UJI HEMOGLOBIN DAN DEOKSIHEMOGLOBIN Tujuan Membuktikan hemoglobin dapat mengikat oksigen membentuk oksihemoglobin (HbO2) dan dapat

terurai kembali menjadi O2 dan deoksihemoglobin. Dasar Dalam keadaan tereduksi Fe dalam molekul Hb dapat mengikat dan melepaskan oksigen tergantung pada tekanan O2 atau CO2. Hb(Fe2+) + O2 Hb(Fe2+)O2 deoksiHb oksiHb Untuk mereduksi oksiHb menjadi deoksiHb digunakan larutan pereduksi Stokes. Bahan dan pereaksi 1. Darah segar 2. Pereaksi Stokes 3. Larutan NH4OH Cara kerja A. OksiHb 1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air suling. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk. 2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 ml. gunakan tabung 1 sebagai kontrol. B. Pembentukan deoksiHb 1. Isi tabung ketiga dengan 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk. Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat. 2. Masukkan beberapa tetes larutan Stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1. C. Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb 1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk. 2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang. Hasil Hasil Warna yang terbentuk Tabung 1 oksiHb Merah terang Tabung 2 deoksiHb Hitam Tabung 3 Reoksigenasi deoksiHb Merah tua

Kesimpulan Stokes mengubah konformasi Hb menjadi deoksihemoglobin sehingga afinitas O2 turun, oleh karena itu terbentuklah warna merah kehitaman. Karena darah dioksigenasikan kembali, maka terbentuklah oksihemoglobin sehingga terbentuk kembali warna merah tua.

UJI TERHADAP KARBONMONOKSIDA HEMOGLOBIN (HbCO)

Tujuan Membuktikan bahwa Hb dapat mengikat CO yang ikatannya lebih kuat daripada Hb dengan O2. Dasar Teori

Gas CO yang berasal dari proses-proses pembakaran yang tidak sempurna dapat mengikat Hb membentuk HbCO. Ikatan ini sangat kuat (lebih kurang 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen). HbCO berwarna merah terang. HbO2 + CO HbCO HbCO + Stokes tidak bereaksi (tetap berwarna merah terang) Bahan dan pereaksi 1. darah segar 2. sumber gas CO 3. pereaksi Stokes 4. NH4OH Cara Kerja 1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi. 2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna kedua tabung tadi. 3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) ke dalam tabung 3 dan 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan 6. 4. Tambahkan pereaksi stokes pada tabung ke 3 dan 5. Jelaskan hasil yang didapat! 5. Encerkan isi tabung 4 dan 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningkan, sedangkan HbCO bersemu kemerahan (carmine tint). Hasil Percobaan 1: Warna sebelum penambahan pereaksi Stokes Dengan aliran CO pertama Dengan tambahan aliran CO pertama Dengan tambahan aliran CO kedua Dengan tambahan aliran CO ketiga

Tabung HbO2 Merah tua Merah kehitaman -

Tabung HbCO Merah marun Merah lebih tua mendekati hitam Merah tua namun lebih muda dari CO pertama Merah tua namun jauh lebih muda dari CO pertama dan kedua

Kami memberikan tambahan intervensi berupa aliran CO tambahan sampai dengan tiga kali pada tabung HbCO.

Analisis Pada tabung oksiHb, warna darah seperti biasa : merah tua. Pada tabung karbonmonoksiHb, warna darah menjadi merah marun. Perubahan warna ini terkait dengan pengikatan Hb dengan CO yang dialirkan. Kemudian setelah dialiri dengan CO, pada tabung oksiHb, warna berubah keruh kemudian menggelap rata. Begitu juga yang terjadi pada tabung HbCO, meskipun kekeruhannya tidak sebanyak tabung oksiHb. Secara teori, warna darah pada tabung HbCO tidak berubah karena ikatan Hb dengan CO sangat kuat. Hasil percobaan yang tidak sesuai dengan teori ini dikarenakan aliran CO yang diberikan kurang, sehingga masih banyak Hb yang belum berikatan dengan CO dan masih berikatan dengan oksigen. Oleh karena itu, kami berinisiatif untuk menambahkan aliran CO. Dari tiga kali aliran CO, didapatkan perubahan kekeruhan yang semakin berkurang. Sehingga dapat kami simpulkan, hasil percobaan kami sesuai dengan teori hanya saja diperlukan waktu yang cukup lama untuk menunggu semua Hb berikatan dengan CO. Grafik penambahan CO dengan kekeruhan cairan darah:

kekeruhan

penambahan CO

Kesimpulan Hb dapat mengikat CO lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen. Pertanyaan Gejala-gejala apakah yang jelas terlihat pada seseorang yang keracunan CO? Jawab: Sesak napas

