-1-

Service de Protomie et de Biochimie des protines

Travaux pratiques de Biochimie

Professeur : R.Wattiez Assistante : C. Rosier

2 Bac Biologie 2 Bac Chimie

-2-

Dosage des protines

-3-

Le dosage des protines :

Intrts du dosage :
Il est souvent ncessaire de connatre la concentration totale de lensemble des protines contenues dans un chantillon, par exemple pour suivre les diffrentes tapes dune purification. Pour ce faire, on cherche mesurer stoechiomtriquement lensemble des protines contenues dans cet chantillon. Les critres importants pour une bonne technique de dosage des protines sont : Le seuil de dtection trs faible La spcificit importante La facilit de mise en uvre La rapidit Le cot peu lev

Lensemble des techniques de dosage protique repose sur lutilisation des proprits physiques et chimiques intrinsques des protines. Citons parmis les plus rpandues : 1. Folin (O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Far rand R.J. Randall (1951). J. Biol. Chem. 193, 265). 2. Absorption U.V. (J. Janin, (1985) Spectroscopie dabsorption. Collection Mthodes, Hermann, 125-135). 3. Bradford (M.M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254). 4. Raction de la fluorescamine avec les amines primaires. (S. Udenfried. (1978) Science 1978, 871-872). Diffrentes mthodes utilises pour le dosage des protines :

-4-

1) Absorption U.V. :
Les mesures dabsorption dun compos en solution aqueuse sont limites lultraviolet ou la partie visible du spectre, zone o le solvant nabsorbe pas ou trs peu. Les molcules qui absorbent dans ces longueurs donde sont appeles chromophores. Ce sont principalement les molcules comportant des noyaux aromatiques ou des doubles liaisons conjugues. Dans le cas des protines, les chromophores sont les rsidus dacides amins aromatiques (TRP, TYR : absorption 280nm) et les liaisons peptidiques (absorption 230nm). Labsorption dun chromophore une longueur donde donne () dpend de sa nature, de sa concentration et de la longueur du trajet optique. Cest ce qui est reprsent par la relation de BeerLambert :

A = LC
O A est labsorption du chromophore la longueur donde , reprsente le coefficient dextinction molaire (mg-1.ml.cm-1), L est la longueur du trajet optique dans la cuvette de mesure (cm) et C est la concentration du chromophore (mg.ml-1). Au vu de cette relation, il est ais dimaginer une mthode de dosage des protines dun chantillon par mesure de son absorption une longueur donde donne. Afin dobtenir une sensibilit maximale, il est prfrable de choisir une longueur donde correspondant un pic dabsorption. Les protines montrent un maximum dabsorption ultraviolette 280nm. La mesure de labsorbance 280nm peut tre utilise comme moyen destimer la concentration totale en protine ; toutefois labsorbance dpend du contenu des protines en deux acides amins seulement, et peut donc varier considrablement dune protine lautre. Dune manire gnrale, lavantage de la technique dabsorption UV pour le dosage du contenu total en protines dun chantillon est que cette technique est non destructive. Nanmoins, la prsence de substances non protiques (autres que les acides nucliques) qui absorbent dans lUV peut invalids la technique.

-5-

2) Folin (ractions chimiques)

En 1927, Folin et Colciateu mirent au point la raction qui porte aujourdhui leur nom et qui est la base dune des mthodes de titration des protines les plus utilises. Lacide phosphomolybdo-tungstique (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O et 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O) est le constituant actif du ractif de Folin. La prsence dune protine entrane sa rduction par perte dun trois atomes doxygne. La fixation de cuivre par chlation faciliterait le transfert dlectrons vers lacide mixte. On obtient ainsi plusieurs espces rduites possdant une couleur caractristique (absorption maximale 745750nm). 3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O 3H2O.P2O5.14WO3.4MoO3.10H2O

Espces rduites colores (bleues) max = 745-750nm

Le mlange dacides mixtes phosphomolybdo-tungstiques est rduit par une raction rapide avec des rsidus dacides amins aromatiques (TYR et TRP) et par une raction plus lente avec les complexes cuivre-liaisons peptidiques et/ou cuivre-chanes latrales polaires.

3) Raction de la fluorescamine avec les amines primaires (fixation covalente sur la protine)
Il est possible dutiliser la ractivit de certains groupements dune protine pour y greffer des molcules de type chromophore ou fluorophore. La fluorescamine en est un exemple. Cette molcule se fixe sur les amines primaires. A ltat libre, elle nest pas fluorescente. Trs rapidement pH 9, on obtient un produit de couplage fluorescent entre lamine primaire et la fluorescamine. Cette raction se droule en parallle avec une raction de dgradation de la fluorescamine, plus lente, produisant des composs non fluorescents. On mesure la fluorescence une longueur donde dmission de 475nm conscutive une excitation 390nm. Il est alors possible de dtecter 0.5g de protines (10 fois plus sensible que la mthode de Folin).

-6-

Lintensit de fluorescence reflte la quantit de fluorescamine couple, c'est--dire la quantit damine primaire. Bien que trs sensible, cette technique est plus variable que les mthodes vues prcdemment puisque la fluorescence est principalement due un seul acide amin seulement (LYS). De plus, cette mthode nest pas absolument spcifique des protines et ne doit donc tre utilise que pour le dosage des protines dbarrasses de toute contamination par des amines primaires (peptides, acides amins, tampon tris, Glycine.).

4) Bradford (fixation non covalente dune colorant)

Certaines molcules ont une affinit pour les protines et peuvent donc sy fixer plus ou moins fortement. Dans le cas o le spectre dabsorption de ces molcules est modifi par la fixation (avec ou sans traitement ultrieur) ou quand une forme ayant un spectre caractristique se fixe seule (quilibre dplac vers cette forme), il est possible de les utiliser pour doser les protines en solution. Lexemple le plus courant est certainement la mthode de Bradford qui utilise la fixation du bleu de Coomassie sur les protines. Ce colorant existe sous trois formes diffrentes (anionique, neutre, cationique) ayant chacune un spectre dabsorption caractristique. Cest la forme anionique qui interagit (de manire non covalente) prfrentiellement avec les protines. La fixation du bleu de Coomassie se ralise si la molcule valuer comporte des groupements fonctionnels basiques et/ou aromatiques.

-7-

Cette mthode est donc base sur l'adsorption dun colorant, le bleu de Coomassie G250 aux protines. Cette mthode est trs sensible (2-5 g de protines) et trs rapide. Elle est aussi assez rsistante la plupart des interfrents qui nuisent la plupart des autres mthodes. Seuls les dtergents, comme le Triton et le dodcyl sulfate de Na (SDS), et des bases fortes interfrent avec celle-ci.

5) Conclusions :
Il existe de nombreuses mthodes de dosage des protines, comportant souvent un certain nombre de variantes. Le choix dune mthode de dosage dpendra avant tout de la quantit de protines doser, des interfrences possibles avec des contaminants non protiques puis de la facilit de mise en uvre, de la rapidit de la rponse souvent importante en cours de procd, ainsi que des conditions de dosage.

-8-

Manipulations exprimentales :
But : Au cours de ces travaux pratiques, vous dterminerez la concentration en protines totale dune solution dilue de blanc duf. Pour ce faire, vous utiliserez les techniques dabsorption UV et de Bradford.

