TRABAJOS PRCTICOS LABORATORIO Y PROBLEMAS

LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS LICENCIATURA EN QUMICA

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

- 2007 -

Lista de Materiales para el Trabajo en el Laboratorio Nota: cada alumno deber disponer y proveerse de estos insumos de forma personal - guardapolvo - libreta de laboratorio - anteojos de seguridad - guantes de ltex - tijera - marcador de vidrio - esptulas metlicas - pera de goma y/o propipeta - tetinas - encendedor - papel de aluminio - algodn - alcohol - escobillas - detergente - repasador - trapo rejilla o similar - pauelos de papel y/o papel higinico y/o rollos de papel de cocina - jabn de mano

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Trabajo Prctico N 1 Empleo de mtodos para la evaluacin rpida de algunos parmetros de la calidad de alimentos. Se encuentran disponibles comercialmente una serie de paquetes de reactivos especialmente preparados en composicin y concentracin adecuadas para ser empleados en al anlisis de determinados componentes de alimentos. Estos conjuntos de reactivos (o "kits") son ampliamente empleados en el rea de anlisis clnicos y de aguas, y se introdujeron con xito en los laboratorios de anlisis de alimentos. Objetivo. El objeto de esta prctica es obtener conclusiones acerca de la calidad de los alimentos analizados empleando algunos de estos conjuntos de reactivos o "kits". 1. Compuestos nitrogenados Los compuestos nitrogenados son por un lado ndices qumicos de contaminacin de aguas por materia orgnica y por otro, frutas y vegetales frecuentemente poseen altas concentraciones de nitrato debido a sobre fertilizacin u otras caractersticas del suelo. Se encuentran tambin en carnes y productos crneos, ya que las sales sdicas y potsicas de nitritos y nitratos se utilizan comnmente en los procesos de curado con el fin de desarrollar y fijar el color (los nitritos forman en la carne xido nitroso que reacciona con compuestos hemo para dar nitrosomioglobina, responsable del color rosado de las carnes curadas), para inhibir el crecimiento de microorganismos (gnero Clostridium) y para desarrollar sabores caractersticos. Desde hace tiempo se sabe que altas concentraciones de nitratos en los alimentos causan el sndrome de cianosis, particularmente en nios y adultos susceptibles. Los lactantes son particularmente sensibles a la presencia de nitratos ya que se transforma a nitrito en un medio reductor como es el intestino de los lactantes y ste causa oxidacin del Fe2+ de la hemoglobina a Fe3+ generando metahemoglobina, que tiene mucho menor eficiencia en el transporte de oxgeno en la sangre que la hemoglobina. La espinaca y la acelga, siendo de los primeros alimentos tpicos luego de la etapa de lactancia, y el agua potable son la causa de niveles bajos de oxgeno en sangre en nios pequeos. Altas concentraciones de nitratos en adultos pueden tambin reducirse a nitritos y generar nitrosaminas txicas. Segn la OMS la concentracin de nitratos mxima aceptable es de 50 mg/L (50 ppm). El C.A.A. fija un mximo para agua potable de 0.10 mg/L de nitrito y de 45 mg/L de nitrato (art. 982). El C.A.A. fija un mximo para chacinados cocidos de nitrato de sodio y nitrato de potasio de 0.03 g/100g (Cantidad residual mxima expresada como nitrito de sodio) (art. 323bis).

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a) Determinacin de nitritos En presencia de un tampn cido los iones nitrito forman con una amina aromtica una sal de diazonio. sta reacciona con N-(1-naftil)-etilendiamina dando un azocolorante violeta roijzo. La reaccin es la siguiente:

sulfanilamida

Sal de diazonio

N-(1-naftil)-etilendiamina

Compuesto diazoico

Mtodo: tiras reactivas Merckoquant 10 007 (0-80 mg/ de NO2-) La concentracin de nitritos se determina semicuantitativamente por comparacin visual de la zona de reaccin de la tira de ensayo con las zonas de una escala colorimtrica. Preparacin de la muestra: Vegetales: picar; pesar 1,0 g de muestra en un vaso de precipitado y cubrir con agua destilada; calentar con agitacin y hervir durante 15 minutos. Dejar enfriar, filtrar y llevar a 50 ml con agua destilada. El valor del pH debe encontrarse en el intervalo 1 - 13. Si el pH es menor que 1, amortiguar con acetato sdico; si es mayor que 13, ajustar a un valor de aprox. 3 - 5 con cido tartrico. Las muestras con ms de 80 mg/l de NO2- deben diluirse con agua destilada. Procedimiento: 1. Extraer una varilla indicadora del envase y cerrar inmediatamente. 2. Introducir la varilla durante 1 segundo en la solucin a examinar de tal manera que la zona de reaccin quede totalmente humedecida. 3. Sacar la varilla indicadora, sacudir ligeramente el lquido sobrante y al cabo de 15 segundos comparar la zona de reaccin con la escala de colores. Notas sobre la medicin: Despus de transcurrido el tiempo de reaccin indicado, la zona de reaccin puede continuar cambiando de color. Esto no debe ser tenido en cuenta en la medicin. Si el color de la zona de reaccin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso, debe repetirse la medicin con nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 80 mg/l de NO2 b) Determinacin de nitratos Los iones nitrato se reducen cuantitativamente a iones nitrito en presencia de cadmio, que en solucin cida forman con el cido sulfanlico una sal de diazonio. sta reacciona con un derivado del cido benzoico dando un azocolorante amarillo anaranjado. Mtodo: Metodo colorimetrico Aquamerck 1.11170.0001 (10-150 mg/l NO3 ).
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La concentracin de nitratos se determina semicuantitativamente por comparacin visual del color de la solucin de medicin con las zonas de color de una tarjeta colorimtrica. Preparacin de la muestra: Productos crneos: pesar 0.5 g de muestra, agregar 10 ml de agua, 1 ml de solucin de solucin de Carrez I, agitar, agregar 1 ml de solucin de Carrez II, agitar y llevar a 20 ml con agua destilada. El valor del pH debe encontrarse en el intervalo 4 - 10. Si es necesario, ajustar con solucin de hidrxido sdico o con cido sulfrico. Filtrar las muestras turbias. Procedimiento:
Notas

Cerrar de nuevo inmediatamente el frasco tras la toma del reactivo. Enjuagar los tubos de ensayo y la jeringa solamente con agua.
Llenar con una jeringa ambos tubos con 5 mL de muestra Aadir 1 microcuchara del reactivo NO3-1 al tubo 2 Dejar reaccionar durante 5 minutos Comparar el color con la escala colorimtrica

Cerrar el tubo 2 y agitar intensamente durante 1 min

Notas sobre la medicin: Si el color de la solucin de medicin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso, debe repetirse la medicin con nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 150 mg/l de NO3-. 2. Nquel El nquel es uno de los metales pesados, que si bien no es de los ms txicos, su presencia es indeseable. Se lo emplea en las industrias del vidrio y cermica, en galvanoplastia y como componente de catalizadores. En aguas superficiales se encuentra generalmente en la forma de carbonato cido, aunque otras sales pueden estar presentes en efluentes. Se puede requerir tambin una identificacin rpida del tipo de acero empleado en las caeras o contenedores. En la industria de alimentos se emplean catalizadores de Ni en la hidrogenacin de aceites. El C.A.A. fija un mximo para agua potable de 0.02 mg/L (art. 982). Determinacin de nquel Mtodo: Aquaquant (Merck) 1.14420 (0.02-0.5 mg/l) El nquel divalente es oxidado con I2 (reactivo Ni-1A) a un estado de oxidacin superior. El reactivo Ni-2A contiene amonaco para llevar el pH a 11,5 y destruir el I2 en exceso. El nquel reacciona con la dimetilglioxima (reactivo Ni-3A) para formar un complejo pardo rojizo.
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+ Ni2+

Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes. Procedimiento: a) Toma de muestra 20 ml a cada tubo

b) Aadir Ni-1A, mezclar, dejar en 4 gotas al tubo interior reposo durante ~ 1 minuto c) Aadir Ni-2A, mezclar d) Aadir Ni-3A, mezclar e) Medir 8 gotas al tubo interior 8 gotas al tubo interior Comparar al cabo de 3 minutos

Orientar el envase abierto de tal modo que los tubos se encuentren a mano izquierda. Llenar ambos tubos con Ia muestra de agua. Aadir los reactivos solamente al tubo interior, prximo al operador. Introducir Ia Parte de los crculos de color de Ia escala desde Ia derecha en Ia ranura del fondo de Ia caja y correrla para que salga por el lado izquierdo (rotulado), hasta que el color de Ia muestra tratada con los reactivos coincida con el circulo de color por debajo del blanco. Leer el resultado en Ia parte de Ia escala que sobresale en el lado derecho de Ia caja.

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3. Plomo En el pasado el empleo de tuberas de plomo para el agua corriente, de latas con soldadura de plomo, de recipientes de barro vidriado y de lminas de plomo utilizadas para sellar los corchos de los toneles en la elaboracin de vinos condujo a menudo a envenenamientos por plomo crnicos. Actualmente la fuente principal de contaminacin la constituyen la utilizacin de combustibles en vehculos a motor y los compuestos inorgnicos formados como consecuencia. No obstante, el contenido de plomo de los alimentos se ha elevado poco por este motivo. Por lo general asciende a 0.02-0.30 mg/kg de alimentos (con excepcin de las verduras de hoja, especialmente si estn cerca de carreteras: superior a 0.65 mg/kg). El C.A.A. fija un mximo para agua potable de 0.05 mg/L (art. 982) y un lmite de 2 mg/kg para alimentos en general (art. 156). Determinacin de plomo Mtodo: Merckoquant 10077 tiras reactivas o varillas analticas (20-500 mg/L). El plomo reacciona en solucin cida con el cido rodiznico para dar un complejo de color rojo. La concentracin de plomo (II) se determina semicuantitativamente por comparacin visual de la zona de reaccin de la tira de ensayo con las zonas de una escala colorimtrica.

+ Pb (II)

Pb

Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes. Las muestras con ms de 500 mg/l de Pb2+ deben diluirse con agua destilada. Procedimiento

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Notas sobre la medicin: Despus de transcurrido el tiempo de reaccin indicado, la zona de reaccin puede continuar cambiando de color. Esto no debe ser tenido en cuenta en la medicin. Si el color de la zona de reaccin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso, debe repetirse la medicin con nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 500 mg/l de Pb2+. 4. Cobalto La determinacin de cobalto tiene aplicacin en el control de aguas residuales, baos galvnicos, en la industria electrnica, la industria metalrgica, y en el examen y la preparacin de minerales. Determinacin de cobalto Mtodo: Merckoquant 10002. Varillas analticas para la identificacin y la determinacin de iones cobalto (II) (0-1000 mg/L). El test de cobalto Merckoquant es un test rpido de orientacin para la determinacin semicuantitativa de iones cobalto (II). El test se basa en la formacin de un complejo (tetratiocianocobalto(II)) entre iones cobalto (II) y tiocianato.

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Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes. Procedimiento: 1. Ajustar el valor de pH de la solucin problema entre 1 y 7. 2. Introducir la zona de reaccin de la varilla analtica 1 segundo en la solucin problema. 3. Eliminar el exceso de Iquido de la varilIa, sacudindola. Al cabo de 15 segundos comparar la zona de reaccin con la escala de colores. Notas sobre la medicin: A un pH de 1-7 la exactitud de la identificacin no depende del valor del pH de la solucin problema. Si la coloracin formada en la zona reactiva no coincide con la escala de colores, se espera 2 minutos y luego se compara con la escala de colores. En caso de no ser posible an clasificar el color de esta forma, es que existe una interferencia debida a iones extraos. En la identificacin normalmente interfieren los iones hierro (III) y los iones cobre. La zona reactiva de la varilla contiene un agente enmascarante especial para suprimir estas reacciones secundarias interferentes. 5. Cromo Su determinacin es importante en la inspeccin de aguas efluentes de curtiembres, plantas galvanoplsticas, como as tambin de muchos otros procesos industriales en las que se emplean sales de cromo. En alimentos su presencia es generalmente producto de contaminaciones involuntarias a partir del material metlico empleado en el procesado y menos probablemente como materia colorante. Se emplean sales de cromo en suplementos dietarios para aumentar la tonicidad muscular. Mtodo: Varillas Chromat-test 10012 (3-100 mg/L). Los iones hexavalentes de cromo en medio cido reaccionan con difenilcarbazida para formar un complejo rojo violeta. En primer lugar el cromo (VI) oxida la difenilcarbazida a difenilcarbazona reducindose a su vez a cromo (III). Estos iones cromo (III) se combinan con la carbazona formando el complejo coloreado intenso. La concentracin de cromato se determina semicuantitativamente por comparacin visual de la zona de reaccin de la tira de ensayo con una escala colorimtrica. difenilcarbazona
+ CrO4-2 Cr (III)

difenilcarbazida

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Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes. Procedimiento: 1. 2. 3. 4. Lavar la probeta con la muestra y llenarla hasta el enrase (5 ml). Aadir gota a gota el reactivo hasta que se obtenga un pH inferior a 1. Extraer una varilla indicadora del envase y cerrar inmediatamente. Introducir la zona de reaccin de la varilla indicadora durante 1 segundo en la solucin a examinar de tal manera que la zona de reaccin quede totalmente humedecida. 5. Sacar la varilla indicadora, sacudir ligeramente el lquido sobrante y al cabo de exactamente 15 segundos comparar la zona de reaccin con la escala de colores. Notas sobre la medicin: Despus de transcurrido el tiempo de reaccin indicado, la zona de reaccin puede continuar cambiando de color. Esto no debe ser tenido en cuenta en la medicin. Si el color de la zona de reaccin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso, debe repetirse la medicin con nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 100 mg/l de CrO4. 6. Perxido de hidrgeno Debido a su poder oxidante los perxidos se emplean en la industria como desinfectantes de equipos y caeras, a veces en combinacin con cido peractico. La determinacin de perxido de hidrgeno se realiza con distintas finalidades: para cuantificar la concentracin de agente efectivo en soluciones que aseguren desinfeccin, para verificar su eliminacin luego de la desinfeccin de caeras, superficies, etc. (industrias de bebidas gaseosas y jugos) y para controlar su uso inadecuado como aditivo no permitido, como por ejemplo en la conservacin de leche. Determinacin de H2O2: La peroxidasa transfiere el oxgeno del perxido a un indicador redox orgnico. Entonces se forma un producto de oxidacin azul. Mtodo: Merckoquant 1.10011 varillas analticas de 0.5-25 mg/l de H2O2. La concentracin de perxidos se determina semicuantitativamente por comparacin visual de la zona de reaccin de la tira de ensayo con las zonas de una escala colorimtrica. Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes. El valor del pH de la muestra acuosa debe encontrarse en el intervalo 2 - 12. Si es necesario, amortiguar la muestra con acetato sdico o ajustar el pH con cido clorhdrico. Las muestras con ms de 25 mg/l de H2O2 deben diluirse con con agua destilada.