UJI METHEMOGLOBIN
Tujuan Memperlihatkan bila besi dalam molekul hemoglobin dioksidasi menjadi Fe3+, maka terbentuk metHb yang tidak lagi bisa mengikat oksigen. Dasar Teori Reaksi oksidasi besi dalam molekul hemoglobin Hb(Fe2+) + K3Fe(CN)6 Hb(Fe3+) + K4Fe(CN)6 Hb oksidator MetHb MetHb yang dihasilkan ini tidak dapat lagi mengikat oksigen Pereaksi Stokes Stokes sering digunakan sebagai reduktor. Merupakan campuran 20 g fero sulfat dan 30 g asam tartrat dalam akuades, lalu diencerkan hingga 1000 mL. 5 mL larutan tadi ditambahkan dengan amonium hidroksida sampai endapan yang terbentuk larut kembali. Pereaksi K3Fe(CN)6 K3Fe(CN)6 sering digunakan sebagai oksidator. K3Fe(CN)6 33% terbuat dari larutan 165 g K3Fe(CN)6 dalam 500 mL akuades. Alat dan Bahan 1. darah segar 2. pereaksi K3Fe(CN)6 3. pereaksi Stokes 4. aquades Cara Kerja 1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi. 2. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K 3Fe(CN)6 33%. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat? 3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya. Perhatikan gelembung-gelembung oksigen yang terbentuk. Hasil Percobaan 1: Tabung + K3Fe(CN)6 Pengocokan kuat + Stokes Pengocokan kuat Warna tabung 1 Coklat kehitaman Ada gelembung Hitam Gelembung semakin banyak

Analisis Darah yang awalnya berwarna merah segar setelah dicampur dengan K3Fe(CN)6 dan dilakukan pengocokan warnanya berubah menjadi coklat kehitaman, hal ini berarti terjadi pengubahan Fe 2+ menjadi Fe3+. Kemudian diberikan Stokes, warna darah menjadi hitam. Dalam tubuh, larutan Stokes dapat mereduksi kembali Fe3+ menjadi Fe2+, namun dalam percobaan ini hal tersebut tidak terjadi. Ini dimungkinkan oleh beberapa faktor yang diantaranya karena kurangnya enzim tertentu yang ada dalam tubuh yang bekerja membantu kerja Stokes. Kesimpulan Pereaksi Stokes tidak mampu mereduksi kembali Fe3+ menjadi Fe2+ Hasil Percobaan 2: Tabung + K3Fe(CN)6 Gelembung udara Warna tabung 2 Merah gelap Ada gelembung

Analisis Larutan dipanaskan untuk melonggarkan ikatan protein (Hb) dengan O2 agar mudah terlepas ketika ditambahkan pereaksi K3Fe(CN)6. Ketika ditambahkan pereaksi K3Fe(CN)6, terjadi oksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ sehingga Hb berubah menjadi metHb yang tidak lagi bisa mengikat O2. O2 tersebut terlepas dari ikatan Hb dan terlihat sebagai gelembung pada dinding tabung reaksi. Kesimpulan MetHb tidak mampu mengikat Oksigen.

PENETAPAN KADAR Hb DENGAN METODE SIANMETHEMOGLOBIN Tujuan Menentukan kadar Hb dalam darah secara kuantitatif dengan metoda sianmethemoglobin. Dasar Pada metoda ini semua bentuk hemoglobin diubah menjadi pigmen yang lebih stabil, yaitu sianmethemoglobin setelah penambahan suatu pereaksi yunggal yang mengandung kalium sianida dan kalium ferisianida. Ferisianida akan mengoksidasi Hb menjadi metHb yang kemudian direaksikan dengan ion sianida membentuk sianmetHb. Alat 1. 2. 3.

