BAB III METODE PENELITIAN

A. 1. Bahan Penelitian

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah isolat fungi Aspergillus niger 65I6, didapatkan dari FTP UGM. Isolat tersebut diperoleh dari jagung dan kacang tanah. Fungi Aspergillus niger 65I6

merupakan fungi yang memiliki aktivitas hidrolitik dan esterifikasi tertinggi dibandingkan Aspergillus niger 62A9, Aspergillus wentii 65H8, Aspergillus wentii 61I8, Aspergillus tamari 62F5, Aspergillus tamari 65A4, Eurotium 66B6, Eurotium 63A1, Fusarium oxysporum, Fusarium proliferatum, Fusarium incarnatum, dan Penicillum sp (Darmasiwi. S, 2010). Isolat tersebut diinkubasi pada PDA miring pada 30C selama 7 hari dan disimpan pada 4C. Isolat diremajakan setiap 2 - 4 minggu sekali. Medium yang digunakan untuk memproduksi lipase adalah biji jarak yang didapatkan dari petani di Wonosari. Produksi lipase melalui proses solid-state fermentation dengan komposisi medium setiap 5 gramnya sebagai berikut: tepung biji jarak 5g, kadar air 50% (4,713 ml), sumber karbonnya adalah olive oil (Sigma Aldrich) 2% (0,1 ml), sumber nitrogennya adalah NaNO3 1% (0,05 ml), (Darmasiwi. S, 2010). Bahan kimia yang digunakan untuk proses purifikasi yaitu buffer Phospat, NaCl, NaOH, resin anion exchange (Amberlite ??????)

Bahan kimia yang digunakan untuk pengukuran kadar protein terlarut menggunakan metode Lowry yaitu NaCO3, NaOH, Cu.SO4.5H2O, KTartat, Follin-Fenol Ciocalteou (Cooper, 1977). Bahan kimia yang digunakan untuk mengukur aktivitas esterifikasi enzim yaitu As. Oleat, methanol, Isooctan (J.T. Baker). Sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk SDS-PAGE yaitu Acrylamide-bisacrylamide, Buffer stock (0.5M Tris-HCl, pH 6.8), Buffer stock (3.0M Tris-HCl, pH 8.8), SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) 10%, Amonium persulphate 1.5%, Aquadest, Temed, Commassie Brilliant Blue R.

2.

Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini untuk pengukuran dan pengamatan yang terdiri dari alat non gelas: pH meter, sentrifuge,

spektrofotometer (Genesys), autoclafe, waterbath shaker (Sibata), sentrifuge suhu dingin, jarum ose, magnetic stirrer, vortex, mikro pipet, oven, blender, kertas saring, kain flanel putih, neraca analitik (Sartorius), ependorf, dan gelas meliputi: kolom Ion Exchange Chromatrography, erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, gelas beaker, pipet ukur, pipet tetes, corong, spatula.

B. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Teknologi Pertanian UGM, Laboratorium Rekayasa Proses Pengolahan Hasil Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian UGM, Laboratorium Pengelolaan Limbah Fakultas Teknologi Pertanian UGM, Laboratorium Kimia dan Biokimia

Pangan Fakultas Teknologi Pertanian UGM, Laboratorium Pangan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian UGM, sejak September 2009 sampai Agustus 2011.