1) Absorption UV : - Mesurer labsorbance 280nm dune solution stock dalbumine bovine afin den calculer la concentration protique exacte. (280nm BSA = 0.66 ) (Concentration thorique de 1mg/ml). - Raliser un spectre dabsorption dans lUV dune solution de blanc doeuf dilue entre 250 et 350nm. 2) Mthode Bradford : Une solution stock de colorant a t prpare. Celle-ci contient 1g de bleu de Coomassie G250 dissout dans 200ml dacide phosphorique 88% et 100ml dthanol 95%. A partir de cette solution, prparer le ractif colorant. Pour ce faire, additionner 30ml de solution stock, 80ml dacide phosphorique 88% et 40ml dthanol 95%, amener 600ml avec de leau distille. Diluer cette solution 2X puis la filtrer sur papier Wathman N1. Une solution stock dalbumine bovine 1mg/ml a t prpare. Cette solution vous permettra de tracer une courbe dtalonnage. Prparer une solution de NaCl 0,9% ncessaire la ralisation des diffrentes dilutions de blanc duf. Manipulation : Dans un premier temps, vous effectuerez une courbe dtalonnage donnant labsorbance du ractif colorant en fonction de la concentration de protine standard, ici lalbumine bovine. Pour cela : Prparer trois sries de tubes numrots de 1 6 Pipeter les quantits de la solution dalbumine bovine indiques dans le tableau ciaprs Amener le volume, dans chaque tube, 100l laide deau distille Additionner 4ml de ractif colorant chaque tube et bien homogniser laide du vortex Aprs 5 minutes et avant 1 heure, mesurer labsorbance 595nm par rapport de leau distille Tracer la courbe dtalonnage, c'est--dire labsorbance 595nm en fonction de la quantit dalbumine bovine (g)

-9-

Tube n 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6

Albumine 1mg/ml (l) -

Eau distille (l) 100

Colorant (ml) 4

Albumine Concentration finale (g)

D.O. 595nm

D.O. 595nm blanc

10

90

20

80

50

50

80

20

100

La concentration finale dalbumine dans chaque tube peut tre calcule prcisment partir de la concentration relle de la solution stock dalbumine calcule pralablement par la loi de Beer-Lambert. Dans un second temps, vous allez dterminer la concentration en protines du blanc duf, partir de la droite dtalonnage. Pour cela : Raliser plusieurs dilutions de blanc doeuf (10X, 100X, 500X, 1000X) dans une solution de NaCl 0,9% Numroter ensuite 2 tubes pour chacune des dilutions ralises Placer dans ceux-ci, 100l de la dilution adquate de blanc duf Additionner 4ml de ractif colorant chaque tube et bien homogniser laide du vortex Aprs 5 minutes et avant 1 heure, mesurer labsorbance 595nm par rapport de leau distille A partir de la courbe talon, dterminer la concentration protique du blanc duf.

- 10 Blanc duf dilu (l) 100 100 100 100 D.O. 595nm blanc Concentration protique (g)

Tube n Blanc Blanc 10X 10X 100X 100X 500X 500X 1000X 1000X

NaCl 0,9% (l) 100 -

Colorant (ml) 4 4 4 4 4

D.O. 595nm

- 11 -

Electrophorse sur gel de polyacrylamide

- 12 -

Llectrophorse sur gel de polyacrylamide :

Introduction :
La technique dlectrophorse repose sur le dplacement (et la sparation) de particules charges dans un champ lectrique. La vitesse de dplacement dun ion (mobilit), sous linfluence dun champ lectrique, dpend dune part de la charge de lion et dautre part des forces de viscosit qui ralentissent son mouvement dans le solvant (friction). On a : mobilit dune molcule = (champ appliqu * charge de la molcule)/(friction de la molcule)

Soit : V=qE/f avec q : charge de la particule ; E : champ lectrique ; f : coefficient de frottement entre les particules et le solvant. Dans le cas des protines, la charge est due essentiellement aux groupements fonctionnels des chanes latrales (lysine, arginine, histidine, acides aspartiques et glutamiques, cystine et tyrosine). La charge porte par ces acides amins dpend du pH et de la constante dionisation des groupes fonctionnels. La technique dlectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence de Sodium Dodcyl Sulfate (SDS) permet de sparer les protines par rapport leur masse molculaire. On parle alors de SDS-PAGE pour SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (voir plus bas).

Electrophorses sur gel de polyacrylamide en prsence de dnaturant : le dodcyl sulfate de sodium (SDS) :
Le SDS est un dtergent dont la formule est : CH3-(CH2)11-OSO3-Na+ Comme toutes les substances amphiphiles, le SDS est constitu dune tte polaire (-) et dune queue hydrophobe. Ce dtergent sadsorbe, grce sa chane aliphatique, sur les protines et les dnature compltement. 1.4gr de SDS se lie par gramme de protine, soit une molcule de SDS pour 2 acides amins. La portion protique du complexe protine-SDS ainsi obtenu subit un changement de conformation conduisant un haut degr dordre : le complexe (charg ngativement) prend la forme dun btonnet. Ce qui permet une sparation des protines dans un champ lectrique en fonction exclusivement de leur masse molculaire.

- 13 -

Cette mthode permet de dterminer rapidement la masse molculaire des protines, celles-ci ayant une migration lectrophortique inversement proportionnelle au logarithme de leur masse molculaire.

Le gel de polyacrylamide :
Le rseau de polyacrylamide est form par la polymrisation de monomre d'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) (acryl) en prsence de bis acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2) (NN'mthylne-bisacrylamide). Le bis acrylamide, appel aussi Bis, est l'quivalent de 2 monomres d'acrylamide lis par un groupement mthyl et est utilis comme agent pontant.

Figure 1 : formules des monomres L'acrylamide polymrise en longue chane incorporant des molcules de bis acrylamide au sein du polymre ainsi form. La polymrisation de l'acrylamide est un exemple de catalyse par radicaux libres (polymrisation vinylique), initie par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED (NNN'N'-ttramthylthylnediamine), le TEMED catalysant la dcomposition des ions persulfates pour donner des radicaux libres.

Figure 2 : initiation de la polymrisation Si on reprsente ce radical R et M un monomre d'acrylamide, on peut alors reprsenter la polymrisation ainsi :

- 14 -

Figure 3 : raction de polymrisation

Figure 4 : structure molculaire du gel Remarque : Loxygne, molcule qui peut se transformer en radical libre, interfre avec ce processus de polymrisation. On obtient ainsi un rseau, dont les mailles sont de tailles variables en fonction des proportions dacrylamide et de bisacrylamide utilises ; le gel obtenu se comporte donc comme un tamis molculaire (les macromolcules migrent dautant moins vite quelles sont volumineuses).

- 15 -

Champ lectrique

Plus prcisment, quelles sont les caractristiques gnrales dun gel lectrophorse SDS-PAGE et comment se droule la migration des protines dans celui-ci ?
Caractristiques gnrales : Un gel SDS-PAGE comprend deux parties distinctes : le gel de concentration dune part et le gel de sparation dautre part. Le passage de l'une l'autre se fait avec un changement de pH et une augmentation de la concentration en acrylamide dun gel lautre. L'objectif du gel d'lectrophorse en deux parties est de pallier aux problmes lis aux faibles quantits de protines et aux volumes parfois non ngligeables dposs dans les puits. On ralise donc une tape de concentration des chantillons jusqu' l'obtention de zones protiques trs fines dans le gel de concentration (stacking gel), qui migreront ensuite dans le gel de sparation (resolving gel).

Caractristiques molculaires : Un gel SDS-PAGE typique comprend 2 parties distinctes : gel de concentration et gel de sparation. Le taux de rticulation de ces gels, qui correspond la porosit du gel, dpend des quantits d'acrylamide et de bis acrylamide. Le gel de concentration est de 4%, le gel de sparation varie entre 5 et 20 % suivant la taille des protines que l'on veut sparer. Masse molculaire (KDa) 10 - 40 40 - 100 100 - 300 300 - 500 % d'acrylamide 15 - 20 10 - 15 5 - 10 5

- 16 Phnomne disotachophorse, principe de la concentration : Le gel de concentration a pour but de concentrer les chantillons dposs. Llectrophorse se droule dans un tampon Tris-Glycine contenant du SDS (TGS). A pH 6.8 du gel de concentration, les ions glycinates ont une faible mobilit compars celles des protines. Par contre, les ions chlorures contenus dans le gel ont une mobilit plus importante (ions pilotes). Ceci induit la formation de 2 limites mobiles : une entre l'ion d'arrire garde et le complexe SDS-protines et une entre SDS-protines et l'ion pilote. Les complexes protines-SDS vont donc se concentrer entre les ions chlorures et les ions glycinates. Au niveau de linterface du gel de concentration et de sparation, des changements drastiques vont soprer. Ces changements se font sur deux niveaux : Le gel de sparation est plus rticul que le gel de concentration. Celui-ci sert ds lors de tamis molculaire. Le gel de sparation a un pH diffrent, il est basique (pH=8.8, le gel de concentration tant 6.8) cette modification de pH ne modifie pas la mobilit des protines mais augmente la mobilit des ions glycinates compltement ioniss ce pH.

Figure 8 : vitesse des diffrents composs ioniques

Les vitesses de migration indiques dans le tableau de la figure 8 sont celles des diffrents acteurs de l'lectrophorse, ce sont en fait les vitesses au niveau des protines si ces ions taient seuls.