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Procedimiento:

Notas sobre la medicin: Toda coloracin azul dentro de 3 minutos puede interpretarse todava como hallazgo positivo. Si el color de la zona de reaccin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso o aparece otra coloracin, debe repetirse la medicin con nuevas muestras a su vez diluidas con agua hasta que se obtenga un valor inferior a 25 mg/l de H2O2. 7. Formaldehdo El formaldehdo se utiliza como desinfectante de superficies, intercambiadores, aparatos de anlisis o como agente conservante. Debido a las limitaciones que presenta desde el punto de vista de la salud, debera comprobarse continuamente su ausencia en la fabricacin y elaboracin de productos. A pesar de todo, el formaldehdo como desinfectante no es sustituible, mientras que en el campo de los productos alimentarios y cosmticos es reemplazado cada vez por otras sustancias. Determinacin de formaldehdo: El formaldehdo forma con 4-amino-3-hidrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol tetrazina rojo prpura. una

Mtodo: Merckoquant 10036 varillas analticas de 10 - 100 mg/l. La concentracin de formaldehdo se determina semicuantitativamente por comparacin visual de la zona de reaccin de la tira de ensayo con las zonas de una escala colorimtrica.

Tetrazina rojo prpura

Muestras: Se utilizarn muestras de agua de diferentes fuentes.

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Procedimiento:

Notas sobre la medicin: Despus de transcurrido el tiempo de reaccin indicado, la zona de reaccin puede continuar cambiando de color. Esto no debe ser tenido en cuenta en la medicin. Si el color de la zona de reaccin corresponde a la tonalidad ms oscura de la escala colorimtrica o es ms intenso, debe repetirse la medicin con nuevas muestras diluidas, hasta que se obtenga un valor inferior a 100 mg/l de HCHO.

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Trabajo Prctico No2 Espectrofotometra UV/Visible. Comparacin de la sensibilidad en la determinacin de un componente en forma directa y luego de su derivatizacin (forma indirecta) 1. Determinacin de cido srbico por espectroscopa UV y de su derivado coloreado en el visible. (a) Construccin de la curva de calibracin para el cido srbico. Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solucin de cido srbico estndar (C: 1000 ppm) y colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen cada matraz con agua destilada. Tomar 0,25 ml de cada solucin y colocarlos en matraces aforados de 25 ml. Agregar a cada matraz 0,10 ml de cido clorhdrico 0,1 N y luego llevar a volumen con agua destilada. Tomar 2 ml de una de las soluciones finales y realizar el espectro de absorcin en un espectrofotmetro UV-visible para determinar la longitud de onda mxima de absorcin. Tomar 2 ml de las soluciones finales y medir la absorbancia de dichas soluciones a max determinada en el paso anterior. Construir una curva de calibracin graficando las absorbancias ledas en funcin de la concentracin de cido srbico. (b) Determinacin de la concentracin de cido srbico en vino (mtodo directo). Preparacin de la muestra Tomar 2 ml de vino y colocarlos en un baln de destilacin. Lavar la pipeta con 2-3 ml de agua. Realizar una destilacin por arrastre con vapor de agua y recoger el destilado. Procedimiento Tomar 2 ml del destilado y colocar en un matraz aforado de 10 ml. Llevar a volumen con agua destilada. Tomar 0,25 ml de la solucin y colocarlos en un matraz aforados de 25 ml. Agregar 0,10 ml de cido clorhdrico 0,1 N y luego llevar a volumen con agua destilada. Tomar 2 ml de la solucin final y medir la absorbancia a la max determinada en el punto (a) en un espectrofotmetro UV-visible. Determinar la concentracin de cido srbico a partir de la curva de calibracin determinada en el tem (a). (c) Construccin de la curva de calibracin para la colorimetra del cido srbico. Fundamento del mtodo El cido srbico reacciona con K2Cr2O7 en presencia de H2SO4 para dar un malonaldehdo intermediario, que a su vez reacciona con el cido tiobarbitrico (TBA) produciendo un producto coloreado rojo.
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Malonaldehdo

TBA

Pigmento

Procedimiento Tomar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solucin de cido srbico estndar (C: 1000 ppm) y colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen cada matraz con agua destilada. Tomar 2 ml de cada solucin y colocarlos en tubos de ensayo. Hacer un blanco con 2 ml de agua destilada. Agregar 1 ml de H2SO4 0,3 N y 1 ml de solucin de K2Cr2O7 (0.147 g/100ml) y calentar en un bao de agua caliente exactamente 5 minutos. Sumergir los tubos en un bao de hielo y agregar 2 ml de solucin de tiobarbitrico 0,5%. Colocar en un bao de agua caliente y calentar durante 10 minutos. Enfriar y realizar el espectro de absorcin en un espectrofotmetro UV-visible para determinar la longitud de onda mxima de absorcin. Medir la absorbancia de dichas soluciones a max determinada en el paso anterior. Construir una curva de calibracin graficando las absorbancias ledas a la max en funcin de la concentracin de cido srbico. (d) Determinacin de la concentracin de cido srbico en vino (mtodo indirecto). Tomar 2 ml del destilado (muestra descripta en el tem b) y realizar la reaccin segn se indic en el item (c). Calcular la concentracin de cido srbico en la muestra expresada en ppm a partir de la curva de calibracin determinada en el tem (c). 2. Determinacin de protenas en gelatina. (a) Construccin de la curva de calibracin para la protena (mtodo directo). Fundamento del mtodo Las protenas poseen una banda de absorcin en el UV entre190 y 290 nm debida fundamentalmente a la presencia de aminocidos aromtcos (tirosina, triptofano y fenilalanina). El mtodo se basa en la medicin de absorbancia a 280 nm. Es un mtodo simple, rpido y no destructivo. Procedimiento Tomar 2, 4, 6 y 8 ml de la solucin de protena estndar (C: 1000 ppm) y colocar cada volumen en distintos matraces aforados de 10 ml. Llevar a volumen cada matraz con agua destilada. Tomar 2 ml de las soluciones finales y medir la absorbancia de dichas soluciones a max: 280 nm en un espectrofotmetro UVvisible.
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Construir una curva de calibracin graficando las absorbancias ledas a 280 nm contra la concentracin de protena. (b) Determinacin de la concentracin de protena en un alimento (mtodo directo). Pesar aproximadamente 1 g de una gelatina comercial, disolverlos en un mnimo volumen de agua caliente, dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada. Tomar 1 ml de muestra, agregar 1 ml de agua destilada y medir la absorbancia de dicha solucin a max: 280 nm en un espectrofotmetro UV-visible. Calcular la concentracin de protena en la muestra expresada en ppm a partir de la curva de calibracin determinada en el tem (a). (c) Construccin de la curva de calibracin para la protena (mtodo indirecto). Fundamento del mtodo de Biuret Las protenas y pptidos reaccionan con iones de cobre en solucin alcalina, formando un quelato color violeta de configuracin desconocida. La intensidad de color es directamente proporcional a la concentracin de protenas presente en la muestra. Reactivos Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de Na2EDTA en 350 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacin constante 100 ml de solucin fresca de NaOH 5 mol/l. Aforar a 500 ml con agua destilada. Solucin de protena estndar: 20 mg/ml. Procedimiento - Preparar los tubos correspondientes a la curva de calibracin de acuerdo a la siguiente tabla: St (20mg/ml) Blanco 1 2 3 4 0 50 l 100 l 150 l 200 l Biuret (Reactivo) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Agua 200 l 150 l 100 l 50 l 0

- Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. - Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotmetro - Construir una curva de calibracin graficando las absorbancias ledas en funcin de la concentracin de protena. (d) Determinacin de la concentracin de protena en un alimento (mtodo indirecto).
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Muestra: Pesar aproximadamente 1 g de una gelatina comercial, disolverlos en un mnimo volumen de agua caliente, dejar enfriar y llevar a 100 ml con agua destilada. - Preparar los tubos correspondientes a la muestra de acuerdo a la siguiente tabla: St (20mg/ml) M1 M2 0 0 Muestra Gelatina 100 mg/10ml 200 l 200 l Agua 0 0 Biuret (Reactivo) 2 ml 2 ml

- Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. - Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotmetro Notas - El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora. - La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl

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Trabajo Prctico N 3 Mtodos enzimticos en el anlisis de alimentos a. Determinacin de componentes por medio de enzimas Determinacin de la cintica de hidrlisis enzimtica de lactosa y del efecto de factores que la modifican. Objetivo: El objetivo de este trabajo prctico es determinar el efecto de la temperatura y la presencia de sales sobre la cintica de una reaccin enzimtica, determinando su producto mediante una reaccin enzimtica. La hidrlisis de lactosa se llevar a cabo empleando una enzima comercial. El seguimiento de la hidrlisis se realizar por la determinacin de la glucosa obtenida mediante un mtodo enzimtico. Preparacin de la muestra: Diluir convenientemente la muestra tal que la concentracin de lactosa inicial sea de 5%. Preparar un volumen de 30 ml de esta dilucin. Ej.: suero de queso en polvo (3g/30ml de agua destilada; leche o suero: 30 ml de muestra tal cual; etc.). Procedimiento: 1. Ajustar la mezcla de reaccin a pH 6.0 con KOH 20%. 2. Distribuir 8 ml de muestra en tubos de ensayo rotulados de la siguiente manera: 37C, 4C y 50C. Agregar 2 ml de agua destilada en cada tubo. 3. Para estudiar la influencia de cationes monovalentes y divalentes distribuir 8 ml de muestra en tubos rotulados de la siguiente manera: Ca2+/Mg2+ 37C y Na+ 37C. Agregar 2 ml de CaCl2 0,05 M 2 ml de NaCl 0,05 M 2 ml de MgCl2. 4. Preincubar a la temperatura de reaccin durante 10 minutos (4, 37 o 50C). 5. Agregar 20 l de enzima a cada tubo y agitar. 6. Inmediatamente despus de agregar la enzima retirar una alcuota de 0.5 ml (por duplicado) de cada muestra y colocar en tubos de ensayo, e inactivar la enzima colocando los tubos a 90C durante 3 minutos. Este ser el tiempo cero de la cintica. 7. Colocar en bao de agua a 37 o 50C, o en heladera a 4C segn corresponda. Colocar bolitas de vidrio sobre los tubos que se incubarn a 50C para evitar la evaporacin de la muestra. 8. Retirar alcuotas de 0.5 ml (por duplicado) en tubos de ensayo a los tiempos indicados en la tabla e inactivar la enzima colocando los tubos a 90C durante 3 minutos. 9. Luego de inactivar la enzima, agregar 4.5 ml de agua destilada. 10. Determinar la concentracin de glucosa de las distintas alcuotas empleando un mtodo enzimtico. Tcnica para determinar glucosa 1. Extraer 20 l de muestra de cada tubo y colocar en un tubo de ensayo 2. Agregar 2 ml del reactivo de trabajo preparado. 3. Incubar en bao de agua a 37C durante 10 minutos.

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4. Realizar el mismo procedimiento con una solucin standard de glucosa 0.1% y un blanco con agua. 5. Medir la absorbancia de las muestras a 505 nm en cubetas de vidrio o plstico. Clculos Abs muestra x 0.1 x 5 % glucosa en cada muestra = -------------------------------- = G Abs standard x 0.5 % lactosa hidrolizada en cada muestra al tiempo t = G x 1.9 = Lt % lactosa hidrolizada = Lt / Lo x 100 Lo = concentracin de lactosa inicial = 5% P/V % Hidrlisis de Lactosa Muestra
1 Tincub: 37 C 2 Tincub: 4 C 3 Tincub: 50 C 4 Ca2+/Mg2+ Tincub: 37C 5 Na+ Tincub: 37C

Tiempo 0 10 20 40 60 120 V mx Informe: 1. Graficar % lactosa vs. tiempo. 2. Graficar % hidrlisis vs. tiempo, estimar velocidad mxima y concluir sobre las condiciones ptimas de actividad enzimtica de la lactasa.
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Trabajo Prctico N 4 Mtodos Enzimticos II Determinacin de actividad enzimtica en alimentos. y su termorresistencia Objetivo: determinar la actividad de distintas enzimas (ureasas, diastasas, fosfatasa alcalina) presentes en alimentos y observar su resistencia trmica. I.- Determinacin de actividad uresica en harina de soja El calentamiento o tostado de la harina de soja es esencial para eliminar factores biolgicamente activos tales como inhibidor de tripsina, hemoaglutinacin, inhibidor de lipasa, antivitamnicos, goitrognicos. Las condiciones ptimas de calentamiento se logran a travs del control de: humedad, temperatura y tiempo. Uno de los mejores indicadores in vitro para controlar si el tratamiento trmico fue el adecuado es la medicin de la actividad uresica. Altos valores de actividad uresica indicaran que el producto ha sido calentado suavemente. Bajos valores, sugieren que pudo haber habido sobrecalentamiento. Poder controlar la intensidad del tratamiento trmico aplicado es importante ya que un calentamiento inadecuado, tanto por exceso como por defecto, conducira a la obtencin de harinas de soja con un menor valor nutritivo. En el caso de sobrecalentamiento, habra prdida de aminocidos esenciales (lisina y arginina1); en el caso de un calentamiento insuficiente, la eliminacin de factores biolgicamente activos no sera completa. I.1.- Preparacin del extracto enzimtico - Mtodo de Natelson (modificado): Mezclar 30 g de harina de soja (recin molida) con 50 mL de cido sulfrico N/1000. Agitar en un agitador de Khan durante 20 min. Aadir 150 mL de agua destilada y continuar la agitacin durante 15 min ms (producto A). Realizar el tratamiento trmico segn se indica ms adelante, filtrar y, sobre el filtrado as obtenido, determinar actividad uresica. I.2.- Tratamiento trmico: Al producto obtenido de la extraccin slido lquido del paso anterior (producto A) se le aplicarn los siguientes tratamientos trmicos: - autoclave: 0 y 30 min - 90C: 0 y 30 min

Algunos autores consideran que a la arginina, y tambin a la histidina, como esencial para nios pero no para adultos. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Qumica Orgnica

