Estudo Comparativo in vitro da Atividade Antibacteriana de Produtos Fitoterpicos Sobre Bactrias Cariognicas

COMPARATIVE STUDY IN VITRO OF the antiBACTERIAL activity FROM phytotherapeutic products against CARIOGENIC BACTERIAS

Milana Ramos Santana DRUMOND* Ricardo Dias de CASTRO** Rossana Vanessa Dantas de ALMEIDA*** Maria do Socorro Vieira PEREIRA**** Wilton Wilney Nascimento PADILHA*****

RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana de produtos fitoterpicos comerciais frente aos microrganismos cariognicos: S. mutans (ATCC 2575); S. sobrinus (ATCC 27607); S. sanguis (ATCC 10557) e L. casei (ATCC 4646). Os produtos utilizados foram: gua Rabelo - (A); Malvatricin - (B); Mel Rosado - (C); Apis Flora - (D); Fitogargarejo - (E )e leo de Copahyba - (F). Empregou-se a tcnica de Concentrao Inibitria Mnima (CIM); cada linhagem bacteriana foi reativada em caldo Tryptic Soy Broth, incubada a 370C por 24 horas em microaerofilia e semeadas em meio de cultura gar Mueller Hintn pela tcnica de inundao. Os produtos fitoterpicos foram empregados em concentraes de 100% 0,19% e os halos de inibio mensurados. Verificou-se para a linhagem S. mutans as CIMs de 0,19%; 12,5%; 1,56%; 3,12% e 0,78% para os produtos B, C, D, E e F respectivamente. Para a linhagem S. sanguis as CIMs observadas foram de 0,39%; 25%; 1,56%; 6,25% e 0,78% em B, C, D, E e F respectivamente. Sobre o S. sobrinus apenas o produto B mostrou atividade antibacteriana na concentrao de 0,19%. Em relao ao L. casei os produtos B, D, E e F apresentaram respectivamente CIMs de 0,19%; 0,78%; 0,78% e 6,25%. O produto B apresentou os maiores halos frente a todas as linhagens. Concluiu-se que os produtos tiveram desempenhos variados, tendo o Malvatricin obtido a melhor CIM frente a todas as linhagens, bem como os maiores espectros de inibio e gua Rabelo no apresentou atividade antibacteriana.

ABSTRACT
This study aimed at evaluating the antibacterial activity of commercial products made with phytotherapeutic products against the cariogenic bacterias: S. mutans (ATCC 2575); S.sobrinus (ATCC 27607); S.sanguis (ATCC 10557) and L. casei (ATCC 4646). The products used were: gua Rabelo - A; Malvatricin - B; Mel Rosado - C; Apis Flora - D; Fitogargarejo - E and leo de Copahyba - F. The technique used was the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), where each bacteria sort were reactivated in Tryptic Soy Broth soup, incubated to 37C by 24 hours in microaerophily and seeded on Mueller Hintn Agar by inundation technique. The phytotherapeutic products were used pure and with the concentrations of 100% the 0,19% and measured inhibition halos. Were verificated for S. mutans the IMCs the 0,19%; 12,5%; 1,56%; 3,12% e 0,78% for the products B, C, D, E and F respectively. For S. sanguis the MICs were observed: 0,39%; 25%; 1,56%; 6,25% e 0,78% for B, C, D, E and F respectively. About S. sobrinus just the product B averaged antibacterial activity for the concentration 0,19%. In relation to L. casei the products B, D, E and F presented respectively MICs the 0,19%; 0,78%; 0,78% e 6,25%.The product B averaged the best halos against all sorts. Were concluded that the products had different performances, having the product B obtained the best MIC against all bacteria sorts, as well as the biggest inhibition specteres and the product A didn't present any antibacterial activity.

DESCRITORES Fitoterpicos; Microbiologia oral; Odontologia preventiva.

DESCRIPTORS Phytotherapic agents; Oral microbiology; Preventive dentistry.

* Aluna de Graduao do Curso de Odontologia da Universidade Federal da Paraba. ** Aluno de Graduao do Curso de Odontologia da Universidade Federal da Paraba. Bolsista PIBIC/CNPq/UFPB. *** Professora de Odontopediatria da FACIMP - MA. **** Professora Adjunta do Depto. de Biologia Molecular da UFPB. ***** Professor Titular de Clnica Integrada do Depto. de Clnica e Odontologia Social da UFPB.