- 17 Au terme de llectrophorse, lorsque le bleu de bromophnol contenu dans les chantillons atteint le bas du gel, le gel est color afin de faire apparatre les protines ainsi spares. Diffrents types de coloration existent, parmis les plus courantes, la coloration au bleu de coomassie ou la coloration largent. Lintensit des diffrentes bandes protiques reflte partiellement leur abondance dans lchantillon et la position/migration reflte la masse molculaire relative de chaque protine. Cette masse molculaire est compare des talons calibrs en unit de masse protique (Dalton, Da). La mesure des distances de migration parcourue par les protines de rfrence permet de tracer une droite talon reprsentant le logarithme du poids molculaire de celles-ci en fonction de leur mobilit, on obtient ainsi une droite de pente ngative, les petites protines migrant plus bas que les grosses. Pour dterminer la masse molculaire dune protine donne, il suffit ds lors de rapporter la distance de migration observe pour celle-ci sur la droite dtalonnage.

- 18 -

Exprimentations :
1. But : Le but de cette manipulation est de dterminer la masse molculaire de protines inconnues laide dune lectrophorse sur gel de polyacrylamide en prsence de SDS et de dterminer si celle-ci est constitue de plusieurs sous units relies par des ponts disulfures. a) pour cela, vous tablirez un talonnage du gel laide dun mlange protique constitu de diffrents rfrents dont les masses respectives sont connues (250kDa, 150kDa, 100kDa, 75kDa, 50kDa, 37kDa, 25kDa, 20kDa, 15kDa, 10kDa). b) A partir de cette droite dtalonnage, vous dterminerez la masse molculaire des protines inconnues. 2. Prparation des gels : Les gels que vous allez prparer sont constitus de deux parties distinctes : un gel dit de concentration et un gel dit de sparation . Comme le nom lindique, le gel de concentration a pour effet de concentrer les diffrents chantillons de faon augmenter la rsolution de sparation lectrophortique. Le gel de sparation est utilis pour sparer les diffrents constituants des chantillons en fonction de leur masse. Ces deux gels diffrent par leur concentration en acrylamide, leur pH et leur concentration en ions. gel de sparation : (0.375mM Tris-HCl, pH 8.8)
7% Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 1.5mM pH 8.8 (ml) Persulfate (l) Temed (l) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml) 2.331 5.014 2.5 7.5 % 2.4975 4.8475 2.5 8% 2.664 4.681 2.5 9% 2.997 4.348 2.5 10 % 3.33 4.02 2.5 11 % 3.66 3.68 2.5 12 % 4 3.35 2.5 13 % 4.33 3.02 2.5 14 % 4.66 2.68 2.5 15 % 5 2.35 2.5

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

50 5 0.1 10

- Mlanger les diffrentes solutions correspondant au gel de sparation 12% (cf. Tableau cidessus) dans 1 petit erlenmeyer. - Bien homogniser. Ds ce moment, il faut procder trs rapidement pour couler la solution ainsi prpare entre deux plaques de verre. - Avant que les gels ne polymrisent, dposer sur leur sommet, trs prudemment, quelques gouttes de butanol.

- 19 - Les gels sont polymriss aprs 40 minutes environ. Avant leur emploi, liminer la couche de butanol en les rinant avec de leau distille. Couler de la mme manire, le gel de concentration. Avant polymrisation du gel, placer le peigne en vitant la formation de bulle. Ce peigne a pour but de former des crneaux : endroits o se dposeront les diffrents chantillons. gel de concentration : (0.125mM Tris-HCl, pH 6.8)
4% 1.33 6.02 2.5 50 10 0.1 10

Acryl/Bis (ml) Eau (ml) Tris-HCl 0.5mM pH 6.8 (ml) Persulfate (l) Temed (l) SDS (ml) Volume total pour 2 mini gels (ml)

3. Prparation des chantillons : Prparer les tubes eppendorfs suivants : - chantillon inconnu n1 + tampon chantillon sans rducteur - chantillon inconnu n1 + tampon chantillon avec rducteur - chantillon inconnu n2 + tampon chantillon sans rducteurs - chantillon inconnu n2 + tampon chantillon avec rducteurs Remarque : composition du tampon chantillon (concentr 4X)
Eau distille Tris-HCl 0.5mM pH 6.8 glycrol SDS 0.05% bleu de bromophnol Rducteurs : Mercaptothanol 3 ml 15 ml 12 ml 1.2 g Quelques grains 12 l

4. Electrophorse :

- 20 -

- Recouvrir dans lappareil, les gels laide du tampon dlectrophorse (Tris-HCl 2.5mM pH 8.3, glycine 19.2mM, SDS 0.01% (w/v). Eliminer soigneusement toutes les bulles dair ventuelles. - Remplir les deux compartiments de lappareil laide du mme tampon. - Dposer, TRES PRUDEMMENT, les chantillons au sommet des gels. - Raccorder les lectrodes au gnrateur. - Raliser llectrophorse sous courant constant de 20mA/gel. Dans ces conditions, le colorant de rfrence (contenu dans le tampon chantillon) parcourt les du gel en 1 heure environ. Aprs llectrophorse, retirer les gels. Attention, ces gels sont hautement fragiles et cassent facilement. En consquence, les manipuler avec prudence. 5. Coloration et dcoloration : solution de coloration :

Bleu de coomassie R-250 Mthanol Acide actique Eau distille

60 mg 100 ml 17.5 ml 132.5 ml

Les gels sont recouverts de solution colorante pendant 1 heure. - Mesurer la longueur du gel

- 21 - Dnombrer le nombre de bandes protiques constituant lchantillon de rfrence (marqueur de masse molculaire), ainsi que les diffrents chantillons et mesurer leur migration relative (Mr) dfinie par la relation suivante : Mr = (P/l) * (L/C) P = distance parcourue par la protine (mm) l = longueur du gel aprs dcoloration (mm) L = longueur du gel avant dcoloration (mm) C = distance parcourue par le colorant de rfrence (mm)

- Porter en graphique le logarithme de la masse molculaire (pour les rfrents) en fonction de leur migration relative. Tracer la meilleure droite passant par ces points. - Dduire partir de ce graphique, la masse molculaire des protines inconnues et dterminer si celles-ci sont constitues de plusieurs sous units. Si oui, dterminer la masse molculaire de chacune des diffrentes sous units. Aprs coloration, les gels sont retirs de la solution colorante, rincs leau distille, puis placs dans une solution de dcoloration. Les laisser dans cette solution jusqu dcoloration complte (en dehors des zones protiques). solution de dcoloration :
Mthanol Acide actique Eau distille 125 ml 12.5 ml 112.5 ml

- 22 -

Purification des protines

Purification des protines :
Sparation des protines par filtration molculaire : Parmi toutes les mthodes chromatographiques permettant la purification des protines, la filtration molculaire sur gel (ou chromatographie dexclusion) occupe une place dterminante. Principe de la filtration molculaire : La filtration molculaire sur gel est un procd qui permet de sparer des molcules en fonction de leur taille (masse). Les gels utiliss sont constitus de particules insolubles mais solvates (se prsentant sous formes de perle) formant un rseau tridimensionnel. Le degr de rticulation dtermine les

- 23 dimensions des mailles du rseau et par consquent laccessibilit de ce dernier aux molcules de soluts que lon souhaite sparer.

Elution

Le principe de la filtration molculaire sur gel est bas sur la capacit des molcules pntrer dans les pores de la phase stationnaire constitue par le gel. Une substance dissoute dans un solvant, est applique sur une colonne contenant un gel : ses molcules se distribuent dabord librement dans la phase mobile (solvant), si elles sont suffisamment petites pour avoir accs aux pores du gel, il stablit un quilibre entre les deux phases (phase mobile et phase stationnaire). Les molcules situes dans le gel ne sont plus entranes par le flux et sont retardes. Ce phnomne dquilibre, rpt tout au long de la colonne, explique laction de tamis molculaire. Les molcules sont donc lues dans lordre des masses molculaires dcroissant. De manire gnrale : - Les molcules de taille suprieure celle des pores des billes sont totalement exclues du gel et ne se rpartissent que dans le volume extrieur aux billes, c'est--dire dans la phase mobile (solvant). Elles sortent les premires, un volume d'lution Vo appel volume mort de la colonne. - Les molcules de taille infrieure celle des pores des billes peuvent pntrer librement dans les billes et se rpartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide l'intrieur des billes (phase stationnaire) + volume de liquide l'extrieur des billes (phase mobile)). Elles sortent donc les dernires, un volume d'lution Vt ou volume total des liquides de la colonne. - Les molcules de taille intermdiaire pntrent dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme; elles pntrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont lues dans l'ordre des masses molaires dcroissantes. Chaque type de molcule sera caractris, pour un gel de rticulation donne, par un coefficient de distribution Kd. Le volume total (V) dune colonne comportant du gel est gal la somme du volume de tampon extrieur aux grains de gel (V0), du volume lintrieur des grains de gel (Vi) et du volume du gel lui-mme (Vg) :

- 24 -

V = Vo + Vi + Vg Vo est galement appel volume mort. Il correspond au volume de liquide ncessaire pour luer une substance travers une colonne quand les molcules sont compltement exclues du gel. Vi peut tre calcul partir du poids sec du gel (a) et du coefficient de rtention deau (Wr) : Vi = a x Wr Le volume dlution dune substance (Ve) dpend du volume extrieur au gel (Vo) et du coefficient de distribution Kd : Ve = Vo + Kd x Vi Donc Kd = (Ve-Vo)/Vi = (Ve-Vo)/(axWr) Pour les grosses molcules qui ne peuvent pntrer dans la phase stationnaire : Kd = 0 (molcules totalement exclues du gel). Pour les petites molcules qui pntrent totalement : Kd = 1 (diffusion libre dans la phase stationnaire).

