Percobaan 1 MIKROSKOP

I. Tujuan
Melatih menggunakan mikroskop untuk melihat morfologi jamur ,Yeast, Bakteri dan beberapa Mikroorganisme Lainnya. Mengenal Bentuk-bentuk Mikroorganisme Melatih Membuat Preparat

II.

Prosedur Kerja 1: Mempersiapkan Mikroskop

Keluarkan Mikroskop hati-hati dari Lemarinya dan Tempatkan Di atas meja untuk Bekerja. Tetapkan tinggi bangku sedemikian rupa sehingga dengan mudah dapat melihat Okuler Putarlah sekrup penetapan kasar, hingga tubus Mikroskop naik kira-kira 2 cm dan tempatkan Preparat di Tengah-tengah mikroskop dan cengkramkan dengan jepitan-jepitan untuk itu Naikkan kondensor setinggi-tingginya dan buka Diafragma seluruhnya Lihatlah melalui Okuler dan Putar Tubusnya pelan-pelan ke atas dengan sekrup Penetapan kasar, hingga dilihat Bayangan 1

Terang dari Preparat. Jika perlu tetapkan dengan sekrup penetapan Halus Bila bayangan kurang terang atau terlalu terang , maka Pencahayaan dapat diatur pengaturan kekuatan Sumber Cahaya Setelah selesai memakai Mikroskop dan sebelum disimpan Kondensor Harus diputar ke bawah,Revolver diputar hingga lensa terkecil berada di bawah dan tubus diputar ke bawah,kemudian Mikroskop beserta Lensanya Dibersihkan

III.
a.

Prosedur Kerja 2 : Mempersiapkan Preparat Mengamati sel Ragi

(Yeast)
Teteskan Yeast yang telah dilarutkan dalam Methylen Blue 0.1 % pada kaca Obyek yang Bersih. Tutup Dengan Desk Glass,lalu Periksa di bawah Mikroskop. Periksalah dengan Pembesaran kuat kurang lebih 100 X Bedakan antara sel mati dan sel hidup (misalnya inti, Vacoula ,Dinding Sel, dll) Amati dan Gambarlah bentuk sel Ragi tersebut

b.

Mengamati bentuk-bentuk bakteri

Bahan pengamatan adalah : milk, Water bakteri , dan Air Sungai. Prosedur : Siapkan kaca obyek yang bersih. Dengan ose steril , ambil Suspensi bakteri dan

taruhlah di pusat kaca Obyek Kemudian tutup Dengan Deck Glass, ditambahkan Oil Imersion di Atas Deck Glass. Lalu Diperiksa di Bawah Mikroskop dengan Perbesaran 1000X tersebut Aturlah Obyektif Preparat sehingga terlihat jelas Amati dan Gambarlah bentuk Mikroorganisme

Dari Media Cair

Taruhlah 1 2 Lup penuh suspensi organisme pada kaca obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawahnya.

Sebarkan organisme hingga rata seluas area yang disediakan

Biarkan Olesan kering di udara

Lalukan Kaca Obyek tersebut beberapa kali di atas api Bunsen . Kaca obyek itu harus terasa agak panas bila ditempelkan pada punggung tangan anda. Gambar 2.1 Penyiapan Olesan Bakteri 5

Dari Medium Padat

Tarulah 1-2 luph penuh air steril pada kaca Obyek yang sudah diberi tanda lingkaran di bawahnya

Dengan Jarum Inokulasi (yang Lurus) pndahkan sedikit biakan ke atas tetes

Lalukan Kaca Obyek tersebut beberapa kali di atas api Bunsen . Kaca obyek itu harus terasa agak panas bila ditempelkan pada punggung tangan anda. Gambar 2.1 Penyiapan Olesan Bakteri 6

1.Kocoklah Tabung dengan gerakan ke Samping sehingga diperoleh suspensi yang rata hindarkan terbasahnya sumbat dan biakan.

2.Pijarkan seluruh panjang kawat Lup Inokulasi .Lewatkan juga tangkainya di atas api

3.Angkat sumbat Tabung dan panaskan mulut tabung.Jangan letakkan sumbat tabung di atas meja agar tidak tercemar.

4.Setelah Lup dibiarkan mendingin sekurangkurangnya lima detik,ambillah satu lup suspensi Organik.Usahakanlah agar Lup tidak menyentuh dinding tabung.

5.Panaskan kembali mulut Tabung

6.Setelah disumbat kembali, letakkanlah tabung tersebut di rak tabung.

7.Letakkan Suspensi organisme yang ada pada lupke tengah-tengah kaca Obyek yang bersih.

8. Pijarkan kembali Lup sebelum digunakan lagi untuk maksud yang sama atau sebelum menaruhnya kembali di tempat semula.

Gambar 2.2 Pemindahan Biakan ke atas kaca Obyek

Hasil Pengamatan

Percobaan 2 STERILISASI
I. Tujuan
Mengenalkan salah satu cara sterilisasi peralatan dan media Memperoleh alat dan media yang steril

II.

Teknik Sterilisasi
Sterilisasi ialah : Proses pembebasan bahan-bahan dan alat-alat dari Mikroorganisme. Macam-macam Sterilisasi: Sterilisasi Secara Kimia Dengan mempergunakan zat-zat kimia yang disebut Desinfektan. Biasanya dengan memberikan desinfektan tersebut pada bahan-bahan yang akan disterilkan dan merupakan semacam Proses Pengawetan. Contoh : Ehlorinasi pada air bersih , Pemberian Alkohol pada peralatan kerja dan luka.