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INTRODUO A necessidade de medicar e a disponibilidade de plantas mescladas no processo civilizatrio constituram os primrdios do ato de curar, remontando antiguidade o uso de vegetais como medicamentos (LIMA, 1997). No Brasil esto localizadas cerca de 20% das 250 mil espcies medicinais catalogadas pela UNESCO, facilitando o aproveitamento do potencial curativo dos vegetais para o tratamento de doenas, inclusive na rea de odontologia (NUNES et al. 1999). A crie dentria uma doena multifatorial, onde se verifica a interao de quatro fatores principais: hospedeiro, dieta, tempo e a microbiota (SOUSA; GIL, 1998). A formao do biofilme dental ocorre atravs da fixao de bactrias sobre as superfcies dentrias. Assim, o biofilme, devido a sua caracterstica contnua de agresso, vai adquirindo novas espcies em cada etapa do seu desenvolvimento. Dentre estes microorganismos pode-se citar: S. mitis, S. sagis, S. sobrinus, S. mutans e L. casei (GEBARA et al., 1996). A remoo do biofilme dentrio um fator importante na preveno da crie e doena periodontal. Frente s limitaes dos mtodos mecnicos de higiene agentes antimicrobianos so estudados no controle do biofilme. Em face do exposto, diversas substncias tm sido utilizadas, por meio de enxge bucal, na reduo da microbiota cariognica (JARDIM; JARDIM, 1998). Alguns produtos de origem vegetal so utilizados na higiene oral com a vantagem de no apresentarem efeitos colaterais, sendo relatados apenas uma pequena ardncia com possibilidade de eroso na mucosa, quando comparados a produtos sintticos (MORAN et al., 1992). Assim, com o estudo cientfico do uso de determinadas plantas nas doenas bucais, a odontologia poder beneficiar a populao ao aderir com a fitoterapia. O leo de copaba vem sendo indicado, h mais de quatro sculos, para diversos fins farmacolgicos. Este leo exudato do tronco da copaibeira3. Os estudos de atividade antibacteriana mostraram atividade bactericida e bacteriosttica do leo frente ao Streptococcus mutans (VEIGA; PINTO, 2002). A malva uma planta herbcea, dispersa no continente europeu, africano e americano. Para fins farmacolgicos utilizam-se suas folhas, flores, razes. utilizada para inflamaes da pele, boca, garganta (laringite, faringite), tratamento de problemas respiratrios e irritaes gastrintestinais (CORREA, 1984; MATOS, 1991; MARTINS, 1998). Weyne et al. (2003) avaliaram clinicamente a ao de dois enxaguatrios bucais - Malvatricin e Flogoral. Aps 7 e 14 dias de tratamento foi observado que os pacientes do grupo do Malvatricin apresentaram uma reduo dos ndices de biofilme de 16,87% e

