limitada para receber a vinhaa, a busca por alternativas para tratar ou reutilizar a vinhaa crucial. Corazza (1999) relata tecnologias alternativas onde a vinhaa reciclada no processo de fermentao, tratada em reatores anaerbios, ou usada para produzir extrato de levedura, rao animal e tambm empregada na construo civil. Em relao ao uso da vinhaa como um agente intensificador da biodegradao de poluentes, Prata et al. (2001) avaliaram os efeitos da vinhaa na degradao e soro do herbicida ametrina. A adio da vinhaa aumentou a atividade microbiana e a degradao da ametrina, e a soro no foi afetada. Crivelaro (2005) estudou o uso da vinhaa como agente acelerador da biodegradao de borra oleosa em solo. Foi observado um aumento na populao microbiana, principalmente fungos, e um ligeiro aumento da eficincia da biodegradao.
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3 - MATERIAL E MTODOS
Amostras de solo e gua subterrnea foram coletadas em trs postos de combustveis localizados nas cidades paulistas de Santa Brbara dOeste, guas de So Pedro e Rio Claro, sendo que neste ltimo apenas solo foi coletado. As amostras bem como os postos de combustveis foram designados de acordo com as seguintes siglas: SB, ASP e RC, respectivamente.
3.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB

A biorremediao natural da gua subterrnea contaminada com leo diesel no posto de combustveis SB foi avaliada mediante o monitoramento de indicadores geoqumicos e microbiolgicos. A rea foi monitorada durante dois anos (entre Maio de 2004 e Abril de 2006) e neste perodo foram realizadas quatro coletas de amostras de gua subterrnea, cada uma avaliada quanto aos parmetros fsico-qumicos, microbiolgicos e concentrao de hidrocarbonetos. 3.1.1 Descrio da rea A descrio da rea baseada em relatrios fornecidos pela empresa Geoinform Pesquisas Geolgicas S/C Ltda, com sede no municpio de Rio Claro. O posto de combustveis est localizado no municpio de Santa Brbara dOeste (22 4515 S e 47o 24 58 W) 138 km da capital paulista. Geologicamente situa-se na Bacia Sedimentar do Paran em rea onde ocorrem o Sistema Aqfero Tubaro (ou Itarar) e os aqferos Diabsio e Cenozico, cada qual com diferentes caractersticas de circulao de gua subterrnea (WATERLOO, 1999).
o
Material e Mtodos
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No ano de 1994 foi constatado vazamento em um tanque de armazenamento subterrneo de combustvel com leo diesel, o qual, na poca, foi imediatamente isolado e retirado. Os trabalhos de avaliao de impacto ambiental na rea comearam em 1999. Inicialmente foram conduzidas 12 sondagens de solo, seguido da instalao de 4 poos de monitoramento. Nesta avaliao inicial no foi verificada a presena de fase livre de combustvel, tanto nos furos das sondagens como na instalao dos poos de monitoramento (WATERLOO, 1999). A regio prxima ao posto de combustveis caracterizada por uma ocupao essencialmente residencial, com ocorrncia de alguns comrcios locais de pequeno porte, no sendo observada grandes lojas comerciais, shopping center, terminais de transporte coletivo ou outro tipo de atividade que favorea a concentrao de pessoas. A pavimentao das ruas vizinhas ao posto de asfalto na sua totalidade, no existindo ruas pavimentadas com paraleleppedos. Na rea localizada nas vizinhanas do posto, o abastecimento pblico de gua e a coleta de esgoto so feitos pelo Departamento de guas e Esgoto (DAE). Em um raio de 500 m a partir do posto, no foi identificado nenhum poo particular ou pblico de captao de gua subterrnea (WATERLOO, 1999). Na rea foram construdos 4 poos de monitoramento para a caracterizao hidrogeolgica e verificao de contaminao associada gua subterrnea (atualmente somente 3 poos esto disponveis). Foram identificados quatro horizontes geolgicos no local (WATERLOO, 1999): aterro areno-siltoso (0,15 a 0,30 m); silte arenoso levemente consolidado (0,42 a 1,16 m); areia siltosa consolidada (0,90 a 2,85 m); arenito pouco alterado de dureza mdia a alta (2,85 m). Na rea de interesse foi identificado at a profundidade investigada (em torno de 5 m) um aqfero de carter livre, anisotrpico e heterogneo, associado aos tipos litolgicos descritos anteriormente. Os trs primeiros horizontes no apresentam estratificao sedimentar, sendo a heterogeneidade textural e granulomtrica sua caracterstica mais marcante; a estratificao plano-paralela aparece a partir do quarto horizonte e constitui uma importante varivel hidrogeolgica (WATERLOO, 1999). A partir de testes de formao do tipo slug test, o valor da condutividade hidrulica mdia obtida foi de 5,38.10-4 cm/s. O nvel dgua mdio obtido foi de 1,79 m. Com base nas cargas hidrulicas obtidas nos poos de monitoramento, foi elaborado um mapa potenciomtrico para a rea, o qual apresentado na Figura 3.1. Nele pode-se observar que o sentido geral de fluxo de sul para o norte seguindo a topografia local. O gradiente hidrulico 46
Material e Mtodos
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mdio observado no mapa potenciomtrico de 3%. Os valores de condutividade hidrulica obtidos para o local so caractersticos de aqferos constitudos por materiais silto-arenosos, conforme a classificao de Freeze e Cherry (1979). Segundo o estudo feito por Gelhar et al. (1992), os valores de porosidade total e efetiva para os aqferos de composies litolgicas semelhantes ao da rea de interesse so em torno de 25%. A velocidade mdia de escoamento calculada com base na Lei de Darcy foi de 6,46.10-5 cm/s ou 5,58 cm/dia. Por outro lado, considerando-se o menor e o maior valor de condutividade hidrulica obtidos nos slug tests, tem-se que a velocidade da gua para a rea pode variar entre 1,84 e 12,13 cm/dia (WATERLOO, 1999).
SB3 N
LEGENDA
96.000 95.000 94.000
SB2
posto de combustveis poo de monitoramento local do vazamento
SB1
93.000
92.000
91.000 0
mo dificado de Waterlo o (1 999)
10
20 m
Figura 3.1 - Mapa da rea e localizao dos poos de monitoramento (Posto SB). 3.1.2 Amostragem de gua subterrnea Inicialmente em cada ponto de coleta (poos de monitoramento SB1, SB2 e SB3, Figura 3.1) realizou-se a medio da profundidade do nvel dgua (nvel esttico) e em seguida procedeu-se o esgotamento dos poos de monitoramento utilizando-se amostradores descartveis do tipo bailer. Aps a recuperao dos poos, realizaram-se medidas de temperatura e condutividade eltrica, ambas com a sonda YSI 3000 TLC e a coleta de gua subterrnea com os amostradores bailer (Figura 3.2).
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Material e Mtodos
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As amostras foram transferidas para diferentes frascos de coleta de acordo com a finalidade da anlise: hidrocarbonetos BTEX (vial com septo exposto faceado de teflon, 40 mL); hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPA) (frasco de vidro mbar, 1 L); anlises fsico-qumicas (frascos plsticos, 2 L); anlises microbiolgicas (tubos de cultura com rosca, 10 mL, previamente autoclavados para assegurar a esterilidade). Os frascos foram mantidos sob refrigerao at a execuo das anlises.
Figura 3.2 - Coleta de amostra de gua subterrnea com amostrador bailer descartvel (posto SB). 3.1.3 Anlises fsico-qumicas Em campo foram realizadas medidas de oxignio dissolvido (Hanna HI 9142). Determinaes de pH (Analion IA601) e Eh (Hanna HI 8314) foram realizadas em laboratrio no mesmo dia da coleta. O eletrodo de Ag/AgCl (Orion 9002) utilizado na leitura do potencial redox foi calibrado utilizando-se uma soluo contendo um par redox estvel e conhecido (ZOBELL, 1946b). Em laboratrio, as concentraes dos ons nitrato, sulfato, fosfato, potssio, clcio, magnsio e ferroso foram determinadas utilizando-se o espectrofotmetro Hach (DR 2000) (HACH, 1992). A determinao de cloreto foi conduzida utilizando-se o eletrodo on seletivo 48
Material e Mtodos
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Orion modelo 9417B e o eletrodo de referncia Orion modelo 9002 acoplados ao analisador de ons Analion IA601. Para a calibrao foram utilizados padres de concentraes conhecidas e compatveis com o esperado para as amostras (TONETTO e BONOTTO, 1999). As determinaes de sdio para as trs primeiras coletas foram efetuadas por espectrofotometria de absoro atmica (FAAS), com o espectrofotmetro GBC 608 no Laboratrio de Geoqumica (LABOGEO) no IGCE/Unesp. Para a ltima coleta, utilizou-se o eletrodo combinado Orion (8611BN) acoplado ao analisador de ons. A alcalinidade total foi determinada por titulao usando uma soluo padro de cido sulfrico (0,020 N) at que o ponto final fosse evidenciado pela mudana de cor da soluo indicadora (HACH, 1992). Os valores obtidos correspondem a concentraes de bicarbonato, j que nem carbonatos ou hidrxidos foram caracterizados. A anlise dos slidos totais em suspenso (STS) consistiu em separar os slidos suspensos por filtrao de um determinado volume atravs de membrana Millipore de 47 mm de dimetro e 0,45 m de porosidade. Aps a filtragem, levou-se a membrana a secar por um perodo de 24 horas. Em seguida, efetuaram-se pesagens sucessivas dessa membrana at a obteno de valores constantes. O valor de STS foi expresso como uma razo entre a massa de material retido e o volume de amostra (TONETTO e BONOTTO, 1999). As anlises de BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos) e HPA (hidrocarbonetos poliaromticos) foram realizadas pelo Laboratrio de Qumica Ambiental do Instituto de Qumica da USP de So Carlos (IQSC) de acordo com as metodologias USEPA 8015 e 8270, respectivamente. 3.1.4 Anlises microbiolgicas A contagem de bactrias heterotrficas totais nas amostras de gua subterrnea foi realizada com a tcnica pour plate em placas de Petri contendo o meio PCA (Acumedia, EUA), incubadas durante 48 h a 35 oC. As metodologias descritas em Aaronson (1970) foram utilizadas para averiguar a presena na gua subterrnea (ponto SB3, 1 coleta) de bactrias oxidantes de benzeno e tolueno e bactrias do gnero Pseudomonas capazes de degradar naftaleno. A verificao qualitativa da presena de coliformes totais e da bactria Escherichia coli foi realizada com plaqueamento utilizando-se o meio de cultura chromocult (Merck, Alemanha). As colnias so diferenciadas pela cor: coliformes totais (violeta) e E. coli (rosa).
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Material e Mtodos
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3.2 Amostragem de solo nos postos de combustveis

3.2.1 - Postos de combustveis ASP e SB Inicialmente o revestimento de concreto do piso da rea foi rompido utilizando-se uma talhadeira (marca BOSCH, modelo SDS-max RTEX 400 mm) acoplada a um martelo/furadeira rompedor (marca BOSCH, modelo GBH 11DE). O procedimento seguinte consistiu na perfurao do solo com trado rotativo manual (Figura 3.3), de dimetro igual a 2, at a profundidade dos pontos de coleta. A coleta das amostras de solo foi realizada com liner de PVC embutido em um amostrador AMS em ao inox, prprio para esta funo. As amostras foram coletadas na profundidade da franja capilar (ASP 1,60 m; SB 2,60 m). As amostras coletadas foram divididas em duas alquotas. A primeira (~ 400g) foi armazenada em saco plstico destinada ao ensaio de anlise granulomtrica e a segunda (~ 2 kg) foi acondicionada no mesmo tipo de embalagem e em seguida identificada e armazenada sob refrigerao para a utilizao nos ensaios de biodegradao. A escolha da localizao das sondagens considerou os locais de maior probabilidade de ocorrncia de contaminao. No posto SB a sondagem foi localizada prximo ao poo de monitoramento 3 (SB3) e ao tanque que apresentou vazamento; no posto ASP a sondagem foi localizada a jusante do tanque que apresentou vazamento.
Figura 3.3 - Realizao da sondagem com trado rotativo manual (Posto SB). 3.2.2 - Posto de combustveis RC Neste local a amostra de solo foi coletada a 0,50 m de profundidade durante a substituio de tubos subterrneos (Figura 3.4). A amostra foi acondicionada em saco plstico
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Material e Mtodos
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e em seguida identificada e armazenada sob refrigerao para a utilizao nos ensaios de biodegradao e caracterizao fsico-qumica.
Figura 3.4 Coleta de solo no posto RC.
3.3 Anlises realizadas nos solos

3.3.1 Caracterizao fsico-qumica A caracterizao fsico-qumica do solo foi realizada pelo laboratrio Instituto Campineiro de Anlise de Solo e Adubo (ICASA), de acordo com a metodologia Embrapa (1997), com exceo das seguintes anlises: nitrognio total (Laboratrio PIRASOLO - Laboratrio Agrotcnico Piracicaba) (EMBRAPA, 1997); anlise granulomtrica; umidade. A anlise granulomtrica das amostras SB e ASP foi realizada no Laboratrio de Geotcnica do Departamento de Geologia Aplicada do Instituto de Geocincias e Cincias Exatas da Unesp, campus de Rio Claro. A anlise seguiu o que preconiza a norma ABNT NBR 7181 Solo - Anlise Granulomtrica (ABNT, 1984), segundo a qual os mtodos do peneiramento e da sedimentao so utilizados, respectivamente, para a separao das fraes arenosas e para a quantificao da frao silte e argila. As fraes constituintes do solo foram 51
Material e Mtodos
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classificadas segundo a norma ABNT NBR 6502 Rochas e Solos (ABNT, 1995), a qual de acordo com o dimetro das partculas (Dp) considera frao areia (0,06 mm < Dp < 2,0 mm), frao silte (0,002 mm < Dp < 0,06 mm) e argila (Dp < 0,002 mm). A umidade foi calculada pela diferena de massa aps secagem do solo em estufa (120 C). 3.3.2 Anlise cromatogrfica A determinao da concentrao de hidrocarbonetos nos solos foi realizada empregando-se a tcnica de cromatografia gasosa. Para esta anlise uma quantidade de 80 g de solo foi acondicionada em frasco de vidro e tampa com vedao em teflon, o qual foi encaminhado ao laboratrio sob refrigerao em caixa trmica. Essas anlises foram realizadas pelos laboratrios Bioagri Ambiental
(Piracicaba/SP) e Analytical Technology (So Paulo/SP) de acordo com a metodologia proposta pelo rgo ambiental federal norte-americano (USEPA). Nas tabelas onde so apresentados esses resultados, est especificado o laboratrio responsvel pela anlise. 3.3.3 Contagem de bactrias heterotrficas totais Bactrias heterotrficas totais foram enumeradas usando a tcnica de pour-plate em meio PCA (Acumedia, USA) esterilizado em autoclave a 121 C por 15 minutos. Amostras de 1 g de solo foram adicionadas a 9 mL de soluo salina estril (0,85%) em tubos de cultura que foram agitados mecanicamente por 2 minutos. Depois de apropriada srie de diluies, 1 mL da soluo foi utilizado no plaqueamento em duplicata. As placas de Petri foram mantidas em incubao durante 48 h a 35 C at a contagem das unidades formadoras de colnia (UFC/g de solo seco).
3.4 Respirometria
A verificao do desempenho de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas aos solos contaminados foi realizada com os respirmetros de Bartha e Pramer (BARTHA e PRAMER, 1965), os quais foram utilizados para medir a produo microbiana de CO2 (Figuras 3.5 e 3.6). Estudos de mineralizao envolvendo medidas de produo de CO2 podem prover excelentes informaes sobre o potencial de biodegradabilidade de hidrocarbonetos (BALBA et al., 1998).
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Material e Mtodos
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Figura 3.5 - Esquema de um respirmetro de Bartha e Pramer
Figura 3.6 - Respirmetros de Bartha e Pramer Nos experimentos respiromtricos, os frascos foram preparados em triplicata (3 x 50 g de solo) e incubados a 27 C no escuro. O CO2 produzido capturado pela soluo de KOH (10 mL; 0,2 N) localizada no brao lateral do respirmetro. Esta soluo foi periodicamente retirada com seringa, e a quantidade de gs carbnico absorvida foi medida pela titulao do KOH residual (Equao 3.1) (aps a adio de soluo de cloreto de brio (1 mL; 1,0N) com uma soluo padronizada de HCl (0,1 N). Durante este procedimento, os respirmetros foram aerados durante 1,5 minutos atravs dos filtros de ascarita (cal sodada). 53
Material e Mtodos
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CO2 gerado (mol) = (VB VA) . 50 . fHCl onde: VB = volume de HCl 0,1 N utilizado para titular o branco, em mL; VA = volume de HCl 0,1 N utilizado para titular o tratamento, em mL; fHCl = fator de correo da normalidade do HCl.
(3.1)
No final dos experimentos respiromtricos, os solos contidos nas rplicas foram misturados para a realizao de anlises fsico-qumicas e microbiolgicas. A produo de gs carbnico foi utilizada para estimar a quantidade total de hidrocarbonetos mineralizados. Assumindo que 50 % do carbono biodegradado convertido CO2 e a outra metade adicionada ao solo como hmus e biomassa (CETESB, 1990), a quantidade de carbono biodegradado pode ser expresso como: Quantidade total de carbono biodegradado (mol) = 2 . CO2 produzido (mol) (3.2)
No caso de experimentos em que foi utilizado controle sem contaminantes (Item 3.6), necessrio subtrair o CO2 produzido pelo controle. Assim, a eficincia de biodegradao (EB) calculada pela seguinte equao: EB% = Quantidade total de carbono biodegradado (mol) . 100 Quantidade de carbono orgnico inicial no solo (mol) (3.3)
A quantidade de carbono orgnico presente no solo foi determinado pelo laboratrio Instituto Campineiro de Anlise de Solo e Adubo (ICASA) de acordo com a metodologia Embrapa (1997). No caso do experimento do Item 3.5, como essa medida inicial no foi realizada, o teor de carbono orgnico inicial foi calculado mediante um balano de massa de carbono, isto , somando o carbono produzido como CO2 quantidade final de carbono orgnico. A metodologia de clculo para a eficincia de biodegrao foi obtida na Norma Tcnica L6.350 Solos Determinao da Biodegradao de Resduos Mtodo Respiromtrico de Bartha (CETESB, 1990).
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3.5 Avaliao de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas ao solo ASP

