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ROTEIROS DAS AULAS PRTICAS


REAES DE CARACTERIZAO DOS GLICDIOS Os glicdios podem ser definidos como poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas, seus polmeros, seus produtos de reduo, oxidao ou seus produtos de substituio. Eles so as molculas biolgicas mais abundantes na natureza. Para um completo entendimento de muitas reaes que se processam com os glicdios nos seres vivos, indispensvel o conhecimento de suas estruturas, suas reaes e de que maneira eles so identificados no laboratrio. Apresentaremos a seguir uma srie de reaes clssicas, geralmente reaes coloridas que apesar do advento da tcnica de cromatografia ainda so utilizadas para identificao dos diversos tipos de glicdios. I - IDENTIFICAO DE GLICDIOS 1-Reao com reagente de Molish (soluo alcolica de - naftol a 5% ) Sob a ao desidratante do cido sulfrico concentrado, os glicdios do origem ao furfural ou aos seus derivados. Estas substncias condensam-se com o - naftol produzindo um composto de cor violeta, de composio incerta. Se um oligossacardeo ou polissacardeo estiver presente, eles so primeiro hidrolisados aos seus monossacardeos constituintes os quais ento so desidratados. As pentoses do o furfural e as hexoses o hidroximetilfurfural. O teste de Molisch considerado uma reao geral para glicdios, quer livres, quer combinados, embora no sendo especfica pois se processa com outras substncias. Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml de gua destilada Tubo B 1 ml de soluo de glicose 1% Tubo C 1 ml de soluo de sacarose 1% Tubo D 1 ml de soluo de amido 1% Colocar em cada tubo duas gotas do reagente de Molish. Agitar bem Adicionar cuidadosamente sem agitao, em cada tubo, 1 ml de cido sulfrico concentrado, inclinando o tubo e deixando o cido escorrer lentamente pelas paredes do mesmo. Deixar o tubo em repouso na estante por 5 min. e observar a formao de um anel de cor violeta na interfase dos lquidos. Interprete os resultados. 2. Reao com iodo O iodo presente no reagente de lugol forma, com o amido, um complexo de cor azul e com o glicognio , um complexo de cor vermelha. Celulose, mono e dissacardeos no produzem colorao com o iodo. Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml de gua destilada Tubo B 1 ml de soluo de glicose 1% Tubo C 1 ml de soluo de sacarose 1%

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Tubo D 1 ml de soluo de amido 1% Acrescentar, a cada tubo, duas gotas de reagente de lugol, misturar e observar. Aquecer ligeiramente no banho-maria o tubo D at mudana da colorao. Resfriar em gua corrente e observar novamente. Explicar o ocorrido. II - IDENTIFICAO DE GLICDIOS REDUTORES Os glicdios que possuem grupamento glicosdico livre (hidroxila anomrica livre), so capazes de reduzir ons de Cu++, Ag+ e Bi++. A reduo do Cu++ conseguida em meio alcalino, a quente: Cu++ Cu2O + H2O Vermelho ou amarelo ++ Mas o Cu tambm reage com o meio alcalino: quente alcalino Cu (OH)2 alcalino
++

Cu+

Cu++

CuO preto

Para evitar que esta reao mascare o teste de presena de glicdio redutor, o on Cu mantido em soluo alcalina sob a forma de complexo. H vrios reagentes base de Cu++, (como Fehling , Benedict) que diferem em relao ao solubilizador, ao alcalinizante ou ao reagente para o Cu++ formado. Reativo de Benedict. (Contm citrato de sdio, carbonato de sdio anidro e sulfato de cobre). Reao de Benedict Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml de gua destilada Tubo B 1 ml de soluo de glicose 1% Tubo C 1 ml de soluo de frutose 1% Tubo D 1 ml de soluo de amido 1% Acrescente a cada um deles 1 ml do reagente de Benedict. Aquecer 3 minutos, em banho-maria fervente. Observar. Explicar. DIFERENCIAO ENTRE ALDOSES E CETOSES Reao de Seliwanoff - O reagente de Seliwanoff contm resorcinol diludo em cido clordrico. Este teste permite diferenciar aldoses e cetoses, que sob a ao desidratante do cido clordrico so transformadas em derivados de furfural, que se condensam com o resorcinol formando um composto vermelho de composio incerta. A reao com cetose rpida e mais intensa pela facilidade de formao do derivado furfural. A sacarose d reao positiva: Explicar este fato. Preparar os seguintes tubos de ensaio: Tubo A 3 ml de Seliwanoff + 5 gotas de gua destilada Tubo B 3 ml de Seliwanoff + 5 gotas de soluo de frutose 1%