10

Sterlisasi Secara Fisika a) Sterilizer ) Dengan alat Hot Air Stelizer , alat tersebut dipakai untuk Sterilisasi dengan Udara panas (Dry Air

mensterilkan alat-alat gelas seperti Petridish,Pipet , tabung Reaksi ,dan lain-lain pada Suhu 1600C-1800C selama 1,5 jam .Cara ini tidak dipakai untuk mensterilkan cairan atau zat-zat organik sebab akan rusak ( zat-zat tersebut terurai pada suhu tersebut ) b) Sterilisasi dengan Arus Uap

Sterilisasi Uap Panas lebih Efisien dibandingkan dengan Sterilisasi udara panas karena : Uap mempunyai daya Tembus yang lebih besar , yang menyebabkan penggumpalan Protoplasma sel-sel itu. Mematikan semua Bakteri karena menggumpalnya protein pada Protoplasma.Alat yang biasa dipakai untuk Sterilisasi ini adalah Arnold Steam Sterilizer yang bekerja pada suhu 1000C selama 20 menit . Pada suhu di atas sudah cukup untuk merusak semua bakteri vegetatif .Arnold Steam Sterilizer dipakai Untuk Sterilisasi : susu ,karbohidrat, media dan lain-lain. Waktu yang lama dan suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan terurainya bahan-bahan tersebut. 11

c) Tekanan

Sterilisasi dengan Uap Panas dan

Alatnya : Autoclave , dipakai untuk sterilisasi medis, agar ,aquades ,non carbohydrat brothdan lain-lain. Cara ini biasanya dipakai untuk proses Sterilisasi makanan dalam kaleng . Cara kerja Autoclave : ataupun Gas Barang-barang yang akan disterilkan diletakkan dalam rak-rak Logam/Plat logam berlubang yang terletak beberapa cm di atas air, setelah hampir mendidih keluar seluruhnya Pentil lalu ditutup, suhu dan Tekanan akan Naik , sampai suhu 1210C dan tekanan 15 Psi . Air dalam Autoclave harus lebih , guna pembentukan uap air ,supaya jenuh .Bila tidak Jenuh maka tekanan Uap dan suhu tidak Sesuai lagi 12 Tutup Autoclave lalu disekrup erat ,sedangkan pentil dibuka sehingga udara terhalau akan Pemanasan air dalam Autoclave dapat dilakukan dengan pemanasan listrik

Jika telah dicapai tekanan

yang dikehendaki ( 15 Psi ), maka aliran gas dan Klep pengaman diatur guna menjaga tekanan tetap konstan .Pemanasan selama 15 Menit Setelah waktu Sterilisasi selesai , Pemanasan dialihkan dan Auto clave dibiarkan dingin hingga meter tekanan menunjukkan angka nol ,lalu secara hati-hati kran udara dibuka sehingga tekanan Uap mencapai tekanan Atmosfer

Prosedur Kerja : Sterilisasi dengan Autoclave

Cuci alat-alat yang akan

dipergunakan dengan air panas atau dengan sabun ,baru dicuci dengan air yang mengalir dan kemudian Aquades atau dengan Alkohol Petridish dan pipet serta Untuk Tabung Reaksi dan peralatan gelas lainnya dibungkus kantong kertas coklat Erlenmeyyer dipakai sumbat dari kapas berlemak .Sumbat harus masuk 2 cm dalam tabung dan bagian luar harus padat sehingga dapat menahan debu dan kotoran kotoran

13

 menit .

Masukkan dalam Autoclave

,panaskan sampai suhu1200C dan tekanan 15Psi selama 15 Perhatian : selama Sterilisasi tidak diperkenankan membuka penutup Autoclave , setelah waktu menunnjukkan berakhirnya Proses, biarkan beberapa saat sampai tekanan menunjukkan 1 atm baru dapat dibuka . Amati gelas atau Media yang diSterilisasi ,apakah telah benar-benar telah Steril , bila tidak , lakukan Steril ,bila tidak , Lakukan Steril kembali

Hasil Pengamatan

14

Percobaan 3 PEWARNAAN
Bagian Pertama : Penyiapan Olesan Bakteri I.

Tujuan
Mempelajari cara menyiapkan olesan Bakteri sebagai awal untuk melakukan berbagai teknik Pewarnaan mikroorganisme

II.

Alat dan bahan

Isopropil Alkohol 95% Sabun Pembersih Air hangat 15

Lap kertas yang tidak meninggalkan serat Jarum Ose Pembakar Bunsen Biakan Streptococcus Epidermis dalam Nutrient Agar (NA) miring Biakan E.Coli dalam Nutrien Agar miring Kaca Obyek

III.

Prosedur kerja
Olesan bakteri yang baik dan disiapkan mestinya merupakan Prasyarat bagi berhasilnya berbagai teknik pewarnaan Olesan seharusnya tidak terlalu tebal tidak terlalu tipis, bila difiksasi dengan panas akan tahan pencucian satu atau lebh selama berlangsungnya Proses Pewarnaan sehingga Organismenya tidak hilang tercuci namun sel-selnya tidak menjadi salah satu bentuk ataupun menyusut. Olesan yang tebal akan menyebabkan sel-sel bakteri bertumpuk-tumpuk sehingga sukar untuk menentukan bentuk 16

sel secara individu . Hal ini cenderung terjadi pada olesan yang dibuat dari biakan yang berasal dari medium padat ( agar miring atau Cawan ) Olesan yang terlalu tipis akan menyulitkan ditemukannya sel-sel tersebut pada pengamatan Mikrokospik . Hal ini cenderung terjadi pada Olesan yang dibuat dari biakan dalam Medium Cair Kaca Obyek yang dipaka tidak boleh tergores dan harus bersih betul