A influncia de trs variveis (contedo de nitrognio e fsforo (NP), adio de surfactante (S) e consrcio de bactrias (CB)) na biodegradao do leo diesel presente no solo ASP foi avaliada atravs de experimento respiromtrico delineado a partir de um planejamento fatorial completo (23), que resultou em 8 condies experimentais (Tabela 3.1). A correo de nitrognio e fsforo foi realizada usando solues de (NH4)2SO4 (6080 mg/Kg de solo) e KH2PO4 (973 mg/Kg de solo), respectivamente, para um ajuste (C:N:P) de 100:15:1 (CASSIDY et al., 1997 apud CARDONA e ITURBE, 2003). O inculo de bactrias e o surfactante no inico Tween 80 foram adicionados em concentraes de 105 unidades formadoras de colnia (UFC) por grama de solo e 0,2 % (m/m), respectivamente. Considerando a adio dessas solues, a umidade do solo resultante foi de 21,9%.
Tabela 3.1 Experimento respiromtrico. Condies experimentais geradas pelo Planejamento Fatorial Completo - 23. Tempo de incubao de 55 dias. tratamento 1 2 3 4 5 6 7 8 NP +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 S +1 +1 -1 -1 +1 +1 -1 -1 CB +1 +1 +1 +1 -1 -1 -1 -1
+1 : C:N:P ajustado para 100:15:1 ou adio de surfactante (0,2% m/m) ou inculo de 105 UFC/g de solo - 1 : C:N:P no ajustado ou no adio de surfactante ou inculo NP: nitrognio e fsforo; S: surfactante; CB: consrcio bacteriano
Anlises estatsticas para se determinar os efeitos de cada varivel na eficincia de biodegradao foram realizadas pelo programa STATISTICA (verso 5.0) para Windows. Significncia foi considerada para o nvel de probabilidade p<0,05. 3.5.1 Preparo do inculo O inculo microbiano constituiu-se de trs espcies de bactrias hidrocarbonoclsticas (Ochrobactrum anthropi, Stenotrophomonas maltophilia e Bacillus cereus) que foram previamente isoladas e identificadas por Kataoka (2001) de um sistema de landfarming da refinaria de petrleo Replan (Petrobras) em Paulnia/SP. As bactrias foram enriquecidas separadamente em meio PCA lquido (10 mL) por 48 h a 35 oC. As clulas foram recuperadas por centrifugao (8.000 rpm durante 10 min) e o meio sobrenadante descartado. As clulas foram ressuspensas em 5,5 mL de soluo salina estril (0,85%) e o
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mesmo procedimento de centrifugao foi repetido. As clulas das trs espcies foram agrupadas e a suspenso final foi preparada com a adio de 5,5 mL de soluo salina. 3.5.2 Testes de toxicidade aguda Testes de toxicidade aguda foram utilizados para verificar a eficincia dos tratamentos em termos de gerao de produtos menos txicos. Primeiramente foi realizada a solubilizao do solo de acordo com a norma ABNT 10006 (ABNT, 2004) para extrair os componentes solveis presentes no solo. A seguir aplicou-se o teste de toxicidade aguda ao solubilizado usando Daphnia similis como organismo teste, seguindo a norma Cetesb L 5.018 (CETESB, 1991). No tempo zero, o teste foi aplicado aos tratamentos 6, 7 e 8 (representativos das trs variveis isoladas) e por similaridade de tratamento, inferiu-se os valores relativos aos tratamentos 1 5. No tempo final, o teste de toxicidade foi aplicado a todos os tratamentos. Os resultados foram calculados baseados no mtodo estatstico de Trimmed Spearman-Karber descrito por Hamilton et al. (1978) e expressos como CE50, 48 h.
3.6 Avaliao da tcnica de bioaumento aplicada a solos

Para esta avaliao, os experimentos respiromtricos foram divididos em trs partes. A primeira objetivou avaliar a influncia das tcnicas de bioaumento em conjunto com a de bioestimulao (adio de nutrientes) na eficincia de biodegradao dos solos ASP e SB. Essas condies experimentais so apresentadas na Tabela 3.2.
Tabela 3.2 - Experimento respiromtrico: Parte 1 solos ASP e SB. Tempo de incubao de 57 dias. tratamento 1 2 3 4 5 6 SB ASP solo condio experimental controle (nenhum tratamento) bioestimulao (adio de N e P) bioestimulao (adio de N e P) + bioaumento (consrcio bacteriano) controle (nenhum tratamento) bioestimulao (adio de N e P) bioestimulao (adio de N e P) + bioaumento (consrcio bacteriano)
A correo de nitrognio e fsforo foi realizada usando solues de (NH4)2SO4 (6080 mg/kg de solo) e KH2PO4 (973 mg/kg de solo), respectivamente, para um ajuste (C:N:P) de 100:15:1 (CASSIDY et al., 1997 apud CARDONA e ITURBE, 2003). O consrcio bacteriano (Staphylococcus hominis e Kocuria palustris) foi adicionado a uma concentrao de 106 UFC por grama de solo seco. Considerando a adio das solues correspondentes a cada tratamento, a umidade dos solos resultante foi de 21,1% (solo ASP) e de 20,2 % (solo SB). 56
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Nos tratamentos 1 e 4 (controles), a umidade foi corrigida em relao aos outros tratamentos com adio de gua destilada. Na segunda parte dos experimentos, foi simulada uma contaminao de leo diesel no solo RC. Assim, leo diesel comprado de um posto de combustveis local foi adicionado ao solo. A Tabela 3.3 traz resumidamente as condies experimentais. Em relao ao bioaumento com o consrcio bacteriano S. hominis/K. palustris, duas condies foram simuladas: a) adio de microrganismos antes da contaminao; b) adio de microrganismos aps contaminao. O objetivo da primeira estratgia foi avaliar o quo eficiente seria o bioaumento se empregado como uma maneira de preparar o solo para possveis vazamentos futuros.
Tabela 3.3 - Experimento respiromtrico: Parte 2 solo RC. Tempo de incubao de 92 dias. tratamento 7 8 9 10 11 12 RC solo condio experimental controle 1 - (apenas solo) controle 2 - (contaminao sem bioaumento) bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao
A adio do inculo no tratamento 9 foi feita 71 dias antes da contaminao. Foi utilizado o mesmo inculo preparado para a primeira parte dos experimentos (Tabela 3.2), numa concentrao de 104 UFC por grama de solo seco. O solo inoculado (600 g) foi mantido em um bquer envolto por um plstico preto para manter o solo em condies sem iluminao. Aps esse perodo, a contaminao do solo foi simulada pela adio de 6 g de leo diesel por quilograma de solo (tratamentos 8 ao 12). Nos tratamentos 10 ao 12, as concentraes de inculos foram, respectivamente, 106, 109 e 108 UFC por grama de solo seco. Considerando a adio dos inculos, a umidade do solo resultante foi de 9,3 % (tratamento 9) e de 28,8 % (tratamentos 10 ao 12). Nos tratamentos 7 e 8 (controles), a umidade foi corrigida em relao ao tratamento 10 com adio de gua destilada. A terceira parte dos experimentos objetivou verificar a eficincia do inculo comercial EM, o qual foi aplicado no solo ASP. As condies experimentais esto apresentadas na Tabela 3.4:
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Tabela 3.4 - Experimento respiromtrico: Parte 3 solo ASP (bioaumento com o inculo comercial EM). Tempo de incubao de 48 dias. tratamento 13 14 solo ASP condio experimental controle (nenhum tratamento) bioaumento (inculo comercial)
Considerando a adio do inculo, a umidade do solo resultante foi de 19,0 %. No tratamento 13 (controle), a umidade foi corrigida em relao ao tratamento 14 com adio de gua destilada.
3.6.1 - Microrganismos As culturas bacterianas Staphylococcus hominis e Kocuria palustris foram isoladas do solo ASP a partir do plaqueamento aps trmino da respirometria do Item 3.5 e identificadas pelo seqenciamento do rDNA 16S (realizado pelo CPQBA/UNICAMP). As bactrias Ochrobactrum anthropi e Bacillus cereus so as mesmas utilizadas na respirometria do Item 3.5. O inculo comercial chamado Microrganismos Eficientes (EM) um consrcio de microrganismos que tem demonstrado bom desempenho como fertilizante biolgico e aumentado a eficincia de lagoas de tratamento de efluentes. Embora EM tem sido aplicado com sucesso em tratamentos biolgicos de efluentes, este consrcio nunca foi testado na biorremediao de locais contaminados com hidrocarbonetos, assim, originalmente o EM no foi desenvolvido para esse propsito. 3.6.2 Preparo dos inculos Nos tratamentos 3, 6 e 9, os inculos foram preparados da seguinte maneira: as bactrias S. hominis e K. palustris foram enriquecidas separadamente em meio PCA lquido (10 mL) por 48 h a 35 oC. As clulas foram recuperadas por centrifugao (8.000 rpm durante 10 min) e o meio sobrenadante descartado. As clulas foram ressuspensas em 5,5 mL de soluo salina estril (0,85%) e o mesmo procedimento de centrifugao foi repetido. As clulas das duas espcies foram agrupadas e a suspenso final foi preparada com a adio de 5,5 mL de soluo salina. Nos tratamentos 10 ao 12, os inculos foram preparados estriando-se as culturas, que estavam armazenadas em tubos, em placas de Petri contendo meio nutriente agar (Merck,
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Alemanha). As placas de Petri foram incubadas durante 24 horas a 35 oC. As clulas foram raspadas utilizando-se gua destilada estril e os inculos ajustados para uma D.O. de 1,2 a 610 nm (SHIMADZU UV-1601PC). O inculo EM foi inicialmente diludo em gua (1:10) e a seguir aplicado a uma concentrao de 0,034 mL por grama de solo, o que correspondeu a 107 UFC por grama de solo seco.
3.7 Avaliao do efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas

3.7.1 Caracterizao da vinhaa A vinhaa foi coletada na usina Santa Lucia (Araras-SP) e armazenada congelada at o seu uso. A caracterizao fsico-qumica da vinhaa foi realizada pelo laboratrio Instituto Campineiro de Anlise de Solo e Adubo (ICASA), de acordo com a metodologia Embrapa (1997), com exceo dos seguintes parmetros: oxignio dissolvido (OD) (Digimed DM4), demanda qumica de oxignio (DQO) (CETESB, 1994b), potencial redox (Eh) (Hanna HI 8314) e condutividade (Analion C-701, eletrodo Analion C 801-1). 3.7.2 Experimento respiromtrico A influncia da adio da vinhaa na biodegradao do leo diesel no solo foi avaliada mediante experimentos respiromtricos. Os experimentos foram divididos em duas partes, descritas na Tabela 3.5. Na primeira, foram simuladas contaminaes do solo RC com leo diesel comercial (comprado em um posto de combustveis local) ou com o leo diesel coletado no posto ASP (6 mg.Kg-1 de solo). Na segunda parte, foi realizado experimento com os solos ASP e SB. Para ambas as partes, a vinhaa foi adicionada a uma concentrao de 33 mL.Kg-1 de solo. Com isso, a umidade resultante dos solos foi de 11,9 % (RC), 19,0 % (ASP) e 19,0 % (SB). Nos tratamentos onde a vinhaa no foi adicionada (controles), a umidade foi corrigida, em relao aos outros tratamentos, com adio de gua destilada.
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Tabela 3.5 - Experimento respiromtrico: adio de vinhaa ao solo. Tempos de incubao de 48 dias (tratamentos 1 a 6) e 47 dias (tratamentos 7 a 10). tratamento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ASP SB RC solo condio experimental solo (controle) solo + vinhaa (controle) solo + leo diesel ASP solo + leo diesel ASP + vinhaa solo + leo diesel comercial solo + leo diesel comercial + vinhaa solo (controle) solo + vinhaa solo (controle) solo + vinhaa
3.7.3 Experimentos com gua subterrnea Com o objetivo de verificar a influncia da vinhaa na biodegradao do leo diesel presente na gua subterrnea dos postos ASP e SB, dois experimentos foram realizados simulando condies aeradas e no-aeradas. No posto ASP, a gua subterrnea foi coletada em um poo de monitoramento jusante do local do vazamento, utilizando-se amostrador descartvel do tipo bailer.
- condio no aerada Este experimento foi realizado em frascos (300 mL) que so utilizados na anlise de Demanda Bioqumica de Oxignio (DBO), os quais foram incubados durante 20 dias a 20,00.2oC (Figura 3.7). Os tratamentos com vinhaa foram comparados com a tcnica de biorremediao padro de injeo de nutrientes, onde a correo de nitrognio e fsforo foi realizada usando solues de (NH4)2SO4 e KH2PO4, respectivamente. A Tabela 3.6 traz resumidamente as condies experimentais. Nos tratamentos sem vinhaa, para se obter as mesmas condies, 5 % do volume do meio reacional corresponde gua destilada.
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Tabela 3.6 - Experimento com gua subterrnea simulando condio no aerada tratamento 1 2 3 4 5 6
DQO = demanda qumica de oxignio
gua subterrnea ASP
condio experimental gua subterrnea (controle) gua subterrnea + nutrientes (DQO:N:P = 100:5:1) gua subterrnea + vinhaa (5% v/v) gua subterrnea (controle)
SB
gua subterrnea + nutrientes (DQO:N:P = 100:5:1) gua subterrnea + vinhaa (5% v/v)
Para cada tratamento, 6 frascos de DBO foram preparados e as seguintes medidas foram realizadas nos intervalos de 0; 5; 10 e 20 dias: oxignio dissolvido (OD) (Digimed DM4); pH (Analion IA601); potencial redox (Eh) (Hanna HI 8314); condutividade (Analion C-701, eletrodo Analion C 801-1); demanda qumica de oxignio (DQO) (CETESB, 1994b); concentrao dos ons potssio e nitrato (Hach DR 2000); concentrao dos hidrocarbonetos BTEX e HPA (item 3.1.3), sendo o ltimo medido apenas nos tempos inicial e final. Nos intervalos de tempo mencionados, para cada tratamento, o OD foi medido em dois frascos, os quais foram misturados, tendo sido retiradas alquotas apropriadas para cada anlise.
Figura 3.7 Experimento com gua subterrnea (condio no aerada)
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- condio aerada O segundo experimento com a gua subterrnea foi realizado em quatro reatores aerados (900 mL) (Figura 3.8), cujas condies experimentais esto listadas na Tabela 3.7. Nos tratamentos sem vinhaa, para se obter as mesmas condies, 5 % do volume do meio reacional corresponde gua destilada. Nos mesmos intervalos de tempo do experimento com os frascos de DBO, foi medida a concentrao de BTEX. A demanda qumica de oxignio (DQO) e a concentrao de HPA foram determinados apenas nos tempos inicial e final.
Tabela 3.7 - Experimento com gua subterrnea simulando condio aerada tratamento 1 2 3 4 gua subterrnea ASP SB condio experimental gua subterrnea (controle) gua subterrnea + vinhaa (5% v/v) gua subterrnea (controle) gua subterrnea + vinhaa (5% v/v)
Figura 3.8 Experimento com gua subterrnea (condio aerada)
3.8 Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado

A capacidade de diferentes microrganismos em biodegradar leo diesel comercial e intemperizado (ASP) foi verificada utilizando-se a tcnica baseada no indicador redox 2,6diclorofenol indofenol (DCPIP). O princpio deste teste que durante a oxidao microbiana dos hidrocarbonetos, eltrons so transferidos at aceptores como oxignio, nitrato e sulfato. Ao incorporar um aceptor de eltron como o DCPIP ao meio de cultura, possvel averiguar a 62
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capacidade dos microrganismos em utilizar hidrocarbonetos como substrato pela observao da mudana de cor do DCPIP de azul (oxidado) para incolor (reduzido). Esta tcnica desenvolvida por Hanson et al. (1993) tem sido utilizada em vrios trabalhos, por exemplo, Cormack e Fraile (1997), Roy et al. (2002), Peixoto e Vieira (2005), Lovaglio et al. (2005), Silva et al. (2005) e Souza et al. (2005). Foi testada a biodegradabilidade do leo diesel comercial, comprado em um posto de combustveis em Rio Claro, e do leo diesel presente na gua subterrnea (fase livre) no posto ASP (Figura 3.9).
Figura 3.9 Fase livre (leo diesel) na gua subterrnea do posto ASP 3.8.1 Microrganismos Diferentes culturas de bactrias e consrcios de microrganismos foram testados em relao capacidade de biodegradar os leos diesel: - Staphylococcus hominis e Kocuria palustris (item 3.6.1). - Ochrobactrum anthropi e Bacillus cereus (item 3.6.1).
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- inculo comercial EM (item 3.6.1). - Pseudomonas aeruginosa LBI - isolada por Benincasa et al. (2002) de uma rea contaminada com hidrocarbonetos. - consrcio microbiano R obtido do efluente bruto da refinaria Replan (Petrobras). - consrcio L o lodo ativado de um reator piloto que est sendo testado para o tratamento de gua de produo no Terminal Martimo Almirante Barroso Tebar (Petrobras), localizado em So Sebastio (SP). - consrcios ASP-S e ASP-AS, obtidos respectivamente do solo e da gua subterrnea do posto ASP. - consrcios SB-S e SB-AS, obtidos respectivamente do solo e da gua subterrnea do posto SB. - consrcio RC, proveniente do solo do posto RC. - consrcio U, obtido de um solo no contaminado coletado no campus da Unesp (Rio Claro). 3.8.2 Preparo dos inculos Os inculos S. hominis, K. palustris, O. anthropi, B. cereus, P. aeruginosa LBI e consrcio R foram preparados estriando-se as culturas, que estavam armazenadas em tubos, em placas de Petri contendo meio nutriente agar (Merck, Alemanha). Para preparar os consrcios ASP-S, SB-S, RC-S e U, 1.0 g dos respectivos solos foram adicionados a frascos erlenmeyers (125 mL) contendo 50 mL de meio Bushnell-Hass (BH) (descrito no item 3.8.3) e mantidos sob agitao durante 3 dias. Aps este perodo, o meio de cultivo foi estriado em placas de Petri contendo meio nutriente agar. Os consrcios ASP-AS e SB-AS foram preparados pelo estriamento de gua subterrnea na superfcie de placas de Petri contendo meio nutriente agar. As placas de Petri foram incubadas durante 24 horas a 35 oC. Ento as clulas foram raspadas utilizando-se gua destilada estril. Os consrcios EM e L foram adicionados aos frascos dos testes sem preparao prvia.
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3.8.3 Preparo do teste Os inculos S. hominis, K. palustris, O. anthropi, B. cereus, P. aeruginosa LBI e consrcio R foram adicionados (125 L, D.O. = 0,55; = 610 nm (SHIMADZU UV1601PC)) separadamente a tubos de ensaio (duplicatas) que continham o meio Bushnell-Hass (BH) (7,5 mL) e 50 L de leo diesel, ambos previamente esterilizados em autoclave. A concentrao de DCPIP foi de 27 g.mL-1. O inculo EM (200 L, concentrao igual a 109 UFC.mL-1), o consrcio L (1,0 mL, concentrao igual to 107 UFC.mL-1), os inculos preparados com os microrganismos nativos dos solos e guas subterrneas (1,0 mL, concentrao no determinada) e P. aeruginosa LBI novamente (1,0 mL, concentrao no determinada) foram adicionados a frascos erlenmeyers (125 mL, duplicatas) que continham meio BH estril (50 mL) e 1% (v/v) de leo diesel. A concentrao de DCPIP foi de 20 mg.mL-1. Os tubos de cultura e os frascos erlenmeyers foram mantidos sob agitao (240 rpm) a 272 oC. O meio BH composto por (g.L-1): MgSO4: 0,2; CaCl2: 0,02; KH2PO4: 1,0; K2HPO4: 1,0; NH4NO3: 1,0; FeCl3: 0,05 (DIFCO MANUAL, 1984). 3.8.4 Experimento respiromtrico A biodegradabilidade desses leos diesel tambm foi comparada em ensaio respiromtrico, onde os combustveis foram aplicados ao solo RC. Para essa anlise foi feita uma composio de experimentos anteriores e de um experimento montado com a adio do leo diesel ASP. Todos foram mantidos sob as mesmas condies, contudo, com perodos de incubao diferentes. A Tabela 3.8 apresenta o protocolo dos experimentos que participaram dessa anlise.
Tabela 3.8 Experimento respiromtrico: Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado (ASP). experimento condio experimental solo RC + leo diesel comercial 1 (tratamento 5, Tabela 3.5) solo RC + leo diesel intemperizado (ASP) (tratamento 3, Tabela 3.5) solo RC + leo diesel comercial 2 (tratamento 8, Tabela 3.3) solo RC + leo diesel intemperizado (ASP) 92 89 48 tempo de incubao (dias)
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3.8.5 Composio dos leos diesel A anlise de cromatografia gasosa foi utilizada para a caracterizao dos leos diesel (comercial e intemperizado). Primeiramente, solo superficial sem cobertura vegetal foi coletado de uma rea no contaminada (campus da Unesp - Rio Claro), o qual foi peneirado (tyler 14) antes de ser contaminado com leo diesel comercial ou intemperizado. Para as anlises de BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos) e hidrocarbonetos poliaromticos (HPA), foram adicionados 8 mg de leo diesel por quilograma de solo e para a anlise de hidrocarbonetos totais de petrleo (TPH), 3 mg.Kg-1. As anlises foram realizadas pelo laboratrio Analytical Solutions (So Paulo/SP) de acordo com as metodologias USEPA 8021B, 8270 e 8015B, respectivamente.
3.9 Produo de biossurfactante utilizando-se leo diesel intemperizado

Neste experimento foi investigada a capacidade das culturas Staphylococcus hominis, Kocuria palustris e Pseudomonas aeruginosa LBI utilizarem leo diesel intemperizado (ASP) como matria prima para produo de biossurfactante. 3.9.1 Preparo dos inculos Os inculos foram preparados estriando-se as culturas, que estavam armazenadas em tubos de cultura, em placas de Petri contendo meio nutriente agar (Merck, Alemanha). As placas de Petri foram incubadas durante 24 horas a 35 oC. Ento as clulas foram raspadas utilizando-se gua destilada estril e o inculo ento ajustado para uma D.O. de 0,65 a 610 nm (SHIMADZU UV-1601PC). 3.9.2 Condies de cultivo Os experimentos foram realizados em frascos erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL de meio lquido. Diferentes combinaes de meio de cultura e fontes de carbono foram avaliadas. Assim, foi testada a influncia de dois meios na produo de biossurfactante: a) o meio descrito por Robert et al. (1989), contendo (g.L-1): NaNO3: 4,0; KCl: 0,1; KH2PO4: 0,5; K2HPO4: 1,0; CaCl2: 0,01; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,01; extrato de levedura: 0,1; e 0,05 mL/L da seguinte soluo de elementos traos: B (0,026%), Cu (0,05%), Mn (0,05%), Mo (0,006%) e Zn (0,07%); b) o meio Bushnell-Hass (BH) (item 3.8.3). O primeiro meio tem sido empregado em experimentos de produo de biossurfactantes com diferentes linhagens de P. aeruginosa (ROBERT et al., 1989; BENINCASA et al., 2002; SILVA, 2005;
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PIRLLO, 2006), enquanto que o meio BH normalmente usado em estudos onde avaliada a biodegradao de hidrocarbonetos (HANSON et al., 1993; ROY et al., 2002). Como fontes de carbono foram testados o leo diesel intemperizado do posto ASP (D-ASP) e comparativamente, um leo diesel comercial (D-C) comprado em um posto de combustveis local. O meio mineral mais a fonte de carbono (diferentes concentraes de leo diesel (Tabela 3.9)) foram esterilizados conjuntamente em autoclave a 121 C e 1 atm durante 15 minutos. Aps isto, os inculos (1 mL) foram adicionados aos frascos, que foram mantidos sob agitao (240 rpm) durante 144 horas a 272oC. Experimentos incluindo a linhagem Pseudomonas aeruginosa LBI e o meio Robert com o leo diesel comercial no foram realizados porque previamente esta linhagem mostrouse eficiente em produzir biossurfactante nessas condies em Pirllo (2006). 3.9.3 Medidas de tenso superficial O monitoramento da produo de biotensoativos foi realizado aps o perodo de incubao medindo-se a tenso superficial do caldo livre de clulas (centrifugao, 8.000 rpm, 15 minutos), segundo o mtodo do anel de De Nuy, utilizando-se o tensimetro Krss K6 (Figura 3.10).
Figura 3.10 Tensimetro Krss K6
3.9.4 Verificao de bioemulsificadores Para os experimentos 1; 4; 5; 11; 14 e 15 (Tabela 3.9), determinou-se o ndice de Emulsificao (E24), segundo Iqbal et al. (1995), para a verificao da presena de bioemulsificadores, com a adio de 1 mL de leo diesel (D-ASP) ou querosene ao caldo de cultivo livre de clulas (1 mL), em tubos de ensaio seguidos por agitao em alta velocidade 67
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em vrtex durante 2 minutos. Os tubos foram deixados em repouso por 24 horas e o ndice de emulsificao foi calculado segundo a frmula: E24= (altura da camada de emulso/altura total)x100 (3.4)
A realizao deste teste importante porque nem todos biossurfactantes apresentam boas propriedades tensoativas, porm em alguns casos, como o biossurfactante emulsan, so timos agentes emulsificantes de hidrocarbonetos (KIM et al, 1997). Segundo Ron e Rosemberg (2001), os biossurfactantes com baixo peso molecular reduzem as tenses inter e superficiais, enquanto que os de alto peso molecular so emulsificadores. 3.9.5 Aplicao de ultrasom Considerando-se a possibilidade de armazenamento de biossurfactante na parede celular (GOMES et al., 2004), tambm foram realizados experimentos (Tabela 3.9) nos quais, antes da realizao da medida da tenso superficial, foi aplicada uma carga de ultrasom ao meio de cultivo (com clulas) objetivando provocar a ruptura da parede celular e conseqente liberao de biossurfactante ao meio. O ultrasom foi irradiado no meio de cultura (com as clulas) antes da medio da tenso superficial. O equipamento utilizado foi o Desruptor de Clulas (UNIQUE), com uma freqncia ultrasnica de 20 KHz, potncia de 306 W e empregando-se a macro ponta como agente gerador das ondas de ultrasom. Para os experimentos 10 e 20 a carga de ultrasom foi aplicada durante 20 minutos e para os experimentos 6; 8; 16 e 18, 10 minutos. O ultrasom somente foi empregado nos experimentos com as culturas S. hominis e K. palustris porque a bactria P. aeruginosa LBI um produtor de biossurfactante extra-celular (PIRLLO, 2006).
68
Material e Mtodos
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 3.9 Resumo das condies experimentais (produo de biossurfactante) experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 cultura meio de cultivo fonte de carbono concentrao de leo diesel (% v/v) 1 5 10 20 30 10 10 10 1 5 10 20 30 10 10 10 30 no 10 aplicao de ultrasom no
K. palustris
Robert et al. (1989)
D-ASP
D-C BH D-ASP
sim no sim no sim no
S. hominis
Robert et al. (1989)
D-ASP
D-C BH P. aeruginosa LBI Robert et al. (1989) BH D-ASP D-ASP D-C
sim no sim no sim
BH Bushnell e Haas D-ASP - leo diesel coletado no lenol fretico do posto de combustveis ASP D-C leo diesel comercial
69
4 - RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB

Resultados obtidos a partir das anlises efetuadas nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006 so mostrados nas Tabelas 4.1 at 4.3.
Tabela 4.1 - Parmetros fsicos e qumicos avaliados nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006. poo monit. SB1 data coleta 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 nvel (m) 2,46 1,80 1,27 1,17 1,69 1,73 2,33 1,80 3,60 3,06 2,88 3,02 T ( C) 25,0 25,6 25,0 25,7 26,3 27,4 25,3 27,0 25,2 25,5 24,5 26,0
o
SB2
SB3
condutividade (25oC) (mS.cm-1) 0,308 0,241 0,378 0,860 0,173 0,179 0,310 0,620 0,254 0,235 0,281 0,260
OD* (mg.L-1) 4,4 1,1 2,2 1,1 4,6 2,8 5,0 4,6 4,3 1,4 2,6 4,5
pH 6,0 6,2 5,8 5,8 6,2 6,4 6,3 6,1 6,5 5,9 5,9 5,8
Eh (mV) 14 72 - 46 48 203 117 215 198 53 89 75 187
Resultados e Discusso
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 4.1 - Parmetros fsicos e qumicos avaliados nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006 (cont.). poo monit. SB1 data coleta 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 Na 26,2 33,2 38,9 64,5 14,9 14,3 20,9 15,9 19,4 18,8 25,8 27,8 Cl 6,40 11,4 15,6 12,7 7,60 3,20 16,6 3,20 2,90 6,00 17,7 9,40 Ca (mg.L ) 0,00 0,38 0,07 0,36 < 0,01 0,64 0,05 0,58 0,06 0,57 0,01 0,57 0,12 0,36 < 0,01 0,60 0,03 0,51 0,07 0,41 0,04 0,41 < 0,01 0,51
-1
Mg
PO430,05 0,53 3,16 2,86 0,20 0,12 0,19 0,18 0,09 0,11 0,07 0,14
K 6,90 20,6 19,0 4,55 6,30 18,2 69,0 4,86 4,61 4,57 2,99 4,55
SB2
SB3
Tabela 4.1 - Parmetros fsicos e qumicos avaliados nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006 (cont.). poo monit. SB1 data coleta 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 08/nov/05 10/abr/06 SO4262 13 27 33 11 8,0 8,0 19 17 4,0 9,0 1,0 Fe(II) < 0,01 0,03 1,30 3,22 0,01 0,02 0,03 0,06 < 0,01 0,79 0,01 0,47 NO3(mg.L-1) 0,50 5,05 1,90 1,94 0,08 0,26 0,28 0,39 1,11 1,54 0,38 0,87 STS** 8,0 80 10 10 8,0 10 20 10 80 10 80 20 alcalinidade*** 52,0 178 72,0 114 39,0 51,0 77,0 44,5 95,0 72,0 67,0 67,5
SB2
SB3
* oxignio dissolvido ** slidos totais em suspenso *** alcalinidade expressa como HCO3-
Tabela 4.2 - Concentrao de BTEX nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006. poo monit. data coleta 01/mai/04 29/abr/05 SB1 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 SB2 08/nov/05 10/abr/06 01/mai/04 29/abr/05 SB3 08/nov/05 10/abr/06 interveno2 referncia3 benzeno <LD1 <LD <LD <LD <LD <LD <LD 49 9,0 <LD <LD 57 5 5 tolueno <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 69 11,4 <LD <LD <LD 700 etil-benzeno (g.L-1) <LD <LD <LD 4330 <LD <LD <LD 90 13,4 <LD <LD 914 300 xilenos <LD <LD <LD 372 <LD <LD <LD 99 22,3 <LD <LD 334 500 TOTAL <LD <LD <LD 4702 <LD <LD <LD 307 56,1 <LD <LD 1305
1 2 3
LD (limite de deteco) = 4,0 g.L-1 CETESB- Valores orientadores para avaliao de solos e guas subterrneas, Novembro de 2005. Portaria 518, 21 de Dezembro de 2004 do Ministrio da Sade.
71
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 4.3 - Concentrao de hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPA) nas amostras de gua subterrnea coletadas em abril de 2006 nos poos de monitoramento SB1; SB2 e SB3. HPA Naftaleno Acenaftileno Fluoreno Antraceno Pireno Benzo (a) Antraceno Criseno Benzo (k) Fluoranteno Benzo (a) Pireno Dibenzo (a,h) Antraceno Benzo (g,h,i) Pirileno Indeno (1,2,3) Pireno Fenantreno Fluoranteno Benzo (b) Fluoranteno TOTAL
1 2 3
SB1 <LD1 <LD 1,15 2,34 <LD <LD 5,18 <LD <LD <LD 6,09 <LD 0,05 <LD 0,07 15
SB2 2,56 <LD 4,97 0,87 6,12 <LD 0,87 <LD 0,02 <LD <LD <LD 1,91 <LD 0,054 17
SB3 (g.L-1) 12,09 <LD 4,54 2,87 1,97 <LD <LD <LD 0,032 <LD <LD <LD 7,12 <LD <LD 29
interveno2 140 1,75 0,7 3 0,18 0,17 140 -
LD (limite de deteco) = 0,01 g.L-1 CETESB- Valores orientadores para avaliao de solos e guas subterrneas, Novembro de 2005. Valor estipulado pela Portaria 518, 21 de Dezembro de 2004 do Ministrio da Sade.
A partir dos dados de concentrao dos componentes maiores (Tabela 4.1) foi feita a classificao hidroqumica da gua subterrnea com o auxlio do diagrama de Piper. Em todas as coletas, as amostras foram classificadas como bicarbonatada sdica, com exceo do ponto SB1 na 1 coleta, classificada como bicarbonatada sulfatada. Assim, no geral, os resultados obtidos em todas as coletas so semelhantes aos representados no diagrama da Figura 4.1, que mostra os dados da 2 coleta.
72
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Posto SB - 29/Abr/05
60
C 40 loret o
SB1 SB2 SB3
80
80
itra
to
lcio C 0
+N
o si 2 0 agn + M 40
Mg
20
u 20 lfato
SO4
20 20
80
80
sio
ica
40 r 4 0 bona
to
20
40
dio S
40
60
60
80 80 Carb ona 60 60 to + B
60
to lfa 40 Su
M 40 agn
ss ot + P 60
80
io 8 0
20
Ca
20
80
Clcio CTIONS
60
40
20
Na + K
HCO3 + CO3
20
Cloreto + Nitrato NIONS
40
60
80
Cl
% meq/L
Figura 4.1 - Diagrama de Piper efetuado a partir de dados obtidos com a coleta de amostras de gua subterrnea realizada em Abril de 2005 (2 coleta). Observaes de campo em relao ao poo de monitoramento SB1, como odor de H2S e rpida recuperao em relao aos outros poos, levantaram a suspeita da possibilidade de infiltrao de gua proveniente da rede de esgoto. Teste realizado em laboratrio (plaqueamento em meio chromocult), cuja finalidade consistiu na verificao da presena de bactrias do grupo coliformes totais e a bactria Escherichia coli, mostrou que os trs pontos de coleta apresentavam E. coli, sendo que somente no ponto SB1 foram verificados os coliformes totais. A bactria E. coli em outros estudos (SORKHOH et al., 1990; AlHADHRAMI et al., 1995) foi considerada como capaz de biodegradar hidrocarbonetos, contudo, a presena dos coliformes um forte indcio da infiltrao de esgoto domstico. Outros parmetros (Tabela 4.1) tambm so indicativos quando so comparados os valores obtidos para SB2 relativamente SB1, que esto situados proximamente, por exemplo, menor concentrao de oxignio dissolvido, e maiores concentraes de sdio, fosfato, sulfato e nitrato. Portanto, devido a esta possvel influncia externa, conveniente no considerar os valores medidos no ponto SB1 na anlise dos indicadores geoqumicos. Fatores importantes para a avaliao da biorremediao natural como a caracterizao da composio natural da gua subterrnea (background) e a delimitao da 73
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
pluma de contaminao no foram possveis de serem obtidos devido ao pequeno nmero de poos de monitoramento na rea. Apesar disso, com as anlises realizadas possvel verificar alguns parmetros que indicam a biodegradao dos contaminantes, como a presena de microrganismos hidrocarbonoclsticos (que consomem hidrocarbonetos) na gua subterrnea. De acordo com a metodologia proposta por Aaronson (1970), foi verificada a presena, na amostra coletada no ponto SB3, de bactrias do gnero Pseudomonas oxidantes de naftaleno, e bactrias capazes de biodegradar benzeno e tolueno. A verificao da presena desses microrganismos na gua subterrnea importante uma vez que o naftaleno, um composto aromtico policclico (HPA) caracterstico na composio de leo diesel, bem como o benzeno e o tolueno, esto especificados na lista de referncia de valores de interveno para guas subterrneas da CETESB (CETESB, 2005a). No teste utilizando-se o indicador redox DCPIP (inculo SB-AS), a descolorao do meio de cultivo ocorreu em 3 dias para ambos os leos testados. Esse resultado mostra que os microrganismos presentes na gua subterrnea apresentam a capacidade de degradar o leo diesel mesmo este estando intemperizado. Rosenberg e Gutnick (1981) concluram que bactrias capazes de degradarem hidrocarbonetos esto localizadas potencialmente em todas as reas naturais, embora apresentem grandes variaes em suas concentraes celulares. No entanto, importante ressaltar que apenas a constatao da presena desses microrganismos no significa que uma biorremediao efetiva esteja ocorrendo no local contaminado. Segundo Corseuil (1994) tambm importante verificar a presena de biomassa suficiente para a degradao dos contaminantes, pois baixas populaes de microrganismos contaminantes-especficos podem resultar em significantes perodos de retardo antes do incio de uma biodegradao mensurvel. A gua subterrnea contaminada com hidrocarbonetos contem frequentemente maiores densidades populacionais microbianas que a gua subterrnea natural do local. Este aumento est relacionado fonte suplementar de carbono oferecida pelos hidrocarbonetos (RISER-ROBERTS, 1992). De acordo com USEPA (1987) apud Shaffner e Juneau (1995), amostras de gua subterrnea coletadas a montante de locais contaminados com hidrocarbonetos tipicamente apresentam uma densidade populacional total de aproximadamente 102 a 103 unidades formadoras de colnias por mililitro (UFC.mL-1). A populao de bactrias heterotrficas totais nas amostras de gua subterrnea em todas as coletas (Figura 4.2) variou entre 104 e 106 UFC.mL-1, valores compatveis com a baixa
74
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
concentrao de hidrocarbonetos verificada na gua subterrnea durante o perodo de monitoramento.
7
SB1 SB2 SB3
6 5 log (UFC/mL) 4 3 2 1 0
01/5/2004 29/4/2005 08/11/2005 10/4/2006
Figura 4.2 - Contagem de bactrias heterotrficas totais nas amostras de gua subterrnea coletadas entre Maio de 2004 e Abril de 2006. Os resultados das anlises fsico-qumicas da gua subterrnea realizadas durante o perodo de monitoramento de dois anos (Tabela 4.1) tambm fornecem parmetros que indicam condies favorveis biodegradao dos contaminantes, como temperatura prximo a 25 C, pH ligeiramente cido e condies oxidantes (valores de Eh positivos). Contudo a baixa concentrao de fsforo dissolvido (PO43-) pode ser um fator limitante. Nas datas em que foi constatada a presena de hidrocarbonetos na gua subterrnea, as concentraes de BTEX no ponto SB3, prximo ao local do vazamento, sempre foram maiores que aquelas encontradas em SB2 que est jusante (Tabela 4.2), sendo que somente no primeiro foi detectada fase livre. Esta diminuio pode ser atribuda a processos como adveco, diluio, disperso, soro, volatilizao e tambm biodegradao, pois nveis de oxignio dissolvido e alcalinidade so, respectivamente, menores e maiores em SB3. Em locais onde esteja ocorrendo processos aerbios de biodegradao, a concentrao de oxignio diminui nos locais de maior concentrao de hidrocarbonetos devido ao consumo destes pelos microrganismos e como produto desse metabolismo tem-se a produo de CO2, que causa o aumento da alcalinidade. Os indicadores geoqumicos tambm indicam que processos anaerbios de biodegradao possivelmente no esto ocorrendo, uma vez que o aqfero apresenta condies oxidantes e a variao das concentraes de nitrato, sulfato, e Fe (II) entre SB3 e SB2 no so significativas. 75
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Na ltima coleta, aps um ano em que a concentrao de BTEX esteve abaixo do nvel de deteco, houve um aumento considervel na concentrao destes contaminantes (Tabela 4.2). Isto indica que hidrocarbonetos retidos ou adsorvidos no solo representam uma fonte constante de contaminao. Nesta mesma data, tambm foi realizada a anlise dos hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPA) e os valores no se encontraram acima daqueles permitidos pela legislao (Tabela 4.3). Em SB3, as concentraes de benzeno e etilbenzeno esto acima do valor de interveno determinado pela Cetesb, sendo este valor definido como a concentrao de determinada substncia no solo ou na gua subterrnea acima da qual existem riscos potenciais, diretos ou indiretos, sade humana, considerado um cenrio de exposio genrico (CETESB, 2005a). Nestes casos, o rgo ambiental indica a necessidade de aes para resguardar os receptores de risco. jusante de SB3, em SB2, as concentraes diminuem e apenas a concentrao de benzeno continua acima dos valores permitidos pela legislao. Segundo Borden et al. (1995), a taxa de biodegradao de compostos aromticos em ambientes aerbios pode ser bastante alta, portanto muito provvel que mais jusante a concentrao deste contaminante atinja valores aceitveis. Considerando que nesta regio no h captao de gua subterrnea para abastecimento pblico, a biorremediao natural monitorada uma opo bastante adequada de saneamento, sendo que a instalao de novos poos de monitoramento jusante de SB2 seria imprescindvel para uma confirmao mais precisa da extenso dessa pluma.
4.2 Caracterizao das amostras de solos