30,13% respectivamente e uma reduo do ndice gengival de 41,58% e 60,68% respectivamente. O grupo que fazia uso do Flogoral apresentaram uma reduo dos ndices de biofilme ao final de 7 e 14 dias de 9,42% e 11,77% respectivamente e uma reduo do ndice gengival de 34,07% e 35,17% respectivamente. Em um estudo realizado por Monfrin, Ribeiro (2002) foi avaliada a eficcia de diversos anti-spticos na reduo da microbiota da saliva visualizando-se in vitro a sua atividade. Foram selecionadas 50 amostras de saliva de indivduos com idade variando de 19 a 54 anos. Os anti-spticos bucais utilizados foram: Kolynos, OralB, Cepacol, Periogard, Flogoral, Fluordent, Wash Plax, Listerine e o Malvatricin. Aps o cultivo dos microorganismos das amostras, procedeu-se inoculao dos dez diferentes anti-spticos em trs dosagens (10 ml, 20 ml, 25 ml). Os resultados mostraram que os produtos Listerine e Flogoral no apresentaram atividade antimicrobiana. Os demais produtos testados apresentaram capacidade de reduo de microorganismos inferior ao Malvatricin e ao Periogard. Gebara et al. (1996) avaliaram a ao antibacteriana de tinturas de malva, cacau, salva, camomila, tomilho e prpolis sobre S. mutans e S. sobrinus in vitro. As concentraes das tinturas variaram entre 0,05 e 0,16 mg/ml. AS Concentraes Inibitrias Mnimas (CIM) para S. mutans foram de 0,06; 0,10 e 0,04 mg/ml para tomilho, cacau e prpolis respectivamente. Para S. sobrinus, as CIM foram de 0,04; 0,12 e 0,02 mg/ml para tomilho, cacau e prpolis respectivamente. Malva, salva e camomila no apresentaram ao antimicrobiana. A hortel grada apresenta propriedade antibacteriana, atribuda s substncias carvacrol e tenol (ALMEIDA, 1993; DINIZ, 1997). O Eucalipto um dos remdios caseiros mais comuns. Oyedeji et al. (1999) descreveram a ao antibacteriana e antifngica de extratos de eucalipto. A prpolis uma substncia com composio bastante complexa, variando de acordo com sua origem botnica, tendo sido isolados mais de 300 componentes qumicos. Um dos seus principais efeitos biolgicos a atividade antimicrobiana (bacteriana, mictica e viral). As aes anti-spticas, antiinflamatrias e cicatrizantes da prpolis j esto comprovadas, tanto cientificamente ou popularmente (COSTA, 1992; DINIZ, 1997; MARTINS, 1998; MATOS, 1991). A ao da prpolis sob forma de bochecho sobre o biofilme dentrio e a gengivite foi testada por Duarte e Kfouri (1999), no encontrando diferena estatisticamente significante no mecanismo de formao do biofilme e nos sinais clnicos da gengivite entre os grupos teste e controle.

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Um estudo duplo-cego realizado por Panzeri et al. (1999) mostrou que um dentifrcio fluoretado contendo prpolis a 3% foi mais eficiente que outro dentifrcio semelhante, porm, sem prpolis no controle do ndice gengival. Na anlise microbiolgica, o dentifrcio contendo prpolis foi eficiente, entre outras bactrias, contra cocos gram-positivos e, os bastonetes gram-negativos foram os mais resistentes. Plantas da famlia das Punicceas, a rom tem apresentado ao bactericida e bacteriosttica sobre bactrias Gram-positivas e Gram-negativas constituintes do biofilme dental (PEREIRA, 2002). Pereira (1998) estudou ao antibacteriana do extrato hidroalcolico da casca da rom (Punica granatum Linn.), frente aos S. mitis, S. mutans e S. sanguis. Esta ao antibacteriana foi ainda comparada atividade antibacteriana da clorexidina. Foi verificado que todas as linhagens bacterianas se mostraram sensveis ao extrato ativo de rom. Para S.mutans a concentrao inibitria mnima (CIM) foi 1:32. Em relao ao S. sanguis o extrato da rom apresentou CIM de 1:128. Sobre S. mitis a CIM foi de 1:64. As linhagens bacterianas tambm se mostraram sensveis ao do gluconato de clorexidina a 0,12%. Desse modo, observou-se que o extrato hidroalcolico do epicarpo da Punica granatum Linn. pode ser utilizado na inibio da formao de placa supragengival com a mesma eficincia da clorexidina. Em 2002, Pereira avaliou a CIM do extrato da rom em cinco linhagens bacterianas predominantes do biofilme dental: S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S.sobrinus e L.casei. Observou-se que a linhagem de S.sobrinus foi a mais sensvel apresentando halos de inibio at a diluia 1:512. A escala de sensibilidade foi seguida pelo L.casei com halo de inibio at a diluio 1:128; S.mitis 1:32; S.mutans e S.sanguis apresentaram sensibilidade at a diluio 1:8. Foi observado tambm que o gluconato de clorexidina a 0,12% demonstrou potencial ao inibitria sobre estes microorganismos. Baseado no exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a ao antibacteriana de produtos fitoterpicos comerciais frente aos microorganismos formadores de biofilme dentrio.

Quadro 1 - Produtos comerciais utilizados no estudo.

A B C D E F

Princpio Ativo Eucaliptol, Hortel da folha grada, Aroeira Malvatricin /Lab. Daudt Oliveira LTDA Malva, Quinosol, Tirotricina Mel Rosado/Lab ADV. Melito de rosa rubra Prpolis Apis Flora /Lab IBRAN Fitogargarejo /Farmcia Homeoptica Gengibre, Rom, Prpolis leo de Copahyba/Lab. IBRAN leo de Copaba

Produtos gua Rabelo /Lab. Rabelo LTDA

Figura 1 - Produtos comerciais utilizados no estudo.