C. Tahap Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam 5 tahap. Diawali dengan peremajaan isolat fungi Aspergillus niger 6516 yaitu ditumbuhkan pada medium PDA-tributirin yang terdiri atas (w/v): 20 g glukosa, 10 g agar teknis, 200 g kentang, 0,1 g kloramfenikol dan tributirin 3 % (v/v). Medium disterilisasi dengan autoklaf pada 121C kemudian dibuat agar miring dan diinokulasi dengan kultur fungi. Kultur fungi diinkubasi selama 7 hari pada 30C (suhu ruang). Apabila tidak langsung digunakan dapat disimpan dalam cool room bersuhu 16C. Tahap pertama dari penelitian ini adalah produksi crude lipase ekstraseluller isolat Aspergillus niger 6516 menggunakan metode Solid State Fermentation. Tahap kedua adalah purifikasi menggunakan metode Ion Exchange Chromatography (Anion Ion Exchange) dengan terlebih dulu melakukan optimasi pH buffer untuk purifikasi crude lipase agar diperoleh lipase parsial yang memiliki aktivitas tertinggi. Tahap ketiga adalah karakterisasi crude lipase dan lipase parsial, yang meliputi optimasi (pH, waktu inkubasi dan suhu inkubasi) dan stabilitas (suhu inkubasi), agar diketahui perbandingannya antara crude dan parsial. Tahap keempat adalah kinetika reaksi yang meliputi Km dan Vmax dari lipase parsial haril purifikasi. Tahap yang kelima adalah SDS-PAGE untuk mengetahui BM dari lipase yang telah di purifikasi.

D. Cara Kerja 1. Produksi Crude Lipase Ekstraseluller Menggunakan Solid State Fermentation a. Penyiapan Medium Untuk SSF Metode ini berdasarkan Darmasiwi (2010) yang telah di modifikasi, medium fermentasi yang digunakan untuk pertumbuhan fungi Aspergillus niger secara solid state fermentation adalah bungkil jarak (jatropha cake) yang telah di-defatting. Tahap awal yang dilakukan adalah menghilangkan cangkang dari biji jarak. Biji kemudian dijemur hingga kering dibawah sinar matahari selama 24 jam. Pengeringan dimaksudkan untuk memudahkan ekstraksi minyak dari biji jarak sehingga lebih mudah dipisahkan. Setelah biji kering kemudian biji dihancurkan menggunakan blender kemudian di press, pengepresan bungkil dilakukan dengan mesin press Paul Weber Maschinen GmBh (Germany) pada tekanan 140,6 kg/cm, sampai minyak benar-benar terpisah dari bungkil, kemudian bungkil di oveb selama 2 jam dan di haluskan sekali lagi dengan blender. Setelah itu dilakukan proses defatting untuk menghilangkan minyak yang masih tersisa, bungkil dimasukkan pada kolom kemudian dialiri dengan n-heksana (1:6) hingga dihasilkan residu minyak yang bening. Bungkil jarak di angin-anginkan agar kering kemudian dioven 70 C selama 1-2 jam, setelah kering dihaluskan dan diayak terlebih dahulu sebelum digunakan untuk medium fermentasi. Apabila bungkil jarak tersebut tidak langsung dipakai, maka

harus disimpan di tempat yang kering dan dalam wadah tertutup agak tidak berjamur. b. Fermentasi Solid State (Falony et al, 2006) Fermentasi Solid State berdasarkan Falony et al (2006) yang telah di modifikasi, 50 g bungkil jarak yang telah di-defatting dalam erlenmeyer 1000 mL ditambahkan dengan olive oil sehingga konsentrasi minyak 2% (v/w); NaN03 1% (v/w) 49,563 mL akuades hingga kadar air berkisar 50%. Medium diaduk kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121C. Medium diinokulasi dengan 10 mL suspensi spora fungi (107 spora/mL), lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Aktivitas lipase dianalisis dengan metode spektrofotometri. c. Ekstraksi Crude Lipase ( Gutara et al, 2009) Fermentasi Solid State berdasarkan Falony et al (2006) yang telah di modifikasi, dilakukan dengan menambahkan 0,1 M buffer fosfat pH 8,0 ke dalam sampel (3 mL/g medium) kemudian diinkubasi pada waterbath shaker 100 rpm selama 20 menit pada suhu ruang. Campuran kemudian disaring dengan menggunakan kain putih steril berukuran (20x20) cm dan dipress dengan menggunakan sendok steril.

Filtrat/supernatan kemudian disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit untuk memisahkan spora. Supernatan yang diperoleh merupakan crude enzyme kemudian di analisis esterifikasi, apabila tidak langsung di analisis dapat disimpan pada suhu -16C.

