FLAVONOID

I. PENDAHULUAN y Senyawa fenol alam y 2% Karbon tumbuhan diubah jadi flavonoid atau 1 milyar ton pertahun y Warna bunga dan buah, flavin (kuning, jingga), antosian (merah, biru, ungu) y Tumbuhan: pigmen, pertumbuh-an, pertumbuhpertahanan, tabir surya, berkomunikasi y Manusia :antioksidan, antiinflamasi, immunostimulan, antikanker, antivirus dan antimikroba.

Kerangka dasar
y Kerangka dasar 15 atom C, dua cincin benzen,
terikat pada rantai propana, susunan C6C3C6 susunan yaitu : 1,3diarilpropana (flavonoid) 1,3 (flavonoid) 1,2 1,2diarilpropana (isoflavonoid) dan 1,1 diaril (isoflavonoid) propana (neoflavonoid) (neoflavonoid)
C3 C3 C1 C2 C1 C2

C3 C1 C2

FLAVONOID

ISOFLAVONOID

NEOFLAVONOID

contoh

1. Flavonoid
OH HO O OH

O O OH

OCH3 O

FLAVON 2. Isoflavonoid
HO O

KUERSETIN

KRANJIN

O OH HO OCH3

FEREIRIN
O H3CO O O O OH O CH2 O OCH3 OCH3 O O

PTEROKARPIN 3. Neoflavonoid
H3CO O O O O OH HO

ROTENON

O H3CO O O

DALBERGIN

BRAZILIN

KALOFILOID

Cincin benzen dihubungkan satuan tiga karbon dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk memudahkan maka cincin pertama benzen diberi indeks A, cincin benzen kedua indeks B dan cincin yang dapat terbentuk cincin C
' ' 8 7 4' OH HO 4' 5' 4 O 6' O ' '

B
9 O ' 5' 6'

B
OH 6

4 5

A
6 5 0

Asal usul Biogenetik

Awal Robinson (1936): kerangka C6 C3 C6. dari kerangka C6 C3 fenilpropana mempunyai gugus fungsi oksigen pada para, para dan meta atau dua meta dan satu para pada cincin aromatik. Senyawa fenilpropana, seperti asam amino fenilalanin dan tirosin, bukan menurunkan flavonoid, hanya senyawa yang bertalian. Dilanjutkan Birch: tahap pertama biosintesis flavonoid, dari unit C6 C3 berkombinasi dengan 3 unit C2 menghasilkan unit C6 C3 (C2+C2+C2), maka biosintesis dari flavonoid melalui 2 jalur bisosintesis yaitu poliketida (asam asetat atau mevalonat) membentuk cincin A dari kondensasi 3 molekul unit asetat, sedang cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal dari jalur fenilpropana (shikimat).

HO

O HO OH

OH

O OH O

FLAVANON Pokok-pokok Biosintesis Flavonoid

KHALKON

Hubungan Biogenetik Berbagai jenis Flavonoid (Grisebach)

OH HO O HO OH [O ] OH HO H O O OH

OH

OH

OH

Fla v anon

K halk on

OH HO O
b
+

OH HO +O H O

Ha

H OH O

OH [O ]

OH
+

O
a

-H

-H + OH

Flava nonol

H OH

HO

HO

O CH

HO OH

OH

OH

O OH O

OH

Flav on

A uron

Fla vonol

H HO O O OH O H HO O

OH

O OH

Isoflavon Ka te kin A ntos ianidin

Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)

OH HO O OH OH OH O OH OH O HO O OH OH

Flavanonol -H2O
OH H+ O O OH O OH OH O O O OH OH

2[H]