A Tabela 4.4 traz a caracterizao fsico-qumica das amostras de solos. As concentraes de metais pesados no esto acima dos nveis mais restritivos determinados pela Cetesb (CETESB, 2005a).
76
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 4.4 Caracterizao das amostras de solos parmetros pH (CaCl2)a carbono orgnico (%) nitrognio total (%) fsforo disponvel (ppm) C:N:P ASP 6,7 1,39 0,08 6,0 100 : 5,75 : 0,043 tipos de solo SB 5,0 0,99 0,07 3,0 100 : 7,08 : 0,03 (mmolc/dm3) K Ca Mg H+Al Al CTCb granulometria (%) areia silte argila 78,7 16,3 5,0 micronutrientes (ppm) solo S ASP 24 SB 14 RC 12
a b
RC 6,7 0,29 0,02 2,0 100 : 6,89 : 0,10
1,7 100 8 11 -a 121,8
1,4 20 6 16 -a 44,1
1,1 15 2 10 -a 28,7
66,7 18,3 15,0
81,4 7,3 11,3 metais pesados (ppm)
Na 24 17 13
Fe 136 150 19
Mn 9,4 49,1 3,0
Cu 1,6 1,1 0,6
Zn 1,7 2,2 7,3
B Co Mo 0,24 -a 0,03 0,21 2,29 -a 0,15 0,56 -a
Ba 9,73 55,81 4,06
Cd 0,03 0,19 0,12
Cr 2,10 4,92 9,93
Ni 0,44 1,53 0,30
Pb 5,9 7,96 7,10
no detectado capacidade de troca catinica
4.3 Avaliao de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas ao solo ASP

A quantidade acumulada de CO2 produzido durante os 55 dias de incubao e a produo diria de CO2 so mostradas nas Figuras 4.3 e 4.4, respectivamente. Os tratamentos no apresentaram a fase de adaptao (fase lag), provavelmente devido a uma adaptao prvia dos microrganismos aos poluentes e a condies experimentais favorveis. Comparando a taxa de produo mdia de CO2 durante os primeiros 20 dias e o perodo subseqente, houve uma diminuio de aproximadamente 45 % para os tratamentos 1; 3; 5 e 7, e 23 % para os tratamentos 2; 4; 6 e 8. Esta variao pode ter sido causada por uma transio de fontes de carbono. O consumo dos hidrocarbonetos mais facilmente biodegradveis (hidrocarbonetos lineares e de cadeias abertas) resulta na diminuio da biodisponibilidade desses compostos. A falta dessas fontes exigiria uma adaptao metablica dos microrganismos para consumirem hidrocarbonetos mais recalcitrantes, como os 77
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
poliaromticos, resultando no decrscimo da produo de CO2. Como esse comportamento foi mais evidente em tratamentos com adio de nutrientes (1; 3; 5 e 7), isto sugere que o efeito benfico obtido com os nutrientes menos pronunciado na biodegradao de hidrocarbonetos recalcitrantes, como observado por Hencklein (2005) quando estudou a biodegradabilidade de borra oleosa de refinaria.
9000 8000 7000 CO2 produzido ( mol) 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50
Condies experim entais
1 4 7
2 5 8
3 6
Figura 4.3 - Produo acumulada de CO2 durante a incubao. Cada barra de erro representa 1 desvio padro de trs rplicas.
Tratamentos: 1 NP/S/CB; 2 S/CB; 3 NP/CB; 4 CB; 5 NP/S; 6 S; 7 NP; 8 controle. NP: nitrognio e fsforo; S: surfactante; CB: consrcio bacteriano.
250
Condies experim entais
produo diria de CO2 ( mol.d-1)
200
1 4 7
2 5 8
3 6
150
100
50
0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50 60
Figura 4.4 - Produo diria de CO2 durante a incubao.
A eficincia de biodegradao (EB) (Figura 4.5) foi calculada usando a Equao 3.3 baseada na produo total de CO2. Esta eficincia est relacionada com a mineralizao dos
78
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
hidrocarbonetos, portanto, no considera a formao de subprodutos intermedirios. Tratamentos com a adio de nutrientes (1; 3; 5 e 7) mostraram claramente melhores resultados (at 19,8%). Na Figura 4.6, o diagrama de Pareto, obtido atravs do planejamento experimental, representa os efeitos de cada varivel testada na eficincia de biodegradao. Efeitos foram considerados estatisticamente significantes para um nvel de 95% de confiabilidade, o qual representado pela linha tracejada (p = 0,05). Efeitos com valores positivos acima daquele indicado pela linha tracejada indicam que o tratamento em questo favorvel para a eficincia de remoo dos poluentes. Assim, as trs variveis isoladamente e a combinao de nutrientes com surfactante (1 by 2) influenciaram positivamente o processo de biodegradao.
25
20 Eficincia de Biodegradao (%) (respirmetria)
19,8
15,2 15 13,5 13,5
10
8,4
8,8
8,8
8,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 tratamento
Figura 4.5 - Eficincia de biodegradao dos tratamentos obtida atravs de dados respiromtricos. Cada barra de erro representa 1 desvio padro de trs rplicas.
Eficincia de Biodegradao (respirmetria) p=,05
(1)NP
12,46453
(2)S
3,68399
1by2
3,44122
(3)CB
2,141017
1by3
1,906558
2by3
1,601737
10
12
14
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Figura 4.6 - Diagrama de Pareto gerado a partir das condies experimentais.

Tratamentos: NP: nitrognio e fsforo; S: surfactante; CB: consrcio bacteriano.
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O efeito relativamente maior dos nutrientes indica que a disponibilidade de nutrientes um fator limitante importante da biorremediao natural do solo ASP. O efeito positivo desse tipo de tratamento foi verificado em diversos trabalhos (GALLEGO et al., 2001; CARDONA e ITURBE, 2003). Contudo, alguns estudos revelam que a correo das quantidades de nitrognio e fsforo pode no apresentar efeitos na descontaminao (SEKLEMOVA et al., 2001; HENCKLEIN, 2005) ou mesmo representar um fator inibitrio devido a uma quantidade excessiva adicionada (TRINDADE et al., 2002; WALWOTH et al., 1997). O nitrognio quando adicionado na forma de sais de amnia pode ser txico aos microrganismos devido possibilidade da gerao de amnia, podendo ser letal em altas concentraes. Algumas fontes de fsforo (fosfatos e orto-fosfatos) podem ter diversos efeitos na biodegradao, dependendo da toxicidade e solubilidade apresentada por essas fontes ((GIBB et al., 2000 e MARGESIN et al., 2000) apud TRINDADE et al., 2002). Segundo Walworth et al. (1997), nveis inibitrios de nitrognio esto na faixa de 100 a 4000 mgN.Kg-1. Estes valores no esto de acordo com a correo de 2090 mgN.Kg-1 efetuada nesse experimento. A bioestimulao com a adio do surfactante Tween 80, cuja funo a de aumentar a disponibilidade dos hidrocarbonetos aos microrganismos, tambm apresentou efeitos positivos na eficincia de biodegradao, principalmente nos tratamentos (1 e 5) onde os nutrientes haviam sido ajustados. Os efeitos dos surfactantes em processos de biorremediao podem variar desde a estimulao at a inibio da desoro e biodegradao dos hidrocarbonetos (VOLKERING et al., 1998). Neste experimento, o surfactante no causou inibio do crescimento bacteriano devido a uma possvel toxicidade de compostos metablicos intermedirios, assim como no houve estmulo do crescimento devido a uma possvel utilizao do surfactante como co-substrato, uma vez que a mdia da populao bacteriana nos tratamentos com Tween 80 no difere estatisticamente (ANOVA) dos outros tratamentos. Aumento das taxas de biodegradao devido adio do surfactante Tween 80 tambm foi obtido por Xie (2003), Kataoka (2001) e Mueller et al. (1991) apud Rouse et al. (1994). De acordo com Zheng e Obbard (2002), Tween 80 um polioxietileno biodegradvel e no apresenta toxicidade quando presente no ambiente. Contudo, Hencklein (2005) observou diminuio da eficincia de biodegradao ao utilizar esse surfactante, o qual pode ter aumentado a disponibilidade de compostos mais txicos presentes na borra oleosa oriunda de refinaria de petrleo.
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O bioaumento com o consrcio bacteriano foi a varivel que apresentou relativamente o menor efeito positivo nas taxas de biodegradao. Comparando-se os tratamentos 1 e 5, possvel observar que a presena do consrcio no tratamento 1 aumentou claramente a eficincia de biodegradao (Figura 4.5). Este efeito positivo tambm pode ser notado na contagem final da populao bacteriolgica, pois, o tratamento 1 foi o que apresentou maior acrscimo. Contudo, a mdia das populaes nos tratamentos com bioaumento no foi estatisticamente (ANOVA) diferente dos outros tratamentos, o que pode ser um indcio do fraco efeito dessa varivel. Alguns pesquisadores reportam que o bioaumento pode no apresentar efeitos positivos, ou meramente marginais, na biodegradao de hidrocarbonetos. Culturas de microrganismos capazes de degradar poluentes orgnicos podem falhar nessa funo quando inoculados em ambientes naturais, porque esto susceptveis a toxinas ou predadores presentes no ambiente. Alm disso, os microrganismos podem metabolizar outros compostos orgnicos em preferncia ao poluente ou serem incapazes de se percolarem atravs do solo at os pontos de contaminao. O sucesso do uso de inculos microbianos requer que os microrganismos entrem em contato com os contaminantes, contudo, a adsoro fsica s partculas do solo ou a filtrao atravs de pequenos poros podem limitar o transporte dos microrganismos (MRQUES-ROCHA et al., 2001). Em alguns estudos, a estratgia do bioaumento tem apresentado melhores resultados quando realizada com microrganismos autctones (BENTO et al., 2003). Em termos de remoo de hidrocarbonetos (Figura 4.7), o comportamento foi similar aos dados respiromtricos, isto , tratamentos mais eficientes foram obtidos com nutrientes em combinao com outras estratgias. O tratamento 3 que apresentou maior remoo (57,8% de eficincia) de hidrocarbonetos (soma de todas as faixas) no corresponde ao tratamento com maior grau de mineralizao (tratamento 1). Em relao s faixas de hidrocarbonetos, no houve diferenas significativas entre a biodegradao de hidrocarbonetos leves e pesados como observado por Bento et al. (2003). Os valores iniciais das concentraes so (mg.kg-1): 151 (C8-C11); 1385(C11-C14); 2255 (C14-C20); 1770 (C20-C40); 5561 (total).
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70 C8 -C11 remoo de hidrocarbonetos (%) 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 tratamento 6 7 8 C11 - C14 C14 - C20 C20 - C40 total
Figura 4.7 - Eficincia de remoo de hidrocarbonetos. Anlises realizadas pelo laboratrio Bioagri Ambiental.
Na Figura 4.8 est representada a contagem de bactrias heterotrficas totais presentes no solo antes e depois do experimento. Na maioria dos tratamentos, as populaes microbiolgicas no final do experimento eram aproximadamente de 2 a 30 vezes maiores que as iniciais. O nmero de bactrias heterotrficas no foi influenciado pelos tratamentos (ANOVA), como observado por Bento et al. (2003). Hickman e Novak (1989) concluram que a biomassa microbiolgica total pode ser um parmetro ineficiente para se determinar o potencial de biodegradao, principalmente porque a biomassa ativa pode diferir na composio de espcies e nos regimes metablicos. Na contagem de bactrias heterotrficas totais aps o trmino deste experimento, foi observado nas placas de Petri o domnio, em termos de nmero de unidades formadoras de colnia, de duas colnias que diferiam pela cor (branca e amarela). As colnias brancas foram classificadas como Staphylococcus hominis e as amarelas como Kocuria palustris, ambas cocus gram-positivos. Na literatura consultada, no foram encontrados estudos que relacionassem a presena dessas espcies em solos contaminados com hidrocarbonetos. Contudo, Gomes et al. (2004) isolaram Staphylococcus aureus de amostras de leo pesado.
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12
10
tempo inicial tempo final
log (UFC / g de solo seco)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
tratamentos
Figura 4.8 - Populao de bactrias heterotrficas totais presentes no solo nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico.
A Tabela 4.5 expressa os valores de pH e consumo de nitrognio e fsforo no final dos tratamentos. Os valores de pH nos tratamentos sem adio de nutrientes aumentaram em comparao ao valor inicial de 6,7. Segundo Rhaman et al. (2003), um aumento no valor de pH sugere a formao de sub-produtos durante a degradao dos hidrocarbonetos. Este comportamento no foi observado nos tratamentos com adio de nutrientes, pois, o (NH4)2SO4 tem a propriedade de aumentar a acidez do solo. importante ressaltar que nenhum dos valores finais de pH considerado prejudicial atividade biolgica. Em relao aos nutrientes, o consumo de N apresentou uma relao linear com a eficincia de biodegradao (r = 0,7485; p = 0,0326); o baixo consumo de P nos tratamentos sem ajuste de nutrientes sugere que esse elemento, quando em baixas concentraes, no est disponvel para a populao bacteriana.
Tabela 4.5 - Valores de pH e consumo de nitrognio e fsforo no final do experimento respiromtrico. tratamento 1 2 3 4 5 6 7 8 pH final (CaCl2) 6,5 7,4 6,7 7,5 6,7 7,5 6,8 7,5 N (mg.Kg-1) 760 310 970 310 1110 380 900 450 P (mg.Kg-1) 73 1 69 0 71 0 59 0
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Os resultados obtidos com o teste biolgico de toxicidade aguda com Daphnia similis esto listados na Tabela 4.6. Inicialmente, somente tratamentos com adio de nutrientes apresentaram algum grau de toxicidade e no final dos tratamentos ocorreram diferentes graus de toxicidade, independentemente das estratgias e eficincia de biodegradao alcanada. Mediante os dados da Tabela 4.6, razovel rejeitar qualquer efeito txico derivado dos nutrientes e do surfactante Tween 80. Pelo fato do teste ser baseado na extrao aquosa dos poluentes, a maioria dos hidrocarbonetos iniciais, que tem baixa solubilidade em gua, foi limitadamente transferida para a gua. Assim, uma possvel explicao para o aumento da toxicidade durante a converso microbiana dos hidrocarbonetos a formao de metablitos intermedirios mais solveis.
Tabela 4.6 - Teste de toxicidade aguda empregando Daphnia similis. tempo inicial final 1 7,16 6,91 2 -1 6,32 3 7,16 7,03 CE50, 48h dos tratamentos 4 5 6 7,16 0,83 4,17 1,78 7 7,16 0,73 8 0,17
1 no txico Tratamentos: 1 NP/S/CB; 2 S/CB; 3 NP/CB; 4 CB; 5 NP/S; 6 S; 7 NP; 8 controle. NP: nitrognio e fsforo; S: surfactante; CB: consrcio bacteriano.
4.4 Avaliao da tcnica de bioaumento aplicada a solos

