INSAMANTARILE ARTIFICIALE

Biotehnologie de genera ia I-a, ce permite Imultiplicarea descenden ei unui mascul valoros, dincolo de limitele biologice ale acestuia Aplicat pe scar larg la bovine i ovine i, ntrntr-o m sur mai mic , la celelalte specii (cabaline, suine, canide) Ofer avantaje de ordin :
Economic  Zootehnic ameliorarea raselor  Medical


Indica iile de ordin clinic



 

  

Deficien a anatomic la unul dintre parteneri ce nu permite monta natural (angustia vulvei sau a vaginului, diferen a mare de greutate sau talie, etc.); Masculul refuz monta deoarece actul montei i provoac durere; Sunt cazuri n care masculul i femela nu se accept reciproc din pur antipatie, n timp ce cu al i parteneri ar fi dispu i s se monteze; Caracterul dominant puternic al femelei ce atrage dup sine inhibarea masculului; Lipsa de experien a unuia dintre parteneri poate face imposibil monta natural . Momentul nepotrivit

Avantaje economice


Elimin costurile, riscurile si timpul legate de transportul femelei. D.p.d.v. al proprietarului masculului, dac acesta are un an expozitional foarte bun, inseminarea artificial permite recoltarea spermei si nsmntarea femelelor fr ntreruperea activittilor curente. Materialul seminal congelat permite reproducerea unui mascul de mare valoare o lung perioad de timp dup moartea sa Riscul transmiterii bolilor venerice este minimalizat

Cuprinde patru etape principale :

Recoltarea spermei  Examenul materialului seminal


Ex. Macroscopic Ex. Microscopic Ex. complementare



Diluarea si conservarea materialului seminal

Refrigerarea  Congelarea

 

In gheata carbonica In azot lichid

Inocularea materialului seminal

Reu ita I.A. depinde de trei puncte cruciale:

  

Calitatea spermei; Alegerea momentului optim de I.A.; Alegerea metodei adecvate de inseminare.

A. Recoltarea spermei


Indiferent de metoda de recoltare utilizata, aceasta trebuie sa fie precedata de examenul general al masculului, inclusiv al aparatului genital, cu efectuarea de teste specifice (ex.: examen serologic pentru bruceloza). Recoltarea se poate face in prezenta unei femele aflate in estru sau cu ajutorul feromonilor artificiali (vier, caine)

Examenul reproducatorului mascul



Anamneza
      

regimul de mont ; comportamentul n timpul montei; rezultatele montelor anterioare; afec iuni recente, ndeosebi ale sferei genitale; eventualele tratamente efectuate i rezultatul lor; regimul de utilizare la munc , sport sau antrenament, performan ele individuale

Examenul reproducatorului mascul



Inspectia
  

Generala Locala Reflexele sexuale

    

Apropierea Erectia Saltul Intromisiunea Ejacularea

  

Palpatia Ecografia testiculara si prostatica Examene serologice pt bolile veneriene (bruceloza, herpesviroza etc.)

A. Recoltarea spermei


1. Vaginul artificial
Imita conditiile de temperatura, presiune si lubrifiere din vaginul femelei in estru  Alcatuit din : carcasa cu robinet, camasa din latex + inele de cauciuc, pahar colector + protectie  Recoltarea se poate face pe o femela in calduri spontane sau induse hormonal, pe manechin sau pe un alt mascul  Folosit la taur, armasar, berbec, vier, caine


2. Electroejacularea

Stimularea centrilor nervo i ai erec iei i ejacul rii din m duva lombo-sacral , cu ajutorul unui curent electric de lombojoas tensiune Se practic la taur (electrod endorectal bipolar), berbec (electrod endorectal monopolar i electrod lombar monopolar) i motan Avantaj : poate fi folosit la masculii cu impoten de copula ie (impotentia coeundi) Dezavantaje : ejaculatul este inferior d.p.d.v. cantitativ si calitativ celui obtinut cu vaginul artificial ; uneori se poate produce ejacularea in furou

3. Metoda prezervativului (condomului)

 

Se practica uneori la armasar Pe post de prezervativ, se poate utiliza o manusa obstetricala pentru ETR

4. Metoda manuala (masturbarea)

 

Se practica la vier si la caine La vier elementul esential este presiunea exercitata de operator cu degetele la nivelul portiunii spiralate a penisului, analog papilelor cervicale ale scroafei La caine presiunea trebuie exercitata la nivelul bulbilor glandului, iar penisul se orienteaza posterior atunci cand masculul paseste peste mana operatorului

5. Masajul transrectal al veziculelor seminale i al ampulelor canalelor deferente



Este o metod practicat uneori la taur, n cazul impoten ei de copula ie Prezint dezavantajul c ejacularea se produce f r erec ie, n furou, iar n cazul masajului prea energic al gtului vezici urinare exist riscul amestecului spermei cu urina. Avantajul principal const n simplitatea metodei, care nu necesita nici un fel de materiale suplimentare