H+
OH H+ HO O OH OH O O OH OH OH

OH

H+

H+
H+ OH OH HO O HO OH OH OH OH OH O OH O

HO

O OH OH OH

Katekin

Antosianidin

Fungsi flavonoid pada tumbuhan

Fungsi penyerbukan:pigmen tumbuhan, warna jingga, merah, biru dan penyerbukan: ungu pada bunga dan buah. faktor penarik lebah, kupu-kupu, burung dan buah. kupuhewan lainnya, terjadi penyerbukan. Burung suka merah, lebah biru. penyerbukan. biru. Fungsi pengatur tumbuh. tidak langsung sebagai zat pengatur tumbuh tumbuh. melalui sistem IAA (Indole Acetic Acid) IAA Oxidase. Secara in vitro, Oxidase. flavonoid (kuersetin ) dapat menghambat enzim IAA Oxidae, berarti kuersetin secara tidak langsung meningkatkan pertumbuhan. pertumbuhan. Sebagai feeding deterrent maupun feeding stimulant. Kadar deterrent stimulant. tanin yang tinggi pada buah muda merupakan feeding deterrent kera deterrent maupun manusia tidak bernafsu untuk memakan sebelum masak. masak. Senyawa morin dan isokuersetrin dalam daun murbei (Morus alba L), merupakan feeding stimulant bagi ulat sutera (Bombyx mori). mori). Zat alelopati. Untuk berinteraksi dengan lingkungan, tumbuhan alelopati. menggunakan sinyal berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara kimia. 1986, hampir bersamaan, para ahli dari berbagai laboratorium di dunia melaporkan bahwa simbiosis antara tumbuhan polong-polongan dengan polongbakteri marga Rhizobium dipicu oleh sinyal kimia berupa senyawa flavonoid dari akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi mengetahui tumbuhan. 1982, tumbuhan Spotted knapweeds (Centaurea maculosa Lam. Lam.) mengeluarkan senyawa alelopati yang menghambat pertumbuhan tumbuhan lain di sekitarnya, tahun 2001 diketahui adalah (-) katekin (golongan flavan), sekarang diteliti untuk herbisida alam. alam. Tabir surya. Rusaknya ozon di lapisan stratosfir, terutama di daerah surya. dekat Kutub Selatan, tumbuhan mengalami cekaman sinar ultraviolet B (UVB). (UVB). Sejenis semanggi di Selandia Baru mempunyai toleransi yang tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi ini karena kadar flavonoid meningkat. meningkat.

II. Ekstraksi dan Isolasi

1.Ekstraksi
Aglikon adalah polifenol maka bersifat fenol, agak asam, larut dalam basa. Senyawa polar, kepolaran berbeda-beda. basa. berbeda-beda. Umumnya larut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air. Bentuk air. glikosida karena ada gula mudah larut dalam air, campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebalik, aglikon kurang polar seperti glikosida. isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol termodifikasi, cenderung larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform. kloroform. Bahan segar bahan ideal untuk analisis flavonoid, kering dan lama masih tetap memberi hasil baik. Bila bahan segar, baik. sisa cuplikan yang dianalisis segara keringkan mencegah kerja enzim. Ekstraksi baik dua tahap; pertama metanol-air enzim. tahap; metanol(9 : 1) dan kedua metanol-air (1 : 1). Ekstrak dicampur dan metanoldiuapkan hingga sepertiga , atau hampir semua metanol menguap. menguap. Ekstrak dapat dibebaskan dari senyawa kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil dengan ekstraksi (dalam corong pisah) menggunakan pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi kloroform. dilakukan beberapa kali, lapisan air mengandung sebagian besar flavonoid, dirotapavor. dirotapavor.

Lanjutan
Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada kepolaran, tetapi juga tempat substansi berada. berada. Bila pada vakuola sel, bersifat hidrofilik, penyarian dengan air atau pelarut alkoholik. Jika alkoholik. dalam kloroplas pelarut nonpolar sebelum alkoholik. alkoholik. Ekstraksi flavonoid tidak cocok untuk antosianin atau flavonoid kepolaran rendah. Antosian, daun rendah. segar atau bunga segera digerus dengan NaOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi pekat. terjadi ditandai adanya perubahan warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak segera dilakukan untuk mencegah hidrolsisi glikosida. glikosida. Untuk simplisia yang mengandung flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi langsung diisolasi dengan heksana atau eter beberapa menit, ingat ekstrak yang diperoleh mengandung lemak dan lilin. lilin.