4.4.1 Teste de biodegradabilidade do leo diesel Os resultados obtidos com o teste de biodegradabilidade usando o indicador DCPIP (Tabela 4.7) mostram que os inculos usados nos tratamentos so capazes de degradar leo diesel (comercial). Alm disso, os testes realizados com os microrganismos nativos indicam que os solos tm uma microbiota adaptada para degradar hidrocarbonetos.
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Tabela 4.7 - Teste de biodegradabilidade do leo diesel (comercial) usando o indicador DCPIP cultura S. hominis K. palustris S. hominis + K. palustris O. anthropi consrcio microbiano - R inculo comercial - EM microrganismos nativos - ASP microrganismos nativos - SB microrganismos nativos - RC descolorao sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 4 dias) sim (aps 13 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 6 dias) sim (aps 2 dias)
Obs: durante o teste no foi observado descolorao do controle do substrato (sem inculo) ou do controle do inculo (sem leo diesel).
4.4.2 Experimentos respiromtricos A produo diria e acumulada de CO2 nos tratamentos 1, 2 e 3 (solo ASP) so mostrados, respectivamente, nas Figuras 4.9 e 4.10. No houve fase de adaptao em nenhum dos tratamentos, provavelmente devido a uma adaptao prvia dos microrganismos aos poluentes (o inculo consistiu de microrganismos indgenos) e a favorveis condies experimentais. Inicialmente a produo de CO2 nos tratamentos 2 e 3 (Figura 4.9) claramente superior ao 1, contudo, aproximadamente depois do 15 dia, estas curvas mostram uma tendncia de alcanar valores iguais ao do controle (tratamento 1), supostamente devido exausto dos hidrocarbonetos prontamente degradveis e ao consumo de nutrientes (Tabela 4.12). A produo de CO2 nos tratamentos com o solo SB (4 ao 6), representada nas Figuras 4.11 e 4.12, demonstram que tambm no houve fase de adaptao nesses casos, apesar do inculo ser constitudo por microrganismos exgenos. A adio de nutrientes no solo SB teve um efeito positivo menos pronunciado. De acordo com Bosma et al. (1997), a taxa em que as clulas microbianas podem converter compostos qumicos durante a biorremediao depende de dois fatores: a velocidade do metabolismo (a atividade intrnseca da clula) e a taxa de transferncia do contaminante para a clula (transferncia de massa), a chamada biodisponibilidade. A correo nutricional est relacionada ao primeiro fator, mas esta pode no ter efeito quando a transferncia de massa um fator limitante. 85
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A diminuio da biodisponibilidade pode ser um resultado de dois fatores no caso do solo SB. Como relatado por Lser et al. (1999), a presena de partculas finas no solo e baixos nveis de concentrao de hidrocarbonetos influenciam negativamente a biodisponibilidade. O solo SB tem uma porcentagem de argila trs vezes maior que o solo ASP (Tabela 4.4) e concentraes menores de hidrocarbonetos, respectivamente, 7198 e 22607 mg.kg-1.
250 produo diria de CO2 ( mol.d ) Parte 1 - ASP 200 1 2 3
-1
150
100
50
0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50 60
Figura 4.9 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 1).
Tratamentos: 1 controle (nenhum tratamento); 2 - bioestimulao (adio de N e P); 3 bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano).
8000 7000
CO2 produzido (mol)
Parte 1 - ASP 1 2 3
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0
10
20
30 tempo (dias)
40
50
60
Figura 4.10 - Produo acumulada de CO2 durante incubao dos tratamentos (ASP parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
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50 produo diria de CO2 ( mol.d )

-1
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50 60 Parte 1 - SB 4 5 6
Figura 4.11 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (SB parte 1).
2500 Parte 1 - SB 2000

CO2 produzido (mol)
1500
1000
500
0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50 60
Figura 4.12 - Produo acumulada de CO2 durante a incubao dos tratamentos (SB parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
Baseado na produo de CO2, a eficincia de biodegradao (EB) foi calculada usando a Equao 3.3 (Figuras 4.13 e 4.14). Esta eficincia est relacionada mineralizao dos hidrocarbonetos, portanto, no considera a formao de intermedirios. Para ambos os solos, a adio de nutrientes teve um efeito positivo na eficincia de biodegradao (ANOVA, nvel de confiana de 95%). O bioestmulo com a adio de nutrientes (N e P) tem sido 87
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reportado como um importante fator para aumentar a eficincia da biorremediao (GALLEGO et al., 2001; CARDONA e ITURBE, 2003). Contudo, quando considerado o foco principal desse experimento, isto , o estmulo da biorremediao mediante a injeo de inculo, no solo ASP isto no teve efeito, e no solo SB a influncia negativa do inculo diminuiu o efeito positivo alcanado com a injeo de nutrientes, de maneira que este tratamento obteve uma eficincia de biodegradao com nenhuma diferena em relao ao controle. Em alguns estudos, com o bioaumento da populao bacteriana que est presente no solo, a degradao de leo diesel e outros hidrocarbonetos presente no solo foi favorecida (KATAOKA, 2001; BENTO et al., 2003). No entanto, alguns pesquisadores reportam que a injeo de inculos no tem efeitos positivos ou so pouco significativos (MRQUESROCHA et al., 2001), um comportamento verificado no caso do solo ASP. O resultado obtido com o solo SB sugere que a competio por regimes metablicos entre as culturas inoculadas e nativas e as diferentes condies do solo (a adaptao do inculo a condies mais cidas no solo SB, Tabela 4.4) podem ter influenciado negativamente. Este efeito prejudicial obtido com a tcnica de bioaumento tambm foi observado por Pala et al. (2002) e Trindade et al. (2002).
Parte 1 - ASP
Eficincia de Biodegradao (%) (dados respiromtricos)
30 25 20 15 10 5 0 1 2 tratamento 3 11,5 22,9 21,2
Figura 4.13 - Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (ASP parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
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Parte 1 - SB
20
16,9
15 12,0 10 10,3
0 4 5 tratamento 6
Figura 4.14 - Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (SB parte 1). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
Na Figura 4.23 est representada a contagem de bactrias heterotrficas totais realizada antes e aps os tratamentos. Em relao ao solo ASP, os tratamentos com adio de nutrientes (2 e 3) tiveram a populao bacteriana final maior que a do controle e possvel verificar a ineficincia do inculo no tratamento 3, pois, a contagem final foi igual ao do tratamento 2, apesar de uma populao inicial maior. No solo SB, o valor final no tratamento 5 maior que no tratamento 4, confirmando o efeito positivo dos nutrientes que proporcionaram um crescimento significativo em relao ao tempo inicial. Este comportamento no foi observado no tratamento 6, possivelmente devido competio causada pelos microrganismos exgenos. Anlises cromatogrficas de amostras dos solos ASP e SB (Tabela 4.8) revelam que nesses locais o leo diesel sofreu um processo de intemperizao, isto , o combustvel teve suas caractersticas alteradas por mecanismos fsico-qumicos e biolgicos devido ao longo perodo de exposio s condies naturais. O leo diesel contem de 2000 a 4000 hidrocarbonetos, que compem uma mistura complexa de alcanos normais, ramificados e cclicos e compostos aromticos (GALLEGO et al., 2001), os quais no podem ser totalmente separados pela cromatografia gasosa. De fato, 89
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somente os n-alcanos e alguns hidrocarbonetos ramificados podem ser identificados separadamente. Perfis cromatogrficos de um leo diesel comercial, como usado nos tratamentos 7 ao 12 (Figura 4.19), geralmente apresentam um resoluo satisfatria para todos os n-alcanos e alguns outros alcanos isoprenides, como o pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) e o fitano (2,6,10,14-tetrametil-hexadecano). Contudo, a maior frao do leo diesel no caracterizada, porque a maioria dos componentes no pode ser resolvida e estes aparecem nos cromatogramas como uma lombada, que chamada a mistura complexa no resolvida (MCNR), que presumivelmente inclui alcanos ramificados e cclicos e subprodutos das transformaes dos hidrocarbonetos (MARCHAL et al., 2003; BREGNARD et al., 1996). Os hidrocarbonetos resolvidos so chamados hidrocarbonetos totais resolvidos (HTR) a os hidrocarbonetos totais de petrleo (HTP) so a soma dos HTR e da MCNR. Os HTR so hidrocarbonetos no degradados e aparecem como picos nos cromatogramas. Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos usualmente degradam alcanos ramificados e compostos isoprenides em velocidades menores que os alcanos de cadeias lineares. Portanto, a razo de alcanos lineares em relao aos compostos altamente ramificados pode refletir a extenso de degradao do leo diesel causada por microrganismos (BALBA et al., 1998). Nos cromatogramas, a lombada correspondente MCNR torna-se maior e os picos dos HTR diminuem devido biodegradao. Os hidrocarbonetos nos solos ASP e SB so principalmente caracterizados como alcanos isoprenides e MCNR, os quais so mais recalcitrantes que os n-alcanos (GALLEGO et al., 2001), e esta composio caracterstica de um leo diesel intemperizado.
Tabela 4.8 - Concentrao de hidrocarbonetos nos solos ASP e SB solo ASP SB n-alcanos totais <LD 81,8 pristano 266 65,0 fitano (mg.kg ) 162 43,8 2844 941 19763 6256 22607 7198
-1
HTR
MCNR
HTP
LD (limite de deteco) = 0,4 mg.kg-1 HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology .
A concentrao de hidrocarbonetos determinada no incio e fim dos tratamentos 1 ao 6 mostrada na Tabela 4.9. Somente a frao HTR foi determinada inicialmente e as concentraes do pristano e fitano no foram aferidas para esses tratamentos. Os resultados esto de acordo com os dados respiromtricos, isto , maiores eficincia de remoo de HTR e menor concentrao final das outras fraes de hidrocarbonetos nos tratamentos com 90
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melhores eficincias de biodegradao. Estes resultados tambm indicam que os microrganismos autctones estavam adaptados ao leo diesel intemperizado presente nos solos ASP e SB e que um contedo desbalanceado de nutrientes era um fator limitante. Cromatogramas das anlises finais podem ser vistos na Figura 4.15.
Tabela 4.9 - Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos tratamentos 1 ao 6. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%) tratamento 1 1 2 3 4 5 6 4084 4084 4084 877 877 877 HTR 2 3620 (11) 2650 (35) 2988 (27) 565 (36) 383 (56) 752 (14) n-alcanos totais 2 mg.kg-1 <LD1 <LD1 <LD1 <LD2 <LD2 <LD2 MCNR 2 20112 15970 17157 3287 2185 4423 HTP 2 23732 18620 20145 3851 2568 5175
LD (limite de deteco) = (1) 21 mg.kg-1; (2) 8 mg.kg-1 HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo; Anlises realizadas por Analytical Technology, exceto HTR no tempo inicial (Bioagri Ambiental). Tratamentos: (ASP parte 1) 1 controle (nenhum tratamento); 2 - bioestimulao (adio de N e P); 3 - bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (SB parte 1) 4 controle (nenhum tratamento); 5 - bioestimulao (adio de N e P); 6 - bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano).
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(1)
(4)
(2)
(5)
(3)
(6)
Figura 4.15 - Anlise cromatogrfica (HTP) no tempo final dos tratamentos com os solos ASP (1 ao 3) e SB (4 ao 5). Fatores de diluio: 50x (1; 2 e 3); 20x (4 e 6); 10x (5).
Tratamentos: (ASP parte 1) 1 controle (nenhum tratamento); 2 - bioestimulao (adio de N e P); 3 - bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (SB parte 1) 4 controle (nenhum tratamento); 5 - bioestimulao (adio de N e P); 6 bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano).
A produo de CO2 nos tratamentos 7 ao 12 (segunda parte dos experimentos respiromtricos solo RC) e seus valores acumulados so mostrados, respectivamente, nas Figuras 4.16 e 4.17. No houve fase de adaptao (lag phase) nos tratamentos, provavelmente pela adaptao prvia dos microrganismos aos hidrocarbonetos, pois o solo RC j mostrava baixo nvel de contaminao antes da adio artificial de leo diesel (Tabela 4.10), possivelmente devido a vazamentos nas tubulaes subterrneas e infiltraes no piso. Aproximadamente aps o 20 dia, a produo de CO2 em todos os tratamentos onde o leo diesel foi adicionado, comea a diminuir, o que pode representar uma falta de fontes de carbono facilmente assimilveis como os n-alcanos, presumidamente consumidos no incio dos tratamentos. Nos tratamentos com adio de inculo, a eficincia de biodegradao (Figura 4.18) no foi afetada (ANOVA, nvel de confiana de 95%) em comparao ao controle (tratamento 8).
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100 produo diria de CO2 ( mol.d ) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tempo (dias) 7 10 Parte 2 - RC 8 11 9 12

-1
Figura 4.16 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (RC parte 2).
Tratamentos: 7 - controle 1 - (apenas solo); 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao.
6000 Parte 2 - RC 5000