2.

Purifikasi Ion Exchange Chromatrography Purifikasi dilakukan menggunakan metode Ion Exchange Chromatography, berdasarkan Scopes (1997) yang dimodifikasi. Tahap yang pertama adalah menimbang 2 gr resin (Anion Exchange Amberlite), kemudian mencuci resin dengan 0,1M buffer phospat pH 8, dilakukan sebanyak 3x. Memasukkan 0,1M buffer phospat pH 8 kedalam kolom sampai volume setengah kolom, kemudian resin yang sudah dicuci dimasukkan perlahan ke dalam kolom, kemudian alirkan 0,1M buffer phospat pH 8, ulangi sampai 3x, diamkan selama 1 jam agar resin tertata dengan rapi dan tidak ada udara di dalam kolom. Setelah 1 jam masukkan 1 ml sample (crude enzim) ke dalam kolom, kemudian eluent ditampung dalam ependorf. Kemudian dilanjutkan dengan tahap elusi, alirkan 0,5 M; 1 M; 1,5 M NaCl dalam 0,1 buffer phospat pH 8 sebanyak 5 ml ke dalam kolom, tampung hasil elusi dalam tabung ependorf. Eluent yang telah tertampung kemudian di uji protein terlarutnya dan di esterifikasikan kemudian dianalisis asam lemak bebas dan metil esternya. Scopes, R.K. 1997. Protein purification. 3rd edition. SpringerVerlag: New York.

3.

Karakterisasi a. pH Untuk mengetahui pH optimum dari crude enzim dan enzim yang telah dimurnikan, dilakukan pengukuran pH terhadap aktivitas optimum lipase dengan mengekstraksi padatan hasil fermentasi pada berbagai pH buffer (5 mL buffer/g medium) yaitu 0,1 M buffer asetat

(pH 4,0; 5,0; 6,0) dan buffer fosfat (pH 7,0; 8,0; 9,0) kemudian larutan diuji aktivitas esterifikasinya. b. Suhu Inkubasi Untuk mengetahui suhu inkubasi optimum dari crude enzim dan enzim yang telah dimurnikan, dilakukan pengukuran suhu inkubasi terhadap aktivitas optimum lipase dengan menginkubasi larutan enzim pada pH aktivitas optimum, pada suhu reaksi 20; 30; 40; 50; 60C selama 30 menit kemudian larutan diuji aktivitas esterifikasinya. c. Waktu Inkubasi Untuk mengetahui waktu inkubasi optimum dari crude enzim dan enzim yang telah dimurnikan, dilakukan pengukuran waktu inkubasi terhadap aktivitas optimum lipase dengan menginkubasi larutan enzim pada pH aktivitas optimum, pada suhu aktivitas optimum, selama 20; 30; 40; 50; 60 menit kemudian larutan diuji aktivitas esterifikasinya. d. Berat Molekul Kemurnian dan berat molekul lipase parsial dapat dilihat dengan menggunakan SDS-PAGE. Dengan tahapannya sebagai berikut yaitu semua komponen alat elektroforesis disiapkan, larutan resolving gel dimasukkan ke dalam plate gelas dengan mikropipet, kemudian aquadest dimasukkan, berfungsi untuk meratakan permukaan gel, setelah itu di tunggu agar gel mengeras selama 30-60 m3nit. Kemudian sisa aquades yang ada dibuang dan diserap menggunakan kertas saring. Selanjutnya stacking gel ditambahkan di atas resolving gel sampai memenuhi plate gelas, kemudian sisir dipasang dan didiamkan sampai terjadi polimerisasi