Seleo das cepas As linhagens bacterianas formadoras de biofilme dentrio utilizadas foram: S. mutans ATCC 2575; S. sobrinus ATCC 27607; S. sanguis ATCC 10557 e L. casei ATCC 4646. Cada linhagem bacteriana foi reativada em caldo nutritivo Tryptic Soy Broth (TSB), incubada a 37C por 24 horas em microaerofilia. A leitura foi realizada atravs da observao visual da turvao do meio e em seguida semeada em placas de petri contendo o meio de cultura gar Mller Hinton (DIFCO) pela tcnica de inundao. Preparao das escalas Para cada produto testado foram preparados escalas com tubos de ensaio numerados de 1 a 10 conforme as diluies. No tubo 1 foi colocado 2ml do produto puro e nos demais tubos (2 a 10) 1ml de gua destilada estril adicionado 1ml do tubo anterior. Assim, os produtos fitoterpicos foram empregados na concentraes de 100% 0,19%. Confeco dos poos Foram confeccionados cinco poos de aproximadamente 6 mm de dimetro, para receber 50l dos produtos nas diferentes concentraes. A CIM foi considerada como a menor concentrao do produto testado capaz de inibir o

MATERIAIS E MTODOS A metodologia foi constituda de trs etapas descritas a seguir: Produtos Utilizados Utilizaram-se seis produtos comerciais disponveis no mercado nacional que apresentam em sua formulao os seguintes componentes descritos no Quadro 1 e mostrados na Figura 1.

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desenvolvimento bacteriano. A ao antibacteriana dos produtos foi quantificada em mm de dimetro dos halos de inibio.

Quadro 5. Distribuio em milmetros de halo de inibio da ao antibacteriana dos produtos fitoterpicos testados sobre a linhagem de Lactobacilus casei, segundo a escala de diluio.
Produtos Testados Escala A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 40 34 30 25 20 17 15 13 11 10 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D 26 25 23 24 22 20 17 17 0 0 E 25 22 20 19 18 16 14 12 0 0 F 16 18 16 14 14 0 0 0 0 0

RESULTADOS Os resultados obtidos so apresentados nos Quadros e Figuras que se seguem.

Quadro 2. Distribuio em milmetros de halo de inibio da ao antibacteriana dos produtos fitoterpicos testados sobre a linhagem de Streptococcus mutans, segundo a escala de diluio.
Escala 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,12% 1,56% 0,78% 0,39% 0,19% A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 45 35 30 27 20 15 13 10 9 8 Produtos Testados C D 28 31 20 18 15 18 10 17 0 14 0 12 0 11 0 0 0 0 0 0 E 22 19 18 16 14 12 0 0 0 0 F 18 19 19 18 22 13 11 10 0 0

100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,12% 1,56% 0,78% 0,39% 0,19%

Quadro 3. Distribuio em milmetros de halo de inibio da ao antibacteriana dos produtos fitoterpicos testados sobre a linhagem de Streptococcus sobrinus, segundo a escala de diluio. Produtos Testados Escala A B C D E F 100% 0 x 0 0 0 0 50% 0 x 0 0 0 0 25% 0 x 0 0 0 0 12,5% 0 40 0 0 0 0 6,25% 0 33 0 0 0 0 3,12% 0 21 0 0 0 0 1,56% 0 20 0 0 0 0 0,78% 0 12 0 0 0 0 0,39% 0 15 0 0 0 0 0,19% 0 12 0 0 0 0 x - superposio dos halos impossibilitando a mensurao.

Figura 2 - Ausncia de halos de inibio do produto A sobre S. mutans nas concentraes 100% a 6,25%.

Quadro 4. Distribuio em milmetros de halo de inibio da ao antibacteriana dos produtos fitoterpicos testados sobre a linhagem de Streptococcus sanguis, segundo a escala de diluio.
Escala 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,12% 1,56% 0,78% 0,39% 0,19% Produtos Testados A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 29 35 24 18 14 13 9 8 7 0 C 12 12 9 0 0 0 0 0 0 0 D 19 14 15 14 12 12 9 0 0 0 E 20 19 16 13 11 0 0 0 0 0 F 16 15 15 14 12 11 11 9 0 0

Figura 3 - Halos de inibio do produto B sobre S. mutans nas concentraes 100% a 6,25%.

