Bacterias Objetivos: Despus de este laboratorio el estudiante podr: 1.

Conocer que es un dominio y cmo se clasifican los organismos en cada Dominio. 2. Conocer las caractersticas que distinguen a las clulas procariotas de las eucariotas. 3. Conocer cules son las caractersticas principales de los organismos dentro del Dominio Bacteria. 4. Identificar las formas principales de las bacterias. 5. Realizar prcticas aspticas bsicas para manejar cultivos de bacterias. 6. Poder preparar una laminilla sencilla de una bacteria. 7. Conocer y realizar varios mtodos simples para hacer cultivos de bacterias. 8. Conocer algunos ejemplos acerca de la importancia econmica, ecolgica y mdica que tienen las bacterias. Introduccin: Los organismos procariotas son por mucho los ms abundantes en la Tierra. Se pueden encontrar en prcticamente todas partes, incluso en ambientes extremos qumicos, de altas temperatura y de gran variabilidad en disponibilidad de oxgeno. Aunque quizs se reconozcan ms por incluir organismos patgenos causantes de enfermedades y desastres agrcolas, la realidad es que obtenemos beneficios de muchos procariotas y su importancia, mdica, ecolgica y econmica, es grande. Los organismos procariotas juegan un papel vital en la productividad y el ciclo de sustancias esenciales para todas las dems formas de vida; siendo las bacterias los nicos organismos capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico. Entre los beneficios econmicos tenemos el uso de bacterias acido-lcticas para fermentar o crecer cultivos de alimentos como por ejemplo yogurt, queso y mantequilla. Algunos usos industriales son el uso de bacterias para la produccin de etanol, para la aceleracin del proceso de compostaje y para la produccin de abono para la agricultura. Inclusive algunos procariotas pueden descomponer contaminantes lo cual es til en la bioremediacin. Los organismos procariotas estn clasificados dentro de dos dominios: Bacteria y Archaea. Los organismos eucariotas se clasifican dentro del dominio Eukarya. Los organismos clasificados dentro del Dominio Archaea, antes se clasificaban junto a las bacterias, pero difieren de las mismas en composicin de membranas, las secuencias de ARN y ADN. Las archaebacterias es un grupo diverso de organismos que aunque tiene organismos que crecen en ambientes no extremos incluye organismos metangenos y extremfilos. Ejemplos de ambientes extremfilos donde viven archaebacterias son: altas temperaturas y alta salinidad En este laboratorio estudiaremos organismos pertenecientes al Dominio Bacteria: las bacterias y las cianobacterias o algas verde-azules. Repasando las caractersticas de las

clulas procariotas tenemos que no poseen organelos rodeados por membranas y que el material gentico se encuentra dentro de una molcula circular de ADN. Pueden, adems tener pequeos anillos de ADN adicional, que se conocen como plsmidos. Las bacterias y cianobacterias tienen la mayora una pared celular, pero su composicin no es igual a la pared celular vegetal, ya que el componente principal de la pared en bacterias son peptidoglicanos, mientras el de las clulas vegetales es celulosa. Muchas de las bacterias son organismos hetertrofos, lo cual quiere decir que consiguen su alimento de otros organismos. Algunas de las bacterias hetertrofas son parasticas, por lo cual se conocen como bacterias patgenas; mientras que otras son saprofticas, alimentndose de organismos muertos, causando la descomposicin de los mismos y as permitiendo que los elementos puedan estar disponibles para ser usados como materia prima por otros organismos. Algunas bacterias son auttrofas, o sea que producen su propio alimento por medio de fotosntesis o quimiosntesis. Todos los organismos vivos dependemos de las bacterias y cianobacterias fijadoras de nitrgeno, ya que ningn otro organismo vivo tiene esta capacidad que libera el nitrgeno para que este pueda ser usado como materia prima para compuestos orgnicos. Es en este contexto que podemos encontrar las micorizas que son bacterias fijadoras de nitrgeno viviendo en simbiosis con plantas. La forma de reproduccin ms comn es la fisin binaria. Existen otras formas de reproduccin menos comunes, como sera la conjugacin por la se produce recombinacin gentica de todo o parte del material gentico de las clulas. En condiciones adversas muchas bacterias pueden formar endosporas. Antes de proceder a realizar los ejercicios se debe conocer que hay varias reglas y procedimientos aspticos a seguir al trabajar con cultivos de bacterias: Su instructor proveer e ilustrar las reglas y mtodos correctos para trabajar con bacterias. Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que est manejando bacterias. Tenga precaucin al trabajar con los mecheros. Limpie su mesa de trabajo, antes y despus de realizar los ejercicios, con un desinfectante. Lvese las manos bien, antes y despus del laboratorio. Todo cultivo deber ser manejado con cuidado y deber ser tratado como posible patgeno.

