FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA

MICROBIOLOGA [LABORATORIO]
MODULO III: PARTO, PUERPERIO Y PERIODO PERINATAL

PRCTICA V. FAGOCITOSIS

DRA. MA. LUCINDA AGUIRRE CRUZ

MESA 3:

ARVIZU RIVERA MARIANA BELEM AVILA CICILIANO ILSE LORENA HERRERA VELSQUEZ ELISA LAGUNA PEDRAZA DULCE RUBI MENDOZA VALENCIANO MARIA ARISBETH MERCADO JIMENEZ ROSA DANA RUBIO MOCTEZUMA UZZIEL SERRANO REYES LILIANA

FECHA DE ENTREGA 29/08/2011

GRUPO.1109

PRCTICA V. FAGOCITOSIS y

OBJETIVOS: INTRODUCCION:

La fagocitosis es un tipo de endocitosis por el cual algunas clulas rodean con su membrana citoplasmtica a una sustancia extracelular (un slido generalmente) y la introducen al interior celular. Los organismos unicelulares utilizan la fagocitosis como mecanismo de nutricin a partir de la ingestin de materia del exterior (bacterias, otras clulas, materia inorgnica, etc). Es uno de los medios de transporte grueso que utilizan para su defensa algunas clulas de los organismos pluricelulares. En muchos organismos superiores, la fagocitosis es tanto un medio de defensa ante microorganismos invasores como de eliminacin (e incluso reciclaje) de tejidos muertos. Clulas fagocticas En los animales superiores, la fagocitosis es una funcin de clulas especializadas (fagocitos profesionales) del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraos y combatir infecciones como primera lnea de defensa natural. Varias clulas ejercen funciones fagocticas: Neutrfilos Monocitos Macrfagos Clulas Dendrticas

Otras clulas como las clulas de Kupffer en el hgado, las clulas de la microgla en el cerebro, las clulas de Langerhans en la piel, etc., son fagocitarias en la mayora de los animales. Todas stas clulas son macrfagos que reciben diferentes nombres segn el lugar donde se encuentren, debido a que histricamente no se reconocan como el mismo tipo celular. Eosinfilos Basfilos

Los eosinfilos y los basfilos son granulocitos que se desgranulan liberando sus sustancias qumicas sobre clulas o microbios dainos provocando su muerte. Los neutrfilos son tanto fagocitos como granulocitos,

contienen grnulos llenos de sustancias qumicas potentes. Estas sustancias qumicas, adems de destruir microorganismos, desempean una funcin clave en las reacciones inflamatorias agudas. Los macrfagos son clulas fagocticas de gran tamao presentes en la mayora de los tejidos y cavidades, proceden de los monocitos que migran desde la sangre hacia los tejidos. Algunos permanecen en los tejidos durante aos y otros circulan por los tejidos linfoides secundarios. Tambin pueden actuar como clulas presentadoras de antgenos.

Los macrfagos expresan receptores de membrana para numerosos antgenos bacterianos, por ejemplo: receptor para lipopolisacrido (CD14), receptores C11b/CD18, receptores para manosas, y receptor para glcidos entre otros. Los macrfagos participan en gran medida de la respuesta inmune innata a infecciones gracias a sus receptores "scavengers", o barredores, que poseen una especificidad a ligandos muy amplia como: lipoprotenas, protenas, poli y oligonucletidos, polisacridos aninicos, fosfolpidos y otras molculas.

Los macrfagos son activados por gran variedad de estmulos durante la respuesta inmune. La fagocitosis de antgenos sirve como estmulo inicial pero su cantidad y actividad aumenta por citoquinas que son secretadas por linfocitos T colaboradores y productos bacterianos. Uno de los ms potentes activadores de macrfagos es el interfern gamma. Los macrfagos tienen la capacidad de quimiotaxis, es decir la de ser atrados y desplazados hacia una determinada localizacin por la presencia de determinados factores quimiotcticos, como la interleuquina-1, trombina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de complemento C5a, fragmentos de colgeno, elastina, fibronectina, calicrena, activador del plasmingeno, inmunoglobulinas y leucotrienos. Los macrfagos procesan y presentan los antgenos en el complejo mayor de histocompatibilidad MHC de clase II., all son reconocidos por los linfocitos T colaboradores, que producen linfoquinas que activan a los linfocitos B. Los anticuerpos producidos por los linfocitos B activados se adhieren a los antgenos bacterianos o de clulas invadidas por virus y as atraen con mayor avidez a los macrfagos para fagocitarlos.