2 Isolasi
Metode terbaik isolasi campuran flavonoid a.l kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Metode KKt, kertas (KLT). disarankan kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau setara. setara. Ekstrak ditotolkan 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 mm berpusat pada satu titik, keringkan bercak dengan pengering rambut. Ekstrak yang rambut. ditotolkan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama kering. dapat BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (n(t-BuOH:HOAc:H2o) 3:1:1. Kertas diangkat, keringkan di lemari (t-BuOH:HOAc: asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Eluen digunting. kedua menggunakan biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang 15% setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%. Flavonoid tidak nampak, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk kuning). mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) diperjelas dengan uap ammonia. ammonia.

Lanjutan
Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Dasarnya, cara ini meliputi penempatan kolom. campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), lanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan sesuai. keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30. 30. Mengemas kolom dengan hati-hati agar kolom homogen, Jika hatitidak ada kaca masir, dapat kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam pengelusi tingginya 10 cm. Kemasan kolom dibuat cm. bubur dengan pelarut sama, lalu dituang ke dalam kolom tanpa putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan lapisan. kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang turun. digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam. jam. Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap baik. ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran, tutup dan tambah perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali perlahanmeresap ke dalam kemasan.

Memilih kemasan kolom disesuaikan dengan flavonoid yang diisolasi;

1. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara glikosida atau glikosida dengan aglikon dan aglikon yang kurang polar 2. Silika. Baik untuk aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan falavonol 3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan flavonoid dan glikosida. 4. Gel sephadex (deret G). Digunakan memisahkan campuran, terutama berdasarkan atas ukuran molekul 5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk (LHmenggunakan pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara.

8 cm

3 cm

arah aliran pengembang pertama

arah aliran pengembang pertama

(a)

(b)

biarkan

cm

(c)

(d)

Karakterisasi dan Identifikasi

Secara umum ditentukan dengan uji warna, kelarutan, bilangan Rf dan ciri spektrum spek ultraviolet. ultraviolet. Jika tidak tercampur, dengan uap ammonia berwarna spesifik masing golongan. Falavon & golongan. flavonol kuning-kuning kemerahan. Antosianin kuningkemerahan. merah biru, flavononol orange atau coklat. coklat. Warna merah & lembayung terjadi mendadak dalam suasana asam, khalkon atau auron. auron. Flavonoid kuning terang atau jingga dalam larutan basa, jika bagian tumbuhan tanwarna diuapi amonia, terbentuk garam karena struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :

OH O OH O
-

OO

O-

Pembentu

n tru tur uinoi

ri flavonoi

engan basa

HO OH O OH NaO c, H HO O OHHO O O O OH

O O

Kompleks flavonoi

engan asam borat an natrium asetat

Adanya gugus fenol memberikan reaksi positif dengan pereaksi fenol, misalnya besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat memberi warna spesifik. Reaksi ini tidak spesifik, tidak dapat digunakan membedakan golongan dan harus diikuti oleh uji warna lainnya. Flavonoid dengan gugus hidroksil kedudukan orto berwarna kuning intensif jika bereaksi dengan asam borat dan larutan natrium asetat, seperti rekasi berikut:

Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksil dengan kedudukan lain diduga dapat membentuk ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam borat, pada pemanasan, pereaksi sitroborat, mekanisme reaksi yang terjadi belum dapat diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang terbentuk adalah kuning,kuning kehijauan dengan sinar UV 366 nm. Pereaksi AlCl3 membentuk kompleks dengan flavonoid (gugus hidroksil berkedudukan orto) menimbulkan warna kuning, ini tidak stabil dengan HCl dan terurai kembali, jika gugus hidroksil yang berkedudukan dekat gugus karbonil akan stabil dengan penambahan HCl.

l OH OH HO O l l H l O O HO O O l O

l O OH OH HO O l l O OH O l l O l O l l O l H l HO O HO O l O OH OH

Kompleks flavonoid dengan AlCl3 lewat gugus hidroksil yang berkedudukan orto dan yang berkedudukan dekat gugus karbonil, digunakan dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid. Lazim identifikasi flavonoid diawali dengan reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi, seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III) klorida, logam magnesium dan asam klorida. Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi, sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu menjadi dasar analisis spektrofotometri UVtampak.