Deux substances de masses molculaires diffrentes auront, vis--vis dun type de gel dtermin, des coefficients de distribution Kd et Kd". Les volumes dlution de ces deux substances diffreront dune quantit Vs dfinie par lquation : Vs = Ve-Ve" = (Vo + Kd x Vi) - (Vo + Kd" x Vi) Vs = (Kd - Kd") x Vi Pour sparer compltement deux substances, le volume de lchantillon ne doit pas tre suprieur Vs. Donc il faut que V chantillon < (Kd - Kd") x Vi. Parmi un grand nombre de gels que lon peut trouver commercialement, citons : le Sephadex G form partir dun hydrate de carbone de haut poids molculaire : le dextrane le Biogel P, form de polyacrylamide Les gels dagarose (Sepharose, Biogels A) forms gnralement partir de polysaccharides Les gels mixtes forms de polyacrylamide et de polysaccharides copolymriss (Ultrogel et Sephacryl).

Lensemble de ces gels est de type hydrophile. Il existe des gels de type organophiles dont les plus courant sont base de polystyrne pont.

- 25 Nous nous intresserons lors de ce TP, au gel de Sephadex ; le plus couramment utilis. Le Sephadex est un gel form de perles, prpar par rticulation du dextran laide de lpichlorhydrine CH3- CH-CH2-Cl. Les chanes de polymres sont relies les unes aux autres par des ponts de type ther glycrate -O-CH2-CH-CH2-OOH

Le grand nombre de groupements hydroxyles (-OH) confre au gel un caractre hydrophile. En consquence, le Sephadex gonfle trs facilement dans leau et les solutions dlectrolytes. Les gels de Sephadex diffrent entre eux par leur degr de rticulation. Types et qualit de Sephadex Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-50 Coarse Medium Fine Superfine Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Diamtres des grains (m) 40-120 40-120 100-300 50-150 20-80 10-40 100-300 50-150 20-80 10-40 10-40 10-40 10-40 10-40 Domaine de fractionnement (Daltons) -700 -1500 1000-5000 Volume de gel en ml/g de Sphadex sec 2-3 2.5-3.5 4-6

1500-30000

9-11

3000-70000 4000-100000 5000-150000 5000-250000

12-15 15-20 20-30 30-40

A chaque type de Sephadex est associ un domaine de fractionnement. Cet intervalle de poids molculaire correspond la zone de sparation. La limite suprieure de ce domaine est appele limite dexclusion. Les molcules ayant un poids molculaire suprieur cette limite

- 26 sont totalement exclues du gel et sont lues dans un volume appel volume mort. Celles qui ont un poids molculaire plus petit que la limite infrieure du domaine de fractionnement sont lues dans un volume sensiblement gal au volume du gel. Ainsi, si l'on connat la masse molaire de la molcule que l'on veut sparer d'un mlange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapt, celui dont le domaine de fractionnement, c'est--dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molcule purifier. Stabilit chimique : Le Sephadex est insoluble dans la plupart des solvants. Il est stable dans leau, les solutions salines, les solvants organiques, les solutions alcalines et faiblement acides. En prsence dacide fort, les chanes glycosidiques de la matrice sont hydrolyses. Stabilit physique : Le Sephadex peut tre strilis soit ltat sec soit ltat humide pH neutre par autoclave 120C. Par contre, chauff plus de 120C, ltat sec, il commence caramliser.

Manipulation :
Prparation dune colonne de Sephadex : Pour obtenir une bonne sparation des constituants dun mlange, la prparation de la colonne doit tre excute avec soin. Faire gonfler le Sephadex au minimum une nuit dans le tampon choisi (calculer la quantit ncessaire pour le volume de la colonne daprs le tableau de la page 25). Remplir ensuite la colonne au 2/3 laide du tampon, puis vers la suspension de Sephadex (robinet ferm). Quand les grains ont sdiments sur une hauteur de quelques cm, on ouvre le robinet et on fait couler goutte goutte. Du Sephadex est ds lors ajout pour complter la colonne. Pour obtenir un remplissage de la colonne homogne, juste avant de rajouter du Sephadex, homogniser la surface du gel sur une profondeur de quelques cm ( laide dune pipette pasteur).

N.B : Il faut surtout viter que le gel ne vienne jamais sec.

- 27 -

NaCl 0.9%

Sephadex

Sephadex

NaCl 0.9%

Application de lchantillon :

But :

Aspirer (au moyen dune pipette pasteur) la plus grande partie du liquide se trouvant au dessus de la surface du gel (robinet ferm) Ouvrir le robinet lgrement et lorsque le reste du liquide a disparu dans le gel, (ATTENTION jamais sec !!!) fermer le robinet Dposer ensuite dlicatement et uniformment lchantillon le long de la colonne avec un mouvement rotatif juste au-dessus de la surface du gel (viter de perturber la surface du gel). La manire dont lchantillon est dpos est trs importante. Faire pntrer lchantillon en ouvrant le robinet. Ds que lchantillon a pntr dans le gel, dposer de la mme manire quelques ml de tampon. Cest le dbut de llution, c'est--dire que la fraction recueillie ds cet instant portera le n1. On remplit ensuite compltement de tampon la colonne et on la relie au rservoir.

Sparer 3 substances de poids molculaires diffrents sur deux types de Sephadex G : un Sephadex G100 et un Sephadex G25. Pour cela, chaque groupe a sa disposition le matriel suivant : 1) Un mlange constitu de : un polymre de haut poids molculaire : le blue dextran 2000 . Cest un polysaccharide dun poids molculaire moyen denviron 2.000.000 daltons sur lequel

- 28 est coupl un chromophore polycyclique donnant une couleur bleue. La concentration en Blue dextran 2000 est de 2mg/ml. Lhmoglobine (Hb), une protine globulaire (rouge) dun poids molculaire de 65000 daltons. Sa concentration est de 5mg/ml. Le Ferrycianide de potassium (FP), K3 Fe(CN)6 compos jaune dun poids molculaire de 329 daltons. Sa concentration est de 2mg/ml.

2) Une colonne de G100 conditionne en NaCl 0.9%. 3) Une colonne de G25 conditionne en NaCl 0.9%. 4) Du matriel ncessaire pour la chromatographie (bouchons, pipette, tuyau, pinces seringues,) Manipulation : Chromatographier 500l de la solution dcrite ci-dessus sur les colonnes de Sephadex. Pour cela suivre les instructions donnes prcdemment. Eluer avec du NaCl 0.9%. Rgler le dbit soit au moyen de la pince, soit en jouant sur la hauteur du rservoir NaCl 0.9% de manire avoir un dbit de 15 ml/h. Observer les sparations au niveau des diffrents types de Sephadex. Rsultats : Observer les sparations. Interprter les rsultats obtenus la lumire des notions thoriques dveloppes prcdemment. Tracer une courbe talon partir des donnes obtenues pour la colonne G100

- 29 -

Extraction et dnaturation de lADN

- 30 -

Extraction et dnaturation de lADN :

L'ADN peut tre extrait et purifi partir de n'importe quel type de cellules nucles. Dans notre cas, nous utiliserons, le thymus de veau. Le thymus de veau (connu sous le terme ris de veau dans le commerce) est constitu de cellules jeunes dont le rapport nuclocytoplasmique est lev. Il sagit dune glande bilobe qui ne joue un rle important que pendant les premires annes de la vie. Il est situ la base du cou, en arrire du sternum. Dj tendu chez le nouveau-n, il se dveloppe pendant lenfance, priode au cours de laquelle il est le plus actif. Il cesse de crotre ladolescence, aprs quoi, il satrophie graduellement. Chez la personne ge, il est presque entirement remplac par une masse de tissu conjonctif et adipeux. Les cellules pithliales du thymus scrtent principalement une famille dhormones peptidiques, dont la thrompotine et la thymosine, qui semblent jouer un rle essentiel dans le dveloppement des lymphocytes T et dans ltablissement de la rponse immunitaire. 1.1 Principe dextraction : Les tapes disolement de lADN sont : Libration de lADN sous une forme soluble par destruction des membranes cellulaires et nuclaires ; Dissociation du complexe ADN-protines (histones, protamines) par dnaturation des protines (traitement par un dtergent, le SDS) ; Sparation de lADN des autres macromolcules par prcipitation lalcool et extraction en prsence de sels.