dengan sempurna selama 24 jam. Pada saat pemasangan sisir disisakan jarak kurang lebih 2 mm dengan permukaan resolving gel. Setelah 24 jam sisir dicabut, gelembung udara yang ada pada sumuran yang terbentuk diserap dengan potongan kertas saring. Slab gel kemudian dimasukkan ke dalam buffer elektroda sampai terendam dan siap diisi dengan sampel (Harris and Angal, 1994; Bollag et al., 1996; Scopes,1994). Bollag, et al., 1996. Protein Methods. A John Willey and sons, inc. GE Healthcare life sciences. 8/262009. Instruction for sephadex media. http://www5.gelifescience.com/aptrix/upp00919.nsf/content/EE755AF81 C96972FC1256 . Harris, E.L.V. and Angal S., 1994. Protein Purification Methods a pratical approach. Oxford University Press. Preparasi sampel, sampel hasil kolom 0,5 dipekatkan menggunakan TCA 0,5 ml, kemudian di sentrifuge suhu dingin 4C, 3000 rpm, selama 10 menit, dilarutkan, kemudian larutkan dengan 0,1 ml sampel bufer. Selanjutnya sampel direbus dalam air mendidih selama 2 menit untuk menyempurnakan proses denaturasi dan segera dimasukkan es. Sampel siap diaplikasikan ke dalam gel. Marker protein 10-200 kDa (Fermentas) sebanyak 10 l dimasukkan dalam sumuran, selanjutnya dimasukkan 20-30 l sampel ke dalam sumuran berikutnya. Sampel siap di running pada gel dengan voltase konstan 100 volt (Harris and Angal, 1994; Bollag et al,. 1996; Scopes,1994).

Setelah

proses

running

selesai,

protein

divisualisasi

menggunakan larutan stainning yang mengandung 0,24 gr Comassie Brilliantblue R250 dalam 1 L larutan campuran aquadest : methanol : asam asetat (5:5:2) selama 24 jam pada suhu ruang dan digoyang. Selanjutnya gel didestainning dan disimpan dalam larutan destaining solution (aquadest : methanol : asam asetat, 5:5:2), sampai latar belakang gel jernih, kemudian gel di press dengan plastik (Harris and Angal, 1994; Bollag et al,. 1996; Scopes,1994).

4.

Stabilitas Metode stabilitas dilakukan berdasarkan Zheng-Yu et al (2007), enzim hasil purifikasi tanpa substrat dimasukkan dalam erlenmeyer 50 ml pada suhu, kemudian di pre inkubasi pada suhu, 20; 30; 40; 50; 60C dan di goyang pelan dalam waterbath shaker selama 30 menit. Kemudian enzim yang sudah di pre inkubasi di analisis kadar protein terlarut dan aktivitas esterifikasinya.

5.

Kinetika Reaksi (Km dan Vmax) Perhitungan untuk penentuan nilai konstanta MichaelisMenten (Km) dan kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) didasarkan pada aktivitas lipase parsial pada kondisi pH optimum, suhu optimum dan waktu inkubasi optimum yang telah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan konsentrasi substrat yang berbeda dengan waktu inkubasi yang berbeda pula. Hasil pengujian aktivitas lipase bila dialurkan terhadap konsentasi substrat

([S]) akan diperoleh kurva hiperbola. Bentuk kurva ini kurang dapat memberi gambaran kecepatan reaksi maksimumnya (Vmaks). Untuk mengatasi masalah ini maka dilakukan pembalikan kecepatan reaksi (1/V) dan konsentrasi substrat ([S]) menurut metode Line weaver-Burk plot akan diperoleh persamaan garis lurus. Dari persamaan regresi yang dihasilkan plot maka dapat dihitung nilai Km dan Vmaks. Nilai ini akan memberikan hubungan kuantitatif antara kecepatan reaksi dengan konsentrasi substrat. Pengukuran untuk penentuan nilai konstanta MichaelisMenten (Km) dan kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) didasarkan pada aktivitas dengan cara menguji aktivitas enzim pada konsentrasi substrat yang berbeda (0,1M; 0,2M; 0,3M; 0,4M; 0,5M dan 0,6M), diinkubasi pada suhu dari hasil optimasi mulai dari 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 20; 30; 40; 50; 60 menit.