Hidrolisis
Flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Flavanoid akar. tertentu bisa terkonsentrasi pada satu jaringan, misal antosianidin zat warna bunga, buah dan daun. daun. Sebagian besar flavonoid alam dalam bentuk glikosida, adalah kombinasi antara gula dan alkohol saling berikatan melalui ikatan glikosida. glikosida. Prinsip ikatan glikosida, gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal. asetal.

OR' C

R'-OH H
+

R C

+C
R

OR'

R' H

+
OR'

H O

OH

Aldehida

Alkohol

emiasetal

Asetal

CH OH OH OH OH OH O C H OH

CH OH O OH H OH
+

CH OH OH R'OH OH OH OH O OR'

Glukosa (rantai terbuka)

Glukosa (siklik hemiasetal)

Glukosida

Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponennya menghasilkan gula dan alkohol, alkohol disebut aglikon. Biasanya, sisa gula aglikon. dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut masingglukosida, rhamnosida, galaktosida dan gentiobiosida. gentiobiosida. Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga trigugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan gula. hanya sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton. aseton. Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa. basa.

Hidrolisis dengan asam

Biasanya dengan HCl, ikatan O-glikosida atau Cglikosida. glikosida. C-glikosida, sangat tahan asam, dibedakan waktu atau lama hidrolsis. hidrolsis. Juga dipengaruhi posisi ikatan gula pada flavonoid. flavonoid. Gula posisi 3 lebih mudah dihidrolisis dibanding posisi 7, paling mudah posisi 5. Flavonol 3-rhamnofuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida relatif lebih stabil. stabil. Cara baku hidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida glikosida: (1mg) hidrolisis 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, refluks 60 menit. Rotavapour, sisa menit. larutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. mungkin. KKt atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil : KLT15% - jika terjadi hidrolsisi, Rf akan lebih kecil, suatu Oglikosida, kemungkinan kecil bisulfat atau C-glikosida ter- glikosida. ter-O-glikosida. - Jika tidak terjadi hidrolisis, adalah C-glikosida atau glukoronida - Jika hidrolisis sebagian, mungkin glukuronida

Hidrolsis dengan enzim

Berguna menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu atau ), khas hanya memutuskan monosakarida flavonoid O-glikosida. glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis, - -glukosidase (emulsin), menghidrolsisi -D-gluksoda dan xilosida, tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida. -galaktosidase, menghidrolsisi -D-galaktosida -glikuronidase, menghidrolsisi -D-glukuronidase - Pektinase, menghidrolsis -D-poligalakturonida dan -L-rhamnosida - Antosianase, menghidrolsis sebagian besar antosiani din glikosida - Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligo sakarida secara utuh dari glikosida dalam Rhamnus frangula - Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neo 7hesperidosida.

HIDROLISIS DE GA BASA
Jarang digunakan hidrolisis gliksodia flavonoid, digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari posisi 7, 4, 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari hidroksil. hidrolisis asam. asam. Hidrolsis basa melepaskan disakarida dari 7 hidroksil asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida ----2 terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) glukosida dan 7----2 O-neohesperidosida tidak hidrolsis. Jaga tidak ada hidrolsis. kontak udara, sebab flavonoid terurai suasana basa jika ada oksigen. Kebanyakan 7 dan 4 O gliksida oksigen. pecah waktu 30 menit, beberapa glikosida perlukan waktu dua jam.Pemutusan gula yang terikat posisi 4 jam. secara selektif tanpa ganggu gula posisi 7. Cara: Cara: Larutan glikosida (10 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% refluks dengan tangas air 30 menit lingkungan N2. Netralkan dengan HCl 2N, dikromatografi kertas eluen HOAc 15% untuk isolasi flavonoid 15%