UNIVERSIDAD ANHUAC MAYAB

Escuela de medicina

Laboratorio de Ecologa Humana

Prof. Pedro R. Aquino Hernndez

Practica No. 4 Determinacin de la sensibilidad antibacteriana Mtodo de Kirby-Bauer. Antibiograma.

Grupo 2B Daniel Snchez Lpez Nikita L. Tejero Tun Pablo Noh Flores

Mircoles 23 de Marzo de 2011

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NDICE Resumen. Marco Terico. Planteamiento del problema. Objetivo. Mtodos y procedimientos. Presentacin de resultados. Anlisis y Discusin. Bibliografa. Pg. 3 Pg. 3 Pg. 7 Pg. 7 Pg. 8 Pg. 8 Pg. 10 Pg. 10

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Determinacin de la sensibilidad antibacteriana. Mtodo de Kirby-Bauer. Antibiograma.

Resumen. Despues de la explicacin del profesor sobre el procedimiendo adecuado que se deba seguir, procedimos a colocar en el agar las bacterias que se nos indicaron, las extendimos en el mismo y procedimos a colocarles el multisensidisco que contena los antibiticos que se iban a probar en las bacterias, finalmente fue colocado en la incubadora para esperar que el antibitico reaccionara con la bacteri, al dia siguiente continuamos con la medicin de los dimetros de las zonas de inhibicin que nos indican que tan efectivo es uno u otro antibitico. Marco Terico. El estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos es una de las funciones ms importantes de los laboratorios de microbiologa clnica. Dentro de los beneficios que presenta se encuentran: Dirigir la teraputica una vez que el germen es conocido Generar una base de datos que permita seleccionar los antibiticos a utilizar en un tratamiento emprico (aquel en que no conocemos el agente causal) Desarrollar polticas de uso de antimicrobianos Vigilar la aparicin de nuevos mecanismos de resistencia Detectar precozmente la diseminacin epidmica de una cepa, tanto a nivel hospitalario como comunitario Pero la determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos no implica solo realizar un conjunto de tcnicas y medir los resultados. Es necesario saber interpretar los mismos y darles el significado que realmente tienen. Entre el mdico clnico que tiene en sus manos un paciente, y el microbilogo que entre las suyas tiene las placas con el microorganismo responsable de una infeccin, debe haber buena comunicacin, lo cual implica hablar el mismo idioma. Los parmetros que determinan los resultados de sensibilidad o resistencia, cada vez ms involucran informacin proveniente de ambos lados: el paciente y el microorganismo. En el captulo 34 se consideraron las caractersticas farmacocinticas y farmacodinmicas para los principales grupos de antibiticos, y en el 35, las diferentes estrategias bacterianas de supervivencia. En este captulo intentaremos desarrollar los diferentes mtodos de estudio y las bases de la interpretacin de los resultados obtenidos in vitro. Clasificacin Estos mtodos pueden clasificarse en mtodos cuantitativos y cualitativos. Mtodos cuantitativos son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin bactericida mnima (CBM). Se define CIM como la mnima concentracin de antibitico que en un perodo de tiempo predeterminado, es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inculo bacteriano previamente estandarizado (concentracin conocida de grmenes). Se define como CBM la mnima concentracin de un antibitico que en un perodo de tiempo predeterminado, es capaz de inducir la muerte in vitro del 99.9% de una poblacin bacteriana previamente
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estandarizada. La determinacin de la CIM puede realizarse por micro o macro dilucin en caldo, dilucin en agar o E-test (marca comercial). Mtodos cualitativos (disco difusin) son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente. Estandarizacin Todos los mtodos de estudio por nosotros utilizados, estn estandarizados por el National Commitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS), de manera que los resultados sean reproducibles y comparables. La realizacin de estos procedimientos requiere la utilizacin de cepas de control de calidad con resultados conocidos, de manera de saber si nuestra metodologa se realiz en forma correcta. Dentro de los parmetros a estandarizar se encuentran los siguientes: a) El tipo de bacterias a estudiar, ya que no es lo mismo un microorganismo de crecimiento rpido que lento, exigente o no exigente, aerobio o anaerobio. Describiremos aqu los mtodos para el estudio de microorganismos no exigentes, de crecimiento rpido, capaces de crecer en aerobiosis. b) Los medios de cultivo para realizar las pruebas. De los medios disponibles se considera que tanto el agar como el caldo Mueller Hinton (MH) son los ms apropiados para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes comerciales, son baratos, contienen bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclinas, son adecuados para la mayora de las bacterias patgenas en lo que a requerimientos nutricionales se refiere y existen suficientes datos recopilados que avalan su uso en las pruebas de sensibilidad. A pesar de estas cualidades, algunos parmetros del medio se deben controlar en cada lote de uso, como ser: pH: para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH 7,2-7,4 a temperatura ambiente. Si el pH es demasiado bajo ciertas drogas como aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos parecern menos activas, mientras otras como las tetraciclinas parecern tener mayor actividad. Si el pH es ms alto se podrn esperar los resultados opuestos. Humedad: si existe un exceso de humedad en la superficie del agar las placas deben ser incubadas a 35C durante 10 a 30 minutos antes de utilizarse. Las placas debern estar hmedas pero no mostrar gotas de agua en la superficie. Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y triometoprim, produciendo alteraciones en las zonas de inhibicin del crecimiento bacteriano en la placa. Cantidad de cationes divalentes: la variacin de los cationes divalentes principalmente de Ca++ y Mg++, tambin afecta los resultados de antibiticos como tetraciclinas, aminoglucsidos, etc. El medio debe ser preparado segn las indicaciones del fabricante. Luego de preparado debe esterilizarse y cuando llega a una temperatura aproximada de 50 C debe ser repartido en las placas de Petri. El espesor del mismo debe oscilar entre 3 y 5 mm. Para esto se considera que aquellas placas de 150 mm de dimetro deben llevar 60 a 70 ml del medio, y las que tienen 100 mm de dimetro deben llevar 25 a 30 ml. Las placas que no se usan en el da pueden mantenerse en el refrigerador; aquellas con ms de siete das de preparacin no son adecuadas, salvo que sean envueltas en bolsas de plstico para evitar la desecacin, de
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lo contrario deben controlarse con los organismos de referencia. Debemos controlar la esterilidad de cada lote incubando al menos una de sus placas 24 hs o ms a 35C, verificando si hay o no crecimiento de algn microorganismo contaminante. c) El tiempo de incubacin: la mayora de los resultados deben leerse entre 18 y 20 horas, aunque para la lectura de la meticilinorresistencia en S. aureus debe incubarse 24 horas completas. d) La temperatura de incubacin, lo cual altera la velocidad de crecimiento bacteriano y su viabilidad. e) El estado de los antibiticos, su fecha de vencimiento si se trata de discos, o su potencia si se trata de antibitico como droga. Si bien estos parmetros pueden ser controlados fsicamente, es decir el operario puede controlar temperaturas, tiempos, estados de los medios, etc., los controles de calidad se realizan utilizando cepas conocidas. A continuacin destacaremos algunos de los mtodos antes mencionados. Mtodo de disco difusin Este es un mtodo cualitativo, que se caracteriza por ser fcilmente estandarizable y que est indicado para microorganismos no exigentes de crecimiento rpido. Partiendo de una muestra clnica siempre se debe realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad antibitica. Para esto se utiliza la tcnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual adems se le deben otorgar las condiciones atmosfricas especficas de esa cepa). El antibiograma por disco difusin basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores, es uno de los mtodos que el NCCLS recomienda para la determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos. Indicaciones: el antibiograma est indicado en las siguientes situaciones: Se asla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos ms habituales. En estudios epidemiolgicos, aunque hasta el momento no se halla descrito mecanismos de resistencia para dicho organismo. Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin (sensibilidad de S. pyogenes a eritromicina en pacientes alrgicos a la penicilina). En el estudio de nuevos antibiticos. Fundamento: el mtodo de disco difusin consiste en depositar en la superficie de una placa de agar MH previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antibiticos. Tan pronto el disco impregnado en antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibitico difunde por el agar, formndose un gradiente de concentracin. Transcurridas 18 a 24 horas de incubacin, los discos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibicin de crecimiento bacteriano. Materiales: suero fisiolgico estril o caldo de cultivo estril, hisopos estriles, pinzas estriles o dispensador, gradillas, descartador, ansa bacteriolgica, estufa de 35C. Discos de antibiticos: los discos deben mantenerse en el freezer o en el refrigerador para mantener la actividad del antibitico. Deben ser sacados una o dos horas antes de su uso. Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos.
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Patrn de turbidez: para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario como estndar de turbidez que corresponde a un 0,5 del nefelmetro de McFarland. La densidad se corrobora con un espectrofotmetro. Luego de preparado el patrn de turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo). Estos deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Esta turbidez corresponde a 1.5 x 108 UFC/ml. Medio: placas de agar MH. Procedimiento (como preparar el inculo): existen dos formas bsicamente de cmo preparar el inculo. 1. Mtodo del medio de cultivo lquido o de Kirby-Bauer: con un asa bacteriolgica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfolgico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado, como caldo MH. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35C hasta que aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hs). La turbidez se ajusta con suero fisiolgico estril o caldo para obtener una turbidez visualmente comparable a la de un estndar preparado previamente (llamado 0.5 de Mc Farland). Este estndar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma visual con el inculo preparado. Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco con una lnea negra como contraste Este mtodo es recomendado cuando el cultivo tiene ms de 24 hs de incubacin. 2. Mtodo de suspensin directa de colonias o Kirby-Bauer modificado: se colocan entre 4 y 5 ml de suero fisiolgico estril en un tubo de ensayo. Se toma con un asa bacteriolgica tres o cuatro colonias morfolgicamente similares y se suspenden en el tubo hasta alcanzar una turbidez comparable a la solucin de Mc Farland 0.5. Luego de preparado el inculo bacteriano con la cepa en estudio se deben seguir los siguientes pasos: Introducir el hisopo estril en el inculo bacteriano preparado, de manera de embeberlo completamente. Antes de retirarlo se debe escurrir sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de lquido del mismo. Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento confluente, para lo cual se estra con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el procedimiento rotando la placa 60 en dos oportunidades ms. Deben extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde, porque de lo contrario pueden haber problemas en la realizacin de las lectu- ras. Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. Colocar los discos. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza estril. Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos levemente para que queden adheridos al mismo. Deben estar a ms de 15 mm del borde de la placa y deben distriburse de manera de que no haya superposicin de los halos de inhibicin. En las placas de 150 mm no se colocarn ms de 12 discos, y en las placas de 100 mm no es aconsejable colocar ms de 6. Luego de colocados los discos las placas deben incubarse a 35C a 37C en grupos no mayores a cinco placas durante 18 hs. Para detectar la meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 hs completas. Las placas deben colocarse en forma invertida para que el agua condensada no caiga sobre el agar, lo que cambiara las condiciones del medio y por lo tanto no servira para la lectura de los halos. Ventajas: es un mtodo sencillo, barato y de fcil control y estandarizacin. Una ventaja
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Adicional del mtodo y especficamente del medio, es que se le pueden realizar algunas modificaciones en cuanto a los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan ms nutrientes que los que este medio les puede ofrecer. Un ejemplo claro es S. pneumoniae, microorganismo exigente para el cual se puede hacer un agregado de sangre de oveja desfibrinada en una concentracin al 5%. Muchas veces estos agregados generan cambios conocidos en los halos de inhibicin del crecimiento bacteriano. Control de calidad Para proceder a la lectura de los antibiogramas debemos previamente asegurarnos que se cumpla un estricto control de calidad para supervisar la exactitud y fiabilidad de la metodologa. Esto se realiza debido a que existe un gran nmero de variables que pueden afectar los resultados dentro de las que se destacan: a) actividad de los discos (cuidar que no estn vencidos o que pierdan su carga por almacenamiento incorrecto); b) inadecuada composicin y espesor del medio; c) alteraciones en ms o en menos en el inculo (patrn de turbidez 0.5 de la escala de Mc Farland); d) problemas con el tiempo o temperatura de incubacin, etc. Para llevar a cabo eficientemente este control de calidad al mismo tiempo que se realiza el procedimiento para la cepa en estudio, se realiza para una cepa control. Las cepas control utilizadas sern las recomendadas por la NCCLS. Estas cepas son denominadas ATCC, una marca registrada (American Type Culture Collection). Estas son cepas conocidas, de las cuales se sabe su patrn de resistencia o sensibilidad. Se conocen y se han establecido los rangos de dimetros en el que debe estar la zona de inhibicin de crecimiento bacteriano si las condiciones del procedimiento son las adecuadas. Estos datos se encuentran en tablas de la NCCLS. Se debe verificar que los dimetros de inhibicin del crecimiento bacteriano de los discos de antibiticos entren dentro de los establecidos en las tablas, de lo contrario podremos concluir que existe alguna variable que est cambiando las condiciones en que debe ser realizado el procedimiento. MEDICIN DE LOS HALOS E INTERPRETACIN DE LOS MISMOS Luego de corroborar que las cepas ATCC se encuentran en rango procedemos a realizar la lectura de los antibiogramas. La lectura se realiza a travs de la medicin de los halos de inhibicin. Al igual que para las ATCC, existen tablas proporcionadas por la NCCLS que segn el dimetro del halo de inhibicin de crecimiento bacteriano, definen categoras de resistencia, sensibilidad y sensibilidad intermedia. Planteamiento del problema. Es muy importante como mdicos conocer el mejor tratamiento disponible para nuestro paciente, para asi poder darle el mejor servicio de salud que podamos. Es por esto que esta prueba es muy til a la hora de preescribir un medicamento ya que es una fuente confiable sobre la eficacia del mismo sobre la enfermedad u organismo al que queremos atacar con el frmaco.
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-Se hizo una prueba de sensibilidad antibacteriana. Cul es el efecto que ejerce cada frmaco sobre el crecimiento de la colonia?, Cules frmacos inhiben el crecimiento de la colonia y en que medida?, la colonia es resistente a algn frmaco? Con las preguntas anteriores se plantean las dudas generales sobre la eficacia antibacteriana de los 12 farmacos puestos a prueba.