Bila mediumnya berupa cairan ( kaldu , susu , air liur , air seni , dan sebagainya ) maka penyiapan olesan dimulai dengan menaruhkan satu atau dua lup Penuh biakan cair tersebut langsung pada kaca Obyek Bila organismenya diambil dari medium padat ( agar miring , agar cawan atau bagian-bagian tubuh) maka perlu ditaruh satu atau dua lup penuh biakan cair tersebut langsung pada kaca Obyek Kesalahan yang seringkali terjadi ialah kecenderungan untuk mengambil biakan terlalu banyak pada jarum Inokulasinya . Untuk mengatasinya maka digunakan jarum 17

inokulasi yang lurus dan bukan lup Inokulasi pada langkah di atas. Olesan bakteri harus betul- betul kering udara sebelum difiksasi dengan panas. Fiksasi dengan panas dilakukan secukupnya dan tidak berlebihan untuk menghindarkan terjadinya salah satu bentuk atau Penyusutan Sel. Meskipun Kaca Obyek yang digunakan pada Penyiapan Olesan itu tidak Steril , namun Hendaknya digunakan Teknik Antiseptik

Bagian Kedua : Pewarnaan Gram Tujuan

Mempelajari cara pewaraan preparat dan perbedaan karakteristik bakteri Gram Positif dan Gram Negatif

Alat dan bahan Kaca Obyek Biakan E.Coli dan streptococcus Jarum Pemanas Aquadest 18

Bunsen Larutan Kristal Violet Larutan Lugol (J2 dalam Larutan KI ) Alkohol 96 % Safranin Kertas Saring Mikroskop dengan Minyak imersi

Prosedur Kerja Ambil sebuah kaca Obyek , bersihkan dengan

sepoong kain supaya hilang debunya , kemusian panaskan sebentar kira-kira 10-20 X di atas nyala sehingga lemaknya hilang . Letakkan kaca Obyek , dengan sisinya yang tidak berlemak pada bagian atas bejana untuk mewarna dan biarkan sampai dingin . kemudian taruhkan setetes air di atasnya ( tetes air ini harus menyebar sama rata ) . Jika air ini tak menyebar ,

19

berarti lemaknya masih belum hilang semuadan pekerjaan ini harus diulang Teteskan satu tetes air pada Obyek yang telah dibersihkan , Pindahkan sedikit biakan bakteri yang berumur 24 jam dengan menggunakan Jarum Ose steril , kemudian ratakan Keringkan larutan bakteri pada kaca Obyek tersebut di udara , jika terlalu lama keringkan dengan cara melewatkan beberapa kali di atas nyala api ( kira-kira 20 cm atas nyala api ) Setelah kering, lewatkan gelas Obyek tersebut dengan cepat 2-3 kali di tengah nyala api agar lapisan bakteri terfiksasi dengan sempurna Teteskan kristal violet dan biarkan selama 1 menit Bilas dengan air kran / Aquadest Teteskan larutan Iodine pada Preparat dan diamkan Bilas dengan air kran / Aquadest Teteskan larutan Safranin dan Biarkan selama 45 Bilas dengan air kran / Aquadest Keringkan di udara , atau gunakan tissue secara hatiBubuhi dengan minyakl Imersi , dan Amati dengan

kurang lebih 1 menit detik hati Mikroskop

20

 tersebut

Catatlah jenis-jenis yang diperiksa , bedakan antara

Gram Positif dan Negatif, Gambarkan bentuk-bentuk bakteri

21

Hasil Pengamatan

22

Percobaan 4
ISOLASI dan TEKNIK PEMINDAHAN BAKTERI
I. Tujuan Mempelajari cara-cara mengisolasi bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan gores dan cawan tuang II. Teori Mikroorganisme di lingkungan mana saja pada Umumnya terdapat dalam Populasi Campuran . Jarang dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam . Untuk mencirikan dan Mengidentifikasikan suatu Species mikroorganisme tertentu , maka Species tersebut harus dapat dipisahkan dari yang lain , lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni Biakan Murni ialah biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan sel tunggal. Biakan murni diperlukan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme , termasuk penelaahan ciri-ciri kultural ,morfologis , fisiologis , maupun Serologis dari satu macam mikrorganisme saja. Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya ialah Teknik Cawan Gores dan Cawan Tuang . Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan Organisme sedemikian sehingga individu species dapat dipisahkan dari yang lainnya , dengan Anggapan, setiap 23

koloni yang terpisah tampak pada cawan petri setelah Inkubasi berasal dari satu sel tunggal III. Cawan Gores Metode ini mempunyai keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode Cawan Gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang seringkali dilakukan ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan Inokulum terlalu banyak serhingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan. Bila lup menggoreskan Inokulasi yang mengandung bakteri pada permukaan agar Nutrient di dalam Cawan Petri , pada dasarnya adalah menaruh puluhan ribu sel pada medium tersebut. Pada waktu Inkubasi , setiap sel induk berbagi diri dengan pembelahan Binner dalam waktu 20-30 menit menjadi dua sel anak. Lalu pada 20-30 menit berikutnya setiap sel anak berbagi diri lagi sehingga kini terdapat 4 sel anak . Sel-sel baru itu terus berbagi diri dalam Jumlah Eksponensial menjadi bermilyar-milyar sel anak yang saling bertumpukan di atas dan di sampingnya membentuk suatu Koloni

24

Kebanyakan baketeri , setelah masa Inkubasi selama 24 jam , satu koloni murni dapat terdiri dari 50-72 generasi sel yang timbul dari satu sel induk tunggal , dengan kata lain satu koloni murni terdiri dari bermilyar-milyar sel anak. Pertumbuhan bakteri sesungguhnya merupakan pertambahan jumlah sel dan bukan ukuran sel IV. Alat dan Bahan Suspensi campuran : serratia mercescens , Escherichia oli Streptococcus. V. Prosedur Kerja Tuliskan nama , nomor kegiatan dan tanggal pada tutup Cawan Petri anda Baliklah cawan Petri Anda dan menggunakan Pensil Lilin atau Spidol Bagilah seluruh area dasar Cawan Petri seperti diperlihatkan pada Gambar 4.1 Cawan Nutrient agar Lup Inokulasi Jarum Pindah Agar Miring (NA) Nutrient Agar