CO2 produzido (mol)
7 10
8 11
9 12
4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tempo (dias)
Figura 4.17 - Produo acumulada de CO2 durante a incubao dos tratamentos (RC parte 2). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
Tratamentos: 7 - controle 1 - (apenas solo); 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao.
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Parte 2 - RC
40 30 20 10 0
30,9 28,5
34,7 29,0
31,0
10 tratamento
11
12
Figura 4.18 - Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (RC parte 2). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
Tratamentos: 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao.
A eficincia de biodegradao em termos de remoo de HTP (Tabela 4.10) mostrou comportamento similar aos dados respiromtricos. As eficincias respiromrtricas foram aproximadamente de 30 % para todos os tratamentos (8 ao 12) e seguindo esta tendncia de nenhuma diferena entre os tratamentos, a remoo de HTP foi aproximadamente 50 % para todos os tratamentos, embora no tratamento 10 a remoo foi ligeiramente maior (58,6 %). Comparando os cromatogramas do tempo inicial com os do tempo final (Figura 4.19), bastante clara a diminuio dos picos referentes aos HTR. A Tabela 4.10 mostra que os componentes do leo diesel foram degradados na ordem decrescente esperada de susceptibilidade (GALLEGO et al., 2001): n-alcanos, alcanos isoprenides (pristano e fitano) e MCNR. Nos tratamentos 9 ao 12 (especialmente no 10), onde os inculos foram adicionados, a remoo de componentes mais recalcitrantes foi maior comparada ao tratamento 8, enquanto que a remoo dos n-alcanos teve um comportamento inverso. Estas informaes obtidas com as anlises cromatogrficas mostram que, apesar dos dados respiromtricos similares, a injeo de microrganismos oriundos de ambientes poludos aumentaram a biodegradao de compostos recalcitrantes. Resultados similares foram obtidos por Marchal et al. (2003).
94
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Tabela 4.10 - Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos tratamentos com o solo RC. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%) tratamento n-alcanos totais 1 2 -a 499 499 499 499 499 38 (92,0) 90 (81,9) 86 (82,7) 186 (62,8) 194 (61,1) pristano 1 44 44 44 44 44 2 25 (43,2) 22 (50,1) 15 (66,4) 21 (52,9) 21 (50,8) 1 24 24 24 24 24 fitano HTR 2 341 339 262 463 503 MCNR 1 4199 4199 4199 4199 4199 2 2717 (35,3) 2564 (38,9) 1984 (52,8) 2292 (45,4) 2449 (41,7) 1 5431 5431 5431 5431 5431 HTP 2 3058 (43,7) 2903 (46,5) 2246 (58,6) 2755 (49,3) 2952 (45,6)
7 8 9 10 11 12
a
2 1 (mg.kg-1) 104 15 1232 (39,1) 13 1232 (45,8) 9 1232 (64,3) 11 1232 (52,5) 12 1232 (45,4)
no analisado HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology, exceto tratamento 7 (Bioagri Ambiental). Tratamentos: 7 - controle 1 - (apenas solo); 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao.
(8)
(9)
(10) (tempo inicial) (11)
(12) Figura 4.19 - Anlise cromatogrfica (HTP) nos tempos inicial e final dos tratamentos com o solo RC (8 ao 11). Fatores de diluio: 20x (inicial e 8); 10x (9 ao 12).
Tratamentos: 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao.
Valores similares de populaes bacterianas iniciais nos tratamentos 7 ao 9 (Figura 4.23) indicam que os microrganismos adicionados previamente contaminao (tratamento 9)
95
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no aumentaram consideravelmente a populao microbiana, talvez devido falta de fontes de carbono adicionais. Esta observao e o fato de que no houve nenhum aumento na taxa de biodegradao sugerem que esta estratgia de bioaumento antes de ocorrer a contaminao tem ainda maiores chances de falhar em situaes reais, pois, durante o possvel longo perodo entre a injeo do inculo e o vazamento, os microrganismos tm que sobreviver perante predadores, competir por nutrientes escassos e manter suas habilidades degradadoras. Alm disso, como demonstrado no item 4.4.1, microrganismos hidrocarbonoclsticos sempre esto presentes em solos, mesmo aqueles no contaminados (VENKATESWARAN e HARAYAMA, 1995; RON e ROSENBERG, 2002 apud LEE et al., 2006). Nos tratamentos 11 e 12, a adio de inculos mais concentrados fez com que a populao microbiana inicial aumentasse para valores entre 108 e 109 UFC por grama de solo seco. Contudo, como nos outros tratamentos, incluindo o tratamento 7 (controle sem adio de leo diesel), a contagem foi de aproximadamente 107 no tempo final. Esta similaridade mostra que geralmente a biomassa microbiana pode ser um indicativo fraco para se determinar o potencial de biodegradao como observado por Hickman e Novak (1989), principalmente porque a biomassa ativa pode diferir na composio de espcies e nos regimes metablicos. A Tabela 4.12 mostra os valores de pH e consumo de nitrognio e fsforo no final dos tratamentos. O pH manteve-se estvel em valores neutros em todos os tratamentos (7 ao 12), o que uma condio favorvel biodegradao. Em relao aos nutrientes, no houve consumo de N ou P. Isto sugere que a maioria das formas qumicas destes compostos no estavam disponveis aos microrganismos. Provavelmente, a adio balanceada de formas facilmente assimilveis, como aquelas empregadas nos solos ASP e SB ((NH4)2SO4 e KH2PO4) (item 4.3), aumentaria a eficincia de biodegradao. A produo de CO2 nos tratamentos 13 e 14 (terceira parte dos experimentos respiromtricos solo ASP) e seus valores acumulados so mostrados, respectivamente, nas Figuras 4.20 e 4.21. No houve fase de adaptao nos tratamentos. Aps aproximadamente o 10 dia, a produo de CO2, em ambos os tratamentos, comea a diminuir, o que pode representar uma falta de fontes de carbonos mais facilmente assimilveis como os n-alcanos. Anlises estatsticas (ANOVA, nvel de confiana de 95%) das eficincias de biodegradao (Figura 4.22) mostram que a adio do inculo comercial EM no teve influncia em comparao ao controle (tratamento 13). Este comportamento tambm observado na concentrao de hidrocarbonetos (Tabela 4.11), cujos cromatogramas so 96
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apresentados na Figura 4.24. A ineficincia do inculo EM pode ser relacionado a sua incapacidade de sobreviver no solo ASP, fato indicado pelo valor mais baixo de contagem de bactrias em relao ao controle (tratamento 13) (Figura 4.23) sendo tambm importante ressaltar que o consrcio comercial EM nunca havia sido empregado na biorremediao de hidrocarbonetos.
60 Parte 3 - ASP produo diria de CO2 ( mol.d ) 50
-1
13
14
40 30 20
10 0 0 10 20 30 40 50 tempo (dias)
Figura 4.20 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 3).
Tratamentos: 13 - controle (nenhum tratamento); 14 - bioaumento (inculo comercial).
2000 1800 1600 CO2 produzido ( mol) 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 40 50 tempo (dias) Parte 3 - ASP 13 14
Figura 4.21 - Produo acumulada de CO2 durante a incubao dos tratamentos (ASP parte 3). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
97
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Parte 3 - ASP Eficincia de Biodegradao (%) (dados respiromtricos)
12 10 8 6 4 2 0 13 tratamento 6,7
8,6
14
Figura 4.22 - Eficincia de biodegradao obtida com os dados respiromtricos dos tratamentos (ASP parte 3). Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
1 2 3 4 5 tratamento 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5,0 6,0 7,0 8,0 log (UFC / g de solo seco)
9,0
10,0
Figura 4.23 - Contagem de bactrias heterotrficas totais no incio e final dos experimentos respiromtricos.
Tratamentos: (ASP parte 1) 1 controle (nenhum tratamento); 2 - bioestimulao (adio de N e P); 3 - bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (SB parte 1) 4 controle (nenhum tratamento); 5 - bioestimulao (adio de N e P); 6 bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (RC parte 2) 7 controle 1 - (apenas solo); 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 - bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao. (ASP parte 3) 13 - controle (nenhum tratamento); 14 - bioaumento (inculo comercial).
98
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Tabela 4.11 - Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos tratamentos com o solo ASP (parte 3). Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%) tratamento n-alcanos totais 1 2 <LD <LD 4,1 3,5 pristano 1 <LD <LD 2 2,4 1,9 1 <LD <LD fitano 2 1 (mg.kg-1) 1,3 1,1 62 62 HTR 2 35 (43,5 ) 38 (38,7) MCNR 1 722 722 2 228 (68,4) 260 (64,0) 1 784 784 HTP 2 263 (66,4) 297 (62,1)
13 14
LD (limite de deteco) = 4,0 mg.kg-1 HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology. Tratamentos: 13 - controle (nenhum tratamento); 14 - bioaumento (inculo comercial).
(13)
(tempo inicial)
(14) Figura 4.24 - Anlise cromatogrfica (HTP) no incio e final dos tratamentos com o solo ASP (13 e 14). Fatores de diluio: 10x (inicial); 1x (13 e 14).
99
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Tabela 4.12 - Valores de pH, nitrognio e fsforo nos experimentos respiromtricos tratamento solo pH1 inicial 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 2
N final 7,5 6,5 7,1 4,9 5,0 5,0 7,1 7,3 7,2 7,3 7,3 7,4 4,5 4,5 inicial 800 2090 2090 700 1480 1480 210 210 210 210 210 210 350 350 final inicial
-1
P final 6 66 56 2 55 48 2 2 2 2 2 2 -
ASP ASP ASP SB SB SB RC RC RC RC RC RC ASP ASP
6,7 6,7 6,7 5,0 5,0 5,0 7,4 7,1 7,2 7,3 7,1 7,1 4,6 4,6
(mg.kg ) 210 6 1050 139 1050 139 350 3 1260 99 1260 99 210 2 210 2 210 2 210 2 210 2 210 2 350 -2 350 -
CaCl2 no analisado Tratamentos: (ASP parte 1) 1 controle (nenhum tratamento); 2 - bioestimulao (adio de N e P); 3 bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (SB parte 1) 4 controle (nenhum tratamento); 5 - bioestimulao (adio de N e P); 6 - bioestimulao (adio de N e P) e bioaumento (consrcio bacteriano). (RC parte 2) 7 - controle 1 - (apenas solo); 8 controle 2 - (contaminao sem bioaumento); 9 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) antes de contaminao; 10 - bioaumento (S. hominis / K. palustris) depois de contaminao; 11 bioaumento (Ochrobactrum anthropi) depois de contaminao; 12 - bioaumento (consrcio - R) depois de contaminao. (ASP parte 3) 13 - controle (nenhum tratamento); 14 - bioaumento (inculo comercial).
4.5 Avaliao do efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas

4.5.1 Caracterizao da vinhaa A caracterizao fsico-qumica da vinhaa apresentada na Tabela 4.13.
Tabela 4.13 Caracterizao fsico-qumica da vinhaa
N P total (P2O5) K Ca Mg S Fe Mn Cu Zn B Na Co Mo Al Ba
a
% ppm K2O % ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm
0,22 65,00 0,32 740,00 210,00 835,00 97,50 -a -a 7,50 5,00 113,00 -a 2,00 72,50 0,54
Cd Cr Ni Pb material orgnica razo C/N massa especfica pH OD DQO Eh condutividade
ppm ppm ppm ppm % g/mL mg/L mg/L mV mS
1,06 0,15 0,26 -a 3,96 10,00 1,00 3,85 4,3 32000 260 8,52
no detectado.
100
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4.5.2 - Experimento respiromtrico As produes dirias de CO2 no experimento respiromtrico so apresentadas nas Figuras 4.25 a 4.29, onde cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas. A evoluo da produo de CO2 no tratamento 2 (Figura 4.25) mostra que a vinhaa foi quase totalmente biodegradada em 20 dias aps ter sido aplicada ao solo RC (sem adio de leo diesel). Um comportamento similar foi observado nos tratamentos com solos contaminados (Figuras 4.26 a 4.29), isto , a produo de CO2 nos tratamentos com vinhaa inicialmente se diferenciaram dos controles e aps aproximadamente o mesmo perodo, a produo declina at valores prximos aos dos controles. A contagem de bactrias heterotrficas totais nos tempos inicial e final da incubao (Figura 4.30) mostra que nos tratamentos com vinhaa a populao bacteriana foi maior que os controles no tempo final. Este aumento da populao microbiana causada pela vinhaa tambm foi verificada por Prata et al. (2001) e Crivelaro (2005) nos seus experimentos de biodegradao. Contudo, como observado por Hickman e Novak (1989), a biomassa microbiana total pode ser um fraco indicador para se determinar o potencial de biodegradao, principalmente porque a biomassa ativa pode diferir na composio de espcies e em regimes metablicos. Certamente estes microrganismos adicionais preferencialmente biodegradaram as fontes de carbono mais assimilveis como o glicerol presente na vinhaa (RODELLA et al., 1983; PRATA et al., 2001); caso contrrio, no seria observado um acentuado decrscimo da produo de CO2 depois do consumo da vinhaa. Alm disso, em relao aos solos RC e ASP, no h praticamente nenhuma diferena de eficincia de biodegradao em termos de concentrao de hidrocarbonetos entre os tratamentos com adio de vinhaa e os controles (Tabela 4.14). Os resultados com o solo SB, onde a eficincia de biodegradao foi claramente superior no controle, indicam que o consumo preferencial da vinhaa pode tambm atrasar o processo de biorremediao.
101
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100 90 produo diria de CO2 (mol.d ) 80

-1
Condies experimentais 1 2
70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 tempo (dias) 30 40 50
Figura 4.25 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos 1 (solo RC) e 2 (solo RC + vinhaa).
120 110 produo diria de CO2 ( mol.d ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 tempo (dias) 40 50 3 4

-1
Condies experimentais
Figura 4.26 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos 3 (solo RC + leo diesel intemperizado) e 4 (solo RC + leo diesel intemperizado + vinhaa).
102
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
160 150 140 produo diria de CO2 (mol.d ) 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 tempo (dias)
-1
Figura 4.27 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos 5 (solo RC + leo diesel comercial) e 6 (solo RC + leo diesel comercial + vinhaa).
80 Condies experimentais produo diria de CO2 ( mol.d )

-1
70 7 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 tempo (dias) 8
Figura 4.28 - Produo diria de CO2 durante a incubao dos tratamentos 7 (solo ASP) e 8 (solo ASP + vinhaa).
103
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
80 produo diria de CO2 ( mol.d )

-1
70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20
30
40
50
tempo (dias)
Figura 4.29 - Produo diria de CO2 durante incubao dos tratamentos 9 (solo SB) e 10 (solo SB + vinhaa).
1 2 3 4 tratamento 5 6 7 8 9 10 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 log (UFC / g solo seco) 7,5
8,0
8,5
Figura 4.30 - Contagem de bactrias heterotrficas totais nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico.
Tratamentos: 1 (solo RC); 2 (solo RC + vinhaa); 3 (solo RC + leo diesel intemperizado); 4 (solo RC + leo diesel intemperizado + vinhaa); 5 (solo RC + leo diesel comercial); 6 (solo RC + leo diesel comercial + vinhaa); 7 (solo ASP); 8 (solo ASP + vinhaa); 9 (solo SB); 10 (solo SB + vinhaa).
104
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Tabela 4.14 - Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) dos tratamentos. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%) trat. n-alcanos totais 1 2 -a -a <LD1 <LD1 499,2 499,2 <LD3 <LD3 <LD4 <LD4 <LD2 <LD2 <LD (>96,3) <LD2 (>96,3) 4,1 3,4 <LD4 <LD5
2
pristano 1 59,0 59,0 43,5 43,5 <LD3 <LD3 32,5 32,5 2 67,0 63,0 38,3 (11,5) 35,0 (19,5) 2,4 2,0 35,7 <LD (>39,7)
5
fitano 1 35,7 35,7 23,8 23,8 <LD3 <LD3 27,5 27,5 2 1 (mg.kg-1) 38,0 36,0 22,0 (7,6) 21,1 (11,3) 1,3 1,1 31,8 <LD (>28,7)
5
HTR 2 550 (22,6) 546 (23,2) 519 (57,8) 502 (59,2) 35,0 (43,5) 37,4 (39,6) 587 349 (31,6) 1 -
MCNR 2 4313 (2,9) 4326 (2,7) 4131 (1,6) 4160 (0,9) 228 (68,4) 204 (71,7) 1903 (41,9) 3183 (2,9) 1
HTP 2 4864 (5,6) 4872 (5,5) 4650 (14,4) 4663 (14,1) 263,2 (66,4) 241,0 (69,3) 2489 (34,3) 3532 (6,7)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
a
104.3 5155 5155 5431 5431 784 784 3787 3787
711 711 1231 1231 61,9 61,9 510 510
4444 4444 4199 4199 722 722 3277 3277
no analisado LD (limite de deteco) = (1) 3,6 mg.kg-1; (2) 18,5 mg.kg-1; (3) 4,0 mg.kg-1; (4) 2,0 mg.kg-1; (5) 19,6 mg.kg-1 HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology Tratamentos: 1 (solo RC); 2 (solo RC + vinhaa); 3 (solo RC + leo diesel intemperizado); 4 (solo RC + leo diesel intemperizado + vinhaa); 5 (solo RC + leo diesel comercial); 6 (solo RC + leo diesel comercial + vinhaa); 7 (solo ASP); 8 (solo ASP + vinhaa); 9 (solo SB); 10 (solo SB + vinhaa).
A Tabela 4.15 mostra os valores de pH e concentrao de matria orgnica, nitrognio e potssio nos tempos inicial e final dos tratamentos. Comparando os tratamentos com adio de vinhaa com os controles, os valores de pH no foram praticamente alterados; a matria orgnica e o contedo de nitrognio (somente no solo RC) e potssio aumentaram com a adio da vinhaa. A concentrao de potssio no solo e a capacidade de troca catinica so parmetros usados para calcular a dosagem de vinhaa a ser aplicada nos campos agrcolas de acordo com as especificaes do rgo ambiental paulista (CETESB, 2005b), uma vez que este resduo apresenta alta concentrao desse elemento.
105
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Tabela 4.15 - Valores de pH, e contedo de nitrognio e potssio no experimento respiromtrico tratamento pH1 inicial 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
matria orgnica final 6,9 7,2 7,0 6,7 7,0 4,5 4,5 4,7 4,9 inicial (mg.kg 6,0 8,0 10,0 8,0 8,0 15,0 18,0 18,0 20,0 final
-1
N inicial final
-1
K inicial final
7,1 7,2 7,2 7,1 7,3 4,6 4,7 4,7 4,8
) 5,0 8,0 8,0 8,0 8,0 13,0 17,0 22,0 18,0
(mg.kg ) 210 210 210 350 280 280 210 350 280 280 350 420 350 420 350 280 350 280
(mmolc/dm3) 3,9 3,9 1,3 1,4 4,0 3,7 1,3 1,2 3,9 3,8 1,3 1,5 3,5 3,8 1,4 1,7 3,7 3,8
CaCl2 Tratamentos: 2 (solo RC + vinhaa); 3 (solo RC + leo diesel intemperizado); 4 (solo RC + leo diesel intemperizado + vinhaa); 5 (solo RC + leo diesel comercial); 6 (solo RC + leo diesel comercial + vinhaa); 7 (solo ASP); 8 (solo ASP + vinhaa); 9 (solo SB); 10 (solo SB + vinhaa).
4.5.3 - Experimento com a gua subterrnea A Tabela 4.16 mostra os parmetros fsico-qumicos medidos durante a incubao dos frascos de DBO. Em geral, os tratamentos com adio de nutrientes tiveram comportamento similar ao dos controles, exceto o oxignio dissolvido que foi mais consumido nos primeiros, indicando uma intensificao das taxas de biodegradao. possvel observar que com a adio de vinhaa, surgiram uma srie de fatores inibitrios eficincia de biodegradao: valores de pH abaixo de 5 (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996); os tratamentos rapidamente alcanaram condies anaerbias (indicado pelo quase total consumo do oxignio dissolvido e pelos valores negativos de potencial redox) devido grande quantidade de matria orgnica presente na vinhaa, o que causou grande aumento na demanda qumica de oxignio (DQO); aumento de condutividade relacionado alta concentrao de sais dissolvidos na vinhaa, principalmente o potssio. A vinhaa tambm foi responsvel pelo aumento na concentrao de nitrato acima do limite (10 mg.L-1) determinado pela legislao em relao s guas potveis para consumo pblico (Portaria n.518/2004 MS). Em termos de concentrao dos hidrocarbonetos BTEX (Tabela 4.17), as concentraes remanescentes principalmente dos xilenos, os mais recalcitrantes (Kaplan et al., 1997), mostram que os tratamentos com vinhaa tiveram os piores desempenhos. As concentraes dos hidrocarbonetos poliaromticos (HPA) esto listadas na Tabela 4.18. Como a maioria destes valores est abaixo do limite de deteco, no possvel identificar qualquer influncia dos tratamentos na biodegradao desses hidrocarbonetos.
106
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Tabela 4.16 - Experimento com a gua subterrnea condio no aerada tratamento ASP pH SB ASP Eh (mV) SB ASP cond. (mS.cm-1) SB ASP DQO (mg.L-1) SB ASP OD (mg.L-1) SB 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 0 7,4 7,4 5,8 6,7 6,7 3,9 230 234 254 229 231 270 0,440 0,480 1,02 0,250 0,290 0,870 41,5 41,5 1699 37,8 35,9 1888 8,6 8,5 7,9 8,6 8,4 8,3 3,52 <LD 19,8 3,52 0,44 20,2 16,1 17,0 372 4,49 5,32 361 tempo (dias) 5 10 7,1 6,9 7,3 7,2 5,0 4,0 6,5 6,3 6,6 6,5 4,1 4,6 158 52 169 50 -18 65 216 92 208 76 -396 -408 0,490 0,500 0,520 0,540 1,17 1,23 0,260 0,290 0,310 0,320 0,970 0,970 41,9 24,1 41,9 20,4 1714 1111 36,2 13,0 30,5 11,1 1904 926 7,1 4,2 4,9 2,0 0,8 0,8 7,6 5,6 6,9 3,9 1,0 0,7 <LD 0,88 <LD 1,32 17,2 52,8 0,88 1,32 <LD 0,88 4,4 39,6 16,7 17,0 17,5 17,3 371 370 4,10 4,66 5,54 5,20 360 361 20 6,3 6,6 4,4 5,5 6,0 4,6 61 62 -58 204 184 -98 0,530 0,570 1,25 0,300 0,340 1,04 24,5 22,4 816 14,3 14,3 612,2 1,4 0,5 0,5 5,4 1,1 0,8 -a 15,8 16,2 370 4,09 5,18 359
ASP NO3 (mg.L-1)