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Tubo C 3 ml de Seliwanoff + 5 gotas de soluo de glicose 1% Tubo D 3 ml de Seliwanoff + 5 gotas de soluo de sacarose 1% Colocar em banho-maria 100C. Observar de trs em trs minutos, durante aproximadamente 10 minutos. Explicar. IV - HIDRLISE DE DI E POLISSACARDEOS A sacarose um dissacardeo encontrado nas plantas (acar comum) e formada por uma unidade de D - glicose e uma de D - frutose com uma ligao do tipo - 1,2. O amido o material de reserva celular dos vegetais. Contm dois tipos de polmeros da glicose, a amilose e a amilopectina. O primeiro consiste de cadeias longas, no ramificadas de unidades de D-glicose conectadas por ligaes -1,4. A amilopectina altamente ramificada. As ligaes glicosdicas unindo os resduos de glicose nas cadeias da amilopectina so -1,4, mas os pontos de ramificao, so ligaes -1,6. Hidrlise da sacarose Preparar os seguintes tubos de ensaio: Tubo A 2 ml de soluo de sacarose 1% + 3 gotas de cido sulfrico concentrado Tubo B 2 ml de soluo de sacarose 1% + 3 gotas de gua destilada Colocar em banho-maria 100C durante trs minutos. Adicionar a cada tubo 3 ml do reativo de Benedict. Agitar. Recolocar no banho-maria durante trs minutos. Retirar. Explicar. Hidrlise do amido O amido quando tratado por um cido a quente, sofre uma sucesso de hidrlises dando dextrinas (amilo, eritro e acrodextrinas), maltose e glicose como produto final. As dextrinas so classificadas pela reao colorida que do com o iodo. Maltose e glicose possuem propriedades redutoras que podem ser reconhecidas pela reao de Benedict. amido + lugol cor azul amilodextrina + lugol cor roxa eritrodextrina + lugol cor vermelha acrodextrina + lugol incolor Colocar em um erlenmeyer 30 ml de soluo de amido a 1% e 6 ml de cido clordrico 2N. Preparar 7 tubos de ensaio, contendo cada um deles, 3 ml da mistura acima. Ao tubo A, juntar uma gota do reativo de lugol e observar a cor que se desenvolve. Explicar. Colocar os tubos restantes em banho - maria 100C. Retirar cada tubo no tempo de reao indicado na tabela abaixo. Resfriar os tubos em gua corrente e adicionar uma gota do reativo de lugol, com exceo do tubo G. Ao tubo G adicionar 3 ml de reativo de Benedict e retornar ao banho - maria 100C durante 3 minutos. Preencher a tabela abaixo. Interpretar os resultados obtidos

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TUBO A B C D E F G

TEMPO DE REAO (MIN) 0 5 10 15 20 25 30

COR COM O REATIVO DE LUGOL

PRODUTO IDENTIFICADO

COR COM O REATIVO DE BENEDICT

REAES DE CARACTERIZAO DOS LIPDIOS Os lipdios biolgicos constituem um grupo de compostos que, apesar de quimicamente diferentes entre si, exibem a sua insolubilidade em gua como caracterstica definidora e comum a todos. Os leos e gorduras, utilizados como formas de armazenamento de energia nos organismos vivos, so compostos do ponto de vista qumico, altamente reduzidos e derivados dos cidos graxos. Os lipdios mais simples constitudos de cidos graxos so os triacilgliceris. A maioria das gorduras naturais, como aquelas dos leos vegetais, dos laticnios e a gordura animal, so misturas complexas de triacilgliceris simples e mistos. Elas contm uma grande variedade de cidos graxos que diferem no comprimento da cadeia carbnica e no grau de saturao da mesma. Os leos vegetais, como o leo de oliva, de canola ou de milho so compostos principalmente de triacilgliceris constitudos por cidos graxos insaturados, por isso, so lquidos temperatura ambiente. Eles so convertidos industrialmente em gorduras slidas por hidrogenao cataltica, a qual reduz, para ligaes simples, algumas de suas ligaes duplas. Os triacilgliceris contendo apenas cidos graxos saturados, como a triestearina, o maior componente da gordura bovina, so slidos brancos e gordurosos temperatura ambiente. O objetivo desta aula prtica analisar as propriedades fsicas e qumicas dos cidos graxos e triacilgliceris. A - Hidrlise alcalina dos triacilgliceris Colocar em um tubo de ensaio de grosso calibre (Tubo A), 10g de manteiga, 10ml de soluo alcolica de hidrxido de potssio 5% e adaptar ao tubo de ensaio a peteca, que servir de condensador. Aquecer em banho-maria 100C durante 30 minutos. (Cuidado com a chama do Bico de Bunsen) Verificar se a hidrlise foi completa, observando a solubilidade de uma alquota da mistura em gua. Esquematizar e nomear a reao qumica ocorrida. No descartar a soluo, ela servir para o experimento seguinte.