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Figura 4 - Halos de inibio do produto C sobre S. mutans nas concentraes 100% a 6,25%.

Figura 5 - Halos de inibio do produto B sobre S. sobrinus nas concentraes 100% a 6,25%.

DISCUSSO Os mtodos de controle qumico do biofilme dentrio so amplamente aceitos (DEAN; HUGHES, 1995), principalmente quando utilizados em pacientes com alto risco a crie dentria, incluindo os usurios de aparelho ortodntico fixo, e aqueles com distrbios de coordenao mecnica impossibilitados de realizar uma satisfatria higiene bucal atravs da escovao dentria. Em nosso estudo foram utilizados produtos comerciais contendo em suas formulaes um nico extrato de planta, combinaes de extratos, e associao entre extratos e frmacos sintticos. Foi verificado que o produto B, constitudo de malva, quinosol e tirotricina, apresentou os maiores halos de inibio frente a todas as linhagens, como mostram os quadros de 2 5. Este resultado concorda com aquele

descrito por Monfrin e Ribeiro (2000), ao comparar a ao antibacteriana deste produto com diversos anti-spticos comerciais tradicionais, em estudo in vitro sobre um pool bacteriano obtido da saliva. importante ressaltar que ambos os trabalhos no podem afirmar sobre a ao antibacteriana de cada componente especfico existente na composio. Uma avaliao clnica do produto B foi relatada por Weyne et al. (2003), seus resultados mostraram que seu emprego como enxaguatrio bucal resultou ao final de 07 e 14 dias numa significante reduo dos ndices gengivais e de placa visvel em comparao a outro antisptico. Esta superioridade tambm foi relatada no estudo in vitro de Monfrim e Ribeiro (2000). Sabe-se, entretanto, que os componentes quinosol e tirotricina possuem ao antibacteriana, assim, a superioridade do produto B sobre os demais fitoterpicos testados pode estar baseada na ao desses componentes. Em 1996, Gebara et al. avaliaram in vitro a ao antibacteriana de substncias naturais sobre S. mutans e S. sobrinus e constataram que a tintura de malva no exerceu atividade antibacteriana sobre o S. mutans. Dentre os produtos que contm apenas um constituinte vegetal, o melhor desempenho foi apresentado pelos produtos D e F, visto que o C no apresentou atividade antibacteriana sobre L. casei. Em relao prpolis, Gebara et al. (1996) encontraram CIM de 0,04 mg/ml sobre S. mutans, em nosso estudo, o produto D, que contm prpolis em sua composio, obteve uma CIM de 1,56% (quadro 2) em relao a esta mesma bactria. Sobre S. sobrinus a CIM obtida foi de 0,02 mg/ml para o extrato da prpolis, enquanto que o produto D no apresentou atividade antibacteriana sobre esta linhagem, como pode ser visto no quadro 3. Nos produtos com mais de um constituinte vegetal o melhor resultado foi do produto E constitudo de gengibre, rom e prpolis. O produto A, que apresenta em sua formulao eucaliptol, hortel da folha grada e aroeira, no apresentou atividade antibacteriana sobre as linhagens estudadas. O produto E possui a rom na sua constituio e, como mostra o quadro 3, no apresentou atividade antibacteriana sobre o S. sobrinus, diferentemente do relatado por Pereira (2002) que descreveu a presena de sensibilidade ao extrato ativo de rom para as mesmas linhagens bacterianas. Estudos que testam a efetividade de produtos comerciais devem considerar, se possvel, alm dos constituintes farmacuticos, as concentraes de cada princpio ativo presente, visando, dessa forma, identificar a ao de cada componente, de modo a permitir a comparao e anlise dos resultados.

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CONCLUSES Nas condies do estudo foi possvel concluir que: 1) Os produtos tiveram desempenho variado; 2) O produto B obteve os maiores espectros de inibio, bem como a melhor CIM frente a todas as linhagens; 3) O produto A no apresentou atividade antibacteriana.

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Recebido para publicao: 19/11/2003 Enviado para reformulao:15/12/2003 Aceito para publicao: 16/01/2004

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