25

Label dapat ditulisakan pada permukaan luar dasar Cawan Petri sebagaimana seharusnya dan bukan pada tutupnya. Perhatikan bahwa Sektor O lebih kecil daripada sektor-sektor lainnya dan goresangoresan inokulasinya pun tidak terpisahkan sebaik seperti pada Sektor berikutnya

(A)

(B)

Gambar 4.1 . Pembagian Area untuk Pembiakan bakteri

Keterangan gambar 4.1 : B. C. Pembagian sektor sebagaimana tergambar pada Pembagian sektor sebagaimana tampak melalui permukaan luar dasar cawan Petri cawan Petri Perhatikanlah Sektor I kiri atas sedangkan Sektor O adalah di sebelah kanan 26

Dengan berpedoman pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3 ,

Goreskanlah biakan Campuran yang disediakan pada Cawan Petri anda Sebagai Berikut:

Gambar 4.2 Cara membuka tutup Cawan Petri selama Penggoressan . Bukalah Sedikit tutup Cawan Petri , namun tutup cawan tersebut harus tetap terletak di atas Cawan . Dengan Demikian maka Medium Steril dalam Cawan Terlindungi dari bakteri asal Udara

27

Gambar 4.3 langkah-langkah dalam metode Cawan Gores untuk Mengisolasi Bakteri. Letakkan Cawan Petri anda di atas meja dengan

Anda

tutupnya terletak di sebelah atas dan Sektor O di sebelah Kiri Kocoklah Tabung berisi biakan campuran dengan

Gerakan Ke samping , Bakteri cenderung mengendap di dasar Tabung bila dibiarkan agak lama, sehingga suspensi tampak rata. Jagalah agar Sumbatnya tidak terbasahi 28

Dengan mengunakan Lup Inokulasi , Pindahkan secara

Aseptik satu Lup penuh biakan campuran bakteri pada Sektor O dan Goreskan Lup anda Bolak-Balik beberapa kali di satu Permukaan agar, lakukan hal ini dengan Cara membuka sedikit saja tutup Cawan Petri Anda pada Posisi yang Berlawanan dengan Sektor O seperti Pada Gambar 4.3 Pijarkan Lup panda dan biarkan dingin . Suhu lup dapat diperiksa dengan cara menyentuhkannya pada permukaan agar bagian tepi yang belum di Inokulasi . Bila mendesis Artinya Lup tersebut masih panas. Pemijaran Lup mematikan sel-sel yang tersisa padanya dan dengan demikian membantu pengenceran Jumlah Sel. Goreskan Lup anda ke sektor O disusul gerakan ke tepi luar sektor satu . lalu kembali ke Sektor O dan Seterusnya,BolakBalik sebanyak dua tiga kali .Kemudian Selesaikan penggoresan tersebut ke sektor satu tanpa lagi menyentuh sektor O sampai sektor satu penuh Terisi goresan yang tidak Bertumpang Tindih Putarlah Cawan Petri sehingga cawan satu terletak di Ulangi langkah ke e untuk mengencerkan biakan dari Putarlah cawan Petri anda sehingga sektor dua terletak sebelah Kiri anda sektor satu ke sektor dua di sebelah kiri anda

29

Ulangi langkah ke e untuk mengencerkan biakan dari

sektor dua ke sektor tiga Perhatian: jangan lupa memijarkan Lup anda setiap kali anda berpindah sektor Lakukanlah penggoresan yang sama ( langkah a-e ) dengan menggunakan biakan campuran yang sama pada cawan petri kedua suhu 300 C VI. Pengamatan Dengan pensil Lilin atau Spidol lingkari Kolonikoloni yang terpisah dan berlainan warna pada Permukaan Luar dasar Cawan Petri anda . Perhatian :Bila koloni pada permukaan agar yang tidak anda gores itu terkontaminasi dari udara luar ,janganlah anda pilih, jadi periksalah lokasi koloni-koloni yang anda pilih dengan teliti. Tunjukkanlah pilihan anda itu pada asisten yang bertugas sehingga keberhasilan teknik anda dapat dinilai.Gambarkanlah koloni pada Cawan Petri yang anda amati. Gunakan gambar-gambar yang berbeda sesuai dengan ruang koloni yang tampak. 30 Letakkan cawan-cawan Petri anda dalam posisi terbalik dalam keranjang yang telah disediakan untuk diInkubasi pada

Pindahkan secara Aseptik ketiga macam koloni

terpilih itu ke dalam tiga agar miring yang tersedia. Serahkan pada Asisten Anda untuk DiInkubasi dan sisimpan untuk keperluan yang akan datang. Amatilah diameter ( gunakan penggaris dan

nyatakan Ukuran tersebut dalam Milimeter), warna , elevasi, tepian , Konsistensi ( Konsistensi ditentukan dengan cara menyentuh koloni yang bersangkutan dengan jarum Inokulasi , jangan dengan tangan) , dan Bau setiap Macam koloni

31

Gambar 5.4 Ciri-ciri Koloni 32

Hasil Pengamatan

33

Percobaan 5
PERHITUNGAN JUMLAH SEL ( Sel Ragi atau Bakteri )
Tujuan Mempelajari cara menghitung jumlah sel Ragi atau sel Bakteri dengan Menggunakan metode Counting Chamber. II. Teori : Metode Noubauer dan Improved Noubauer Tiap daerah penghitung terdiri dari empat persegi yang sisinya 3 mm, sehingga luasnya = 9 mm2. Empat persegi ini dibagi menjadi 9 empat persegi kecil yang masing-masing mempunyai sisi 1 mm dengan luas 1 mm2. Bujur sangkar yang letaknya di tengah dibagi menjadi 25 bujur sangkar kecil yang sama Luasnya. Tiap bujur sangkar itu mempunyai sisi 1/5 mm dengan Luas = 1/25 mm2 .Selanjutnya tiap bujur sangkar ini dibagi lagi menjadi 16 bujur sangkar yang masing-masing mempunyai sisi 1/20 mm2 dengan Luas 1/400 mm2.Semua bujur sangkar dalam kamar hitung dalamnya = 1/10 mm.