-
SB ASP
K (mg.L-1)
a
SB
no analisado LD (limite de deteco) = 0,04 mg.L-1 Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + nutrientes; 3 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 4 - gua subterrnea (controle); 5 - gua subterrnea + nutrientes; 6 - gua subterrnea + vinhaa.
107
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Tabela 4.17 - Experimento com a gua subterrnea condio no aerada concentrao de BTEX (g.L-1) 0 105,23 <LD 231,35 290,38 105,23 <LD 231,35 290,38 105,23 <LD 231,35 290,38 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD tempo (dias) 5 10 <LD <LD 9,07 <LD 110,18 <LD 493,04 396,65 <LD 400,69 <LD <LD 452,7 <LD 166,67 254,63 <LD <LD <LD <LD 449,59 1775,73 730,65 2545,67 <LD <LD <LD <LD <LD <LD 149,57 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 658,24 731,22 <LD <LD <LD 694,49 1610,85 1163,25 20 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 9,081 1,08 0,06 98,12 60,33 1,09 <LD 1,23 1,04 <LD <LD <LD 3,12 0,092 <LD 134,02
ASP
SB
B T E X B T E X B T E X B T E X B T E X B T E X
B-benzeno; T-tolueno; E-etilbenzeno; X-xilenos LD (limite de deteco) = 0,004 g.L-1 Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + nutrientes; 3 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 4 - gua subterrnea (controle); 5 - gua subterrnea + nutrientes; 6 - gua subterrnea + vinhaa.
Tabela 4.18 - Experimento com a gua subterrnea condio no aerada concentrao de HPA (g.L-1) 1 0 Naftaleno Acenaftileno Fluoreno Antraceno Pireno Benzo[a]antraceno Criseno Benzo[k]fluoranteno Benzo[a]pireno Dibenz[a,h]antraceno Benzo[g,h,i]perileno Indeno(1,2,3)pireno Fenantreno Fluoranteno Benzo[b]fluoranteno
<LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
ASP 2 20
0,12 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
0
20
1,04 <LD 0,74 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,07 <LD <LD <LD <LD
3 4 tempo (dias) 0 20 0 20
<LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,03 <LD 0,94 <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,01 1,14 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 2,09 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
SB 5 0
6 20 0
20
2,07 <LD 0,13 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,23 <LD <LD <LD <LD
1,66 0,19 0,06 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
LD (limite de deteco) = 0,01 g.L-1 Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + nutrientes; 3 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 4 - gua subterrnea (controle); 5 - gua subterrnea + nutrientes; 6 - gua subterrnea + vinhaa.
108
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Os resultados anteriores mostraram que a alta concentrao de matria orgnica na vinhaa causou um rpido consumo do oxignio dissolvido na gua subterrnea. Assim, objetivando superar essa deficincia do processo, a segunda parte dos experimentos com a gua subterrnea foi baseada num sistema aerado. Os resultados obtidos com os biorreatores aerados so mostrados nas Tabelas 4.19 a 4.21. Tratamentos com adio de vinhaa tiveram o melhor desempenho em termos de diminuio da demanda qumica de oxignio (DQO) (Tabela 4.19), no entanto, os valores finais ainda so bastante altos (at 40 vezes em relao aos controles), indicando que, mesmo em 20 dias, a vinhaa no foi totalmente biodegradada. Assim como no experimento com frascos DBO, a adio de vinhaa teve um efeito negativo na biodegradao dos hidrocarbonetos, como sugere as concentraes de benzeno (ASP) e xilenos (ASP e SB) (Tabela 4.20). Nenhuma influncia da vinhaa na concentrao dos hidrocarbonetos poliaromticos (HPA) (Tabela 4.21) pde ser identificada, uma vez que a maioria destes valores est abaixo do limite de deteco.
Tabela 4.19 - Experimento com a gua subterrnea condio aerada tratamento DQO (mg.L-1) ASP SB 1 2 3 4 0 20 tempo (dias) 41,5 16,3 1699 408,2 37,8 12,2 1888 510,2 reduo % 60,7 76,0 67,7 73,0
Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 3 - gua subterrnea (controle); 4 - gua subterrnea + vinhaa.
Tabela 4.20 - Experimento com a gua subterrnea condio aerada concentrao de BTEX (g.L-1) 0 105,23 <LD 231,35 290,38 105,23 <LD 231,35 290,38 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD tempo (dias) 5 10 <LD <LD <LD <LD 78,44 <LD 111,32 996,13 <LD 1167,78 <LD <LD 75,76 <LD 97,79 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 922,53 <LD <LD 1051,65 20 <LD <LD <LD 3,35 276,02 0,08 <LD 111,87 0,07 <LD 3,02 10,34 0,21 <LD 1,32 123,09
1 ASP 2
3 SB 4
B T E X B T E X B T E X B T E X
B-benzeno; T-tolueno; E-etilbenzeno; X-xilenos LD (limite de deteco) = 0,004 g.L-1 Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 3 - gua subterrnea (controle); 4 - gua subterrnea + vinhaa.
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Tabela 4.21 - Experimento com a gua subterrnea biorreatores aerados concentrao de HPA (g.L-1) ASP 1 0 Naftaleno Acenaftileno Fluoreno Antraceno Pireno Benzo[a]antraceno Criseno Benzo[k]fluoranteno Benzo[a]pireno Dibenz[a,h]antraceno Benzo[g,h,i]perileno Indeno(1,2,3)pireno Fenantreno Fluoranteno Benzo[b]fluoranteno
SB 2 3 tempo (dias) 20 0
2,02 <LD 1,17 1,09 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 0,16 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
4 20
2,1 <LD 0,02 0,04 0,01 <LD <LD <LD 0,01 <LD <LD <LD 0,43 <LD <LD
20
0,08 <LD 0,14 0,72 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
0
0
20
0,17 <LD <LD 0,12 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
LD (limite de deteco) = 0,01 g.L-1 Tratamentos: (ASP) 1 - gua subterrnea (controle); 2 - gua subterrnea + vinhaa; (SB) 3 - gua subterrnea (controle); 4 - gua subterrnea + vinhaa.
4.6 Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado

4.6.1 - Composio dos leos diesel O leo diesel foi coletado de uma espessa camada acima da gua subterrnea, onde se encontrava devido a um vazamento que ocorrera h aproximadamente dez anos. De acordo com Kaplan (1997), nesta situao onde h uma espessa camada de produto em fase livre, a taxa de alterao do leo lenta porque os processos responsveis por esses fenmenos somente ocorrem nas interfaces combustvel/gua e combustvel/ar. A biodegradao na regio interna do produto extremamente lenta devido limitao de oxignio, gua e nutrientes. Assim, o combustvel pode permanecer relativamente inalterado por um longo perodo de tempo, como dcadas. As alteraes mais provveis a acontecer nesta situao so a evaporao dos hidrocarbonetos mais volteis e a dissoluo dos componentes mais solveis. Apesar dessas consideraes, as anlises mostram que o leo diesel no posto ASP teve algumas de suas caractersticas alteradas, e provavelmente devido a processos biolgicos e fsico-qumicos. O leo diesel intemperizado tem uma colorao verde escura e um odor diferente em relao ao leo diesel comercial. A mudana de cor resultado da deteriorao dos corantes presentes no combustvel (KAPLAN, 1997). A Tabela 4.22 mostra que o leo diesel 110
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comercial tem concentrao maior de BTEX. A comparao dos cromatogramas encontra-se na Figura 4.31. Isto reflete principalmente o efeito da exposio do leo diesel a um ambiente aquoso e volatilizao. No poo de monitoramento onde o leo foi coletado, a gua subterrnea apresentou as seguintes concentraes de BTEX: 112,1; 98,5; 115,7 e 865,8 g/L, respectivamente. As concentraes dos HPA esto listadas na Tabela 4.23. Estas molculas recalcitrantes so lentamente degradadas, e na medida que os outros processos de alterao dos demais hidrocarbonetos avanam mais rapidamente, o leo diesel torna-se enriquecido com a frao dos HPA. Assim, o leo intemperizado mostrou um significante aumento da concentrao de HPA. A Figura 4.32 mostra os cromatogramas comparativos. Analisando a concentrao dos HTP (Tabela 4.24), o leo intemperizado no apresenta n-alcanos detectveis e tem uma alta abundncia dos recalcitrantes pristano e fitano, o que est de acordo com o processo de intemperizao. Alm disso, as fraes HTR e MCNR, respectivamente, so menor e maior no leo intemperizado, o que outro indicativo de biodegradao. Nos cromatogramas (Figura 4.33), possvel observar que a lombada caracterstica da MCNR torna-se maior e os picos dos HTR diminuem no leo intemperizado.
Tabela 4.22 Concentrao de BTEX nos leos diesel comercial Benzeno Tolueno Etilbenzeno m,p-Xilenos o-Xileno Total <LD 84,90 171,71 565,24 321,41 1143,26 intemperizado g.Kg-1 <LD <LD 69,78 112,86 14,52 197,16
LD (limite de deteco) = 1,58 g.Kg-1 Anlises realizadas por Analytical Technology
111
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Tabela 4.23 Concentrao de HPA nos leos diesel comercial Naftaleno Acenaftileno Acenafiteno Fluoreno Fenantreno Antraceno Fluoranteno Pireno Benzo(a)antraceno Criseno Benzo[b]fluoranteno Benzo[k] fluoranteno Benzo[a]pireno Indeno(1,2,3-cd)pireno Dibenz[a,h]antraceno Benzo[g,h,i]perileno Total 578,31 <LD(1) 257,32 534,84 257,65 13,88 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 1641,99 intemperizado g.Kg-1 4276,21 <LD(2) 822,63 1221,17 2024,41 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 8344,42
LD (limite de deteco) = (1) 3,16 g.Kg-1; (2) 31,9 g.Kg-1 Anlises realizadas por Analytical Technology
Tabela 4.24 Concentrao de HTP nos leos diesel comercial C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 pristano C18 fitano C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 C35 C36 <LD <LD <LD 21703,5 21654,5 29535,3 25213,5 20737,7 26837,2 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD intemperizado g.Kg-1 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 37916,4 <LD 18833,5 <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD
112
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Tabela 4.24 Concentrao de HTP nos leos diesel (cont.) HTR MCNR Total (HTP) 592987,1 2601550,3 3194537,4 424207,6 2900513,6 3324721,2
LD (limite de deteco) = 17712.8 g/Kg. HTR - Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology
(a)
(b)
Figura 4.31 - Anlise cromatogrfica (BTEX) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: 1x.
(a)
(b)
Figura 4.32 - Anlise cromatogrfica (HPA) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: respectivamente: 1x e 10x.
113
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(a)
(b)
Figura 4.33 - Anlise cromatogrfica (HTP) dos leos diesel (a) comercial e (b) intemperizado. Fator de diluio: 50x. 4.6.2 - Teste de biodegradabilidade: indicador redox DCPIP Os resultados obtidos com o teste de biodegradabilidade usando o indicador redox DCPIP esto listados nas Tabelas 4.25 e 4.26, que expressam os testes realizados em tubos de ensaio e em frascos erlenmeyers, respectivamente. Inicialmente, como nos tubos de ensaio os inculos foram adicionados em concentraes iguais, a habilidade relativa das diferentes culturas pode ser avaliada dependendo do tempo desprendido para a descolorao do meio de cultivo (HANSON et al., 1993). Assim, todas as culturas tiveram capacidade similar para biodegradar o leo diesel comercial, mas somente o consrcio R, oriundo da gua residuria da refinaria Replan, degradou o leo intemperizado (Tabela 4.25). Mesmo culturas nativas (S. hominis e K. palustris) e os gneros Bacillus e Pseudomonas, conhecidos por serem degradadores de hidrocarbonetos (BALBA et al., 1998), no foram capazes de biodegradar o leo intemperizado. Nenhum estudo relacionando as culturas S. hominis e K. palustris biodegradao de hidrocarbonetos foi encontrado. No entanto, Gomes et al. (2004) descrevem a produo de biossurfactante por uma linhagem de S. aureus. As outras culturas vm demonstrando serem capazes de degradar hidrocarbonetos. P. aeruginosa um reconhecido produtor do biossurfactante raminolipidio (MAIER e SOBERON-CHAVEZ, 2000). A linhagem P. aeruginosa LBI foi capaz de produzir biossurfactante utilizando a borra resultante do refino da soja (soapstock) (MORAES et al., 2002), manitol e glicerol (SILVA, 2005) e querosene, leo diesel comercial, petrleo e borra oleosa (PIRLLO, 2006). A mesma cultura O. anthropi melhorou a biodegradao de borra oleosa e foi capaz de biodegradar hexano, heptano, hexadecano e leo diesel comercial (KATAOKA, 2001). 114
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Tabela 4.25 Teste de biodegradabilidade (DCPIP) em tubos de ensaio cultura comercial (1) O. anthropi (2) B. cereus (3) S. hominis (4) K. palustris (5) consrcio R (6) P. aeruginosa LBI (1) + (2) (3) + (4) (1) + (2) + (3) + (4) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 4 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 3 dias) descolorao intemperizado no no no no sim (aps 15 dias) no no no no
Obs: durante os 18 dias de teste, no foi observado descolorao do controle do substrato (sem inculo) ou do controle do inculo (sem leo diesel).
Nos testes realizados em frascos erlenmeyer (Tabela 4.26) (Figura 4.34), novamente P. aeruginosa LBI no demonstrou habilidade para degradar o leo intemperizado. Todos os consrcios conseguiram degradar ambos os leos diesel, exceto o inculo comercial EM. Como mencionado anteriormente, EM nunca havia sido testado em hidrocarbonetos. Neste experimento, este inculo foi capaz de biodegradar somente o leo comercial, assim como os outros microrganismos com reconhecida habilidade de biodegradao desses compostos. A Figura 4.34 mostra o resultado do teste com a P. aeruginosa LBI (leo diesel comercial); a colorao verde do frasco 2 caracterstica dessa espcie de bactria. Os testes realizados com os microrganismos nativos (ASP-S, SB-S, RC-S, ASP-AS e SB-AS) indicam que nos solos ou guas subterrneas contaminados j se encontra uma microbiota adaptada para degradar hidrocarbonetos recalcitrantes. Alm disso, o resultado obtido com o consrcio U mostra, como em outros trabalhos (VENKATESWARAN e HARAYAMA, 1995; RON e ROSENBERG, 2002 apud LEE et al., 2006), que microrganismos hidrocarbonoclsticos sempre esto presentes em solos, mesmos aqueles no poludos. O melhor desempenho dos consrcios demonstra a importncia de se considerar o papel do co-metabolismo no tratamento de poluentes recalcitrantes como o leo diesel
115
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intemperizado, onde cada espcie tem uma funo especfica nas seqncias de reaes enzimticas responsveis pela quebra de cadeias complexas de hidrocarbonetos.
Tabela 4.26 Teste de biodegradabilidade (DCPIP) em frascos erlenmeyer cultura comercial P. aeruginosa LBI EM L ASP-S SB-S RC-S U ASP-AS SB-AS sim (aps 3 dias) sim (aps 13 dias) sim (aps 5 dias) sim (aps 3 dias) sim (aps 6 dias) sim (aps 2 dias) sim (aps 2 dias) sim (aps 1 dia) sim (aps 3 dias) descolorao intemperizado no no sim (aps 5 dias) sim (aps 9 dias) sim (aps 6 dias) sim (aps 2 dias) sim (aps 4 dias) sim (aps <1 dia) sim (aps 3 dias)
Obs: no foi observado descolorao do controle do substrato (sem inculo) ou do controle do inculo (sem leo diesel).
(1)
(2)
Figura 4.34 - Descolorao do indicador redox DCPIP durante teste de biodegradabilidade do leo diesel comercial pela bactria P. aeruginosa LBI (frasco 2). Frasco 1: controle do substrato (sem inculo). 4.6.3 - Experimento respiromtrico A produo diria de CO2 no experimento 1 e seu valor acumulado esto representados, respectivamente, nas Figuras 4.35 e 4.36. Estes resultados mostram que at aproximadamente o 10 dia as taxas de biodegradao foram bastante similares, mas aps este 116
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perodo, a velocidade de consumo do leo comercial aumenta at o 27 dia (valor mximo), enquanto que a taxa em relao ao leo intemperizado mantem-se quase constante. Certamente os hidrocarbonetos mais facilmente assimilveis, em maior quantidade no leo comercial, foram responsveis por essa diferena. Os resultados do experimento 2, que foi realizado nas mesmas condies mas por um perodo mais longo, foram colocados nos mesmos grficos contendo os resultados do experimento 1 (Figuras 4.37 e 4.38). Esta comparao confirma que, aps 70 dias, as taxas tornam-se iguais, indicando o consumo dos hidrocarbonetos mais facilmente assimilveis presentes no leo comercial durante esse perodo. Alm disso, a similaridade entre as curvas mostra que o experimento respiromtrico tem uma boa reprodutibilidade.
100 90 produo diria de CO2 ( mol.d )