Ejercicio 1: Identificando bacterias. Debido al tamao pequeo de las bacterias y su similaridad en estructura celular, para identificar bacterias se utilizan criterios diferentes que los usados en la identificacin de organismos macroscpicos. Para identificar bacterias se usan diferencias en tincin, formas de crecimiento, nutricin y fisiologa. En este ejercicio se observarn e

identificarn formas comunes de bacterias. Se practicar adems como realizar una preparacin y tincin simple de una laminilla de bacterias. 1.a. Identificando morfologa individual de bacterias Las bacterias se clasifican bajo tres formas bsicas: bacilos, cocos o espirilos. Los bacilos tienen una forma ovalada y alargada formando bastoncillos. Los cocos tienen una forma circular y los espirilos o vibrios parecen espirales o comas. Estos pueden estar formando cadenas o grupos, aunque cada clula manteniendo su integridad. Materiales Microscopio compuesto Laminillas preparadas de bacilos, cocos y espirilos Aceite de inmersin Papel de lente Procedimiento: Consiga una laminilla preparada de bacterias. Tendr varias laminillas a observar de bacterias mixtas o individuales de cocos, bacilos o espirilos. Monte la laminilla en su microscopio a una baja magnificacin y observe. Qu puede distinguir? Qu implica esto acerca del tamao de las bacterias?

Cambie a una magnificacin mayor, usando el objetivo 40X y observe. Qu formas puede observar?

Cambie ahora al objetivo 100X. Enfoque la laminilla usando solamente el botn de ajuste fino o micromtrico. Mueva el objetivo fuera de la laminilla y coloque una gota de aceite de inmersin sobre la laminilla. Ponga el lente objetivo en posicin y enfoque otra vez. * Recuerde que al terminar de ver una laminilla con aceite de inmersin se debe limpiar la laminilla y el lente objetivo con papel de lente para remover los rastros del aceite. NO use otro tipo de papel ya que rayara los lentes. Puede observar alguna diferencia al usar el aceite de inmersin? Dibuje los tres tipos de bacterias por su forma.

1.b. Identificando formas de bacterias que ocurren en nuestras encas Las partculas de alimento que se acumulan en las encas crean un ambiente ideal para el crecimiento de las bacterias. La mezcla de material de los alimentos y las bacterias forman lo que conocemos como placa dental. En este ejercicio se observar las formas de las bacterias que forman parte de la placa dental . Materiales Microscopio compuesto Aceite de inmersin Papel de lente Laminillas y cubreobjetos Palillos de dientes Pinche de ropa de madera Mechero Fsforos Botella con gotero con tinte de Cristal violeta Botella con gotero de agua destilada Bandeja para tensin Botella con agua destilada Papel secante o papel toalla. Procedimiento Usando un palillo de diente raspe el rea del diente cercana a la enca. Ponga en una laminilla una gota de agua bien pequea. Coloque su muestra sobre la laminilla. Deje que se seque la laminilla al aire. Usando un mechero y agarrando la laminilla por un extremo con el pinche de ropa flamee la laminilla a un ngulo de 45 Esto lo debe hacer rpidamente y varias veces. La laminilla debe estar caliente, pero que la pueda tocar. Con un gotero aplique 3-4 gotas de cristal violeta sobre la laminilla en la bandeja de tincin y deje teir por 1 minuto. Lave con chorro suave de agua destilada hasta que la mayor parte del color se vaya de la laminilla. Seque gentilmente con papel secante (Bilobous paper) o papel toalla. Observe bajo el microscopio. Para poder observar la laminilla mejor deber usar el objetivo 100X y aceite de inmersin. Qu formas puede observar en la laminilla?

Las bacterias estn individuales o agregadas? Se pueden observar todas las formas de las bacterias?

Qu tipo de bacterias son las ms abundantes?