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B- Separao dos cidos graxos Adicionar ao tubo da reao A, 1 ml de cido clordrico concentrado, gota a gota, sob agitao. Colocar novamente em banho-maria e deixar at separao de uma camada oleosa na superfcie do lquido. Esfriar os tubos em gua corrente e a seguir em banho de gelo. Observar. Isolar os produtos obtidos, descartando na pia o lquido do tubo. Reservar os produtos obtidos para as experincias seguintes. CSolubilidade nos solventes

Retirar com basto uma alquota dos cidos graxos obtidos na experincia B e distribuir em trs tubos de ensaio: Observao: trabalhe longe da chama do Bico de Bunsen Tubo A cidos graxos + 1ml de ter Tubo B cidos graxos + 1ml de gua destilada Tubo C cidos graxos + 1ml de lcool etlico Agitar. Observar e explicar. D - Formao de sabes por redissoluo dos cidos graxos Adicionar ao tubo da experincia B, 10 ml de gua destilada e 6 ml de soluo de KOH 0,5 N. Colocar no banho-maria 100C durante 5 minutos. Agitar e observar. Guardar os sabes para a experincia seguinte. E - Separao do sabo por salificao Colocar numa proveta 3 ml da soluo de sabes da experincia D. Acrescentar gua destilada at 20 ml e adicionar cloreto de sdio em espcie agitando com o basto at saturao. Observar e explicar. F - Formao de sabes insolveis Preparar dois tubos de ensaio, contendo: Tubo A 2 ml da soluo de sabo obtido na experincia D + 3 gotas da soluo de cloreto de clcio 5% Tubo B 2 ml da soluo de sabo obtido na experincia D + 3 gotas de soluo de acetato de chumbo 5%. Observar e equacionar as reaes.

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DETERMINAO QUALITATIVA DOS AMINOCIDOS Os aminocidos so as unidades estruturais bsicas das protenas. Um aminocido constitudo de um grupamento amina, uma carboxila, um tomo de hidrognio e um grupamento R diferenciado, todos eles ligados a um tomo de carbono . Sendo portanto, compostos orgnicos de funo mista. O grupamento R referido como uma cadeia lateral. Vinte tipos de cadeias laterais, variando em tamanho, forma, carga, capacidade de formao de pontes de hidrognio e reatividade qumica, so comumente encontrados em protenas.Todas as protenas em todas as espcies, de bactrias a seres humanos, so construdas a partir do mesmo conjunto de 20 aminocidos. A notvel gama de funes exercidas por elas resulta da diversidade e da versatilidade desses 20 tipos de precursores. O objetivo desta aula prtica a determinao qualitativa de aminocidos bem como a pesquisa da ligao peptdica. PESQUISA DA LIGAO PEPTDICA Reao do Biureto A reao do Biureto ocorre com substncias que contm no mnimo duas ligaes peptdicas ( tripeptdeo). Portanto, essa reao positiva para todas as protenas, graas s suas ligaes peptdicas. Reagente do Biureto (Contm sulfato cprico, tartarato de sdio e potssio e hidrxido de sdio) Preparar os seguintes tubos de ensaio, contendo: Tubo A 1 ml de soluo de ovo albumina 2% + 1ml do reagente de Biureto Tubo B 1 ml de soluo de gelatina 1% + 1 ml do reagente de Biureto Tubo C 1 ml de gua destilada + 1 ml do reagente de Biureto Agitar e observar. Qual a aplicao importante dessa reao? REAES DE PRECIPITAO DE PROTENAS 1-Efeito de cidos fortes Colocar em um tubo de ensaio, 1 ml de cido ntrico concentrado e adicionar cuidadosamente, pelas paredes do tubo, 2 ml de soluo de ovo albumina 2%. Observar e explicar o aparecimento de um precipitado branco. 2- Precipitao com sais de metais pesados Preparar os seguintes tubos de ensaio, contendo: Tubo A 2 ml de soluo de ovo albumina 2% + 3 gotas de soluo de cloreto de mercrio 5% Tubo B 2 ml de soluo de ovo albumina 2% + 3 gotas de soluo de acetato de chumbo 10%