Los neutrfilos son los leucocitos ms abundantes (>70%). Su tamao es de 1020m de dimetro y se clasifican como granulocitos debido a sus grnulos citoplasmticos de lisosimas y de lactoferrina. Pasan menos de 48 horas en la circulacin antes de migrar a los tejidos, debido a la influencia de los estmulos quimiotcticos. Es en ellos donde ejercen su accin fagoctica y eventualmente mueren.

Los monocitos son clulas circulares cuyo dimetro oscila entre 15 a 30 m y poseen una alta relacin ncleo/citoplasma. Se originan en la mdula sea y constituyen cerca del 5% del total de leucocitos de la sangre, donde permanencen slo unos tres das. Depus atraviesan las paredes de las vnulas y capilares (diapedesis) donde la circulacin es lenta. Una vez en los rganos, se transforman en macrfagos, lo que se refleja en el aumento de su capacidad fagoctica, de la sntesis de protenas, el nmero de lisosomas y la cantidad de aparato de Golgi, microtbulos y microfilamentos. Estos ltimos se relacionan con la formacin de pseudopodos, responsables del movimiento de los macrfagos.

Reconocimiento y unin de partculas por fagocitos A pesar de que la fagocitosis de partculas fue demostrada por Haeckel en 1862 y que los macrfagos y micrfagos fueron descriptor por Metchnikoff en 1892, el rol de los factores sricos que intervienen en este proceso fue puesto en evidencia recin en 1904 cuando Wright y Douglas determinaron que dichas sustancias eran fundamentales para una ptima ingestin. Etapas de la fagocitosis 1- Quimiotxis Es la etapa de movilizacin y reclutamiento de clulas fagocticas por medio de interacciones celulares a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere a la superficie del endotelio previamente activado por citoquinas, a travs de uniones moleculares de baja afinidad entre receptores en el fagocito y selectinas presentes en el endotelio. En un punto especfico, determinado por la presencia y activacin de quimioquinas, los fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el endotelio por medio de integrinas y otros ligandos endoteliales. En especial las molculas endoteliales LFA-a, CR3 y VLA-4 se adhieren a ligandos especficos sobre los fagocitos, entre ellos VCAM-1 e ICAM-1. Los fagocitos atrados por gradientes de concentracin de las quimioquinas, atraviesan entonces el epitelio vascular hacia el foco de infeccin patgena. 2- Opsonizacin

La opsonizacin se consigue recubriendo las partculas con anticuerpos especficos de la clase IgG, con o sin complemento. Debido a que los fagocitos tienen receptores de membrana para el fragmento Fc de IgG, reconocen a estas partculas recubiertas por los anticuerpos. La IgM no tiene capacidad de opsonizar, pero su unin a las partculas induce la activacin del sistema de complemento. Esto lleva a que el componente C3b se deposite sobre las partculas, las cuales son reconocidas por los receptores de los fagocitos para el fragmento C3b. A pesar que el reconocimiento de partculas recubiertas con IgG y/o C3b va los receptores FcK y C3b, es el principal mecanismo de ingestin de partculas extraas, llamado fagocitosis inmune , existen otros factores que median o ejercen su influencia sobre este proceso. 3- Adherencia Receptores especficos sobre la membrana de los fagocitos permiten la adherencia sobre los microorganismos, ya sea a productos microbianos especficos o sobre opsoninas del sistema inmune del hospedador. Receptores de membrana presentes en las clulas fagocticas:
y y y y y

Receptor de manosa. Este receptor tiene afinidad por los componentes de manosa presentes en las glucoprotenas y glucolpidos de las paredes celulares bacterianas. Scavenger. Estos receptores se unen directamente a microorganismos y a moleculas de LDL modificadas. CD14. Es un ligando con preferencia especfica al lipopolisacrido presente en ciertas bacterias y est asociado a un receptor tipo Toll. Transmembrana de 7 helices alfa. Es un receptor recientemente descubierto, cuya funcin est asociada a seales de quimioquinas y ciertos pptidos microbianos. Receptores para los fragmentos Fc de los anticuerpos opsonizantes IgG2 e IgG3.

4- Ingestin La unin a receptores de adherencia promueve seales de comunicacin intracelular que resultan en la invaginacin de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando patognico. Al rodear por completo al complejo receptor-molcula, la membrana se une en sus extremos y libera al interior de la clula un fagosoma. Esto puede ocurrir en mas de un punto de la membrana celular. 5- Digestin Los fagocitos cuentan con variados mecanismos microbicidas, los cuales se activan al fusionarse el fagosoma con un lisosoma intracelular. Las enzimas del lisosoma se liberan dentro del fagolisosoma recien formado actuando sobre su contenido. Otros componentes txicos usados en la digestin de microorganismos son los intermediarios reactivos del O2 y el xido ntrico. Mtodos para medir fagocitosis y muerte intracelular 1- Mtodos in vivo para estimar fagocitosis Estos mtodos dependen bsicamente de la medicin del clearance de la circulacin de material inyectado por va intravenosa (coloides, bacterias, macromolculas, eritrocitos opsonizados, etc.). Proveen informacin del estado funcional de los macrfagos del hgado (clulas de Kupffer) y en menor medida de los macrfagos de los pulmones (macrfagos alveolares) y del bazo. Sin embargo, la interpretacin de estos resultados es