1.2 Mthode dextraction : Par groupe de 2 tudiants : 1) couper 10g de thymus de veau (1g dADN) en petits morceaux 2) homogniser au mixer 3 minutes dans 40ml du tampon glac suivant : NaCl 0.9% - Citrate de Na 0.01M 3) centrifuger froid 5000t/min pendant 10 minutes dans un tube centrifuger 4) rcuprer le culot, et y ajouter 40ml de tampon glac, homogniser en agitant fortement et centrifuger nouveau 10 minutes 5) renouveler lopration une troisime fois 6) rcuprer le culot et homogniser 3 minutes dans un rcipient contenant 200ml de NaCl 0.09% glac

- 31 7) ajouter en agitant (agitateur magntique) 18ml dune solution Sodium Dodcyl Sulfate (SDS) 5% dans de lthanol 45% 8) agiter lentement 1heure temprature ambiante 9) ajouter ensuite 13g de NaCl solide et agiter 10 minutes 10) filtrer sur tamine (rcuprer le filtrat dans un bcher) 11) ajouter lentement 200ml dalcool dnatur en tournant dlicatement la main avec une baguette de verre Remarques : Pendant les manipulations dextraction, il faut faire attention ne pas altrer lADN : viter les pH extrmes, les tempratures leves, les faibles forces ioniques. 12) Une fois la purification termine, remettre lADN en solution dans 100ml dune solution de NaCl 150mM, citrate de sodium 15mM.

1.3 Dnaturation de lADN purifi : La dnaturation de lADN est possible par variation du pH, de la temprature ou de la concentration en sels. Dans ces conditions, les 2 brins dADN se sparent pour se retrouver sous forme dADN monobrin. Dans notre cas, nous allons dnaturer lADN, pralablement purifi partir du thymus de veau en augmentant graduellement la temprature. Dnaturation de lADN par variation de la temprature : Les deux brins antiparallles d'ADN sont toujours troitement relis entre eux par des liaisons hydrogne formes entre les bases complmentaires A-T et G-C.

Lorsque l'nergie thermique apporte par une augmentation de la temprature, est suffisante les liaisons H interbrins rompent. Ce sont les appariements A-T qui se sparent les premiers

- 32 au cours de la monte de la temprature car ils ne possdent que deux liaisons hydrognes contrairement aux appariements G-C qui en possdent trois. Ainsi une molcule d'ADN double brin compose uniquement d'appariements G-C (3 liens H) ncessitera plus d'nergie pour tre dnature sous la forme de molcules simple-brins, qu'un ADN de mme taille compos d'appariements A-T (2 liens H). La dnaturation de lADN peut tre mise en vidence par mesure de la densit optique 260nm. En effet, celle-ci augmente au cours du dsappariement, cest ce quon appelle leffet hyperchrome.

La dnaturation de lADN peut tre suivie par mesure de la DO260nm en fonction de la temprature. La sparation des 2 brins dADN saccompagne dun changement des proprits de la solution (la viscosit diminue) et a lieu dans un intervalle de temprature troit. On nomme temprature de fusion Tm (melting temperature), la temprature pour laquelle 50% des molcules d'ADN sont dsapparies (i.e. sous forme simple brin).

- 33 -

Plusieurs formules empiriques permettent de calculer la valeur de la temprature de fusion. Elles tiennent compte du pourcentage de base (G+C), de la salinit du milieu ainsi que de divers facteurs correctifs, tels que la prsence de structures secondaires intra ou extra molculaires (repliement de l'ADN sur lui-mme, formation d'appariements entre deux brins).

Dans cette partie de la manipulation, vous allez dterminer la Tm et le contenu en GC de votre ADN purifi. Pour ce faire, votre solution dADN purifi est place dans un bain marie 90C, avec un thermomtre dedans afin de contrler sa temprature. Veuillez bien homogniser votre solution en la mlangeant continuellement. Prlever 1ml de votre solution chaque saut de temprature de 5C et mesurer la densit optique de celui-ci 260nm. Porter en graphique, lvolution de la DO260nm en fonction de la temprature et dterminer sur ce graphe, la Tm de votre ADN purifi. Dterminer ensuite grce cette valeur, le % de GC contenu dans votre ADN en vous rapportant la figure prsente cidessus. Remarques : Prendre une mesure de la DO260nm avant toute lvation de la temprature (ADN sous forme double brins) Il faut que celle-ci avoisine une valeur de 0.2 (soit 10g/ml). Si ce nest pas le cas, diluer votre solution dADN purifi pour arriver cette valeur de dpart.

- 34 -

Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle

- 35 -

Analyses des lipides du tissu adipeux et de la cervelle :

Introduction Les lipides constituent la matire grasse des tres vivants. Ce sont de petites molcules hydrophobes ou amphipathiques principalement constitues de carbone, dhydrogne et doxygne et ayant une densit infrieure celle de l'eau. A temprature ambiante, les lipides peuvent tre l'tat solide, comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles. Le groupe des lipides est diversifi et comprend les graisses neutres, les phospholipides, les strodes et une certain nombre dautres substances lipodes. Les graisses neutres : Les graisses neutres, aussi appeles triglycrides ou triacylglycrols, sont des esters dacides gras (R1, R2, R3) et de glycrol. Ils sont dits simple lorsque les 3 acides gras sont identiques et mixtes lorsquils contiennent 2 ou 3 acides gras diffrents.
Liaison ester

CH2 O CO R1 CH O CO R2 CH2 O CO R3
Squelette glycrol Groupement Acyle

Les triglycrides se retrouvent principalement au niveau du tissu adipeux sous cutan et entourant certains organes. Ils servent de protection et disolation ces organes mais sont galement une rserve dnergie pour lorganisme. Les phospholipides : Les phospholipides ou glycrophospholipides, sont des triglycrides modifis ayant un groupement contenant du phosphate et deux chanes dacides gras au lieu de trois. Les phospholipides diffrent les uns des autres par le type d'acides gras rattachs au glycrol. Gnralement, un des deux acides gras est satur et l'autre ne l'est pas. Ils diffrent aussi par diffrents groupements chimiques qui peuvent se rattacher au groupement phosphate.
Liaison ester

CH2 O CO R1 CH O CO R2

Groupement Acyle

CH2
Squelette glycrol

Ethanolamine Choline O CO -- O -- P O -- Srine Inositol

Tte hydrophyle

- 36 Le tableau ci-aprs prsente les diffrents groupements chimiques pouvant se lier au groupement phosphate : Ethanolamine Choline NH2 CH2 CH2 - OH CH3 |+ CH3 N - CH2 CH2 - OH | CH3 NH2 CH2 CH OH | COOH OH OH OH OH OH OH Les glycrophospholipides sont amphiphiles comportant la fois une caractres hydrophile et hydrophobe. Les glycrophospholipides sont les principaux constituants des membranes cellulaires et sont abondants dans le tissu nerveux.

Srine

Inositol

Les strodes : Les strodes ont une structure trs diffrente des graisses. Les strodes le plus courant pour ltre humain est le cholestrol.

Le cholestrol est un composant majeur des membranes cellulaires, il contribue leur stabilit et au maintien de leurs structures en s'intercalant entre les phospholipides. Le cholestrol est galement un prcurseur de nombreuses molcules :

la vitamine D3 qui intervient dans la calcification des os, les hormones strodes : cortisol, cortisone et aldostrone, les hormones strodes sexuelles : progestrone, strogne et testostrone les acides biliaires,.

