UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL SIMN RODRGUEZ NCLEO CANOABO INGENIERIA DE ALIMENTOS LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Prctica n 1

Anlisis microbiolgico de microorganismos indicadores de calidad alimentaria y contaminacin fecal

Facilitador: Ing. Tedder Molina

Participantes: Danyela Figueroa C.I.: 19842394 Gustavo A. Luna C.I.: 18257127 Seccin: B

Canoabo, noviembre de 2010

Anlisis microbiolgico de microorganismos indicadores de calidad y contaminacin fecal

Introduccin

Existen procedimientos

diversos basados

mtodos en en

para

cuantificar lquidas serie, en

el y

nmero slidas.

de Los

microorganismos

presentes

muestras

diluciones

haciendo

crecer

microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable en un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos, y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termo tolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

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DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES , COLIFORMES FECALES Y E. COLI

P ROPSITO DE LA PRCT ICA Evaluar mediante las tcnicas de recuento estndar en placas o por el mtodo de nmero ms probable (NMP) la poblacin de algunos indicadores de calidad sanitaria y de contaminacin fecal presente en la muestra bajo anlisis.

R EVISIN BIBLIOGRFICA

Microorganismos Indicadores

Microorganismos Aerobios mesfilos

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las

condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son recomendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminacin de la materia prima - Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin - La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos - La inmediata alteracin del producto

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El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

Enterobacterias Las Enterobacterias son bacilos GRAM-, son las bacterias de mayor tamao que colonizan al hombre y presentan variada morfologa, son anaerobios facultativos (crecen en Aerobiosis y en anaerobiosis),

metablicamente activos, que crecen en medios simples y n o forman esporas. La mayora son mviles y unas pocas son capsuladas (algunas especies de E. Coli y Klebsiella). Sus envolturas celulares son las tpicas de todo GRAM-. Taxonmicamente la familia est dividida en tribus, las tribus en gneros, los gneros en especies. Algunas especies expresan serovariedades, se diferencian por serotipificacin. Los gneros ms importantes son: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Proteus y Yersinia, entre otras. La mayora de las especies son oportunistas, pero algunas son alta y especficamente patgenas y causan enfermedad entrica, urinaria o sistmica. Las Enterobacterias pueden vivir libres forman parte de la FLORA en la naturaleza y

habitualmente

NORMAL DEL COLON

HUMANO, en escaso porcentaje (ms del 98 % de la flora intestinal son anaerobios de los gneros Bacteroides y Prevotella). Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente perianal), el tracto genital femenino y, muy ocasionalmente, el tracto respiratorio superior de los individuos sanos. Las Enterobacterias aparecen en una mayor proporcin en la flora de individuos hospitalizados, especialmente en aquellos que sufren enfermedades graves y debilitantes.

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Escherichia coli es la especie ms comnmente encontrada en la flora normal, seguida en orden de importancia por Klebsiella, Proteus y Enterobacter. Los gneros Salmonella, Shigella y Yersinia son patgenos primarios para el hombre y no forman parte de la flora normal. Ciertos serotipos de E. Coli son patgenos primarios.

Bacterias

Coliformes,

como

indicadores

de

la

calidad

higinica de las Alimentos El empleo de coliformes como indicadores de organismos patgenos en el agua es una prctica vigente en la actualidad. Las bacterias Coliformes, comprenden la E. Coli y Enterobacter aragenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram, negativo que fermentan la lactosa con produccin gas. E. Coli tiene su localizacin primaria en el tracto intestinal del hombre y de los animales, y de all su nombre Coli, q ue deriva del colon. E. Coli se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad. Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higinica de los alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran nmero de organismos de los alimentos y en el agua indica la polucin o contaminacin fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carcter intestinal la presencia de polucin indica la posibilidad de que existan agentes etiolgicos productores de estas enfermedades.

Escherichia Coli.