Ejercicio 2: Identificacin de formas de colonias Aunque usualmente para la clasificacin de las bacterias se deben realizar tinciones y otras pruebas, observaciones de la morfologa de las colonias pueden ser tiles para la identificacin preliminar de las especies. Una colonia se puede formar a partir de una sola bacteria y se compone de millones de clulas. Como regla general en estudios de bacterias no se cuentan organismos individuales sino cantidad de colonias. Es importante adems poder describir estas colonias. En este experimento observaremos placas con algunas bacterias para ver las caractersticas que muestran las mismas en cuanto al crecimiento de las colonias. Para este ejercicio tendr disponible en el laboratorio varias placas Petri con diferentes colonias de bacterias creciendo en cada placa. Busque una placa y sin abrirla observe usando el estereoscopio. Describa las colonias usando los siguientes criterios: forma, color, apariencia, forma del borde y textura de la colonia. Compare con otras placas disponibles. Los criterios a seguir son los siguientes: a. Forma de la colonia: puntiforme (a) (menos de 1mm de dimetro), redonda (b), irregular (c) o filamentosa (d). b.

c. Margen de la colonia: entero (a), curveado (b), ondulado (c), lobulado (d) o filamentoso (e). La diferencia entre curveado, ondulado o filamentoso estriba en el tipo de curva en el borde. El lobulado es irregular, el curveado es regular y ms apretado, mientras que el ondulado son curvas mas relajadas.

d. Textura de la colonia: lisa (a), concntrica (b), arrugada (c) o con curvas o contorno (d). La diferencia entre concntrica y con curvas es que el dimetro de la concntrica se va haciendo ms pequeo de forma regular a medida que se sube en la colonia, mientras en la que tiene curvas el contorno es mas irregular.

e. Color de la colonia. Porque no usamos cantidad de colonias como criterio?

Pudo hacer todas las observaciones de las colonias para todos los cultivos? Qu problemas encontr?

Es este el mejor mtodo o el mtodo primordial para identificar las colonias? Explique.

Ejercicio 3. Bacterias en el medio ambiente. Las bacterias se encuentran en una gran variedad de medios ambientes. En este ejercicio compararemos diferentes medios para observar la presencia de bacterias en varios medios de nuestro entorno. Materiales: Platos Petri con agar Papel de parafina Isopos estriles de algodn Lpiz de cera Incubadora. Procedimiento:

1. Obtenga un plato petri de su instructor y escoja un lugar para muestrear. Algunos ejemplos pueden ser estanques de agua, exposicin de la placa en algn lugar en particular como por ejemplo ambiente areo o de tierra. Asegrese de que se escojan diferentes ambientes por mesa de laboratorio. Para transferir muestras lquidas a su placa siga el siguiente procedimiento para hacer la siembra en la placa. Con un isopo estril de algodn recoja parte de la muestra. Sin presionar fuertemente el la superficie del agar distribuya su muestra con movimientos de izquierda a derecha sobre un tercio de la superficie del agar (1). Gire su placa y empezando en parte del rea 1 haga lo mismo a la regin 2. Gire su placa nuevamente y empezando en la regin 2 haga lo mismo en la regin 3. Este mtodo le asegurara que las bacterias vayan reduciendo en densidad y para la regin 3 pueda ver colonias aisladas.

2. Si la muestra proviene de algn lugar seco como por ejemplo tierra, tome un poco de muestra y humedezca con agua hasta poder sacar parte del material diluido en el agua y siembre como se mostr anteriormente para una muestra lquida. Es importante que no tome mucho particulado grande sino el que se encuentra diluido en agua y que pudo tomar con el isopo. 3. Si el lugar a muestrear es aire en algn lugar en especfico abra la placa en el lugar deseado y exponga el agar por 10 a 15 minutos. 4. Luego de tomar la muestra cierre el plato con un pedazo de parafina, rotule y coloque en incubadora boca abajo por 48 horas a 25 C. Saque de la incubadora y guarde en la nevera hasta la prxima reunin de laboratorio. 5. Observe las placas y compare con los dems ambientes muestreados por sus compaeros. Observ diferencias entre los ambientes muestreados?

Qu tipos de ambientes mostraron ms crecimientos de bacterias?