34

Untuk menampung Kelebihan cairan maka di kedua sisi samping terdapat dua buah saluran yang dalam. Sebagai penutup ruang penghitung tersebut dilengkapi dengan kaca tipis . Jika di bawah kaca penutup dimasukkan setetes Suspensi ragi maka dengan mikroskop dapat dihitung jumlah sel Ragi tersebut dalam tiap-tiap ml dari suspensi. Pada Waktu meletakkan kaca tutup di atas ruang hitung,bagian bawah dari pinggir kaca penutup tak boleh basah, oleh karena dalam hal ini tinggi ruang hitung lebih besar dari 0,1 mm.

35

Lihat Gambar Berikut.

1/20 mm 1/5 mm

Tiap persegi kotak besar yang dibatasi garis ganda mempunyai sisi = 1 mm .Luasnya = 1 mm2, Volume tiap Kotaknya = 0,1 mm3. Tiap persegi dari kotak kecil yang dibatasi garis tunggal sisinya = 1/5 mm . Luasnya = 1/25 mm2 : volume tiap kotak = 1/250 mm3

36

III.

Prosedur Kerja Ambil satu butir ragi yang besar-besar dan kurang lebih sama besarnya suspensikan dengan 10 ml Aquadest Ambil 1 ml ( 2 tetes ) dari suspensi tersebut tambahkan 9 ml Aquadest sehingga sekarang pengenceran menjadi : 10 X 10 = 100 X kali gelas Obyek . Letakkan kaca Penutup pada bagian yang terdapat asahan kamar Hitung. Baik gelas obyek dan kaca penutup harus kering dan basah Letakkan kamar Hitung di bawah Mikroskop , tetesi bagian pinggirnya kiri kanan , kemudian Lihat Tetapkan secara Acak tiga kotak kecil yang akan dihitung jumlah selnya Hitung jumlah sel Ragi yang terdapat pada tiga kotak yang telah ditetapkan ( misal N sel) Hitung rata-rata jumlah sel tiap kotak dengan cara jumlah total sel terhitung dibagi 3 ( tiga) ( N/3 sel) Jumlah sel =N/3 sel per 1/250 mm3 Hitung jumlah sel Ragi yang anda Amati

37

Hasil Pengamatan

38

Percobaan 6
BIOKIMIA & HIDROLISA
Bagian Pertama : Uji Biokimia

I. Uji Oksidasi Fermentasi ( O F Test ) 1. Tujuan Mempelajari kemampuan mikroorganisme dalam katabolisme karbohidrat , apakah berlangsung secara Oksidatif atau Fermentatif 2. Teori Dalam uji ini digunakan tabung reaksi , masing-masing dalam Kondisi Aerobik dan Anaerobik untuk setiap jenis Mikroorganisme yang diuji. Indikator yang akan Digunakan adalah Brom Tymol Blue akan Memperlihatkan perubahan warna apabila terjadi perubahan PH kultur akibat terbentuknya asamasam Organik. Kemungkinan-kemungkinan yang akan terjadi dalam Pengamatan adalah Reaksi Oksidatif (O) atau Reaksi Fermentatif (F)

39

Bila terjadi Perubahan Warna indikator Tampak pada Tabung Aerob atau Anaerob.Bila kedua tabung tidak memperlihatkan warna Indikator , Mikroba tidak dapat Mengkatabolisme Karbohidrat. 3. Prosedur Kerja Panaskan Tabung-tabung reaksi

yang berisi 10 ml media Hugh dan Leifson steril dalam penangan air 1000C selama bebrapa menit. Inokulasikan satu Jenis mikroorganisme pada dua tabung reaksi dengan menggunakan Jarum Ose lurus sampai ke Dasar tabung Setelah Inokulasi , Tambahkan Kurang lebih 1 cm Parafin cair yang Steril ke dalam salah satu tabung . Tabung ini berfungsi sebagai Tabung Anaerob. Sediakan dua tabung Kontrol yang Inkubasikan semua Inokulum pada Amati perubahan yang terjadi berisi media steril yang kondisi Aerob dan Anaerob. 300C setelah 24 Jam dan 72 jam , Apabila belum terjadi perubahan , teruskan Inkubasi selama 1 minggu 40

II. Uji Katalase 1. Tujuan Mempelajari dimiliki atau tidaknya

enzim katalase pada suatu mikroorganisme 2. Prosedur Kerja Ambil sedikit biakan dari kultur

Logam )

agar miring dengan menggunakan pengaduk gelas ( bukan Suspensikan biakan tersebut pada

setetes larutan H2O2 3% pada gelas Obyek amati segera apabila timbul gelembung-gelembung gas sampai jangka waktu 5 menit setelah pencampuran dengan H2O2 Gelembung timbul Gelembung Uji Katalase Negatif : bila tidak Uji Katalase Positif : bila timbul