-1
Condies experimentais intemperizado comercial
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
10
20
30
40
50
tempo (dias)
Figura 4.35 - Produo diria de CO2 durante a incubao (experimento 1).
117
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3500 Condies experimentais 3000 produo diria de CO2 ( mol) 2500 2000 1500 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 tempo (dias) intemperizado comercial
Figura 4.36 - Produo acumulada de CO2 (experimento 1) durante a incubao. Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
100 90 produo diria de CO2 ( mol.d )

-1
Condies experimentais intemperizado comercial
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60
70
80
90
tempo (dias)
Figura 4.37 - Produo diria de CO2 durante a incubao: 48 dias (experimento 1) e 92 dias (experimento 2).
118
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6000 Condies experimentais 5000 CO2 produzido ( mol) 4000 intemperizado comercial Srie3 Srie4 3000
2000 1000
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tempo (dias)
Figura 4.38 - Produo acumulada de CO2 nos experimentos 1 (48 dias) e 2 (92 dias) durante a incubao. Cada barra de erro representa um desvio padro de trs rplicas.
As concentraes de hidrocarbonetos no comeo e final do experimento respiromtrico 1 so listadas na Tabela 4.27. Estes valores esto de acordo com os resultados respiromtricos. As eficincias de biodegradao em relao aos hidrocarbonetos no recalcitrantes (n-alcanos totais e a frao HTR) so claramente maiores no leo comercial, o que explica o aumento da taxa de produo de CO2; as concentraes das fraes principais (HTR e MCNR) so similares no final do experimento, confirmando a tendncia de equalizao das taxas de produo de CO2. A Figura 4.39 mostra que a populao de bactrias heterotrficas totais foi favorecida pela relativa maior abundncia de hidrocarbonetos no recalcitrantes no leo diesel comercial. Embora os microrganismos nativos do solo RC (consrcio RC-S) fossem capazes de biodegradar ambos os leos diesel, como demonstrado no teste do indicador redox, numa condio de contaminao simulada (experimento respiromtrico), a eficincia de biodegradao dos HTP foi aproximadamente 2,5 vezes maior quando o leo comercial foi utilizado; essa diferena pode ser significante na estimativa de tempo necessrio para a limpeza de uma rea contaminada antiga.
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Tabela 4.27 - Concentrao de hidrocarbonetos no incio (1) e final (2) do experimento respiromtrico 1. Valores entre parnteses indicam a eficincia de remoo (%) leo diesel n-alcanos totais 1 2 499 < LD2 < LD1 (>96,3) < LD1 pristano 1 43,5 58,9 2 38,3 (12,0) 67.0 (-13,8) 1 23,8 35,7 fitano HTR 2 519 (57,8) 550 (22,6) 1 4199 4444 MCNR 2 4131 (1,6) 4313 (2,9) 1 5431 5155 HTP 2 4650 (14,4) 4864 (5,6)
comercial intemp.
2 1 (mg.kg-1) 22,0 1231 (7,6) 38,0 711 (-6,4)
LD (limite de deteco) = (1) 18,5 mg.kg-1; (2) 3,6 mg.kg-1 HTR Hidrocarbonetos Totais Resolvidos; MCNR Mistura Complexa no Resolvida; HTP - Hidrocarbonetos Totais de Petrleo Anlises realizadas por Analytical Technology
leo diesel intemperizado
tempo inicial tempo final leo diesel comercial
5,0
5,5
6,0 6,5 log (UFC / g solo seco)
7,0
7,5
8,0
Figura 4.39 - Contagem de bactrias heterotrficas totais nos tempos inicial e final do experimento respiromtrico 1.
4.7 Produo de biossurfactante utilizando-se leo diesel intemperizado

A Tabela 4.28 mostra os resultados das medidas de tenso superficial dos meios de cultivo sem inculo (tenso superficial inicial) e aps o perodo de incubao (tenso superficial final) de acordo com as condies experimentais descritas na Tabela 3.9. Foi avaliada a influncia do meio de cultura (Robert ou BH) e da fonte de carbono (diesel intemperizado (D-I) ou comercial (D-C)) em diferentes concentraes, na produo de biossurfactante. A irradiao de ultrassom em alguns experimentos foi realizada objetivando verificar um possvel armazenamento de biossurfactante na parede celular das culturas S. hominis e K. palustris.
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Os resultados demonstram que em todos os experimentos, nenhuma diminuio significativa na tenso superficial foi verificada. De acordo com Haba et al. (2000), so considerados bons produtores de biossurfactante aqueles que reduzem a tenso superficial a 40 mN.m-1 ou menos. Assim, nenhuma produo de biossurfactante foi obtida nos experimentos.
Tabela 4.28 Medidas de tenso superficial experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 tenso superficial inicial final (mN.m-1) 53,0 62,0 52,4 51,2 52,4 53,3 54,0 53,0 52,0 51,5 50,0 55,5 51,5 56,0 51,5 57,0 50,0 55,5 50,0 59,9 53,0 52,5 52,4 49,1 52,4 51,2 54,0 53,0 52,0 51,0 50,0 57,0 51,5 53,5 51,5 57,5 50,0 49,0 50,0 57,0 52,0 48,5 61,0 58,0 52,5 45,0
Testes de emulsificao nos experimentos 1; 4; 5; 11; 14 e 15 demonstraram que nenhum bioemulsificador foi produzido pelas culturas S. hominis e K. palustris, uma vez que o parmetro E24 (Equao 3.4) para ambos os leos diesel e querosene foi igual a zero. O biossurfactante raminolipdio produzido pela linhagem P. aeruginosa LBI utilizando-se leo diesel comercial (PIRLLO, 2006) foi capaz de emulsificar diferentes compostos como benzeno, querosene, leo diesel comercial e petrleo. Os testes de biodegradabilidade utilizando-se o indicador redox DCPIP (item 4.6.2) esto de acordo com os resultados obtidos pela P. aeruginosa LBI em relao produo de biossurfactantes, isto , esta cultura somente foi capaz de produzir biossurfactante
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(PIRLLO, 2006) utilizando uma fonte de carbono que pudesse ser biodegradada (leo diesel comercial). Ambas as culturas S. hominis e K. palustris demonstraram capacidade de biodegradar leo diesel comercial (item 4.6.2), contudo, conhecido que nem todos os microrganismos hidrocarbonoclsticos so capazes de produzir biossurfactantes. Algumas clulas microbianas mostram alta hidrofobicidade superficial, sendo consideradas elas mesmas um biossurfactante, por exemplo, microrganismos hidrocarbonoclsticos, algumas espcies de Cyanobacteria e alguns patgenos como S. aureus e Serratia sp. (NITSCHKE e PASTORE, 2002). Nenhum estudo relacionando as culturas S. hominis e K. palustris biodegradao de hidrocarbonetos e produo de biossurfactantes foi encontrado. No entanto, Gomes et al. (2004) relatam o armazenamento de biossurfactante na parede celular de uma linhagem de S. aureus. Analisando a influncia do meio de cultivo na produo de biossurfactante, a cultura P. aeruginosa LBI foi capaz de produzir biossurfactante em meio Robert usando leo diesel comercial como fonte de carbono (PIRLLO, 2006). Isto sugere que o meio BH (como empregado no experimento 23) pode no ser adequado produo de biossurfactantes, especialmente nos casos em que so utilizados hidrocarbonetos como matria prima. Este meio no apresenta nenhuma fonte de carbono facilmente biodegradvel como o extrato de levedura, que pode ser utilizado como um inicializador (start-up) pelos microrganismos. Alm disso, o meio BH contem altas concentraes de ferro. Ramana e Karanth (1989) observaram que a presena de ferro no meio inibia a produo de glicolipdios pela P. aeruginosa CFTR-6, principalmente em concentraes de FeSO4.7H2O maiores que 0,01 g.L-1. Este fato tambm foi observado por Silva (2005) com a linhagem P. aeruginosa LBI. Outra questo a ser considerada que mesmo culturas com provada capacidade de produzir biossurfactantes, por exemplo a P. aeruginosa LBI, pode no demonstrar uma resposta positiva imediata a matrias primas que tenham suas caractersticas alteradas por mecanismos fsico-qumicos e biolgicos devido ao longo perodo de exposio desses compostos a condies ambientais, a exemplo do leo intemperizado utilizado nesse experimento, no qual esto presentes maiores quantidade de hidrocarbonetos recalcitrantes. Este fato pode em alguns casos diminuir a produo de biossurfactante in-situ em processos de biorremediao baseados na adio desses microrganismos em reas onde a contaminao ocorreu h vrios anos. 122
5 - CONCLUSES
A partir de ensaios laboratoriais e do monitoramento da gua subterrnea, ainda que atravs de um nmero pequeno de poos de monitoramento, foi possvel identificar fatores que corroboram a eficincia da tcnica de biorremediao natural para o tratamento da gua subterrnea contaminada em decorrncia do vazamento de leo diesel no posto de combustveis SB. A presena de microrganismos capazes de biodegradar hidrocarbonetos, a disponibilidade de oxignio dissolvido e a diminuio da concentrao de hidrocarbonetos ao longo do sentido do fluxo da gua subterrnea so indicativos de que est ocorrendo a biodegradao. Contudo, a presena de hidrocarbonetos retidos no solo representam uma fonte contnua de contaminao, e por isso o monitoramento a longo prazo faz-se necessrio. A combinao das tcnicas de biorremediao (bioestimulao com a adio de nutrientes e de um surfactante e bioaumento) aplicadas ao solo ASP aproximadamente dobrou a eficincia de biodegradao em termos de mineralizao (19,8%) com uma remoo de hidrocarbonetos de 45,5%. Observou-se que a deficincia de nutrientes foi o fator limitante principal do processo e o aumento da eficincia de biodegradao com o surfactante Tween 80 sugere que este produto foi efetivo em aumentar a biodisponibilidade dos hidrocarbonetos. O escasso efeito do bioaumento com bactrias alctones est de acordo com outros estudos que recomendam o uso dessa tcnica em casos de poluentes mais recalcitrantes ou quando a microbiota local insuficiente ou inadequada. Com a aplicao da tcnica do bioaumento em diferentes solos, foi verificado que nenhum ganho foi obtido com esta tcnica de biorremediao, embora o bioaumento tenha sido realizado com microrganismos com comprovada capacidade de degradar leo diesel. Uma explicao razovel para esta ineficincia que, quando adicionados ao solo, microrganismos esto sujeitos a princpios ecolgicos de competio e predao, o que
Concluses
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diminui significativamente as suas chances de sobrevivncia em ambiente naturais. Alm disso, os solos coletados dos trs postos de combustveis apresentaram uma microbiota nativa j adaptada para degradar hidrocarbonetos, o que sugere que o uso do bioaumento com o objetivo de acelerar o processo de biorremediao, alcanaria melhores resultados no caso de substncias mais recalcitrantes ou quando a populao microbiana local insuficiente ou inadequada. De qualquer modo, o desenvolvimento de tcnicas para assegurar a sobrevivncia dos microrganismos no ambiente natural essencial. Embora a adio da vinhaa tenha proporcionado certa fertilizao dos solos e um aumento da populao microbiana, esta no se mostrou adequada para aumentar a eficincia de biodegradao do leo diesel. A adio de vinhaa nas guas subterrneas contaminadas teve um efeito negativo na biodegradao dos hidrocarbonetos, uma vez que a vinhaa, como uma fonte de carbono facilmente assimilvel, foi preferencialmente consumida. Assim, o uso da vinhaa em processos de biorremediao mostrou-se ineficiente nas condies estudadas. importante ressaltar a necessidade de ateno em qualquer tentativa de utilizar-se resduos como agentes estimulantes da biorremediao, porque eles representam uma fonte potencial de poluio; assim, o uso deveria ser restrito a tratamentos ex-situ, pois, processos controlados minimizariam qualquer risco de contaminao adicional. Estudos de biodegradabilidade que no consideram o efeito de intemperizao dos poluentes podem superestimar a taxa de biodegradao; assim, quando a tcnica do bioaumento necessria, a melhor estratgia seria aquela baseada na injeo de consrcios, pois, mesmo culturas com reconhecida habilidade de biodegradar hidrocarbonetos podem falhar quando aplicadas isoladamente. As culturas Staphylococcus hominis, Kocuria palustris e Pseudomona aeruginosa LBI, nas condies estudadas, no foram capazes de produzir biossurfactante utilizando leo diesel intemperizado proveniente de um vazamento. Apesar disso, tentativas para empregar resduos hidrofbicos como substratos de baixo custo no podem ser descartadas, uma vez que outros estudos vm demonstrando que isto possvel. Alm disso, o uso de matrias primas de baixo custo pode no somente melhorar o aproveitamento de resduos, mas tambm simultaneamente gerar produtos com alto valor agregado de extrema importncia. Finalmente, culturas com demonstrada capacidade para produzir biossurfactantes, como P. aeruginosa LBI, podem no apresentar um bom desempenho quando matrias primas alternativas so empregadas, por exemplo, leo diesel intemperizado. Este fato tambm pode comprometer a produo in-situ de biossurfactantes em processos de biorremediao.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Instituto de Geocincias e Cincias Exatas Campus de Rio Claro

Adriano Pinto Mariano

Rio Claro (SP) Dezembro/2006

Prof. Dr. Daniel Marcos Bonotto Unesp/IGCE/Rio Claro

Prof. Dr. Carlos Renato Corso Unesp/IB/Rio Claro

Prof. Dr. Bruno Coraucci Filho Unicamp/FEC/Campinas

Profa. Dra. Cassiana Maria Reganhan Coneglian Unicamp/Ceset/Limeira

Dra. Aurora Mariana Garcia de Frana Souza Cetesb/Piracicaba

Adriano Pinto Mariano

Rio Claro, 13 de Dezembro de 2006.

Resultado: Aprovado com Louvor

63 64 65 65 66 66 66 66 67 67 68 70 70 76 77 84 84 85 100 101 106 110 110 114 116 120

5 CONCLUSES............................................................................................................................................... 123 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................................................... 125

102 103 103 104 104 113 113 114

Key words: Bioremediation, petrol stations, diesel oil, vinasse, biosurfactant

- comparar a capacidade de diferentes microrganismos em biodegradar leo diesel comercial e intemperizado;

2.1 Combustveis derivados do petrleo

2.2 Hidrocarbonetos como fonte de contaminao da subsuperfcie

2.3 Tcnicas de remediao aplicadas a reas contaminadas

Documento em fase de concluso disponvel na pgina da CETESB na internet (www.cetesb.sp.gov.br).

Tabela 2.1 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona no saturada

Tabela 2.2 Alguns exemplos de tcnicas de remediao da zona saturada

carvo ativado Tratamentos ex situ: coluna de aerao (air stripping) biorremediao

hidrocarbonetos, em zonas contaminadas e no contaminadas; potencial de biodegradao e taxas de degradao.

2.4 Biodegradabilidade dos hidrocarbonetos BTEX

2.5 Microrganismos degradadores de hidrocarbonetos

2.6 Mtodos de avaliao da biodegradao em laboratrio

2.7 Processo de intemperizao do leo diesel

2.8 Produo de biossurfactantes utilizando-se matrias primas alternativas

3.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB

3.2 Amostragem de solo nos postos de combustveis

Figura 3.4 Coleta de solo no posto RC.

3.3 Anlises realizadas nos solos

Figura 3.5 - Esquema de um respirmetro de Bartha e Pramer

3.5 Avaliao de diferentes tcnicas de biorremediao aplicadas ao solo ASP

3.6 Avaliao da tcnica de bioaumento aplicada a solos

3.7 Avaliao do efeito da adio da vinhaa na biorremediao de solos e guas subterrneas

gua subterrnea ASP

Figura 3.7 Experimento com gua subterrnea (condio no aerada)

Figura 3.8 Experimento com gua subterrnea (condio aerada)

3.8 Comparao da biodegradabilidade de leo diesel comercial e intemperizado

3.9 Produo de biossurfactante utilizando-se leo diesel intemperizado

Figura 3.10 Tensimetro Krss K6

Robert et al. (1989)

sim no sim no sim no

Robert et al. (1989)

D-C BH P. aeruginosa LBI Robert et al. (1989) BH D-ASP D-ASP D-C

sim no sim no sim

4.1 Avaliao da biorremediao natural da gua subterrnea no posto de combustveis SB

Eh (mV) 14 72 - 46 48 203 117 215 198 53 89 75 187

interveno2 140 1,75 0,7 3 0,18 0,17 140 -

SB1 SB2 SB3

Cloreto + Nitrato NIONS

concentrao de hidrocarbonetos verificada na gua subterrnea durante o perodo de monitoramento.

4.2 Caracterizao das amostras de solos

RC 6,7 0,29 0,02 2,0 100 : 6,89 : 0,10

1,7 100 8 11 -a 121,8

66,7 18,3 15,0

81,4 7,3 11,3 metais pesados (ppm)

Mn 9,4 49,1 3,0

Cu 1,6 1,1 0,6

Zn 1,7 2,2 7,3

B Co Mo 0,24 -a 0,03 0,21 2,29 -a 0,15 0,56 -a