Ejercicio 4: Resistencia a antibiticos y antispticos Aun cuando la mayora de las bacterias son beneficiosas y necesarias para mantener un ambiente ptimo, un crecimiento descontrolado puede ser daino o destructivo para otras especies. Algunas bacterias son patgenas, o sea causan enfermedades en plantas y animales. Se han desarrollado agentes para controlar el crecimiento de las bacterias. En este ejercicio se usaran antibiticos, antispticos y desinfectantes para ver como estos afectan el crecimiento de las bacterias. Un antibitico es un qumico producido por una bacteria o un hongo que tiene el potencial de controlar el crecimiento de otra bacteria y hongo. Otros agentes que usamos para limpieza se usan para el control de bacterias. Aquellos usados para controlar bacterias sobre tejidos vivos se conocen como antispticos y los que se usan es objetos o superficies no vivas son los desinfectantes. Para realizar este experimento se deben seguir los pasos de asepsia a continuacin para evitar la contaminacin de nuestros cultivos. 1. Al abrir cultivos esto se debe hacer por la cantidad mnima de tiempo posible. 2. Las agujas de inocular se deben pasar por una llama y dejar enfriar brevemente antes de introducirla en el cultivo de bacterias. Si utiliza hisopos de algodn, no tiene que realizar este paso. 3. Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que est manejando bacterias y mantenga los cultivos lejos de su cara. 4. No agite los tubos con cultivos de bacterias antes de abrir y mantenga los mismos en una rejilla para sostenerlos mientras no lo estn usando. 5. Lvese las manos con agua y jabn antes y despus de hacer el ejercicio. 6. Limpie su mesa de trabajo con un desinfectante antes y despus de los ejercicios de este laboratorio. Materiales Plato Petri con agar Isopos estriles de algodn Parafina Mechero con alcohol Fsforos Tubo Con cultivo en caldo de bacterias Discos estriles Discos con antibiticos

Lpiz de cera Procedimiento: 1. Rotule en plato petri y divida en 4 cuadrantes el fondo de su plato con el lpiz de cera. Rotule 1-4. 2. Prepare un sembrado en su plato como muestra la figura. Abra el tubo con el cultivo y flamee levemente la abertura. Con isopo estril de algodn remueva un poco del caldo. Flamee abertura del tubo y cierre. Abra su plato y sin presionar fuertemente cubra toda la superficie del agar con movimientos de izquierda a derecha, tomando el cuidado de llegar hasta los bordes del plato petri. Rote el plato 45 y haga lo mismo. Cierre su plato.

3. En el centro del cuadrante 1 coloque un disco estril. Porque se coloca un disco estril? 4. En el centro del cuadrante 2 coloque un disco con antibitico provisto por su instructor. Es importante anote el nombre del antibitico ya que puede variar por mesa de laboratorio. 5. En el cuadrante 3 coloque un antisptico. 6. En el cuadrante 4 coloque un desinfectante. 7. Selle su placa con parafina y coloque boca arriba en incubadora a 37 C. Observe de 24-48 horas y transfiera a nevera. 8. En su prximo periodo de laboratorio examine su placa para ver si sus tratamientos afectaron el crecimiento de las bacterias. Mida el dimetro (en milmetros) de la zona de inhibicin de cada tratamiento (zona alrededor del disco donde el crecimiento de las bacterias fue inhibido por el agente usado). 9. Compare sus resultados con las dems placas hechas en el laboratorio. Fue la zona de inhibicin igual para todos los tratamientos?

Fueron los tratamientos con antibiticos ms efectivos que los antispticos o desinfectantes?

Basado en sus resultados, qu antisptico fue ms efectivo? Qu desinfectante?

El efecto de los agentes usados es el mismo para todo tipo de bacterias? Por qu?

Ejercicio 5. Efectividad en lavarse las manos para inhibir el crecimiento de las bacterias. En este ejercicio compararemos el crecimiento de las bacterias con distintas maneras de limpiarse las manos versus el no lavrselas. Materiales Plato Petri con agar Papel de parafina Jabn Lpiz de cera Incubadora Procedimiento: 1. Divida un el fondo de un plato petri en 4 partes y numere de la siguiente forma: a. Manos sin lavar b. Manos lavadas con agua c. Manos lavadas con agua y jabn d. Manos lavadas con agua y jabn luego de 5 minutos 2. Con mucho cuidado levante un poco la placa (para evitar exponer la placa a las bacterias del ambiente) y toque sin presionar fuertemente la placa con el dedo sin lavar. 3. Lave una mano con agua solamente y presione en otro cuadrante con un dedo hmedo 4. Lave sus manos con agua y jabn y con un dedo hmedo presione sobre otro cuadrante. 6. Espere 5 minutos y use ese mismo dedo para presionar el ltimo cuadrante.

7. Cierre la tapa con papel de parafina, incube por 24 horas a 25C, y transfiera a nevera hasta el siguiente periodo de laboratorio. 8. Analice el resultado y llene la siguiente tabla: Cuadrante A B C D Cantidad de colonias Cantidad de colonias diferentes Apariencia de las colonias

Pudo observar ms de un tipo de bacterias en la placa? Describa los diferentes tipos de crecimiento.

Qu cuadrante tuvo menos colonias y cual tuvo ms? Discuta sus resultados.

Se observaron diferencias notables entre el tratamiento C y D? Qu espera que pase si pasa ms tiempo?