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I.3- Medicin actividad enzimtica Usando urea como sustrato, se determinar la actividad uresica en la harina de soja. Para ello se practicar, con agua destilada, una dilucin del extracto de soja tratado trmicamente en proporcin 1:82. I.3.1.- Fundamento del mtodo: La ureasa, al actuar sobre la urea, la hidroliza originando anhdrido carbnico y amonaco. El amonaco reacciona con fenol e hipoclorito (reaccin de Berthelot), en presencia de un catalizador (nitroprusiato de sodio), generando un producto cuya coloracin es proporcional a la cantidad de urea hidrolizada. I.3.2.- Reactivos: - Solucin de sustrato estndar: 0.6 g urea/L. - Reactivo 1: fenol, nitroferricianuro de sodio y etilen-bis-ditiocarbamato manganoso. - Reactivo 2: hipoclorito de sodio y p-toluen sulfocloramida en hidrxido de sodio. I.3.3.- Procedimiento: Se mezcla por agitacin suave 50 L de extracto de dilucin adecuada y 20 L de sustrato. Juntamente realizar un blanco. Incubar durante 5 minutos a 37C. Agregar 1 mL del reactivo 1 y 1 mL del reactivo 2. Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37C. Luego agregar 8 mL de agua destilada y mezclar por inversin. Medir A 540nm, dentro de los 20 min. Ajustar el cero del espectrofotmetro con agua destilada. Esquemticamente: muestra (L) agua destilada (L) sustrato (L) incubar a 37C x 5 min reactivo 1 (mL) 1 reactivo 2 (mL) 1 mezclar x agitacin suave incubar a 37C x 5 min agua destilada (mL) 8 mezclar x inversin leer A (540 nm) muestra 50 20 blanco 50 20 1 1 8

Las diluciones adecuadas pueden variar, dependiendo de cada partida de harina y del estado de conservacin de las muestras. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Qumica Orgnica

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II.- Determinacin de actividad -amilsica en miel La actividad diastsica de la miel ha recibido considerable atencin por aos como indicador de "frescura". El tratamiento trmico (63C/30 min. o 77C/pocos seg), ha sido rutinariamente usado para destruir levaduras y retardar la granulacin en mieles. El Codex Alimentarius y el CAA exigen valores mnimos de diastasa como control de la exposicin de la miel al calentamiento. II.1.- Tratamiento trmico de las muestras: Sobre aprox. 2 g de miel se realizarn los siguientes tratamientos trmicos: - 63 C a 0, 15, 30, 45 y 60 min. - 85C a 0, 10, 15, 30 y 45 min. Luego del calentamiento, enfriar las muestras en bao de hielo. Pesar aprox. 1g de muestra y diluir a 10 mL con agua destilada. Realizar las determinaciones de actividad enzimtica por duplicado. II.2.- Medicin actividad enzimtica II.2.1.- Fundamento del mtodo: El sustrato, almidn tamponado, al ser incubado con la muestra se hidroliza enzimticamente. Esta se detiene por el agregado de reactivo de iodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidn no hidrolizado3. La disminucin de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en UA (unidad amiloltica: la cantidad de enzima contenida en 100 mL de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 min). UA = A control - A muestra x 1000 A control II.2.2.- Reactivos:4,5 - Solucin de sustrato: solucin de almidn 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1 mol/L en NaCl 0.15 mol/L. Almacenar en heladera. - Reactivo de iodo: solucin 0.01 eq/L de I2 en cido clorhdrico 0.02 mol/L. Almacenar en heladera.

El color de la reaccin del Amilokit no es azul debido a un exceso de yodo que junto con el HCl presentes en el reactivo de yodo son necesarios para asegurar (i1) la completa inhibicin de la reaccin enzimtica; (i2) la estabilidad del color y para (ii) eliminar la influencia que pudiera haber de las protenas en la reaccin de color.
4 5

Amilokit Wiener lab Debido a la alta actividad amilsica de la saliva, hay que evitar toda contaminacin donde esta est involucrada. El sustrato debe medirse con pipeta de 5 mL o con pipeta de 1 mL de doble aforo. No debe soplarse por la pipeta ya que la mnima contaminacin con saliva deteriora definitivamente al sustrato.

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II.2.3.- Procedimiento: Incubar 1 mL de sustrato atemperado a 37C, con 400 L de muestra en bao de agua a 37C. Realizar paralelamente un control. A los 7 min y medio exactos, se agrega 1 mL de reactivo de iodo. Se mezcla por agitacin suave y se retiran los tubos del bao. Inmediatamente se agregan 8 mL de agua destilada. Luego se mezcla por inversin. Medir A 640nm, dentro de 1h. Si la temperatura ambiente es superior a 25C, leer antes de los 20 min. Ajustar el cero del espectrofotmetro con agua destilada. Esquemticamente: muestra sustrato (mL) 1 bao de agua a 37C x unos minutos 400 muestra (L) agua destilada (L) incubar a 37C x 7 min 30 seg exactos iodo (mL) 1 mezclar x agitacin suave y retirar del bao agua destilada (mL) 8 mezclar x inversin leer A (640 nm) control 1 400 1 8

III.- Determinacin de la actividad de fosfatasa alcalina en productos lcteos La determinacin de fosfatasa alcalina est destinada a decidir si un producto lcteo ha sido pasteurizado en condiciones de tiempo y temperatura adecuados. El CAA y las Normas Mercosur exigen que la prueba de fosfatasa alcalina en productos lcteos d negativa. III.1.- Preparacin de muestra: - leche en polvo: reconstituir aprox. 1g en 10 mL de agua. - leche fluida: tal cual - manteca: pesar aprox. 1 g de muestra, extraerla por debajo de la superficie con un cuchillo limpio. - crema de leche: tal cual III.2.- Medicin actividad enzimtica III.2.1.- Fundamento del mtodo: La determinacin de actividad fosfatasa se basa en la hidrlisis enzimtica, en medio alcalino, del fenilfosfato disdico (NaFF) a fenol y posterior determinacin colorimtrica del fenol liberado con 4-aminoantipirina (4-aminofenazona) y ferricianuro como agente oxidante.

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III.2.2.- Reactivos: - Solucin sustrato: NaFF (1.4 mM) en buffer de pH 10 de aminometilpropanol (3 M) y 4-aminoantipirina (29 mM). Conservar en heladera durante no ms de 5 meses. - Reactivo de color: ferricianuro de K (10 mM). Estable durante 5 meses a temperatura ambiente y al abrigo de la luz. - Estndar: solucin de fenol (200 UI/L) III.2.3.- Procedimiento: Preincubar 0.5 mL de solucin de sustrato unos minutos a 37C. Luego, agregar 50 L de muestra, mezclar e incubar exactamente 10 min6. Realizar paralelamente el estndar y un blanco de reactivos. Agregar 2.5 mL de reactivo de color y retirar los tubos del bao. Medir A 520nm, dentro de los 30 min. Ajustar el cero del espectrofotmetro con agua destilada. Esquemticamente: blanco estndar sustrato (mL) 0.5 0.5 incubar a 37C en bao de agua x unos minutos (4 min) muestra (L) 50 estndar (L) H2O destilada 50 (L) mezclar bien (vortex) incubar a 37C x 10 min exactos react. de color 2.5 2.5 (mL) mezclar inmediatamente (vortex) leer a A (520 nm) III.3.- Informe: La cantidad de producto formado luego del tratamiento, U, est relacionada con la cantidad de producto formado en el tiempo cero (sin tratamiento trmico), Uo. La actividad remanente (RA) se puede expresar como: RA = 100 U/Uo Nota: En trabajos prcticos tomaremos U = A al tiempo correspondiente U0 = A al tiempo 0 Construir el grfico de actividad enzimtica remanente en funcin de las condiciones de tratamiento. Concluir sobre la cintica de inactivacin y la estabilidad relativa de las enzimas.
6

muestra 0.5 50 -

2.5

El tiempo y la temperatura de reaccin son crticos. Un min o 1C en exceso o defecto pueden producir un error de 10%.