41

III. Uji Methyl Red Proskauer (MRVP) IV. 1. Prosedur Kerja Inokulasikan ke dalam dua tabung

reaksi yang berisi 5 ml media MRVP masing-masing sedikit biakan E.Coli dan Aerogenes suhu 370C selama 48 jam Naphtanol 5% KOH Merah menunjukkan test Positif 42 Terbentuknya warna Tambahkan 30 ml 40% Amati terbentuknya Asetil metil Tuangkan suspensi Tambahkan 3 ml Karbinol dengan cara sebagai berikut : biakan ke dalam tabung yang bersih Inokulasikan kedua tabung pada

Untuk Menguji terbentuknya Asam

Organik , Tambahkan beberapa tetes Indikator Methyl Red pada sisa Biakan .Warna Merah menunjukkan Test Positif , Sedangkan Warna Kuning menunjukkan test Negatif

Bagian Kedua : Hidrolisa I. Hidrolisa Kanji dan Kasein 1. Prosedur Kerja Membagi dua buah Petridish menjadi dua Mensterilkan Petridish ke dalam Autoclave Menuangkan media kanji agar 450 C ke

bagian yang sama besar dengan menggunakan Spidol. pada Suhu 1210C selama 15 menit dahulu 43 dalam masing-masing Petridish yang telah disterilkan terlebih

Membiarkan media menjadi padat

kemudian melakukan Inokulasi .Untuk Petridish Pertama, menginokulasi Bakteri Escheria Coli ( bagian kiri Petridish ) dan Bacillus Subtilis ( bagian Kanan Petridish ). Untuk Petridish kedua , menginokulasikan Bakteri E. Aerogenes ( bagian kiri Petridish ) dan S. Lactis ( bagian kanan Petridish ) Membungkus semua hasil inokulasi dengan kertas coklat dan menginkubasikannya di dalam Inkubator pada suhu 300selama 48 jam Media Casein Agar. Melakukan pengamatan dan uji Untuk Terhidrolisanya kanji: masingUntuk terhidrolisanya Casein : mengamati terhidrolisanya kanji dan Casein selama 48 jam masing biakan ditambahkan Larutan Iugol tetap Buram) II. Hidrolisa Gelatin 1. Prosedur kerja perubahan media di sekitar koloni Bakteri ( menjadi Jernih atau Untuk prosedure Hidrolisa casein , melakukan hal serupa hanya saja media yang digunakan adalah

44

 mengeringkannya.

Membersihkan Tabung Reaksi dan Mengisi semua Tabung dengan Media

Gelatin ( cair ) sampai kira-kira setengah tinggi tabung reaksi kemudian mensterilkannya . B.Subtilis. Menginokulasi hasil Inokulasi dalam Melakukan pengamatan dan uji Inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. terhidrolisanya Gelatin selama 48 jam dengan jalan mendinginkannya di dalam Freezer (0-40C) selama kurang lebih 10 menit Menginokulasikan bakteri untuk tabung pertama dengan bakteri E.Coli dan Tabung kedua dengan

III.

Hidrolisa Lemak 1. Alat dan Bahan 45

 2.

Biakan murni bakteri-bakteri dalam media Bacillus Subtilis Eschericia Coli Pseudomonas Flouresesnt Serratia Marcescens Medium Nutrient agak tegak . Minyak tumbuh-tumbuhan yang Steril. Larutan CuSO4 Jenuh Petridish Steril Pipet 1 cc Steril Prosedur Kerja Cairan Media Nutrien agar dan didinginkan Tambahkan 0,3 - 0,4 cc minyak tumbuh-

nutrien Cair umur 24 Jam.

sampai temperatur kurang lebih 500 C tumbuhan Steril secara Aseptik ke dalam Tabung Medium Nutrient Agar ,kemudian kocoklah sampai minyaknya Campur Homogen Tuangkan secara Aseptik campuran tersebut ke Inukulasi secara goresan , masing-masing 2 dalam Petridish dan Biakan , sampai menjadi Padat. Petridish dengan biakan murni B.Subtilis ,E.coli, P.Flourescens, S.Marcescens, dan 1 Petridih untuk Kontrol 46

Inkubasikan secara terbalik pada temperature

370C atau pada temperatur kamar , selama paling sedikit 3 hari ( biasanya 5-7 hari ). Setelah Inkubasi Tuangkan larutan CuSO4 jenuh Buang larutan CuSO4 yang masih ada di dalam Amati terjadinya warna Mengikat Kehijauan ke dalam Petridish kemudian diamkan selama 10 15 menit. Petridish.

Hasil Pengamatan
47

48

Percobaan 7
OLIGODINAMIK, ANTISEPTIK, dan ,DESINFEKTAN
I. Oligodinamik 1. Tujuan Menunjukkan pengaruh logam berat pada pertumbuhan mikroorganisme 2. Prosedur Kerja Bersihkan Logam ( Cu,Ag,Al) dengan larutan Keringkan dengan pemanas di atas nyala api. Letakkan Logam tersebut di tengah tengah Inokulasikan bakteri E.Coli pada media NB agar HNO3 10% kemudian cuci dengan air sampai bersih dari asam.

Petridish Steril yang bersuhu kurang lebih 450 C dan juga B.Subtilitis .Tuangkan NB agar tersebut dalam Petridish dan Biarkan dingin. Inkubasikan Pada suhu 370C selama 48 jam

49

3.

