Tecnologa Mdica Morfofisiopatologa y Citodiagnstico

Miguel Ramrez Lpez. Sergio Medina Mendoza. Pedro Ossandn Pradenas.

Seminario de Biotecnologa 21 de Junio del 2011

Proteoma: formado por todas las protenas que se expresan a partir del genoma de un organismo.

CONOCER ESTRUC. PRIMARIA

CUANTIFICACION

PROTEOMICA

MOD. POSTTRADUCC.

LOCALIZACION

Protemica de expresin: Estudio cuantitativo de la expresin de protenas. Protemica del mapa celular o estructural: Estudio de la localizacin subcelular de la protenas y de la interaccin protena-protena mediante la purificacin de orgnulos y finalmente la identificacin de sus componente por espectrometra de masas.

Protemica funcional: Estudio y caracterizacin de un grupo de protenas que proporciona informacin sobre la sealizacin, mecanismos de la enfermedad y interacciones protena-frmaco.

Biologa molecular

Bioqumica

PROTEOMICA

Microbiologa

Bioinformtica

Bsqueda de Biomarcadores: molculas que sirven como indicadores del estado fisiolgico, y de los cambios que se producen en el proceso y desarrollo de un padecimiento Enfermedades Crnicas: Ej.: Caso de Obesidad. Enfermedades Infecciosas: Estudio de husped y del agente patgeno.

Empleada para el anlisis global del proteoma, mediante dos etapas o dimensiones.

MUESTRA PREPARA A

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

1 SEPARACIN

ensitmetro

ANLISIS

Protean IEF cell (BioRad)

Escner de Fluorescencia

2 SEPARACIN

A QUISICIN Y IGITALIZACION
Software informtic P Quest

VISUALIZACIN

Protean Plus (BioRad)

odeca Cell

ELECTROFORESIS

Tcnica analtica de gran sensibilidad empleada para identificar y caracterizar protenas. un espectrmetro de masas esta formado bsicamente por:  fuente de iones.  analizador de masas.  detector.
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La huella peptdica de una determinada protena es un conjunto de pptidos generados mediante la digestin de una proteasa especifica.
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Identifica protenas de forma rpida igestin con tripsina Las masas proteicas experimentales son comparadas con masas proteicas tericas presentes en la base de datos. eben coincidir para identificar las proteinas

Cromatografa Multidimensional: Se requiere una digestin previa antes de la separacin de las protenas por carga e hidrofobicidad. 1: Cromatografa Bidimensional 2: Anlisis peptdico con MS Arrays de protenas: caracterizar actividades, y deteccin protena-protena.

ICAT (Isotope Coded Affinity Tag): 2 muestras son marcadas con un istopo, que se une a las cistenas, luego se separan en una columna de afinidad y analizados con MS. DIGE ( ifferential Gel Electroforesis): Se basa en una separacin de protenas en un 2 -PAGE y luego marcacin con flurocromos.

La protemica proporciona un conjunto de herramientas muy poderosas para el estudio a gran escala de la funcin de los genes a nivel de la protena. Estas herramientas son muy importantes en la salud pblica, porque nos otorga mecanismos para estudios poblacionales de protenas que pueden estar alteradas en respuesta a una patologa.

Protemica salival para el descubrimiento de biomarcadores del cncer oral

biomolculas que se determinan en un tejido o fluido corporal para definir una enfermedad a nivel molecular y para predecir la respuesta a una terapia.

HIPTESIS: ` Los biomarcadores presentes en la saliva son tiles para detectar precozmente el carcinoma oral de clulas escamosas (OSCC). OBJETIVOS: ` Identificar biomarcadores que en su conjunto puedan mejorar la sensibilidad y especificidad en la deteccin del carcinoma oral de clulas escamosas (OSCC).
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Validar con tcnicas de Inmunobloting y Elisa protenas sobreexpresadas en pacientes con OSCC para utilizarlas como biomarcadores del OSCC. Determinar y analizar protenas que se expresan slo en pacientes con OSCC, protenas que se expresan en pacientes sanos y aquellas que se expresan en ambos grupos.

MATERIALES Y MTO OS
N Paciente s OSCC Paciente s sanos Total paciente s 64 64 128 Hombre Mujeres s 44 44 22 22 Edad media 54 aos 46.9 aos
PROTOCOLO DE RECOLECCIN DE LAS MUESTRA Muestra de saliva antes de enjuagar con agua. Centrifugacion a 2600 x g durante 15 min. A 4 C para eliminar desechos y celulas Se agrega el inhibidor de proteasa, para asegurar la preservacion de la integridad de las proteinas. Muestras son alicuotadas en pequeas cantidades y almacenan a -80 C.

Shotgun proteome analysis: Basado en cromatografa inversa de fase lquida.

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Posterior LC espectrometra de masas Concentracion de proteinas se midio utilizando un Kit 2 Quant. 2% de falsos positivos.

ELECTROFORESIS EN DOS DIMENSIONES EN GEL  utilizado para mapear las proteinas en las muestras de saliva.  Las proteinas de ambas muestras se precipitaron en etanol fro toda la noche.  Centrifugacion 14.0000 x g por 20 min.  Los 100 mg de proteinas totales obtenidas de las muestras son analizados en E 2 .

Inmunoensayos Para inmunotransferencia : Los anticuerpos testeados fueron MRP14, PROFILINA, C 59, CATALASA, PROTEINA Rab-7, MOESINA Las bandas fueron detectadas por quimioluminiscencia y cuantificado con Scion imgenes de software.

CANTI A 52

E PROTENAS ETECTA AS P. Sanos y con OSCC 409 Pacientes sanos 29

Pacientes con OSCC

BIOMARCA ORES PROPUESTOS MRP14 M2BP

CD59

Profilina

Catalasa

CONCLUSIN:
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el estudio proteomico de muestras salivales comprende una nueva herramienta clnica y diagnstica no invasiva en la deteccin del carcinoma oral de clulas escamosas (OSCC). La validacin de 5 biomarcadores proteicos expresados en pacientes con OSCC demuestran la sensibilidad y especificidad de las tcnicas proteomicas y su importancia en la medicina.

Tecnologa Mdica Morfofisiopatologa y Citodiagnstico

Miguel Ramrez Lpez. Sergio Medina Mendoza. Pedro Ossandn Pradenas.

Seminario de Biotecnologa 21 de Junio del 2011