6.

Metode Analisis a. Reaksi Esterifikasi (Bezbradica et al., 2006) Reaksi esterifikasi dilakukan menggunakan metode

Bezbradica et al. (2006) yang dimodifikasi. Reaksi dilakukan dalam tabung reaksi berisi 4 ml larutan 0,5 M asam oleat dan 0,5 M metanol dalam isooktan. Reaksi dimulai dengan menambahkan 200 l ekstrak lipase ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi dalam waterbath shaker (120 stroke per menit) pada suhu dan selama periode tertentu sesuai dengan rancangan percobaan. Reaksi dihentikan dengan cara tabung reaksi yang berisi larutan dimasukkan dalam icebath selama 5 menit.

Selanjutnya diambil 200 l larutan dan ditambah dengan isooktan (600l) kemudian diemulsikan menggunakan vortex hingga homogen. Kemudian di analisis kadar asam lemak bebasnya dalam larutan. Metil ester yang terbentuk dihitung berdasarkan penurunan kadar asam lemak bebas dalam larutan. Bezbradica, R., I. Karalazic, N. Ognjanovic and D. Mijin, 2006. Studies on specificity of Candida rugosa lipase catalyzed esterification reactions in organic media, Journal of the Serbian Chemical Society 71 (1): 31 41. b. Analisis Asam Lemak Bebas dan Metil Ester Analisis asam lemak bebas dilakukan menggunakan metode Marseno et al., (1998) yang dimodifikasi. Larutan hasil proses esterifikasi (200 l) ditambah dengan isooktan sebanyak 1.800 l serta cupri-asetat pyridin 400 l. Setelah itu larutan dicampur dengan menggunakan vortex selama 5 detik, dan didiamkan selama 20 menit, kemudian absorbansinya ditera pada panjang gelombang 715 nm. Absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar asam lemak bebas melalui kurva standar. Metil ester ditentukan berdasarkan pengurangan jumlah asam lemak bebas awal dengan jumlah asam lemak bebas setelah reaksi. Marseno, D.W., R. Indarti and Y. Ohta. 1998. A Simplified Method for Determinat ion of Free Fat ty Acids for Soluble and Immobilized Lipase Assay. Indonesian Food and Nutrion Progress 5: 79-83.

c.

Kadar Protein Terlarut Lowry ( Cooper, 1977) Kadar protein terlarut dalam enzim kasar ditentukan dengan metode Lowry. Penentuan kadar protein terlarut dalam sampel (enzim kasar) dilakukan dengan terlebih dahulu membuat beberapa macam reagen, yaitu : 1. Reagen A dibuat dengan cara melarutkan 25 gram NaCO3 dalam 0,5 N NaOH hingga volume 250 mL. 2. Reagen B dibuat dengan cara melarutkan 0,25 gram CuSO4.5H2O dalam aquadest hingga volume 25 mL. 3. Reagen C merupakan larutan 0,5 gram K-Tartrat dalam 25 mL aquadest. 4. Reagen D merupakan campuran 30 mL reagen A, 1,5 mL reagen B dan 1,5 ml reagen C. 5. Reagen E dibuat dengan cara melarutkan 5 mL reagen Follin-Fenol Ciocalteu 2N dalam aquadest hingga volume 50 mL. Kadar protein terlarut dalam enzim kasar ditentukan dengan cara menambahkan 1 mL larutan enzim dengan 1 mL reagen D, kemudian dikocok dengan vortex selama 15 detik dan didiamkan selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 3 mL reagen E, dikocok 30 detik dan didiamkan selama 45 menit. Absorbansi dibaca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Kadar protein terlarut kemudian ditentukan melalui kurva standar yang menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin) sebagai protein standarnya. Komposisi larutan standar

BSA dapat dilihat pada lampiran 9. Cooper, 1977. The Tools of Biochemistry. Wiley, New York.