Pengamatan

Ukur diameter zona bebas bakteri dan diameter logam. Tentukan logam mana yang mempunyai Zona Bebas bakteri tersebut. II. Antiseptik dan Desinfektan 1. Tujuan Mempelajari Pengaruh Desinfektan terhadap pertumbuhan bakteri tersebut. 2. Prosedur Kerja kurang lebih 450 C . Inkulasikan bakteri E.Coli Tuangkan isi tabung A Celupkan 2 potong kertas pada tabung A , B.Subtilitis pada tabung B. dan B tersebut dalam Petridish dan biarkan dingin. saring berbentuk lingkaran ke dalam Desinfektan , angkat dan 50 Sediakan 2 buah Tabung Reaksi A dan B yang berisi media agar NB steril dan bersuhu

letakkan sebentar pada sehelai kertas saring untuk mencegah menetesnya kelebihan desinfektan. Letakkan masing-masing Inkubasikan selama 48 kertas saring ke dalam Cawan Petri A dan B. jam. 3. Pengamatan Pengamatan Oligodinamik. Lakukan sebagaimana

51

Hasil Pengamatan

52

Percobaan 8
FERMENTASI
I. ETANOL

1. Teori Etil Alkohol ( CH2CH3OH) sering disebut etanol banyak digunakan dalam Industri Kimia,Kosmetik ,Minuman Keras,atau dalam bidang Pengobatan sebagai bahan dasar, bahan Pelarut , dan lain-lain.Etanol dapat dihasilkan dengan cara fermentasi Mikrobial atau Silase Kimiawi. Produksi Etanol dengan fermentasi dapat menggunakan berbagai bahan baku antara lain gula bit, gula Tebu, sari buah ,molase, selulose, dan lain-lain.Produksi komersial secara fermentasi didasarkan pada pengubahan karbohidrat menjadi bahan Organik yang lebih sederhana dengan bantuan Enzim yang dihasilkan oleh Khamir . Fermentasi Etanol berlangsung secara Anaerob.Secara Teoritis dari setiap molekul Sukrosa akan diperoleh empat molekul Etanol dan empat molekul Karbon Dioksida. Pada kenyataannya hasil ini tidak tercapai karena ada efek samping. Dalam Fermentasi Etanol, beberapa Species Khamir dapat digunakan.Organisme-organisme penting yang digunakan meliputi Saccharomyces Cerevisiae, S.Uvarium , Schizosaccharomyces Pombe dan kluyvromyces.Sp 53

2.Alat dan Bahan 3. Erlenmeyer Botol Fermentasi Statif dan Klem Holder Selang Plastik Pupuk ZA Pupuk NPK H2SO4 Air Kapur Tetes Tebu Saccharomyces Cerevisiae

Prosedur Kerja a. Pembuatan Starter

Mencampur tetes dengan air dengan Perbandingan 1 : 4 dalam Labu Erlenmeyyer 250 ml Memanaskan campuran di atas dengan memanaskan air pada suhu 800C selama 10 menit dan mendinginkannya sampai hangat-hangat kuku. Menambahkan 0,3 gram pupuk ZA dan 0.08 gram NPK , Kemudian mengocoknya sampai Larut. Mengatur derajat keasaman sehingga 4,8 dengan menambahkan H2SO4 54

Menginokulasikan Saccharomyces Cerevisiae secara Aseptik Menyumbat Erlenmeyyer dengan kapas dan Menginkubasikan selama dua hari.

b. Fermentasi Membuat campuran tetes dengan air dengan Menambahkan 2,4 Gram ZA dan 0,64 gram NPK , Menambahkan H2SO4 untuk mengatur PH Mencampur larutan ini dengan starter Menyumbat mulut Erlmenyyer dengan penutup

Perbandingan 1 : 4 dalam Labu Erlenmeyyer 1 liter. kemudian Mengocoknya sampai larut. sehingga 4,5 4,8.

karet yang telah diberi dengan selang Plastik dan mencelupka ujung selang pada air kapur untuk mempertahankan keadaan anaerob. Terbentuknya gelembung-gelembung udara menunjukkan proses Fermentasi pembentukan Etanol sedang berlangsung. Menginkubasikan selama 7 hari. Diamati Kadar Alkoholnya ( dengan Conway ) dan

kadar Glukosa dan Kurva pertumbuhan

55

II.

YOGHURT Prosedur Kerja Panaskan 500 ml susu

segar pada suhu kuranglebih 900 C di atas api kecil sehingga Volumenya menjadi 400 ml (tergantung dari kekentalan yang didinginkan) sambil melakukan pengadukan. demi sedikit diaduk supaya tidak larut. starter Yogrt jadi dan diaduk merata. Campuran dimasukkan ke dalam erlenmeyyer steril yang telah disediakan, kemudian ditutup dan diinkubasikan pada suhu 410 - 450C selama 4 jam. dan diamati (PH ,Rasa,Mikrobanya) Setelah itu didinginkan Susu kemudian didinginkansampai suhu mencapai 450 C lalu ditambah 5% Sebelum Penguapan susu segar ditambah dengan susu Krim dengan cara sedikit

56

III. ASAM ASETAT Prosedur Kerja

1. Memasukkan ke dalam 2 Beaker Glass masing-masing 500 ml Tuak untuk diinkubasikan secara Aerasi ( tidak tertutup). 2. Menambahkan Fermipan pada Salah satu gelas berisi Tuak. 3. Menginkubasikan selama satu minggu. 4. Mengamati bakteri yang ada dalam Larutan dengan Mikroskop. 5. Mengambil Tuak yang diberi asam cuka baik yang diberi Fermipan atau tidak masing-masing 5 ml dan memasukkannya ke dalam Erlenmeyyer. 6. Menambahkan Indikator P dalam Larutan kemudian Titrasi dengan Larutan NaOH . 7. Mencatat Volume NaOH yang Diperlukan. 8. Mengulangi langkah 5 7 sebanyak 3 kali . 57

9. menghitung Kosentrasi Asam Asetat dan buat Grafik antara waktu dan kosentrasi Asam Asetat untuk masing-masing Beaker Gelas. Pengamatan dilakukan setiap 2 hari selama 2 minggu pada saat Inkubasi.

IV.