Pipet Sahli 0,2 ml; Pipet volumetric 5 ml; Spektrofotometer dan kuvet.

Bahan 1. Darah yang akan diuji; 2. Pereaksi Drabkin (1 gram NaHCO3, 52 mg KCN, dan 198 mg K3Fe(CN)6 dalam 1 L air suling); 3. Standard Hb. Cara Kerja / Metoda 1. Sediakan 5 tabung reaksi yang terdiri dari 1 buah sebagai tabung blanko, 2 buah sebagai tabung standard, dan 2 buah sebagai tabung uji; 2. Pipetkan pereaksi drabkin sebanyak 5 ml ke dalam 5 tabung tersebut, kecuali pada blanko sebanyak 5,02 ml; 3. Tambahkan 0,02 ml darah uji pada 2 tabung uji yang telah berisi Drabkin lalu homogenkan; 4. Tambahkan 0,02 ml standard Hb pada 2 tabung standard yang telah berisi drabkin lalu homogenkan; 5. Diamkan 5 tabung tersebut selama 10 menit; 6. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektrofotometer dan tentukan serapannya pada panjang gelombang 540 nm; 7. Tentukan kadar Hb dalam g%. Kadar Hb = Ru Rs x konsentrasi standar (g%) = .. g%

Hasil

Blanko

St 1

St 2

Uji 1

Uji 2

Tabung Blangko Standar Uji Pereaksi Drabkin (ml) 5,02 5,00 5,00 Darah segar (ml) 0,02 Standar Hb (ml) 0,02 Diamkan (menit) 10 10 10 Serapan pada panjang gelombang 540 0,005 0,405 0,411 0,125 0,366 nm Hasil perhitungan: kadar (g%) 13,8 13,37 *hasil uji yang digunakan adalah yang berilai 0,366, dikarenakan nilai 0,125 dianggap tidak sesuai, dan muncul akibat kesalahan pada proses praktikum.

Interpretasi Hasil : Batas-batas kadar Hb normal: Laki-laki: 13,5-18,0 g/dl Perempuan: 11,5-16,5 g/dl Pada percobaan ini, kadar Hb pada OP yang berjenis kelamin laki-laki adalah 13,37 % Diskusi dan Kesimpulan 1. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa darah uji memiliki kadar hemoglobin normal, yaitu 13,37 g/dl. (range kadar Hb untuk laki-laki = 13.5 sampai 18.0 g/dl) (range kadar Hb untuk wanita = 11.5 sampai 16.5 g/dl) 2. Dalam percobaan terdapat beberapa faktor perancu hasil, yaitu: Jumlah darah yang dimasukkan dalam reagen tidak tepat 0,02 ml, karena kesulitan pengambilan darah. Sehingga konsentrasi darah dalam reagen tidak sesuai teori. Pengocokan (pencampuran) darah dan reagen terambat dilakukan sehingga penghitungan waktu 10 menit dilakukan pasca pengocokan. Pengukuran absorbansi tiap-tiap tabung tidak tepat dilakukan selama 10 menit setelah pencampuran.

HEMOLISIS SEL DARAH MERAH Tujuan Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah. Dasar Dalam larutan hipotonik, sel darah merah akan menggembung karena cairan dari luar sel akan masuk ke dalam sel dardah merah. Bila pembengkakan eritrosit melewati batas fragilitas, maka sel itu akan pecah (hemolisis). Hemoglobin akan larut dalam cairan hipotonik sehingga larutan akan berwarna merah jernih. Di dalam larutan hipertonik, cairan dari eritrosit akan keluar dari sel sehingga eritrosit akan mengerut (crenated). Bahan dan Pereaksi 1. Darah segar 2. Larutan NaCl 2% Cara Kerja 1. Ke dalam 10 tabung reaksi, isiskan campuran berikut: Tabung Air suling (mL) NaCl 2% (mL) % NaCl 1 10,0 0,0 0% 2 9,0 1,0 0,2% 3 8,0 2,0 0,4% 4 7,5 2,5 0,5% 5 7,0 3,0 0,6% 6 6,5 3,5 0,7% 7 6,0 4,0 0,8% 8 5,5 4,5 0,9% 9 5,0 5,0 1,0 % 10 4,5 5,5 1,1% 2. Campur dengan baik 3. Tambahkan 2 tetes suspensi darah ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalikbalikkan tabung perlahan. Diamkan selama 1 jam. 4. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis setiap tabung. Hasil Tabung 1 2 3 4 5 6