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Observar e explicar. REAES DE AMINOCIDOS Reao da ninidrina (hidrato de tricetoidrindeno) Esta reao ocorre devido presena do amino grupo livre e possibilita inclusive a determinao quantitativa do aminocido. Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml de gua destilada + 0,5 ml de soluo de ninidrina 0,1% Tubo B 1 ml de soluo de ovo albumina 2% + 0,5 ml de soluo de ninidrina 0,1% Aquecer em banho maria 100C durante 3 minutos. Observar e explicar os resultados. Reao Xantoproteca Esta reao ocorre na presena dos aminocidos tirosina e triptofano. Colocar num tubo de ensaio, 1 ml de soluo de ovo albumina 2% + 10 gotas de cido ntrico concentrado. Ferver. Acrescentar 4 ml de soluo de hidrxido de sdio 2N. Observar e equacionar a reao. Reao de Millon Esta reao ocorre devido ao grupo hidroxifenil da tirosina. Colocar num tubo de ensaio, 1 ml de ovo albumina 2% + 5 gotas do reativo de Millon (mercrio + cido ntrico concentrado). Aquecer. Observar e explicar a reao. Reao do grupo sulfidrila Esta reao determina a presena dos aminocidos cistina e cistena. Colocar num tubo de ensaio uma pequena quantidade de cabelo + 5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10% + 2 ml de soluo de hidrxido de sdio 50%. Aquecer 5 minutos, em banho - maria 100C. Observar e explicar o resultado obtido. PROPRIEDADES DA UREASE A urease uma enzima altamente especfica para a uria. Nesta prtica utilizaremos a urease para estudar as propriedades das enzimas como por exemplo: atividade, especificidade, inibio, desnaturao e natureza da estrutura enzimtica. Como j foi discutido, com exceo das enzimas de RNA ou ribozimas, todas as enzimas so protenas. Por isso, a primeira reao a ser realizada nesta prtica ser para verificar a estrutura protica da urease. A - Reao da urease com o Biureto

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Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml do reativo de Biureto + 3 gotas de soluo de urease Tubo B 1 ml do reativo de Biureto + 3 gotas de gua destilada Observar e explicar o resultado. B - Teste da atividade Preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 1 ml do substrato (soluo de uria 0,4 M pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol) + 3 gotas da soluo de urease Tubo B 1 ml do substrato + 3 gotas de gua destilada Misturar levemente. Aguardar 2 min. Observar e equacionar a reao. C - Teste da especificidade As enzimas so especficas pelos seus substratos. Especificidade a habilidade da enzima de discriminar entre dois substratos competidores. Para demonstrar a especificidade da urease ser utilizadas uma substncia com estrutura similar a uria: a tiouria. Colocar em um tubo de ensaio, 1 ml da soluo de tiouria 0,4 M pH 7,0 (contendo vermelho de fenol como indicador) + 3 gotas da soluo de urease. Misturar levemente. Aguardar 2 min. Observar e comparar com a reao B ( teste da atividade). Explicar. Desnaturao pelo calor A maneira de demonstrar a importncia da estrutura especfica das protenas para a funo biolgica que exercem, alterar esta estrutura e determinar o efeito que isto causa nesta funo. Uma alterao extrema a desnaturao. Desnaturao a perda total da estrutura tridimensional da protena. Colocar num tubo de ensaio 1 ml de gua destilada + 3 gotas da soluo de urease. Colocar em banho maria 100C, durante 5 minutos. Adicionar em outro tubo de ensaio 1 ml da soluo do substrato (soluo de uria 0,4 M pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol) e acrescentar 0,5 ml da soluo de urease fervida. Misturar levemente. Aguardar 2 min. Observar e comparar com a reao B. Explicar. Inibio por sais de mercrio Os grupos sulfidrilas (-SH) so essenciais para a atividade enzimtica da urease. Eles podem manter ou talvez constituir parte do centro ativo da enzima. Para verificar a inibio da atividade da urease pelo cloreto de mercrio, preparar a seguinte srie de tubos, contendo: Tubo A 3 gotas de soluo de urease + 1 ml de gua destilada