dificultosa, porque esta eliminacin de partculas est influenciada tambin por otros factores como la velocidad del flujo sanguineo, la presencia o ausencia de factores opsonizantes, la adhesividad de las partculas que pueden adherirse a las paredes de los vasos y a los cambios de las poblaciones fagocticas en el hgado. 2- Mtodos in vitro para estimar fagocitosis La ventaja de la medicin de la fagocitosis in vitro radica en que las poblaciones celulares, las partculas, los factores opsonizantes y dems condiciones experimentales estn bin definidas. Los mtodos deben cumplir con las siguientes condiciones: 1) 2) 3) Las partculas no ingeridas asociadas a las clulas deben ser facilmente distinguibles de las partculas ingeridas. La ingestin debe ser 0 a tiempo 0. La velocidad y el grado de ingestin deben alcanzar una cintica de orden 0 al aumentar la relacin partcula:clula. Los mtodos que miden el aumento en el nmero de partculas intracelulares Los mtodos en los cuales la disminucin del nmero de partculas extracelulares es tomado como una medida de la fagocitosis.

Los mtodos que cumplen con estos criterios pueden ser divididos en dos grupos: 1) 2)

1) Aumento en el nmero de partculas intracelulares Puede ser determinado por microscopa ptica o electrnica, siempre que se pueda establecer una clara distincin entre las partculas extra e intracelulares. Esto es muy dificultoso empleando microscopa ptica salvo que se utilicen partculas de ltex que se puedan disolver con xilol cuando estn adheridas a la clula pero no hayan sido internalizadas, glbulos rojos extracelulares lisados con agua o cloruro de amonio, o bacterias como Staphylococcus aureus lisadas con lysostaphin que no hayan sido an fagocitadas. 2) Disminucin del nmero de partculas extracelulares Se utilizan para determinar la velocidad de fagocitosis de microorganismos y complejos inmunes. El nmero de microorganismos extracelulares puede ser determinado directamente por mtodos microbiolgicos o indirectamente empleando microorganismos marcados radioactivamente. Desventajas en el empleo de microorganismos marcados radioactivamente: 1- La marca representa un promedio del nmero de microorganismos. 2- El nmero promedio de bacterias por unidad de marca puede cambiar debido a la divisin bacteriana, cuando se utilizan microorganismos viables; o debido al decaimiento de la marca en el caso que se empleen microorganismos muertos y marcados que hayan sido guardados por un tiempo. Ms an, los mtodos en los que se emplea radioactividad no suministran informacin acerca de la actividad microbicida de factores sricos o de factores liberados por los fagocitos durante el ensayo

DESARROLLO:
Se obtendr re5 ml de sangre humana por equipo. Se colocarn inmediatamente en un tubo conteniendo anticoagulante y se agitar suavemente varias veces.

Se centrifugar a 300 rpm/ minutos. Se separar la capa de clulas blancas y se colocarn en un tubo de 13x100. Se adicionar 0.05 ml de microorganismo de Staphylococcus, agitar y ponerlos en bao mara a 37 C por una hora. Tomar un portaobjetos muy limpio (limpiado con alcohol). Colocar una gota en uno de los extremos y hacer una extensin con otro porta-objetos. Dejar secar el frotis al aire y teir con colorante de Wright: o Cubrir la preparacin con el colorante y se deja actuar 2 minutos. La solucin no debe de precipitarse en el portaobjetos por la evaporacin. o Aadir una cantidad aproximadamente igual de agua destilada distribuyndola por toda la extensin soplando suavemente la superficie del porta-objetos con ayuda de una pipeta, mezcla presenta un brillo metlico. Dejar actuar la mezcla durante 7 minutos. Lavar 30 seg. con agua corriente. Dejar secar al aire y observar a inmersin. Efectuar esquemas. Determinar el porcentaje de leucocitos fagocitantes.

RESULTADOS:

Despus de la centrifugacin previamente realizada, y con la previa aplicacin de microorganismos Staphylococcus encubados a 37 por una hora. En el momento de aplicar sobre el portaobjetos un poco de esta preparacin con el debido frotis y colorante de Wright. El portaobjetos fue observado al microscopio, donde se logro observar de un color aparentemente morado la acumulacin de racimos de staphylococcus.