Se considera indicador de contaminacin fecal reciente, humana o animal en productos como agua embotellada, leche y jugos, alimentos infantiles, y alimentos procesados, en general. Se caracteriza por ser coliformes termotolerantes (fermenta lactosa a 44.5C) que produce indol a partir de triptfano y produce -glucuronidasa, caractersticas que se usan

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para su identificacin en laboratorio, generalme nte en la etapa final del NMP o de alguno de los otros mtodos, incluyendo Petrifilm.

Pruebas Bioqumicas IMVIC Indol: fundamento; el indol es uno de los productos finales del metabolismo de las protenas. Donde la enzima triptonasa acta sobre el triptfano nico aminocido que contiene el anillo indol. Medio de siembra; Agua peptonada. Reactivos utilizados; 10ml de Kovacs. Es positiva cuando hay formacin de un anillo rojo intenso y negativa cuando no hay cambio de coloracin. Rojo De Metilo: fundamento; Algunas bacterias fermentan la glucosa y producen gran acidez aumentando gradualmente al concentracin de los iones de hidrogeno lo cual provoca que el pH del medio disminuya por debajo de 4,5 ocasionando un cambio de viraje. Medio de siembra; medio RM-VP. Reactivos utilizados; 5 gotas de rojo de metilo. Se considera positiva una coloracin rojo brillante dbil o anaranjado y negativa una coloracin amarillo.

Voges Proskaver: fundamento; Consiste en la deteccin del acetil metil carbinol que es un compuesto intermedio del metabolismo de la glucosa. Medio de siembra; medio RM-VP. Reactivos utilizados; 1 ml de alfa naftol a 6%, 1ml de KOH a 16%. Es positiva una coloracin rojo carmes y negativa si no cambia de color.

Citrato:

fundamento;

Determina

la

capacidad

que

tiene

un

microorganismo de utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono para su desarrollo y crecimiento. Medio de siembra; Caldo de citrato Koser. No se utilizan reactivos para la realizacin de esta prueb a. Cuando hay presencia de turbidez es considerada positivo caso contrario negativa.

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Ureasa: Algunas Bacterias tienen grandes cantidades de la enzima ureasa, la sintetizan produciendo amoniaco y dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo.

M ATERIALES Y MTODOS

Materiales y equipos

Medios de cultivo y reactivos

Pipetas graduadas de 1 ml. Pipetas volumtricas de 1 ml. Placas de petri. Gradillas. Pinzas. Tubos de ensayo. Mechero. Asa y aguja de platino. Contador de colonias. Estufa. Frascos y tubos de dilucin.

Agar plate cound. Agar Mc- Conkey. Agar KF. Agar EMB. Caldo EC. Caldo lauril sulfato triptosa (LST). Caldo MR- VR. Solucin de rojo de metilo. Solucin de -naftol al 6%. Solucin de KOH al 16%. Agua peptonada al 0.1% para diluciones.

Mtodos: Recuento de microorganismos aerobios mesfilos en placas. Recuento de Enterobacterias en placas. Determinacin de Coliformes totales, fecales, y E. Coli, a travs de mtodo del numero ms probable (NMP).

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R ESULTADOS DEL RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS , E NTEROBACTERIAS , COLIFORMES TOTALES , FECALES , E. COLI Y
PRUEBAS BIOQUMICAS

Experiencia n 1.- Recuento de microorganismos aerobios mesfilos en placas, por siembra en profundidad.

Se tom una muestra de jugo de meln, comprado en un local de venta de comida y lunchera llamado La Tropi, al mismo se le realiz tres diluciones comenzando con 10 ml del jugo diluido en 90 ml de agua peptonada (10 -1), luego de esta dilucin se tomo 1 ml y se trasvas a un tubo de ensayo con 9 ml de agua peptonada (10 -2) y de igual manera, de esta dilucin se tom 1 ml y se trasvas a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua peptonada (10 -3 ). Se realiz dos siembras en placas en profundidad por cada dilucin con Agar Plate Count y se dejo en incubacin durante 24 horas a 35-37C, luego de la incubacin se hizo el contaje de las colonias en las seis placas dando como resultados los siguientes:

Cuadro n 1.- Conteo de colonias de aerobios mesfilos y recuento de UFC/ml de muestra (jugo de meln)

Dilucin 10 -1

Dilucin 10 -2

Dilucin 10 -3

Expresin de resultados (UFC/ml)

Incontables Incontables

279 268

171 192 4.1*10 4

Experiencia n 2.- Determinacin de Enterobacterias

De las diluciones realizadas del jugo de meln, se realizaron dos siembras en profundidad por cada dilucin, esta vez utilizando como

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medio de cultivo el Agar Bilis Rojo Violeta (es igualmente eficaz usar como medio de cultivo el Agar McConkey); y se incub a 35 -37C durante 24 horas, luego de este tiempo se hizo el contaje de las colonias de Enterobacterias, resultando las siguientes:

Cuadro n 2.- Conteo de colonias de Enterobacterias y recuento de UFC/ml de muestra (jugo de meln)

Dilucin 10 -1

Dilucin 10 -2

Dilucin 10-3

Expresin de resultados (UFC/ml)

Incontables Incontables

293 257

165 179 4.1*10 4

Experiencia n 3.- Determinacin de Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichia Coli

Para la determinacin de coliformes totales, se realizaron siembras en tubos con Caldo Lauril Sulfato de Sodio (tres tubos por dilucin) y se llev a incubacin durante 24 horas a 32 -35C, luego del perodo de incubacin, se realizaron las observaciones de turbidez, precipitaciones y presencia de gas, dando como resultados los siguientes:

Cuadro n 3.- Coliformes totales

Dilucin 10 -1

Dilucin 10 -2

Dilucin 10 -3

Expresin de resultados (NMP/ml)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+) 2400

Nmeros de resultados positivos 3/3

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Partiendo de los tubos positivos a la presencia de Coliformes Totales se realiz una siembra por triplicado de cada dilucin, usando como medio de cultivo el caldo E. Coli; se llev a incubacin en bao de agua circulante durante 24 horas a 45 0,05 C, luego del perodo de incubacin, se realizaron las observaciones de turbidez, precipitaciones y presencia de gas, dando como resultados los siguientes:

Cuadro n 4.- Coliformes fecales

Dilucin 10 -1

Dilucin 10 -2

Dilucin 10-3

Expresin de resultados (NMP/ml)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+)

Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+) 2400

Nmeros de resultados positivos 3/3

De los tubos positivos a la presencia de coliformes fecales, se realiz la siembra en superficie en placa con Agar EMB para determinar la presencia de E. Coli, y se llev a incubacin a 35C durante un tiempo de 18-48 horas. Luego de transcurrido ese tiempo, se realiz la observacin de turbidez, precipitaciones y presencia de gas, dando como resultado el siguiente:

Cuadro n 5.- Escherichia Coli

Dilucin 10-1 No hubo crecimiento de colonias de E. Coli

Dilucin 10-2 No hubo crecimiento de colonias de E. Coli

Dilucin 10-3 No hubo crecimiento de colonias de E. Coli

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De las placas donde no hubo crecimiento de E. Coli, se tomaron las colonias aisladas de la bacteria presente, con las cuales se realiz una siembra en tubos para realizarle las pruebas Bioqumicas IMVIC luego de haberse realizado el incubado durante 18-48 horas a 35-37C. Los resultados de estas pruebas fueron los siguientes:

Cuadro n 6.- Pruebas bioqumicas

Prueba Indol Rojo de metilo Voges Proskaver Ureasa

Reactivo Kovacs Rojo de metilo -naftol + KOH ---------------

Resultado
Tubo 1 NEGATIVO (-) Tubo 2 NEGATIVO (-) Tubo 1 POSITIVO (+) Tubo 2 POSITIVO (+) Tubo 1 NEGATIVO (-) Tubo 2 NEGATIVO (-) Tubo 1 NEGATIVO (-) Tubo 2 NEGATIVO (-)