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Trabajo Prctico No. 5. Aplicaciones de microscopa en ciencia de alimentos La primera aplicacin de la microscopa en el estudio de alimentos data de1850, cuando Arthur Hassall demostr que con ayuda del microscopio era posible diferenciar el caf molido de la achicoria. Fue desde entonces un tipo de anlisis muy empleado para detectar adulteraciones en alimentos, aditivos e ingredientes. Durante el siglo XX una legislacin cada vez ms rgida limit la adulteracin en alimentos y drogas, y por lo tanto fueron necesarios procedimientos analticos ms precisos. Actualmente, la microscopa es una herramienta poderosa para complementar tcnicas tales como reologa o calorimetra y se emplea cada vez ms para estudiar la influencia de los ingredientes y las condiciones de procesado en la estructura de los alimentos. Las tcnicas ms empleadas tradicionalmente para caracterizar componentes y estructuras en alimentos son: microscopa ptica, microscopa con luz polarizada y con contraste de fase Se han desarrollado potentes herramientas para la caracterizacin microscpica de materiales, cuya aplicacin en tecnologa de alimentos tiene amplias oportunidades de favorecer la investigacin Entre algunas de las ms importantes de las tcnicas ms actuales se encuentran: Microscopa de estreo fluorescencia. Microscopa lser confocal de barrido.. Microscopa de fluorescencia confocal. Microscopa electrnica de barrido. Microscopa electrnica de transmisin. Microscopa de fuerza atmica. Adems, mediante el acoplamiento con platinas trmicas controladas se pueden registrar los efectos de la temperatura simultneamente con los cambios de estructura y el desarrollo de mtodos computacionales de anlisis de imgenes permite una cuantificacin de los fenmenos. Objetivo: Observar cambios estructurales producidos en los alimentos al atravesar los materiales temperaturas crticas, como aquellas correspondientes a sus transiciones de estado. Desarrollo de la prctica. Se realizarn observaciones en funcin de la temperatura y el tiempo de exposicin a temperaturas dadas. Materiales Muestras: Sacarosa amorfa. Polivinilpirrolidona (PVP) Maltodextrinas. Caf instantneo. Microscopios pticos con polarizadores. Baos secos. Platina de Koffler con luz polarizada. Pinzas y esptulas metlicas pequeas.

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Dispositivo para tratamiento trmico y observacin de las muestras. El dispositivo que muestra la figura ha sido diseado para mantener el contenido de agua constante a medida que la muestra se somete a tratamiento trmico. Portaobjetos Microscope glass slide
a)
Supercooled material Muestra

O-ring de goma Rubber O-ring

b)
Metal clip metlico

Sujetador

Las observaciones a realizar son las siguientes: a) Cambios de estructura en polmeros provocados por la transicin vtrea. b) Cristalizacin de sacarosa amorfa. c) Apelmazamiento debido a la temperatura en caf instantneo. d) Gelatinizacin de almidn. Datos: - Temperaturas de transicin vtrea de los materiales a analizar en funcin del contenido de agua. - Temperaturas de gelatinizacin del almidn. Informe: 1. Realizar observaciones preliminares de: opacidad del material, color, presencia de anisotropa, formas y tamaos de las partculas, definicin de las formas. 2. Someter al material dado a temperaturas inferiores, superiores y cercanas a las crticas de acuerdo con los datos suministrados. La sacarosa amorfa se someter a tratamiento trmico en la platina de Koffler y se realizarn observaciones peridicas para concluir acerca de la velocidad de cristalizacin. 3. Observar nuevamente el material y concluir acerca de los cambios ocurridos, explicndolos en base a las temperaturas y tiempos de tratamiento. 4. Analizar las condiciones para observacin de las muestras (con/sin luz polarizada, con/sin tinciones).

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Trabajo Prctico No. 6. Medida de los tiempos de relajacin transversal en sistemas modelo situados en distintas regiones del diagrama de fases. La espectroscopa de resonancia magntica nuclear se basa en la medida de la absorcin de la radiacin electromagntica en la regin de las radiofrecuencias, aproximadamente de 4 a 900 MHz. En el proceso de absorcin estn implicados ncleos de tomos que tienen propiedades de espn y momento magntico tales que al ser expuestos a un campo magntico intenso absorben radiacin electromagntica como consecuencia del desdoblamiento de sus niveles de energa inducido por el campo magntico. Desde hace unas dcadas existen en el mercado equipos que operan a bajas frecuencias para el anlisis de rutina en alimentos. Estos funcionan midiendo una cantidad de tomos de hidrgeno para ciertos componentes en la muestra de inters. Los tomos de H ms comnmente analizados por esta tcnica son los de lpidos o agua, en fases lquidas o slidas y polmeros. Los ncleos de H en estas molculas se comportan como pequeas barras de imn y cuando la muestra se coloca en un campo magntico se alinean paralelas al mismo. Posteriormente, la orientacin de los ncleos se cambia por medio de la aplicacin de un pulso de radiofrecuencia. Luego, estos ncleos de H vuelven a alinearse con el campo magntico del imn, emitiendo una seal de radiofrecuencia que es detectada por el equipo. Bsicamente, el equipo consta de un imn permanente con un espacio entre los polos para colocar las muestras y una fuente de radiofrecuencias. En el mtodo por pulsos los ncleos se excitan por un pulso de radiofrecuencias (de unos microsegundos de duracin) que excita los H de todas las fases. Luego el pulso se apaga y los ncleos retornan a su estado original, mediante el proceso de relajacin, emitiendo una seal a medida que lo hacen. La seal emitida tiene una intensidad mxima cuando todos los ncleos han rotado 90 respecto de la direccin del campo magntico esttico. La evolucin de la seal en el tiempo contiene la informacin ms importante para propsitos analticos. A medida que la muestra retorna a su posicin de equilibrio, la oscilacin del vector magnetizacin en el plano x,y (perpendicular al campo magntico permanente) emite el exceso de energa en forma de una seal de voltaje decreciente que se denomina decaimiento libre de la induccin: FID (free induction decay). Esta seal es recibida por un sepentn colocado en el plano x,y. La amplitud inicial de la seal FID es proporcional al nmero de protones en la muestra. Ya que esta seal es una medida de amplitud en funcin del tiempo, se llama grfico en el dominio de los tiempos. Caractersticas de las aplicaciones analticas: 1. La amplitud inicial de la seal es proporcional al nmero total de ncleos que absorben a la frecuencia dada 2. Las seales debido a ncleos en distintos ambientes (fsicos o qumicos) relajan a distinta velocidad. Cada componente decae con un tiempo de relajacin caracterstico. Las seales debidas a H en fase slida decaen ms rpido que las de H en fase lquida.