B. Examinarea materialului seminal

Este precedat i corelat ntotdeauna cu examenul fizic general al reproduc torului mascul. mascul. 1.Ex. macroscopic: Ex. macroscopic:  Volum Volum se apreciaz imediat dup recoltare prin citire directa n paharul de recoltare  CuloareCuloare- se apreciaz subiectiv imediat dup recoltare i variaz n func ie de specie, concentra ia n spermatozoizi sau prezen a substan elor str ine n ejaculat (snge, puroi, urin , etc). (s

pH apreciat cu ajutorul pH-metrelor sau pHcu hrtie indicatoare special ; exist o h corela ie direct ntre calitatea spermei i pHpH-ul acesteia (cu ct proba de sperm este c mai bun cu att este mai acid ) at Miros - sperma normal este inodor ; prezen a urinei, a puroiului, a sngelui sau a urinei, puroiului, ngelui unor unor medicamente n ejaculat modific mirosul acestuia

2. Ex. microscopic:


Concentra ia materialului seminal -tehnica hemocitometric : adaptat dup tehnica de num rare a globulelor ro ii. ii. - metoda electronic (SQA): mult mai rapid i mai exact . (SQA): Pe baza densit ii optice determin concentra ia, mobilitatea i procentul de spermatozoizi f r anomalii. anomalii. - sistemele computerizate de analiz a spermei (CASA): (CASA): softul este proiectat pentru a determina concentra ia, viabilitatea, morfologia i mobilitatea spermatozoizilor. spermatozoizilor. Este foarte rapid i precis. precis. Azoospermia = absen a spermatozoizilor n ejaculat Oligozoospermia = un num r sc zut de spermatozoizi n ejaculat (raportat la specie)

 Mobilitatea spermatozoizilor
- Mobilitatea generala a spermei se apreciaza cat mai repede dupa recoltare prin examenul in picatura suspendata (o picatura de sperma nediluata se depune pe o lama); miscarea in val (taur, tap) se noteaza cu 5, iar lipsa de miscare cu 0 - Mobilitatea individuala se apreciaza prin examinarea unei picaturi de sperma proaspata diluata depusa intre lama si lamela; se vor aprecia miscarea de inaintare, traiectoria liniara si viteza de inaintare (velocitatea). Mobilitatea individuala se noteaza pe o scara de la 0-5, sperma normala regasindu-se in intervalul 2,5-5. Astenozoospermia defineste o mobilitate foarte scazuta a spermatozoizilor.

Morfologia spermatozoizilor Se apreciaz imediat dup recoltare prin examen microscopic (100x cu imersie) i colorare (albastru de metilen, violet de gen iana, tu de China, opal-bleu, albastru-tripanGiemsa, eozin -negrozin , Spermac etc). Ofer posibilitatea de a pune n eviden spermatozoizii imaturi, cu anomalii (majore sau minore) sau mor i. Teratozoospermia = exces de forme teratologice ale spermatozoizilor dintr-un ejaculat. ntr-un ejaculat normal procentul spermatozoizilor anormali, imaturi sau mor i = max 20%.

Principalele anomalii morfologice ale spermatozoizilor: majore i minore

 Viabilitatea


Tehnici de colorare intravitale (eozina-negrozina, albastru (eozinatripantripan-Giemsa etc.) sau tehnici de colorare fluorescenta, urmate de examinare microscopica simpla sau speciala (microscop cu lumina polarizata, microscop cu contrast de faza sau cu lumina fluorescenta)

3. Ex. complementare:


Testul hipoosmotic permite aprecieri privind integritatea membranei spermatozoidului. n mediul hipoosmotic, spermatozoizii normali prezint gonfl ri ale membranei din zona piesei intermediare i/sau a celei din regiunea cozii. Proba redox urm re te aprecierea metabolismului celulelor spermatice prin intermediul unei substante colorate pe principiul masurarii capacitatii de reducere a (albastru de metilen); cu cat decolorarea amestecului este mai rapida cu atat proba de sperma este mai buna.

 

statusului membranelor acrozomului

Colora ia Spermac - Permite identificarea Analiza structurii cromatinei spermatozoizilor (SCSA) pune n eviden

modul n care are loc fragmentarea ADN.



Ex. bacteriologic - presupune recoltarea separat a frac iunilor ejaculatului i realizarea de ns mn ri pe medii pentru germeni aerobi, anaerobi, micoplasme i fungi; n mod normal, n sperm se g sesc aproximativ 10.000 celule bacteriene/ml.

Ex. imunologic - urm re te detectarea anticorpilor antispermatici care ar altera capacitatea fecundant a spermatozoizilor. Ruperea barierei hemato-testiculare (n traumatisme, infec ii) permite contactul spermatozoizilor cu sngele circulant => sinteza de c tre propriul sistem imun a anticorpilor antispermatici


C. Diluarea i conservarea materialului seminal

Diluarea materialului seminal se realizeaz n scopul frac ion rii ejaculatului =mai multe doze de inseminare.