PEMBUATAN TEMPE A. usus. B. Untuk mengetahui bahwa Sacarifikasi dapat Alat dan Bahan Petridish Penggerus Porselin Besek Kantong Plastik Daun Pisang Kedelai 58 berjalan secara serentak. Tujuan Untuk mengetahui bahwa jamur dapat mefermentasikan suatu bahan sehingga mudah dicerna oleh

 C.

Jamur Tempe Prosedur Kerja Merebus kedelai sebanyak 25 mg sehingga Mencuci kedelai dengan air dingin lalu Merebus kedelai sampai matang dan Membuat jamur tempe dengan cara Menginokulasi kedelai dengan jamur Menyimpan hasil Inokulasi ke dalam: Kantung Plastik Tertutup Kantung Plastik Berlubang Daun Pisang tertutup Daun Pisang Berlubang

kulitnya mudah mengelupas. mengupas kulitnya sampai bersih. didinginkan sampai kering. mengeringkan tempe sampai kering lalu dihaluskan. Tempe sebanyak 5 Gram , dicampur sampai merata

Petridish tertutup Petridish terbuka Pengamatan dilakukan selama 3 hari Amati bentuk Rhizopus dan gambaramati Bandingkan berbagai hasil fermentasi 59

kenampakan dari hasil tempe dan percobaan. dengan berbagai cara penyimpanan.

Hasil Pengamatan

60

Percobaan 9
PEMBUATAN MEDIA
I. Guna media Untuk hidup dan tumbuhnya Mikroorganisme Untuk memberi persediaan makanan pada mikroorganisme Untuk membedakan Mikroorganisme itu sendiri. II. Persyaratan Media Tidak terlalu Asam dan tidak terlalu Basa , Mengandung macam-macam Nutrient

mempunyai Reaksi yang sesuai. yang diperlukan oleh Mikroorganisme untuk pertumbuhannya dan Jumlahnya sesuai. Harus Disterilkan terlebih dahulu sebelum ditumbuhkan Mikroorganisme.

61

III. a.

Prosedur Kerja Media Cair

1,2 Nutrient Broth dilarutkan dalam 150 ml aquades . Masukkan dalam tabung reaksi yang bersih masing-masing sebanyak 10 ml. Tutup dengan Kapas berlemak, Sterilkan dalam Autoclave pada suhu 1210 C ,selam 15 menit (semua tabung reaksi dimasukkan dalam Beaker Glass dan diatasnya ditutup Kertas) b. Media Padat 1,2 Nutrient Broth dilarutkan dalam 150 ml Aquades , ditambahkan agar-agar sebanyak 76 gr. Didihkan hingga semua agaragar larut , masukkan dalam Petridish atau tabung reaksi yang bersih masing-masing sebanyak 10 ml. Sterilkan dalam Autoclave pada suhu 1210C, selama 15 menit. ( semua tabung reaksi dimasukkan dalam Beaker Glass dan diatasnya ditutup Kertas ). A. Hugh Liefson ( media uji Oksida-Fermentasi ) Bahan Aquadest Pepton Agar Batang Glukosa NaCL : 1000 ml : 2 gram : 6 gram : 10 gram : 5 gram 62

 Pembuatan

KH2PO4

: 0,3 gram : Secukupnya

Brom Thymol Blue(BTB)

Panaskan Aquadest pada ot Plate Stirrer,

setelah cukup panas masukkan bahan satu persatu ( keculai agar dan Indikator ) , aduk hingga rata. Potong Agar menjadi bagian kecil agar Panaskan Hingga bercampur homogen, Atur kondisi media hingga PH = 7 Tutup dengan kertas mengkilap dan lebih cepat meleleh dan masukkan ke campuran. kemudian masukkan Indikator

simpan di tempat dingin B. Media MVRP ( Uji Asetil Metil Karbinol dan Asam Organik) Bahan Aquadest KH2PO4 Pepton Glukosa : 200cc : 0,3 gram : 1,4 gram : 1 gram

63

Pembuatan hingga rata. Homogen. simpan di tempat dingin. C. Media Kanji Agar Bahan Aquadest NB Agar Batang Glukosa : 1000 cc : 8 gram : 12 gram : 3 gram Atur kondisi media hingga PH = 7 Tutup dengan kertas mengkilap dan Panaskan Hingga media bercampur Panaskan Aquadest pada ot Plate Stirrer, setelah cukup panas masukkan bahan satu persatu, aduk

Tepung Kanji: 10 gram 64

Pembuatan Kanji , aduk hingga rata. Potong menjadi bagian kecil agar Panaskan Hingga media Bercampur Atur kondisi media hingga PH = 7 Tutup dengan kertas mengilap dan lebih cepat meleleh dan masukkan ke campuran. Homogen Panaskan Aquadest pada Hot Plate Stirrer, setelah cukup Panas masukkan NB, Glukosa dan tepung

simpan di tempat yang dingin. D. Media Gelatin E. Bahan Pembuatan Aquadest NB Gelatin Glukosa : 1000 cc : 8 gram : 10 gram : 3 gram

65

 Gelatin, Aduk hingga rata.

Panaskan Aquadest pada Hot Plate

Strirrer, setelah cukup panas masukkan NB , Glukosa dan Potong menjadi bagian kecil agar Panaskan Hingga media Bercampur Tutup dengan kertas mengilap dan

lebih cepat meleleh dan masukkan ke campuran. Homogen simpan di tempat yang dingin F. Media Kasein Bahan Aquadest NB Agar Batang Glukosa Susu Krim : 1000 cc : 8 gram : 12 gram : 3 gram : 15 gram

Pembuatan Hingga rata. 66 Panaskan Aquadest pada Hot Plate Stirrer, setelah cukup Panas masukkan NB, Glukosa ,dan Aduk

 Homogen. simpan di tempat dingin

Panaskan Hingga Media bercampur Tutup dengan kertas mengkilap dan

67

Hasil Pengamatan

68