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Tubo B 3 gotas de soluo de urease + 1 ml de gua destilada + 5 gotas da soluo de cloreto de mercrio 5 % Misturar levemente e adicionar 1 ml do substrato (sol. de uria 0,4 M pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol) a cada um dos tubos. Observar e propor uma equao para a inibio. AS ENZIMAS E O LABORATRIO CLNICO Os princpios de enzimologia so aplicados no laboratrio clnico para medir as atividades de enzimas e as concentraes de substratos no plasma ou em tecidos de pacientes. O fundamental para a medida das atividades de enzimas plasmticas baseiase na hiptese de que alteraes nas atividades reflitam alteraes que tenham ocorrido num tecido ou num rgo especfico. Enzimas plasmticas so de dois tipos: (1) um tipo est presente em concentrao mais elevada , especfica do plasma e tem um papel funcional no plasma e (2) o segundo est normalmente presente em concentrao muito baixa e no tem nenhum papel funcional no plasma. O primeiro inclui as enzimas associadas coagulao sangnea (p. ex., trombina), dissoluo da fibrina (plasmina) e ao processamento de quilomcrons (lipoprotena lipase). Nas doenas de tecidos e rgos, enzimas no plasma - especficas so as mais importantes. Normalmente, os nveis plasmticos dessas enzimas so baixos ou ausentes. Uma doena pode causar alteraes na permeabilidade da membrana celular ou aumentar as mortes celulares, resultando na liberao de enzimas intracelulares no plasma. No diagnstico do envolvimento de um rgo especfico numa doena, seria ideal se as enzimas particulares para cada rgo pudessem ser identificadas. Isso improvvel porque os processos metablicos de vrios rgos so muitos semelhantes. A lcool desidrogenase do fgado e a fosfatase cida da prstata so teis para identificao especfica de doenas nesses rgos. Alm desses dois exemplos, h poucas enzimas que so tecido ou rgo especficos. Porm, a proporo entre as vrias enzimas varia, de tecido para tecido. Esse fato, combinado com o estudo da cintica de aparecimento e desaparecimento de enzimas particulares no plasma, permite que o diagnstico do desenvolvimento de um rgo especfico seja feito. As transaminases (aminotransferases) TGP e TGO so importantes no diagnstico de leses hepticas e cardacas. A ocluso de uma artria coronariana por depsitos lipdicos pode causar severa isquemia local e ter como conseqncia final a degenerao de uma poro no msculo cardaco; este processo chamado de infarto do miocrdio. Esta leso provoca o extravasamento na corrente sangnea das aminotransferases, CPK (creatina quinase) , e HBDH ( - hidroxibutrico desidrogenase), das clulas cardacas injuriadas. No infarto do miocrdio, CPK sobe abruptamente mas por pouco tempo; HBDH sob lentamente mas persiste. A transaminase oxalactica est quase sempre elevada aps o infarto do miocrdio, fato incomum para a pirvica. A transaminase oxalactica comea a elevar-se 6 a 12 horas aps o infarto para alcanar o pico mximo entre 24 e 48 horas, normalizando-se pelo 5 ou 6 dia. A lactato desidrogenase tambm escapa do msculo cardaco injuriado. Elevaes das aminotransferases ocorrem na hepatite (viral e txica), cirrose, metstase heptica, pancreatite. Nas hepatopatias agudas geralmente o valor da transaminase pirvica excede o da oxalactica.