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D ISCUSIN DE RESULTADOS

El

principal objetivo de la prctica fue la determinacin de

microorganismos indicadores de calidad alimentaria y contaminacin fecal, permitiendo determinar en qu condiciones sanitarias se encontraba la muestra (jugo de meln), obtenido del establecimiento La Tropi; se aplicaron las tcnicas de siembra y recuento en placas y en tubos de la Profesora Miriam Barreto y se realizaron las experiencias previstas obteniendo como resultado el crecimiento de microorganismos Aerobios Mesfilos, tal como se demuestra en el cuadro n 1, para el cual se obtuvieron 4,1*104 UFC/ml, este resultado se encuentra dentro de los parmetros establecidos por la Comisin Internacional de Especificaciones Microbiolgicas para alimentos el cual es de 1.0*10 5 (ICMSF, 1994).

Por su parte el recuento de las Enterobacterias se encuentra denotada en el cuadro n 2, el cual fue de 4,1*10 4 UFC/ml, estas bacterias representan una contaminacin por microorganismos en el que pueden encontrarse bacterias patgenas causantes de enfermedades, esto puede deberse a una mala prctica de elaboracin del jugo, falta de higiene por parte del manipulador del mismo, as como inadecuadas medidas sanitarias que garanticen la inocuidad del jugo. Las Enterobacterias son de gran

importancia, ya que son organismos involucrados en la degradacin de los alimentos; son indicadores de contaminacin fecal en los alimentos y algunos son patgenos de origen alimentario.

Las colonias presentes eran lactosa positiva ya que presentaron su coloracin roja que permitieron su identificacin. Asimismo se realiz la determinacin coliformes totales y fecales, cuyo recuento se hizo por el mtodo del Nmero Ms Probable, en los cuadros n 3 y 4 se muestra que su NMP fue 2800, ya que los tres tubos de cada dilucin dieron positiva la presencia de coliformes totales y fecales, este

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valor sobrepasa los establecidos por el IMCSF 1994, donde dice que el NMP debe ser de 100, esto denota que no se utiliz agua potable para la elaboracin del jugo. En la determinacin de Escherichia coli, se utiliz un medio de cultivo adecuado para su aislamiento, y luego de su incubacin se pudo observar que no hubo presencia de colonias caractersticas de la bacteria, pero si se not un crecimiento bacteriano al cual se le realizaron las pruebas de identificacin bioqumica IMVIC para determinar el tipo de bacteria presente, cuyo resultado fue positivo en la prueba de Rojo de metilo, lo que nos indica que dichas bacterias realizan fermentacin cido mixta.

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CONCLUSIONES

El recuento de microorganismos aerobios mesfilos fue de 4.1*10 4 UFC/ml Las Enterobacterias presentes en la muestra dieron un recuento de 4.1*10 4 UFC/ml. Se determin que tanto los coliformes totales como los fecales en la muestra dieron como resultado un NMP/ml 2800 ya que los tubos de todas las diluciones dieron positivo. No se detect la presencia de Escherichia coli, y en su aislamiento se detect la presencia de bacterias de fermentacin cido mixtas. El jugo analizado presento una elevada carga microbiana, indicando inadecuada manipulacin del producto y/o uso de agua no potable.

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B IBLIOGRAFA
PELCZAR, M. (1977). Microbiologa. 4 Edicin. Editorial Mc Graw Hill. Mxico. VANDEVENNE, C. RIBES, M. (2002). Mtodos de anlisis microbiolgicos de los alimentos. Ediciones Daz de Santos, S. A. Madrid-Espaa

Pginas web
http://www.scribd.com/doc/27307620/metods-aerobios-mesofilos http://www.scribd.com/doc/6467706/ENTEROBACTERIAS http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EpZyyEpuAZFmLJrXEl.ph p http://www.monografias.com/trabajos911/pruebas-bioquimicas/pruebasbioquimicas.pdf