- 37 Autres substances lipodes :

Manipulations : Le but de la manipulation est de passer en revue les principaux lipides des mammifres. A cette fin, nous allons analyser deux tissus riches en lipides, savoir le lard et la cervelle. A partir de ces tissus, nous allons prparer des extraits dont nous sparerons les trois principales classes de lipides : les graisses neutres ou triacylglycrols, les phospholipides et le cholestrol, sur base de leur solubilit dans divers milieux. A. Matriel : (pour 10 groupes)

Solvant chloroforme/mthanol (1 :2)

Chloroforme Mthanol 300ml 600ml

Lard Cervelle Solution de KOH sature (dans une bouteille en plastique)

KOH H2Od 50g 45ml 20ml 180ml 300ml 300ml 28g 19.6ml 450ml 260ml 100ml 4ml 16ml 29.4g 100ml

Solution KOH dans lalcool

Solution KOH sature Alcool dnatur Alcool thylique H2Od CdCl2 1/2H2O H2Od Alcool dnatur Chloroforme Mthanol Acide actique H2Od

Alcool thylique (alcool dnatur) 50% Chlorure de cadmium (solution sature dans lalcool thylique)

Solvant chromatographie (65 : 25 : 1 : 4)

Chlorure de calcium 2M
CaCl2 H2Od

Ether dithylique

200ml

- 38 Actone Ninhydrine
Ninhydrine Butanol

300ml
25mg 50ml

Ether de ptrole Molybdenum blue

200ml

!!!! Remarque importante : les solvants organiques, spcialement lther et lther de ptrole, sont trs inflammables. Il est donc interdit dallumer une flamme proximit de ceux-ci. B. Prparation des extraits de lard et de cervelle : Lextrait de lard et de cervelle est ralis avec lassistant (45g de tissu / 300ml de solvant). Il consiste en un broyage mcanique du tissu dans un mlange chloroforme : mthanol (1 : 2). Les rsidus insolubles sont ensuite limins par filtration. Lanalyse des lipides de ces deux tissus se fait en parallle. C. Exercice I : Sparation des 3 groupes de lipides : Dans un bcher marqu lard ou cervelle, pipeter 20ml de lextrait correspondant. Evaporer sur la paque lectrique jusqu limination complte du solvant (SOUS HOTTE !!!!!). Pendant lvaporation, commencer prparer les chromatographies (exercice II). 1. Prcipitation des phospholipides : Les phospholipides et spcialement leurs sels de cadmium sont insolubles dans un mlange actone : ther (3 :1). Aprs refroidissement, dissoudre le rsidu de lvaporation dans 2ml dther, verser cette solution dans un tube centrifuger marqu lard ou cervelle selon le cas. Ajouter 5 gouttes de la solution de CdCl2 et 6ml dactone. Centrifuger quelques minutes et comparer limportance des prcipits obtenus dans chacun des tubes. 2. Saponification des graisses neutres : Le surnageant de la centrifugation contient les graisses neutres et le cholestrol. Dcanter ce surnageant dans un bcher marqu lard ou cervelle selon le cas. Ajouter 6ml de la solution KOH-alcool et mlanger. Chauffer jusqu vaporation (SOUS HOTTE !!!!!). Les graisses sont saponifies. Les acides gras librs sont prsents sous formes de sels de potassium (savons). Laisser vaporer pour voir les savons se dposer sous forme de masse visqueuse dans le fond du bcher. 3. Sparation des savons et du cholestrol : (lassistant le fait pour tout le monde) Aprs refroidissement, dissoudre le rsidu du bcher cervelle laide de 7ml dalcool 50%. Transvaser le tout dans une ampoule dcanter et ajouter 10ml dther de ptrole. Par agitation, le cholestrol est extrait dans cette phase organique, tandis que les savons restent dans la phase aqueuse. Aprs sparation des deux phases, on laisse scouler la phase aqueuse. Lther de ptrole est recueilli dans un bcher sec marqu, et est laiss sous la hotte jusqu vaporation. Le cholestrol cristallise en aiguille.

- 39 Remarque : A la fin des manipulations, rincer lampoule dcanter avec une dizaine de ml de la solution alcool 50%. Agiter vigoureusement et liminer le liquide lvier. 4. Prcipitation des savons calciques : Reprendre le rsidu du bcher lard laide de 20ml deau. Mlanger. La solution de savon peut tre assez visqueuse lorsque ceux-ci sont abondants. Sparer ces 20ml en deux tubes contenant 10ml chacun. Ajouter, goutte goutte, 10 gouttes de la solution de CaCl2 2M lun des deux tubes et 10 gouttes dacide actique lautre. Bien observer le phnomne. Les sels dacides gras prcipitent. Agiter vigoureusement. D. Exercice II : Chromatographie sur couche mince : La chromatographie sur couche mince se ralise sur des plaques de verre recouvertes dune mince couche de silice, ou acide silicilique amorphe, renfermant 13% de CaSO4.H2O. Il sagit dune mthode physique de sparation des diffrents constituants dun mlange. Cette technique est base sur les diffrences daffinit des substances lgard de deux phases : la phase stationnaire fixe sur une plaque de verre (la silice) et la phase mobile (solvant ou un mlange de solvants) qui progresse le long de la phase stationnaire. Une petite quantit de la ou des solutions analyser est dpose sur le bord d'une plaque de chromatographie. Cet chantillon est adsorb par la silice ; ce qui signifie que les molcules interagissent avec cette dernire et qu'elles auront tendance rester au mme endroit. La plaque de chromatographie est ensuite trempe dans un solvant (luant) et place dans un rcipient ferm. Pendant que le solvant (luant) monte le long de la plaque chromatographie par capillarit, il rencontre l'chantillon et l'entrane. Les diffrentes substances constituant l'chantillon migrent diffrentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec la silice. Une fois la migration termine, gnralement quand le front de solvant (luant) est presque arriv en haut de la plaque chromatographie, celle-ci est retire de la cuve et le solvant est vapor. Par la suite le rsultat de la migration, le chromatogramme, peut-tre rvl de diffrentes manires.

Plaque de chromatographie

- 40 -

1. Prparation des plaques : Prparer une plaque de chromatographie en prenant comme modle le dessin suivant : A laide dun crayon fin, (!!!!! ne pas appuyer trop fort avec la pointe du crayon), tracer dans le gel de silice, une ligne divisant la plaque de chromatographie en deux parties gales, noter L ou C pour lard ou cervelle respectivement. Noter galement les initiales de votre groupe dans un coin.

Gel de sparation

Gel de concentration

Lapplication des chantillons est une opration dlicate : attendre la dmonstration par lassistant. Un petit volume de lchantillon analyser est prlev par capillarit, dans une pointe de pipette pasteur. Il est appliqu dlicatement, par simple contact, lendroit prvu sur la plaque. Le liquide diffuse dans le gel partir du point de contact. Le diamtre de la tche forme ne peut pas excder 4 5 mm. Laisser scher. Recommencer ct en appliquant 3 gouttes puis 5, laisser bien scher avant lapplication des gouttes successives. Procder de manire similaire pour chacun des chantillons (lard ou cervelle). 2. Chromatographie : La plaque, une fois prpare est dispose dans une cuve (les bords correspondant aux tches trempent dans le solvant). Fermer la cuve hermtiquement. Le solvant monte dans le gel par capillarit (chromatographie ascendante). Laisser migrer le solvant jusquau moment o il atteint la ligne transversale. Le solvant utilis pour la chromatographie est constitu dun mlange acide (chloroforme (65vol) mthanol (25vol.) acide actique (1vol) eau (4vol)) qui assure une migration complte des lipides neutres et une rtention partielle des lipides polaires et surtout chargs. Pendant la migration, continuez lexercice I. 3. Rvlations : (ralises par lassistant)

- 41 -

On enlve la plaque de la cuve, sans toucher la couche de gel, et on laisse scher. Trois rvlations diffrentes sont appliques cette chromatographie. vapeur diode : la vapeur diode a la proprit de sadsorber au niveau des diffrents lipides spars. Ceux-ci apparaissent alors sous forme de tches jaunes brunes. Cette adsorption est rversible. En effet, liode se dsorbe lair libre.

Placer votre plaque chromatographie dans une cuve contenant des paillettes diode. Les tches de lipides apparaissent aprs quelques minutes. Sortir la plaque et dessiner le chromatogramme sur la plaque chromatographie laide dun crayon fin. Lorsque liode est sublim, appliquer le second rvlateur. Ninhydrine : certains phospholipides portent une fonction NH2 libre que lon peut rvler la ninhydrine.

Placer la plaque de chromatographie sur le support appropri dans la hotte. Pulvriser de faon homogne la solution de ninhydrine et mettre la plaque de chromatographie ltuve quelques instants. Des tches colores apparaissent. Sur le chromatogramme dj ralis, colorer les tches qui ont ragis ce test. Ractif du phosphore : ce ractif contient du molybdate et un rducteur. En prsence de phosphore, il se forme un complexe phosphomolybdique qui est rduit en phosphomolybdyle bleu. Seuls les phospholipides ragissent.