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Nesta prtica faremos determinao da Desidrogenase ltica, Aminotransferases ou CPK usando Kits Labtest. CONSUMO DE GLICOSE PELAS HEMCIAS OBJETIVOS 1- Demonstrar o consumo celular de glicose. 2- Verificar o efeito de um inibidor da via glicoltica sobre o consumo de glicose. 3- Determinar os nveis de glicose utilizando uma tcnica espectrofotomtrica. INTRODUO Nos mamferos, a hemcia madura no contem ncleo, nem mitocndrias, nem ribossomos e por isso no capaz de desempenhar as mesmas atividades metablicas das clulas nucleadas. O ganho de energia na hemcia faz-se, fundamentalmente, pela gliclise. Essa energia utilizada, pela hemcia, na manuteno das condies osmticas, da forma discide e do ferro no estado ferroso. A glicose desaparece rapidamente no sangue deixado fora dos vasos sangneos e nessas condies, aumenta os nveis de cido lctico. Portanto, o sangue colhido para a dosagem de glicose deve ter o plasma separado imediatamente dos glbulos, ou ao sangue total deve-se acrescentar fluoreto que um inibidor da enolase, enzima que catalisa a seguinte reao na via glicoltica:

2-Fosfoglicerato REAGENTES

Fosfoenolpiruvato

a) Soluo fisiolgica - NaCI 0,9g / 100 ml b) Soluo de glicose l g de glicose por ml de soluo fisiolgica. Manter a soluo na geladeira. d) Soluo de fluoreto de sdio l g para 100 ml de gua destilada. e) Anticoagulante - Dissolver 20g de oxalato de potssio com gua destilada para um volume de 100 ml. Utilizar 20 l da soluo para cada 10 ml de sangue. lSOLAMENTO E PURIFICAO DAS HEMCIAS a) Coletar 10 ml de sangue e transferir para tubos de ensaio contendo oxalato de potssio (anticoagulante), centrifugar em centrfuga de bancada por 10 minutos a 2.500 r.p.m.. Desprezar o sobrenadante (plasma) e ressuspender o sedimento com 6 ml de

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soluo fisiolgica. Centrifugar por 10 minutos a 2.500 r.p.m. e desprezar o sobrenadante. Repetir esta operao por trs vezes. Finalmente ressuspender o sedimento em 8 ml de soluo fisiolgica. b) Adicionar suspenso de hemcias 6 ml da soluo de glicose 1 g/100 ml. OBS.: Este material (suspenso de hemcias lavadas) j est pronto. PROCESSO Preparar uma srie de 4 tubos de ensaio (S l, S2, F1 e F2) e colocar os tubos em um bquer com gelo. Aos tubos S 1 e S2 adicionar 3 ml da suspenso de hemcias j contendo glicose e 1 ml de soluo fisiolgica. Aos tubos F1 e F2 adicionar 3 ml da suspenso de hemcias j contendo glicose e 1 ml de soluo de fluoreto de sdio l g / 100 ml. Homogeneizar o contedo de cada tubo e incubar S l, S2, F1 e F2 em banhomaria a 37C por 30 minutos, resfriar os tubos e determinar os nveis de glicose em cada tubo. MTODO PARA DOSAGEM DE GLICOSE Fundamento - O grupamento amino da orto - toluidina reage com o grupamento aldedo da glicose, em meio actico a quente e d origem a um composto de cor verde, estvel. A intensidade de cor proporcional concentrao de glicose na amostra e sua estabilidade depende do equilbrio entre uma glicosilamina e a base de Schiff correspondente. Soluo padro de glicose 100 mg de glicose em 100 ml de soluo. Para a dosagem diluir a soluo padro 1:10 com gua destilada. Dosagem de glicose - Transferir 0,2 ml da suspenso contida nos tubos Sl, S2, Fl e F2, para quatro tubos de centrfuga e adicionar 1,8 ml da soluo de cido tricloroactico a 10%. Misturar, deixar em repouso por 5 minutos e centrifugar a 2.500 r.p.m. por 5 minutos. Identificar sete tubos (B, P1, P2, S 1, S2, F 1 e F2) - Branco, Padro e Testes. Transferir 1 ml de cada sobrenadante lmpido para tubo de ensaio previamente identificado. Adicionar a cada tubo: Tubos Soluo Testes gua Reagente da Padro Diluda (S1, S2, F1 e F2 ) Destilada Orto-Toluidina Padro 1 ml 7 ml Testes 1 ml 7 ml Branco 1 ml 7 ml Aquecer os tubos em banho-maria fervente por 10 minutos e resfri-los em gua corrente. (O nvel de gua no banho deve ser superior ao nvel de reagentes no tubo de ensaio). Determinar as absorvncias dos testes e padro em 630 nm, acertando o zero do espectrofotmetro com o branco. Calcular a concentrao de glicose em cada amostra expressando os valores em mg %.

