ANEXO 1 Conteo en cmara de Neubauer. Esta cmara se utiliza para conteo celular.

Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cmara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observar lo siguiente.

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Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

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cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cmara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:

Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales clulas son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen. Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X son las que no se deben contar.

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Despus de contar las clulas se procede a calcular la el numero de clulas por unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido en el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara y la laminilla de cuarzo.

Se promedia el nmero de esporas de la cmara de arriba con la de abajo, se multiplica por el factor de dilucin y por un factor F igual a106 si se cont el cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.

Si 1ml del preinoculo ?

____________ X esporas

____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

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ANEXO 2 Mtodo del cido Dinitrosaliclico (DNS) Pasos para preparar DNS: Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos mbar a 4 C

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 C. A partir de la solucin de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrn con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4. Procedimiento: Tomar 0.5 mL de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco por dilucin de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en bao mara por 5 minutos. Enfriar con hielo. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Agitar y dejar en reposo 15 min. Leer a 540 nm.

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Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. Debe tener un coeficiente de correlacin de 0.991 a 0.999.

0.5ml muestra problema + 0.5 ml DNS

Ebullicin de muestra 5min

Enfriar con hielo 0.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min

Leer Absorbancia = 540nm Figura 14. Mtodo de DNS

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ANEXO 3 Mtodo de Lowry Para obtener la curva estndar de Albmina se preparan 5 soluciones patrones de Albmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200, 300 y 400 g/mL. Si la concentracin de Protena es menor de 500 g/mL se lee la absorbancia a 750 nm, si est entre 1000 y 2000 g/mL se lee a 550 nm. Se prepara un blanco que no lleva Albmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL de solucin salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a las dems muestras. Procedimiento: Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrn de albmina, las muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para conservar el orden de concentraciones para la curva. Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al bao Mara precalentado a 100C por un tiempo de 10 minutos. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente. Agregar a cada tubo 5 mL de la solucin complejante, mezclar y dejar reposar por 10 minutos. Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20 segundos. Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.

Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrn construir la grfica Absorbancia vs. Concentracin de albmina srica de bovina (BSA); con esta se puede determinar la concentracin de las muestras problema interpolando el valor 128

de absorbancia. La curva estndar debe tener un coeficiente de correlacin (r) de 0.991 a 0.999. Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco

0.5ml de NaOH 2N

Adicionar

Calentar 100C 10min.

Enfriar a Tem. Ambiente 0.5ml de solucin l j t Mezclar y agitar

0.5ml de Reactivo

Reposar 10 min.

Mezclar en vrtex 20

Leer absorbancia

Graficar Absorbancia Vs. Figura 15. Mtodo de Lowry 129

ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el anlisis estadstico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano de microorganismos, variando el pH de extraccin del Higo y la concentracin de nutrientes. Tabla 35. Anlisis de varianza efecto de pH de extraccin sobre el crecimiento de A. niger.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124,684607 3 41,5615357 2,06354694 0,12229449 2,86626545 Dentro de los grupos 725,069663 36 20,140824 Total 849,75427 39

Tabla 36. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato en el crecimiento de A. niger.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255,85077 3 418,616924 12,9680654 3,344E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1420,34637 44 32,2805993 Total 2676,19714 47

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Tabla 37. Anlisis de varianza de la incidencia del pH de extraccin en el comportamiento del Trichoderma harzianum
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108,935449 3 36,3118164 4,02126552 0,01446703 2,86626545 Dentro de los grupos 325,078109 36 9,02994747 Total 434,013558 39

Tabla 38. Anlisis de varianza de la incidencia de la concentracin en el crecimiento del Trichoderma harzianum
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971,163585 3 323,721195 12,0302319 7,0164E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1183,99485 44 26,9089738 Total 2155,15843 47

Tabla 39. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0,40189872 3 0,13396624 Dentro de los grupos 18,7962027 32 0,58738133 Total 19,1981014 35

Probabilidad

Valor crtico para F

0,22807371 0,87615582 2,90111757

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Tabla 40. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 0,89247125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545 Dentro de los grupos 10,8085088 36 0,30023635 Total 11,70098 39

Tabla 41. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento de Rhodotorula.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0,17674497 3 0,05891499 Dentro de los grupos 12,7860256 32 0,3995633 Total 12,9627706 35
Valor crtico F Probabilidad para F 0,14744845 0,93056632 2,90111757

Tabla 42. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato sobre el crecimiento de Rhodotorula.
ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 3,88085737 3 1,29361912 4,16272894 0,01248242 2,86626545 Dentro de los grupos 11,187442 36 0,31076228 Total 15,0682993 39

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ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utiliz el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variacin del pH de extraccin Aspergillus niger a pH de extraccin 2

BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.333

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Aspergillus niger a pH de extraccin 7

BiomasapH7 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.3556933 Aspergillus niger a pH de extraccin 12

BiomasapH12 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2194934

134

Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.1340424 Trichoderma harzianum variacin del pH de extraccin Trichoderma harzianum a pH de extraccin 2

BiomasapH2 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.1203965

135

Trichoderma harzianum a pH de extraccin 7

BiomsapH7 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2273364 Trichoderma harzianum a pH de extraccin 12

BiomasapH12 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.6580878

136

Trichoderma harzianum medio de Control

BiomasaControl = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.97329 A. Niger variacin de la concentracin de azcares reductores Aspergillus niger a concentracin de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.9509181 137

Aspergillus niger a concentracin de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4580631 Aspergillus niger a concentracin de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4753353

138

Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.6402406 T. harzianum variacin de la concentracin de azcares reductores Trichoderma harzianum a concentracin de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.8190618

139

Trichoderma harzianum a concentracin de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/11.412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.1414981 Trichoderma harzianum a concentracin de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/29.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.6289445

140

Trichoderma harzianum medio de Control

Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.4885395

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