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3. A veces se obtiene ms informacin si se aplican series de pulsos de radiofrecuencias en secuencias determinadas en lugar de un nico pulso. 4. Por medicin de la seal en intervalos de tiempo adecuados se obtiene toda la informacin necesaria para el anlisis. Se hace por microprocesadores acoplados. 5. La relacin entre la amplitud de la seal y el tiempo es logartmica y se aproxima a 0 a aproximadamente 5 veces el tiempo de relajacin. Ejemplo: El tiempo de relajacin para la manteca de cacao en cacao en polvo es 10 ms. Todos los ncleos vuelven a su estado alineado en menos de 1s. Para mejorar la reproducibilidad se acumulan varios barridos de una muestra. Aplicaciones de rutina Las aplicaciones de rutina de la RMN son las determinaciones de contenido de agua, de lpidos totales, y el ndice de grasa slida. En las mediciones relativas, como aquellas en las que se determina el ndice de grasa slida, se realiza el cociente entre la amplitud de dos seales (una que corresponde al contenido total de lpidos en ambas fases y otra a los lpidos en la fase lquida) y la medicin no requiere el conocimiento de la masa de muestra. En las mediciones absolutas la amplitud de la seal se normaliza por la masa de muestra para obtener el porcentaje en peso de un determinado componente. Existen diferentes tipos de tcnicas desarrolladas para equipos de resonancia magntica nuclear resuelta en el tiempo, entre ellas hay algunas aplicaciones de gran inters en el rea de alimentos. Las aplicaciones absolutas permiten cuantificar de manera sencilla y rpida algunas variables de gran importancia como por ejemplo contenido de agua, de azcares, de aceite. En muchas aplicaciones absolutas se emplea la medicin del eco de espn en el que se aplica ms de un pulso de radiofrecuencias para dar la seal a ser medida. El experimento comienza con un pulso de 90 pero a un cierto tiempo T (de unos ms) luego del primer pulso se aplica otro de 180 y al tiempo 2T aparece la seal del eco de espn. Esta metodologa es especialmente til para la medicin de aceite en semillas en donde tambin hay una cierta cantidad de agua. Se puede medir a un tiempo (entre 7 y 10 ms) en el que solo el aceite contribuye a la amplitud de la seal. Aplicaciones especiales Las aplicaciones especiales se basan en que la tcnica permite relacionar la movilidad de los tomos en anlisis a travs de sus procesos de relajacin. De esta manera, es posible obtener informacin que se relaciona con las carctersticas mecnicas y trmicas de los materiales, con sus transiciones de fase y estado y con procesos de difusin, complementando otras tcnicas como la calorimetra de barrido diferencial, o anlisis trmico mecnico. Es por eso que se aplica en Ciencias de polmeros y alimentos, farmacia. Existen dos tipos fundamentales de procesos de relajacin (regreso a la condicin de equilibrio) en espectroscopa de RMN 1) relajacin longitudinal o espnred y 2) relajacin transversal o espn- espn. Las relajaciones espn-espn se realiza entre los ncleos que absorben y las relajaciones espn-red se realizan con todo el conjunto de tomos de la muestra. En este ltimo caso, cuando dos ncleos vecinos se hallan en diferentes estados cunticos magnticos los campos magnticos de los mismos pueden interactuar entre s produciendo un intercambio de estados cunticos. Como consecuencia el tiempo de vida promedio de un ncleo excitado se
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acorta. La relajacin espn-espn es un proceso de disminucin exponencial de primer orden que se caracteriza con un tiempo de relajacin T2. Para slidos cristalinos o lquidos muy viscosos el fenmeno de relajacin espn espn es ms eficiente y los tiempos son muy pequeos (10-4 s). Cuanto menor es la viscosidad de la muestra ms largos son estos tiempos. Desarrollo de la prctica Realizaremos observaciones de sistemas con distintos tiempos de relajacin en funcin de la viscosidad o caractersticas fsicas del medio. Objetivo 1: evaluar la influencia de las transiciones de fase o estado sobre los cambios en los tiempos de relajacin transversal. Se analizar el efecto de: a) El tratamiento trmico de suspensiones de almidn, seguido de enfriamiento. b) El tratamiento trmico en soluciones de gelatina, seguido de enfriamiento. c) La recristalizacin de azcares de soluciones sobresaturadas Materiales Almidn. El almidn es un polmero de glucosa parcialmente cristalino y parcialmente amorfo. La amilosa y algunas ramificaciones de amilopectina contribuyen a formar las regiones amorfas y las cadenas externas de amilopectina contribuyen a la regin cristalina. El almidn se vuelve totalmente amorfo despus de la gelatinizacin. Cuando el producto gelatinizado se enfra, la fraccin amilosa liberada del grnulo gelifica durante el enfriamiento posterior, aumentando notablemente la viscosidad del medio. Protenas. Gelatina. Est compuesta por fracciones de colgeno hidrolizado y tiene la propiedad de gelificar al enfriar, generando una estructura ordenada de caractersticas mecnicas ms semejantes a un slido. Azcares Segn la zona del diagrama de estado en que se encuentren los sistemas, se observar la re-cristalizacin de azcares. Se analizarn transiciones de los distintos componentes mencionados, a distintas temperaturas y tiempos de calentamiento/enfriamiento. Procedimiento Colocar 4 mL en tubos estandarizados para RMN de cada una de las muestras. Medir T2 empleando la secuencia de eco de espn Carr-Purcel-Meiboon-Gill (CPMG) (90 180 ). Calcular T2 interpretando los datos X, Y con la siguiente ecuacin: I = A1 exp (-t/T2) Donde, I es la intensidad en la escala de ordenadas y t es el tiempo. A1 es una constante relacionada con la fraccin de agua no congelada (cuanto mayor es A1
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menor es la formacin de hielo) y T2 se relaciona con la movilidad molecular (cuanto mayor es T2 mayor es la movilidad de los protones en la matriz). Informe. a) Indicar en cada caso qu proceso est detectando a travs de T2. b) Relacionar los resultados con las caractersticas de cada material. Objetivo 2: Observar la transicin vtrea en muestras de productos de cereal a un dado contenido de agua, a travs del anlisis de los tiempos de relajacin T2 obtenidos por RMN en el dominio del tiempo. Materiales Se analizarn muestras de cereales de un dado contenido de agua en funcin de la temperatura. Procedimiento Se colocarn aproximadamente 2 g de muestra en tubos de vidrio de 8 mm de dimetro (tubos para RMN). Se determinarn los tiempos de relajacin T2 a travs del anlisis del decaimiento libre de la seal luego de un pulso de 90(FID). Informe. a) Graficar los tiempos de relajacin en funcin de la temperatura y concluir sobre el valor de Tg . b) Explicar los resultados obtenidos. c) Comparar con datos de bibliografa para sistemas relacionados (almidn, gluten, harinas, etc.).

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Trabajo Prctico N 7 Mtodos electroanalticos para la caracterizacin de alimentos Objetivo: Caracterizar la variacin de la conductividad elctrica y el pH con el contenido acuoso, complementadas por la determinacin de cenizas. Sobre distintas muestras de miel se realizarn las siguientes determinaciones: Contenido de agua. Conductividad especfica en funcin del % de miel en base seca. pH en funcin del % de miel en base seca.