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HIPERURICEMIA E GOTA OBJETIVOS 1- Determinar os nveis de cido rico no soro utilizando uma tcnica espectrofotomtrica. 2- Correlacionar os resultados obtidos da dosagem com a ocorrncia de gota INTRODUO Gota um termo que representa um grupo heterogneo de doenas, que em seu pleno desenvolvimento so manifestadas por: 1- um aumento na concentrao srica de urato; 2- ataques recorrentes de um tipo caracterstico de artrite aguda, no qual so demonstrveis cristais de urato monossdico monoidratado em leuccitos de lquido sinovial; 3- depsitos agregados de urato monossdico monoidratado (tofos) que ocorrem principalmente nas articulaes das extremidades ou em torno delas e algumas vezes conduzindo incapacidade e deformidade; 4- doena renal envolvendo tecido intersticial, glomrulos, tbulos, e vasos sangneos; 5- urolitase de cido rico. Estas manifestaes ocorrem em diferentes combinaes. A caracterstica bioqumica e pr-requisito da doena so os nveis elevados de cido rico no sangue e urina devido a vrias anormalidades metablicas que levam produo aumentada de purina nucleotdeos pela via de novo. A maioria dos sintomas clnicos associados com nveis elevados de cido rico aparecem devido baixa solubilidade do cido rico em ambientes aquosos. Muitos defeitos bioqumicos resultam numa sntese aumentada de nucleotdeos, por exemplo: Atividade aumentada da PRPP sintetase Atividade HGPRTase parcial diminuio parcial da atividade da HGPRTase Deficincia da glicose 6-fosfatase Mtodo para dosagem de cido rico Mtodo Enzimtico cido rico + O2 + H2O uricase H2O2 2H 2O2 + DHBS + 4-aminoantipirina + 4 H2O A intensidade da cor vermelha formada diretamente proporcional concentrao do cido rico da amostra.
peroxidase

Fundamento Alantona + CO2 + Antipirilquinonimina

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Reagentes 1- Soluo padro 2- Amostra 6,0 mg/dl. Contm azida sdica 0,1 g/dl. Pipetar com cautela. Soro, urina e lquidos (amnitico e sinovial) Tampo 50 mmol/l, pH 7,5; uricase 60 U/l; Peroxidase 660 4-aminoantipirina 1mmol/l; cido 3,5 dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (DHBS) 4 mmol/l; estabilizadores e ativadores. Contm azida sdica 0,1 g/dl. Pipetar com cautela. Procedimento Identificar trs tubos (B, P, T) - Branco, Padro e Teste. Adicionar a cada tubo: BRANCO 1,0 ml TESTE 0,02 ml 1,0 ml PADRO 0,02 ml 1,0 ml

3- Reagente de cor U/l;

Amostra Padro Reagente de cor

Misturar e colocar em banho-maria a 37C, 10 minutos. (O nvel de gua no banho deve ser superior ao nvel de reagentes no tubo de ensaio). Determinar as absorvncias do teste e padro em 520 nm, acertando o zero do espectrofotmetro com o branco. A cor estvel por 15 minutos. Calcular a concentrao de cido rico em cada amostra expressando os valores em mg/dl. Clculos Absorvncia do teste cido rico (mg/dl) =----------------------------- x 6 Absorvncia do padro Valores de referncia Soro Homens: 2,5 a 7,0 mg/dl Mulheres: 1,5 a 6,0 mg/dl