% NaCl 0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7

Hemolisis hemolisis Hemolisis Hemolisis hemolisis Hemolisis Hemolisis

7 8 9 10

0,8 0,9 1,0 1,1

Hemolisis Separuh hemolisis Tidak hemolisis Tidak hemolisis

Kesimpulan Persentase NaCl dalam darah adalah 0,9 %. Oleh karena itu pada larutan dengan konsentrasi kurang dari 0,9 %, eritrosit akan mengalami hemolisis. Pada konsentrasi lebih dari0,9 %, eritrosit tidak akan hemolisis tetapi akan mengerut (crenated).

PENGARUH PELARUT ORGANIK TERHADAP MEMBRAN SEL DARAH MERAH

Tujuan Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam pelarut organik tertentu. Dasar Membran sel darah merah mengandung lipid. Pelarut organik tertentu yang bersifat melarutkan lemak akan menyebabkan lipid membran larut sehingga terjadi hemolisis.

Jenis Pelarut NaCl 0,9 % : garam fisiologis tubuh manusia Kloroform: nama umum untuk triklorometana (CHCl3). Kelarutan dalam air sebesar 0.80 g/L Eter: suatu senyawa yang mengandung satu gugus ROR', dimana R= alkil. Contoh dari senyawa ini adalah dietil eter Aseton: CH3COCH3 dikenal sebagai propanon, dimetil keton, 2-propanon, propan-2on, dimetilformaldehida, dan -ketopropana, adalah senyawa berbentuk cairan yang tidak berwarna dan mudah terbakar. Ia merupakan keton yang paling sederhana. Aseton larut dalam berbagai perbandingan dengan air, etanol, dietil eter,dll. Dapat larut dengan baik dalam air Toluene : C6H5CH3 metilbenzena ataupun fenilmetana, adalah cairan bening tak berwarna yang tak larut dalam air dengan aroma seperti pengencer cat dan berbau harum seperti benzena. Toluena adalah hidrokarbon aromatik yang digunakan secara luas dalam stok umpan industri dan juga sebagai pelarut. Kelarutand alam air sebesar 0,47g/L Alkohol: CnH2n+1OH stilah yang umum untuk senyawa organik apa pun yang memiliki gugus hidroksil (-OH) yang terikat pada atom karbon, yang ia sendiri terikat pada atom hidrogen dan/atau atom karbon lain. Contoh dari senyawa ini adalah etanol, senyawa ini dapat larut dalam air
Alat dan Bahan 1. darah segar 2. larutan NaCl 0,9% 3. kloroform 4. eter 5. aseton 6. toluen 7. alkohol Cara Kerja 1. Ke dalam 6 tabung reaksi, masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%. 2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan alkohol secara berurutan.

3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol. Hasil Pengamatan Pelarut NaCl 0,9% (kontrol) Kloroform Eter Aseton Toluen alkohol Hemolisis Bening Kuat Paling kuat Tidak kuat Tidak terlalu kuat

Analisis

Berdasarkan hasil percobaan, diperoleh bahwa hemolisis paling kuat (nyata) terjadi pada larutan yang mengandung eter, kemudian secara berurutan (dari paling kuat ke paling lemah) kloroform, toluen, alkohol, aseton. Hal ini menunjukkan daya larut masing-masing pelarut organik, makin tinggi sifat pelarut dalam melarutkan lemak (nonpolar), makin kuat daya lisisnya terhadap
membran sel darah merah

Kesimpulan 1. Membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam pelarut organik tertentu 2. Hemolisis paling kuat terjadi pada larutan yang mengandung pelarut dengan daya larut lemak paling tinggi. .