Mediile de dilu ie trebuie s con in : - substan e energetice (glucide); -substan e crioprotectoare (glicerina, lecitina din g lbenu ul de ou); - substan e tampon - men in constant pH-ul spermei n timpul dilu rii i conserv rii (citra i, fosfa i, tartra i, etc); - substan e care s activeze mobilitatea spermatozoizilor n c ile genitale femele (mucinaza); - substan e care s mpiedice dezvoltarea florei microbiene (antibiotice, sulfamide) Diluantul trebuie s fie izoton i izoterm cu sperma, s aib acela i pH cu aceasta, s se prepare u or, s fie economic, s - i men in propriet ile un timp ndelungat.

Conservarea materialului seminal urm re te men inerea mobilit ii i capacit ii fecundante a spermatozoizilor un timp ct mai ndelungat, n afara c ilor genitale femele. Principiul care st la baza crioconserv rii materialului seminal = reducerea temperaturii spermei determin o sc dere a activit ii metabolice a spermatozoizilor permi nd stocarea lor.

Conservarea materialului seminal se poate realiza prin: -refrigerare (p strare la 2-8 grade Celsius) -congelare (p strare n azot lichid la -196 grade Celsius). Procedee de congelare a materialului seminal: - congelarea n paiete (mari, mijlocii i mici); - congelarea n fiole; - congelarea n pilule n ghea carbonic la 79 grade Celsius abandonat la ora actual

Etapele congel rii

Centrifugarea pt. A ndep rta excesul de fluid prostatic  Diluarea  Echilibrarea termic pt a evita ocul termic sperma este refrigerat (1-4 ore) nainte de plonjarea n azotul lichid  Ambalarea se prefer paietele: volum mic, congelare uniform , se pot marca pt identificarea animalului i data recolt rii  Congelarea propriu-zis


Decongelarea materialului seminal



Exista o corelatie intre ratele de racire si cele de decongelare se respecta instructiunile furnizate de firma/persoana care a facut congelarea Decongelarea n baie de ap cald Pt. paietele de 0,5 ml: 8 secunde la 70C sau 30-60 secunde la 35C In apa cu gheata timp de 3 minute Decongelare in buzunar

 

D. Inocularea materialului seminal



=depunerea materialului seminal n c ile genitale femele. Principii - n momentul optim pentru fiecare specie; - la locul de elec ie caracteristic fiec rei specii; - instrumentarul folosit la inseminare s fie steril i nc lzit la 38 C; - s se evite traumatizarea mucoasei vestibulovaginale, cervicale sau uterine n timpul inocul rii.

Pentru sperma refrigerat : - flaconul cu material seminal se las la temperatura camerei 5 minute; se utilizeaz minute; sperma care con ine cel pu in 60% spermatozoizi cu 60% mi c ri vioaie de naintare. naintare. Pentru sperma congelat : - se inoculeaz dup decongelare; decongelare; se admite inocularea spermei care con ine minimum 35-40% spermatozoizi cu mi c ri vioaie de 35-40% naintare. naintare.

Inocularea spermei la vaca: : - se inoculeaz o singur doz de material seminal la 12 ore de la depistarea estrului -n canalul cervical sau n cavitatea uterina; uterina; - metoda recto-vaginal /bimanual (cel mai frecvent) rectosau metoda cu speculum vaginal.

Inocularea spermei la iap :

- depistarea momentului optim pentru I.A. se realizeaz prin ultrasonografie / ETR in dinamica (evolu ia m rimii i formei foliculului ovarian,preovulator 35-40 mm) ovarian,preovulator 35- mm) - cu 12 ore naintea ovulatiei; ovulatiei; - n cavitatea uterin .

La oaie: oaie:
-imediat ce este depistata in calduri (berbecul incercator) si se repeta dupa 12-18 ore; 12- ore; - cu un speculum vaginal si seringa de inoculare se inoculeaza 0,1 ml sperma la nivelul canalului cervical. cervical.


-

La scroafa:
Depistarea: cu vier ncerc tor / apari ia imobiliz rii la ngrijitor se folosesc catetere cu oliva sau spiralate asemanator portiunii libere a penisului la vier (cateterul Melrose); varful pipetei se angreneaza in cervix, iar materialul seminal se depune in corpul uterin.

La catea:
Progesteron (ng/ml) 01 13 36 6 12 > 12 Momentul montei n 36 48 ore n 36 48 ore n 24 36 ore n 9 24 ore n 12 ore ( < 24 ore)
-

detectarea momentului optim pentru I.A.: ex. citovaginal (celule Schollen) i prin dozarea progesteronului plasmatic (peste 8 ng/ml) sau a LHului; se mai pot utiliza vaginoscopia si examenul ecografic al ovarelor intravaginal, intracervical sau intrauterin

Examenul citovaginal hormonal - estrus



celule superficiale cheratinizate, anucleate, grupate n ciorchine Eritrocitele sunt rare sau chiar absente Fondul frotiului este curat lipsit de mucus i detritusuri celulare

C eaua se va men ine cu trenul post. ridicat 15 min pentru a facilita pasajul spermatozoizilor n uter, timp n care se va masa clitorisul (stimuleaz contrac iile vaginale i uterine antiperistaltice)