Contenido de agua. (A.O.A.C., 969.38 B,1990). El contenido de agua en mieles se determinar por refractometra a 20C (refractmetro Abb). Procedimiento: Abrir el doble prisma y esparcir la muestra con ayuda de una varilla sobre la cara inferior, cerrar los prismas firmemente y dejar un minuto para que la temperatura de la muestra y el aparato se equilibren. Buscar en el campo del visor la franja que indica reflexin total; ajustar dicha franja en el punto de interseccin de la cruz del visor, rotando el tornillo compensador si la lnea no fuera ntida y presentara coloracin. Leer el ndice de refraccin directamente sobre la escala, hacer 2 o 3 lecturas y promediarlas. Calcular el % de agua a partir de la tabla correspondiente (A.O.A.C., 940.39, 1990). Como el refractmetro a utilizar no cuenta con camisa termostatizada, se har circular agua durante las observaciones, se leer la temperatura en el termmetro del aparato y se corregir la lectura para obtener la equivalencia a 20C, como se indica la nota al pie de la tabla. El instrumento puede chequearse con agua destilada a 20C (ndice de refraccin = 1,3330). Conductividad. El valor de conductividad es muy usado en el anlisis de aguas para obtener un valor estimativo rpido del contenido de slidos disueltos. La conductividad est ntimamente relacionada con la suma de la concentracin de los cationes o aniones determinados qumicamente. Aproximadamente el valor de la conductividad en S/cm por un factor que oscila entre 0,55 y 0,7 es igual al contenido de slidos en mg/L. El agua de mar tiene conductividades de alrededor de 50000 S/cm; aguas residuales entre 600 a 2000 S/cm; aguas de pozo 150 a 1000 S/cm y de ro de 100 a 3000 S/cm.
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La determinacin de la conductividad especfica en mieles, es un parmetro que permite establecer la calidad de las mismas. Adems puede emplearse para determinar la procedencia botnica de la miel, particularmente para distinguir entre miel floral y miel de mielada. La conductividad se mide mediante instrumentos comerciales de lectura directa de S/cm a una dada temperatura (generalmente 20 o 25C) con un < 1%. Se puede realizar la determinacin mediante una celda adecuada y un dispositivo puente de Wheatstone o similar, para lo cual se debe calcular la constante de conductividad de la celda con una solucin de KCl 0,01 M. Determinacin de la constante de la celda. Solucin de KCl 0,01M: Disolver 745,6 mg de KCl en agua bidestilada y diluir a 1 L. Se coloca la solucin de KCl, previamente diluda 1:10, en un vaso de precipitados. Sumergir en esta solucin un termmetro y los electrodos de conductividad (previamente enjuagados en la solucin de KCl diluda). Leer el valor de la conductancia elctrica en S o mS. Para evitar que los resultados de la medicin se desvirten a causa de fenmenos de polarizacin, el proceso de medicin debe ser rpido. La constante de la celda K se calcula con la siguiente frmula: K = 1,278 GKCl K = constante de la celda en cm--1. GKCl = conductancia en mS (lectura del conductivmetro). 1,278 = conductancia terica de la solucin de KCl 0,01 M a 20C en mS*cm.

Luego de cada lectura enjuagar el electrodo con agua destilada y para evitar el envejecimiento del platinado, se guarda en agua destilada mientras no se use. Determinacin de la conductividad especfica Medir el contenido de agua de la muestra de miel con el refractmetro. Preparar 100 ml de las siguientes soluciones de miel, expresadas en % base seca: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90. Colocar en un vaso de precipitados un volumen de solucin de miel tal que cubra los electrodos. Con el resto de la solucin enjuagar cuidadosamente los electrodos de conductividad y colocarlos en la solucin. Leer el valor de la conductancia de la solucin a 20 C en mS o S. La conductividad especfica (k) de la solucin es:

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k=K*G k = conductividad especfica en mS/cm o S/cm. K = constante de la celda. G = lectura del conductivmetro en mS o S. Graficar k en funcin del % de miel en base seca. Determinacin de pH. Se determinar el pH de las soluciones de miel preparadas para medir conductividad. Para ello se utilizar un pHmetro calibrado con buffers a pH 4 y 7. Graficar pH en funcin del % de miel en base seca. Informe. Observar y analizar las diferencias de comportamiento entre las mieles de distinto origen y explicar los grficos obtenidos en funcin del contenido de agua.

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Trabajo Prctico No. 8 Intermediarios y productos de reacciones de deterioro: Maillard y oxidacin de lpidos 1) Reaccin de Maillard. Determinacin de la cintica de formacin de fluorescencia y de absorbancia en el espectro visible. La incubacin de protenas o aminocidos con glucosa lleva a la formacin de productos de glicosilacin a travs de la reaccin de Maillard. Productos intermediarios de esta reaccin compleja se caracterizan por su fluorescencia y con el tiempo llevan a la formacin de pigmentos pardos y/o formacin de entrecruzamientos. La composicin del medio (pH, presencia de sales) y de factores ambientales (temperatura, humedad a la que el producto est expuesto) determinan la cintica de las reacciones. Objetivos: determinacin de las caractersticas y cintica de generacin de compuestos fluorescentes y pigmentos marrones (productos finales) provenientes de la reaccin de Maillard. Seleccin de los intermediarios adecuados para la determinacin del avance de la reaccin. Preparacin de las soluciones modelo: Preparar soluciones de glucosa - glicina (1:1) en buffer fosfato 0,1M de pHs 5 y 7. Colocar 4 ml de sistemas en frascos y taparlos adecuadamente. Incubar a 45 y 70C. A intervalos de tiempo adecuados, retirar 2 frascos y medir la absorbancia a 420 nm y la fluorescencia (excitacin a 347 nm y emisin a 415 nm). Informe: * Caracterizar los espectros de fluorescencia y absorbancia de los sistemas previamente tratados en condiciones (tiempo, temperatura) en las que se desarroll la reaccin de Maillard. * Determinar la cintica de cambios de pH, desarrollo de fluorescencia y absorbancia en dichos sistemas previo almacenamiento a temperaturas entre 45 y 70C. * Observar las curvas tpicas de intermediarios y productos. 2) Reaccin de oxidacin de lpidos. Determinacin de la absorbancia a 234 nm (dienos) y a 268 nm (trienos), y de la concentracin de hexanal (producto secundario). Se emplean diferentes mtodos para monitorear la oxidacin de aceites y alimentos lipdicos: ndice de perxido, disminucin de O2, medicin a dos longitudes de onda, compuestos voltiles, etc. El anlisis de compuestos voltiles, producidos por la oxidacin de lpidos, es un buen indicador para evaluar la estabilidad y el flavor en alimentos. Algunos de los compuestos voltiles que se forman y ms empleados para el seguimiento de la oxidacin son: hexanal, pentano, 2-heptenal, octanal, nonanal.

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Preparacin de la muestra: Se envasan las muestras correspondientes (segn lo indicado por los docentes, estas pueden ser: aceite de soja comercial, papa y/o tomate deshidratados), y se sellan hermticamente. Se realiza un tratamiento trmico a 70C, o se almacenan a 25C a la luz y en oscuridad. A distintos intervalos de tiempo se retiran frascos, sobre los cuales se determinarn hexanal por GC y la absorbancia a 234 y 268 nm. Previo al anlisis por CG, las muestras deben ser acondicionadas en un bao de agua a 60C por 10 min. Determinacin de hexanal por la tcnica de headspace: Se toma 1 ml del espacio cabeza con una jeringa para headspace y se inyecta directamente en el cromatgrafo gaseoso. Las condiciones de corrida son: - T inyector = T detector (FID) = 250C - Modo splitless - Flujo = 1 ml / min - Columna: SPB-1 (no polar) - Programacin de temperaturas: 50C, 0' 5C / min

70C, 1'

200C, 10' 35C/min

Se graficar rea del pico de hexanal en funcin del tiempo de tratamiento trmico. Determinacin de absorbancia: Hacer una dilucin conveniente de la muestra con ter etlico y leer las absorbancias a 234 y 268 nm. Graficar absorbancia (corregida por concentracin) en funcin del tiempo de tratamiento trmico. Objetivos: determinar las caractersticas y cintica de generacin de compuestos secundarios (productos finales) provenientes de la oxidacin de lpidos. Informe: * Determinar la cintica de formacin de hexanal y absorbancia a dos longitudes de onda en productos grasos previo almacenamiento a 70C y distintos tiempos. * Observar las curvas tpicas de intermediarios y productos. Decidir acerca de la sensibilidad de los distintos marcadores.

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