Placer la plaque de chromatographie sur le support appropri dans la hotte. Pulvriser prudemment et de faon homogne la solution de molybdne bleu (le liquide est trs acide). Complter nouveau le chromatogramme. Ces deux dernires mthodes de rvlations ntant pas applicables en mme temps sur une mme plaque de chromatographie, certains groupes appliqueront la premire et dautres groupes la deuxime. Les rsultats seront donc mis en commun afin didentifier les diffrentes tches rvles sur la plaques de chromatographie que ce soit pour lextrait lard ou pour lextrait cervelle. Lensemble de ces mthodes permet la dtection, par ordre croissant, des principaux lipides dintrt biologique : 1. 2. 3. 4. 5. 6. les lipides neutres et cholestrol glycolipides phosphatidylthanolamine phosphatidylcholine phosphatydylsrine sphingomyline

- 42 -

Caractrisation des sucres

- 43 -

Caractrisation des sucres :

Les glucides sont les biomolcules les plus abondantes de la terre. Chez les vgtaux, la photosynthse synthtise, partir du gaz carbonique et de leau, le glucose qui est stock sous forme damidon ou transform en cellulose. Chez les animaux, la majeure partie des glucides est apporte par lalimentation et est dorigine vgtale ; nanmoins, les glucides peuvent galement tre synthtiss partir de molcules non glucidiques. Les glucides sont constitus dune ou de plusieurs units aldhydiques ou ctoniques polyhydroxyles. Ce groupement aldhyde ou ctone leur confre un caractre rducteur. En effet, en milieu alcalin, le glucose va rduire le Cu2+ (bleu) de la liqueur de Fehling, en Cu+ (prcipit rouge brique). Le rle des glucides est multiple. Tout dabord, au niveau extracellulaire, ils jouent un rle structural important, soutenant et protgeant les structures biologiques. Exemples : la cellulose de la paroi cellulaire vgtale la chitine des exosquelettes dinsectes et de crustacs Au niveau intracellulaire, ils ont un rle nergtique (production dnergie, rserve sous forme de cellulose chez les vgtaux et sous forme de glycogne chez les animaux,) et mtabolique important. On classe les glucides de la manire suivante : les monosaccharides, forms dune seule sous unit (le glucose par exemple) les disaccharides, forms de deux sous units (le saccharose par exemple = glucose + fructose) les oligosaccharides, forms de 3 units ou plus les polysaccharides, forms de plus de 10 units ou plus

Les monosaccharides : Les monosaccharides possdent tous une fonction carbonyle : Aldhyde pour les aldoses (exemple : glucose) qui sont composs d'une chane d'alcools secondaires ayant une extrmit un alcool primaire et un aldhyde l'autre extrmit. Ctone pour les ctoses (exemple : fructose), les autres carbones tant porteur d'une fonction alcool primaire ou secondaire selon la position.

Ils sont caractriss par leur nombre de carbone : formule gnrale : Cn(H2O)n Les trioses possdent 3 carbones : dihydroxyactone, glycraldhyde ; Les tetroses possdent 4 carbones : rythrose, throse, rythrulose;

- 44 Les pentoses possdent 5 carbones : ribose, arabinose, xylose, lyxose, ribulose, xylulose; Les hexoses possdent 6 carbones : allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, psicose, fructose, sorbose, tagatose; Les heptoses possdent 7 carbones ; sedoheptulose;

Dihydroxyactone Les disaccharides :

Ribose

Galactose

Fructose

Glucose

Ils sont constitus de 2 oses lis par une liaison osidique. Par exemple : le maltose (-Dglucopyranosyl(14)-D-glucopyranose), le saccharose (-D-glucopyranosyl(12)-Dfructofuranose), le lactose (-D-galactopyranosyl(14)-D-glucopyranose), ...

Saccharose

Maltose

Lactose

Les saccharides simples et les disaccharides ayant de libre leur carbone hmiactalique sont rducteurs de par leur fonction aldhyde. La fonction aldhydique est oxyde en fonction acide carboxylique. L'une des fonctions alcool primaire peut tre oxyde en fonction acide carboxylique.

- 45 Les disaccharides non rducteurs sont ceux dont aucun carbone hmiactalique n'est libre, il est mis en jeu dans la liaison osidique. Les polysaccharides : Association d'un trs grand nombre de molcules lies par des liaisons O-glycosidiques. Les chanes sont soit linaires soit ramifies. L'amidon L'amidon est un glucide de rserve utilis par les vgtaux suprieurs pour stocker de l'nergie (dans les graines, les racines, ) au mme titre que le glycogne chez les animaux. C'est un polysaccharide (C6H10O5)n constitu de deux composs : L'amylose, molcule forme d'environ 600 molcules de glucose chanes linairement par une liaison (14) L'amylopectine, amylose ramifi par une liaison (16) environ toutes les 20 units de glucose.

(14)

(16)

L'amylose s'organise en une hlice droite six glucoses par tour. Il se dissocie en glucose assimilable sous l'action d'enzymes, les amylases. Ces enzymes sont prsentes dans la salive, ainsi que dans le suc pancratique. L'alpha-amylase est spcifique des liens (1-4) glycosidiques, ce qui a pour consquence la transformation de l'amylose en molcules de maltose (disaccharides de -glucose). L'amidon est insoluble dans l'eau froide. En le traitant par l'eau chaude, on obtient l'empois damidon. Il est exploit dans l'industrie pour ses proprits d'paississant et de glifiant. Lamidon peut-tre mis en vidence par le lugol (eau iode) qui conduit une coloration noire caractristique (raction entre l'amylose et l'iode). Le glycogne Au niveau de sa structure, il est pratiquement identique l'amidon. Toutefois, il possde plus de ramifications que ce dernier (ramification environ toutes les 10 units de glucose), tout le

- 46 reste de la structure est identique l'amidon. C'est la substance de rserve glucidique des animaux. La cellulose La principale molcule structurelle des plantes est la cellulose. Le bois est en partie compos de cellulose, tandis que le papier et le coton sont de la cellulose presque pure. La cellulose est un polymre de glucose lis par une liaison (14). C'est une molcule trs longue et rigide, dont la structure lui confre ses proprits mcaniques telles qu'observes chez les plantes.

Le lien osidique
L'hydrolyse du lien osidique peut tre chimique, elle n'est alors pas spcifique et elle conduit la formation de plus petites sous units : les monosaccharides. Elle peut tre ralise en prsence d'acide chlorhydrique. L'hydrolyse du lien osidique peut galement tre enzymatique. Dans ce cas, elle est spcifique et ralise par des hydrolases. la -glucosidase hydrolyse les liaisons osidiques mettant en jeu un glucose dont l'OH hmiactalique est en position ; L'-amylase rompt les liaisons osidiques l'intrieur de la chane d'amylose ; La -amylase hydrolyse les liaisons osidiques partir des extrmits.

- 47 -

Manipulations :
Tests de la mise en vidence des glucides : 1) Test la liqueur de Fehling :

La raction de Fehling est une raction caractristique des aldhydes. Ainsi, le test la liqueur de Fehling met en vidence la prsence des glucides (aldose ou ctose*) par laction rductrice dune solution de sel cuivrique. (* : En milieu alcalin, le ctose est isomris en aldose et se comporte
donc comme un sucre rducteur.)

Pour l'essentiel, la solution de Fehling (ou liqueur de Fehling) est un complexe basique dions cuivriques par les ions tartrates. Au cours de la raction, le cuivre oxyde l'aldhyde pour donner un acide selon la raction bilan d'oxydo-rduction gnrale : R-CHO + 2Cu(OH)2 RCOOH + Cu2O(s) + 2H2O En prsence de sucres rducteurs, le cuivre prsent dans le complexe bleu est rduit et prcipite sous forme doxyde cuivreux Cu2O de couleur jaune rouge. Prparation de la liqueur de Fehling : Solution A : 3.47g de CuSO4.5H2O, ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentr et complter 50ml avec de leau distille Solution B : dissoudre avec prcaution 17.3g de tartrate sodico-potassique (KNaC4H4O6.4H2O) et 5g de NaOH en pastille dans H2Od et amener le volume de la solution 50ml

Les solutions A et B sont mlanges volumes gaux au moment de lutilisation pour le test. Remarque : Il est indispensable dajouter le tartrate sodico-potassique afin que le cuivre reste en solution sous forme de complexe bleu soluble. En effet, si ce dernier nest pas prsent, le NaOH ragit avec le CuSO4 par la raction suivante : CuSO4 + 2NaOH Na2SO4 + Cu(OH)2 Bleu insoluble Puis, dj temprature ambiante, mais encore plus si on chauffe, lhydroxyde cuivrique est dshydrat par la raction suivante : Cu(OH)2 H2O + CuO Noir insoluble

- 48 Par contre, si avant dajouter NaOH CuSO4 en solution, on ajoute le tartrate sodicopotassique, le cuivre restera en solution sous forme de complexe bleu soluble.