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PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUMICOS DO LEITE Introduo O leite obtido em circunstncias naturais uma emulso de cor branca, ligeiramente amarelada, odor suave e gosto adocicado. um produto segregado pelas glndulas mamrias e constitui alimento indispensvel aos mamferos nos primeiros meses de vida, enquanto no podem digerir e assimilar outras substncias necessrias sua sobrevivncia. O leite fresco, tanto de vaca quanto humano, tem uma reao de pH 6,6 a 6,8 . A acidez do leite deve-se, em parte, a fosfatos solveis. O leite possui ao tampo, em conseqncia do seu contedo em fosfatos, citratos e bicarbonatos. Deixando-o por algum tempo, suficientemente longo, sem esterilizar, o leite torna-se fortemente cido, em conseqncia da produo de cido lctico, a partir da fermentao da lactose que ele contm, por atividade de certas bactrias. A fermentao ltica do leite ocorre por conta do Streptococcus lactis e de outros microorganismos. A fermentao lctica do leite leva-o ao processo de coagulao por auto acidificao. Objetivo O objetivo desta aula a verificao dos componentes bioqumicos do leite. Sero usadas para esse reconhecimento reaes conhecidas e estudadas durante o desenvolvimento da disciplina Bioqumica. Separao dos componentes qumicos do leite 1-Colocar 50 ml de leite e 50 ml de gua destilada em um bquer de 250 ml e aquecer at 38o C. 2-Adicionar soluo de cido actico a 10% gota a gota com agitao constante at coagulao (cerca de 15 gotas).O pI da casena 4,5. 3-Deixar em repouso por cinco minutos. 4-Filtrar. Reservar o filtrado e o precipitado. 5-Concentrar o filtrado por fervura at reduo de 1/3 do volume e reservar. Este ser o filtrado (F) onde sero identificados vrios componentes do leite. 6-Colocar o precipitado obtido no item 4 em um becker, adicionar 10 ml de lcool etlico e amassar com o basto de vidro. Descartar o sobrenadante na pia. Adicionar novamente 10 ml de lcool e repetir a operao. 7-Acrescentar ao precipitado 10 ml de ter. Com o auxlio do basto de vidro, amassar o precipitado at o lquido tornasse levemente amarelado e (Cuidado!! Trabalhe longe da chama do bico de Bunsen, o ter altamente inflamvel) colocar o sobrenadante em uma placa de Petri. Deixar o ter evaporar temperatura ambiente e observar as gotculas de gordura. Reservar o precipitado (P).

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Identificao dos componentes do leite 1-Protenas Colocar em 3 tubos de ensaio: Tubo A- Alquota de P + 1 ml de gua destilada Tubo B- 1 ml de F Tubo C- 1 ml de gua destilada Acrescentar em todos os tubos, 1 ml de reagente de Biureto. Observar. Explicar 2-Acar Redutor Colocar em 2 tubos de ensaio: Tubo A- 1 ml de F Tubo B 1 ml de gua destilada. Adicionar a cada tubo, 2 ml do reagente de Benedict. Aquecer em banho-maria 100C durante 3 minutos. Observar e interpretar o resultado. 3-Clcio Colocar em 2 tubos de ensaio Tubo A- 1 ml de F Tubo B 1 ml de gua destilada Adicionar a cada um dos tubos o reativo de Sulkowitch ( oxalato de amnio 4%) gota a gota at a formao de um precipitado branco. Esquematizar a reao. 4-Cloretos Colocar em 2 tubos de ensaio: Tubo A - 1 ml de F Tubo B - 1 ml de H2O destilada Adicionar a cada um dos tubos 2 gotas de cido ntrico concentrado. Misturar e acrescentar 3 gotas da soluo de nitrato de prata 5%. Observar e esquematizar a reao.

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NORMAS PARA ELABORAO DO RELATRIO O relatrio deve conter os seguintes tpicos: TTULO- o mesmo indicado no roteiro da prtica RESUMO- um breve relato de tudo que foi desenvolvido no experimento, inclusive os resultados obtidos. No deve conter mais que 08 (oito) linhas. INTRODUO- neste tpico deve constar o fundamento terico necessrio para o bom entendimento da experincia realizada, bem como dos resultados e discusso. Pode ser compilado de livros ou manuais existentes na literatura. Seja objetivo. MATERIAL E MTODOS - descrio da parte experimental, destacando os materiais e equipamentos usados. RESULTADOS- os resultados devem ser apresentados de maneira sucinta e clara. Tabelas, figuras e reaes podem ser usadas para melhor compreenso dos dados. DISCUSSO - O propsito da discusso interpretar os resultados e relat-los com base no conhecimento terico existente. Informaes dadas em outra parte do texto podem ser citadas mas no repetidas em detalhes na discusso. CONCLUSES- Esta parte do relatrio deve sumarizar as principais concluses obtidas no decurso do trabalho realizado. REFERNCIAS - livros, artigos, websites consultados, manuais utilizados na elaborao do relatrio devem ser relacionados (utilizar NBR 6023 - ago 2002, da ABNT).

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