Resulta interesante observar en las imgenes que adems de los microorganismos identificados, se puede apreciar detalladamente el proceso de degradacin o mejor dicho de fagocitosis en este caso de los staphylococcus que estn siendo atacados por los leucocitos de la sangre. As mismo se puede observar que dentro del leucocito se encuentran las partculas de estos microorganismos los cuales estn siendo destruidos, comprobando as el proceso fagosomico que realiza la defensa del cuerpo para la eliminacin de agentes patgenos.

CONCLUSIONES
Tras realizada la prctica, pudimos ver la accin fagocitica de las clulas blancas del tejido sanguneo, mediante la observacin de un fagocito en tres etapas distintas de este proceso: 1. Opsonizacin: Observamos la manera en la que los Staphylococcus recubran la membrana del fagocito, mientras que este se preparaba para fagocitar a las bacterias, formando pequeas vacuolas en su citoplasma. 2. Formacin del Fagosoma, en esta etapa, el macrfago ya haba fagocitado al Staphylococcus y se daba la formacin de una vescula fagocitica, en el interior del fagocito. 3. Exocitosis. Pudimos identificar esta etapa final de la fagocitosis, ya que el fagocito presentaba cmulos de materia con un color carbn en su citoplasma y en su exterior se presentaban las mismas partculas. Finalmente con esta prctica, conocimos la importancia de las clulas polimorfo-nucleares y fagocitos profesionales en la respuesta inmune y de defensa contra los antgenos extraos. As mismo, diferenciamos los componentes del plasma y del suero en el tejido sanguneo. Y cual es la importancia y aplicacin clnica de ambos.

CUESTIONARIO:

1. DEFINA QUE ES LA FAGOCITOSIS Es la ingestin de partculas extraas (o propias) por clulas individuales llamadas fagocitos, las cuales las localizan, identifican e introducen al interior de su citoplasma para ser degradadas enzimticamente. Se da mediante los siguientes pasos: a) Quimiotaxis: Alineacin de fagocitos mediados por sustancias qumicas que los dirigen al lugar donde son requeridos para la defensa b) Reconocimiento del antgeno: Reconocimiento especfico por estructuras o caractersticas especiales de la superficie de la partcula a fagocitar c) Ingestin: El fagocito extiende sus seudpodos y capta a la partcula en una vacuola o fagosoma dentro de su citoplasma crendole una pared dentro del citoplasma d) Degranulacin: Gran actividad de sus grnulos que vierten dentro del fagosoma diversas enzimas. e) Muerte y digestin del antgeno: Las enzimas intervienen en el metabolismo y reproduccin del antgeno, provocando su muerte.

2. MENCIONE BREVEMENTE CUAL ES EL MECANISMO DE LA INFLAMACIN Iniciacin: Dao o invasin del tejido Respuesta del tejido: Liberacin de sustancias qumicas activas (histamina, prostaglandinas, etc). Vasodilatacin y aumento de permeabilidad en vasos sanguneos. Respuesta leucocitaria: Fagocitosis de microorganismos y tejido daado Reparacin del tejido daado Curacin

3. DE QU ORIGEN EMBRIONARIO PUEDEN SER LAS CLULAS CON CAPACIDAD FAGOCITARIA? Son de origen mesodrmico, debido a que de esta hoja embrionaria se deriva el tejido muscular y el conectivo, el cual da origen a los huesos, cartlago y sangre y de esta ltima se derivan los leucocitos que principalmente sirven como defensa de nuestro organismo (Polimorfonucleares, macrfagos y linfocitos).

4. QU ES EL FENMENO DE DIAPEDESIS?

Es la migracin de los fagocitos de los vasos sanguneos atrados por unas sustancias solubles que se liberan en el tejido inflamado producto de la destruccin de las clulas con las que hace contacto el antgeno.

5. QU ES EL FENMENO DE QUIMIOTACSISMO? Es la tendencia de algunas clulas u rganos a moverse en una direccin determinada segn la presencia de determinadas sustancias qumicas. De esta manera, el quimiotacsismo es la alineacin unidireccional de fagocitos mediados por sustancias como Hageman, kalicrinas, linfoquininas, linfotoxinas, etc., que los dirigen al lugar donde el organismo los necesita para la defensa.

a) b) c) d) e)

6. QU NOMBRE RECIBEN LOS FAGOCITOS EN LOS SIGUIENTES TEJIDOS? Hgado: Clulas de Kupffer Sangre: Monocitos y Polimorfonucleares Sistema nervioso: Clulas de la Microgla Tejido conectivo: Macrfagos o Histiocitos Pulmn: macrfagos alveolares o Clulas polvo