Test de Fehling : Rpartir dans 5 tubes essai 1ml de la solution A et 1ml de la solution B Dans chaque tube, ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v), glucose 5% (w/v), amidon 5%, sucrose 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v) acidifi de 4 gouttes dHCl concentr. Placer les tubes dans un bain-marie 100C pendant 5 minutes Indiquer les tubes o la raction est positive et expliquer les diffrents rsultats obtenus. 2) Test de Tollens : La raction de Tollens est une raction caractristique des aldhydes. Il met donc en vidence la prsence des glucides (aldose ou ctose*). (* : En milieu alcalin, le ctose est isomris en aldose et
se comporte donc comme un sucre rducteur.)

Pour l'essentiel la solution de Tollens est un complexe de nitrate d'argent en solution ammoniacale. Au cours de la raction l'ion argent I oxyde l'aldhyde pour donner un acide selon la raction bilan doxydo-rduction gnrale : R-CHO + 2Ag(NH3)2OH + NaOH RCOONa + 2Ag + 2H2O + 4NH3 Un dpt dargent se forme alors sur les parois du tube voquant un miroir, ce qui confre ce test le nom de test du miroir d'argent . Prparation du ractif de Tollens : Prparer une solution de 2ml dAgNO3 5% Ajouter 1ml de NaOH 10% pour prcipiter Ag2O Ajouter par petites portions (environ 0.5ml) NH4 OH 10% en agitant frquemment le tube jusqu' dissolution du prcipit (3ml de NH4OH devraient suffire) Complter 10ml avec H2O

Test de Tollens : Rpartir dans 4 tubes essai 1ml de ractif de Tollens Dans chaque tube, ajouter respectivement 1ml de fructose 5% (w/v), glucose 5%(w/v), amidon 5% (w/v) et sucrose 5% (w/v). Indiquer les tubes o la raction est positive et expliquer les diffrents rsultats obtenus.

Hydrolyse de lamidon par les -amylases: Ltudie de lhydrolyse de lamidon par les -amylases salivaires consiste en une analyse des produits forms au cours du temps. Cette hydrolyse se ralise en plusieurs tapes :

- 49 Amidon soluble dextrines de longueurs variables maltose Afin de mettre en vidence, lhydrolyse de lamidon, deux tests vont tre raliss, le test la liqueur de Fehling dune part et le test de liode dautre part. Test de liode pour les polysaccharides : Liode se complexe avec les polysaccharides (amidon, glycogne) en formant vraisemblablement une structure de coordination rsultant de sa fixation entre les chanes adoptant une conformation hlicodale. La couleur du complexe form dpend de la longueur entre branchements du polysaccharide considr. La molcule prsentant le plus grand nombre de branchement tant lamidon, celui-ci devrait ragir fortement avec liode. Cette raction devrait ensuite diminuer graduellement en fonction de la digestion de lamidon par les -amylases. Mode opratoire : Mlanger 0.4g dempois damidon dans 10ml dH2Od. Verser cette suspension dans 20ml dH2O bouillante. Laisser bouillir 2 minutes. Laisser refroidir dans la glace. Amener 40ml avec H2O. Bien mlanger. Quand lamidon est refroidi, ajouter 0.4 0.5ml de salive Rpartir le mlange dans 6 tubes essai (solution bien homogne) et les placer dans un bain-marie 37C Sortir un tube la fois aprs 0, 2, 5, 15, 30 et 60 minutes et stopper la raction en plongeant le tube dans un bac de glace. Effectuer immdiatement le test de liode. Pour ce faire, prlever 2ml du tube essai puis leurs ajouter 2ml H2O et 1 goutte de ractif liode (lugol = 5g I2 + 1g KI + 100ml H2O) Effectuer ensuite un test la liqueur de Fehling comme expliqu prcdemment sur 1ml dchantillon. Observer et expliquer les diffrents rsultats obtenus.

Mtabolisme du glucose chez la levure : La fermentation alcoolique est une raction biochimique consistant librer de l'nergie partir de sucre (du glucose la plupart du temps). La fermentation ne ncessite pas de dioxygne, elle peut donc avoir lieu en milieu anarobie. Elle se distingue, par son faible rendement nergtique, de la respiration cellulaire, qui ncessite, elle, de l'oxygne (milieu arobie). Lors de la respiration, l'accepteur final des lectrons provenant des cofacteurs rduits NADH, H+ sont transfrs l'oxygne, alors que dans le cas de la fermentation, les lectrons sont transfrs des composs des voies mtaboliques, tels que le pyruvate entranant la formation dthanol. C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP La fermentation alcoolique est ralise par de nombreux organismes (bactries, levures) vivant de manire permanente ou occasionnelle dans des milieux dpourvus d'oxygne. La

- 50 proprit de certaines levures transformer le sucre en thanol est utilise par l'homme dans la production de boissons alcoolises et pour la fabrication du pain. Le meilleur milieu de temprature est 35C-40C. Le but de lexprience est dobserver le mtabolisme du glucose chez la levure et donc sa consommation. Ceci peut-tre raliser par mesure du CO2 produit au cours de la fermentation. Pour ce faire, dans un systme hermtique, nous allons mettre en prsence des levures avec diffrentes concentrations de glucose. La raction suivante va alors avoir lieu : 1 glucose 2 pyruvate 2CO2 + 2 thanol En intgrant dans notre systme une quantit connue de NaOH, nous allons pouvoir par la suite titrer la quantit restante de celui-ci aprs un temps donn puisque ce dernier va ragir avec le CO2 produit de la manire suivante : CO2 + 2 NaOH Na2CO3 + H2O Afin de ne pas renverser la raction, et donc de ne pas provoquer une libration du CO2 produit, lors du titrage de NaOH restant, nous ajouterons dans le systme du BaCl2, amenant la production dun prcipit de BaCO3. Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2 NaCl Mode opratoire : a) prparation de la levure : peser 4g de levure par groupe placer la levure dans un tube centrifuger la suspendre dans 10ml H2Od, porter le volume 40ml centrifuger 5 minutes (centrifugeuse de table), dcanter et jeter le surnageant laver une deuxime fois la levure de la mme manire, centrifuger, reprendre le culot de levure dans 5ml H2Od. Ceci constitue la suspension de levure.

b) fermentation du glucose : Dans 3 fioles coniques avec un compartiment central, placer les diffrentes solutions comme indiqu dans le tableau ci aprs : Fiole n 1 (contrle) Compartiment extrieur : Suspension de levure H2O Solution de glucose 20mg/ml Solution de glucose 40mg/ml Compartiment intrieur : Solution de NaOH 3M 1.5ml 2.5ml 0.6ml Fiole n 2 1.5ml 2.5ml 0.6ml Fiole n 3 1.5ml 2.5ml 0.6ml

Fermer les 3 fioles avec 2 feuilles de parafilm afin que le systme soit bien hermtique

- 51 Incuber les fioles 45 minutes 25C (tuve), agiter trs dlicatement de temps en temps Au terme des 45 minutes, injecter travers le parafilm 1ml de TCA 20% dans le compartiment extrieur des 3 fioles pour stopper la fermentation Refermer avec une nouvelle feuille de parafilm Incuber 15 minutes 25C (tuve) Titrer le CO2 produit par la fermentation*. Pour ce faire, ajouter dans un bcher, 2ml de BaCl2 1M + 1ml H2Od + 3 gouttes de phnophtaline + 0.5ml du NaOH de votre fiole conique. Titrer le tout avec 10ml de HCl 0.3M

*Remarque : raliser au pralable un titrage test afin de connatre quelle est la quantit maximum de HCl quil faut pour neutraliser 0.5ml NaOH 3M normalement. Pour ce faire raliser la mme opration mais placer dans votre bcher du NaOH frais (nayant fixer aucune molcule de CO2). Grce aux diffrents volumes de titration obtenus pour les 3 fioles, vous pouvez prsent calculer combien de molcules de glucose ont t consommes et quels sont les rendements observs dans chaque cas.

- 52 -