Objetivos.

Conocer el mtodo ms eficaz y usado actualmente en el mbito de la medicina asi como reconocer la sensibilidad de ciertas bacterias hacia los antibiticos mas usados en el campo clnico.
Mtodos y procedimiento. Materiales

y y y y y

Solucin salina normal o medio de nutrientes Placas de agar Muller Hinton Mechero tipo Fisher Multisensidisco para Gram positivos y Gram negativos Pinzas

Mtodo: 1. Partimos de un cultivo puro de 48 horas tomamos una colonia con el asa bacteriolgica y la disolvemos en 1 ml de solucin salina normal o en un medio con nutrientes como el BHI, contenida en un tubo de ensayo. 2. Con el hisopo estril tomamos una muestra, procurando quitar el exceso de lquido oprimindole con las paredes del tubo. 3. Con el hisopo extendemos bien el inoculo por toda la superficie de la placa del agar muller hinton 4. Utilizamos unas pinzas para poner los multidisco sobre el agar. 5. Finalmente incubar 24 horas a 37C y en posicin invertida tras la incubacin va a parecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecer o no un halo de inhibicin dependiendo si el germen es sensible hacia ese antibitico, el tamao del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibitico o si es resistente. puede aparecer un pequeo halo aun siendo resistente esto se debe a la alta concentracin de antibitico en el medio inmediato del disco. 6. Despus de 24 horas de incubacin sacar las cajas de la estufa bacteriolgica, observar el crecimiento bacteriano y medir los dimetros de las zonas de inhibicin en mm.
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Presentacin de resultados.
AK AM LEV CF CTX CRO CL GE NET NF FEP SXT Amikacina Ampicilina Levofloxacina Cefalotina Cefotaxima Ceftriaxona Cloranfenicol Gentamicina Netilmicina Nitrofurantoina Cefepime Trimetropin sulfametoxazol 30 g 10 g 5 g 30 g 30 g 30 g 30 g 10 g 30 g 300 g 30 g 25 g Resistente 14 13 13 14 14 13 12 12 12 14 14 10 Intermedio 15-16 14-16 14-16 15-17 15-22 14-20 13-17 13-14 13-14 15-16 15-17 11-15 Sensible 17 17 17 18 23 21 18 15 15 17 18 16 17 mm 0 25 mm 0 30 mm 26 mm 20 mm 21 mm 17 mm 17 mm 28 mm 27 mm

Sensible a 10 de los 12 antibioticos de los cuales el mas eficiente es el Levofloxacina ya que en pocas dosis causa un gran efecto inhibidor. La Salmonella es resistente a dos de los doce frmacos: a la Ampicilina y a Cefalotina en los cules el alo de crecimiento fue nulo.

Preguntas de revisin.
1.- Qu se entiende por concentracin inhibitoria minima (CIM)? R=La Concentracin mnima inhibitoria (CMI), en microbiologa, es la concentracin ms baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo despus de su incubacin. La concentracin mnima inhibitoria es importante en diagnsticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y adems para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos. 2.-Qu es la concentracin bactericida mnima (CBM)? R= La Concentracin Mnima Bactericida (CMB), se define como la mnima concentracin de antimicrobiano que elimina a ms del 99,9% de los microorganismos viables despus de un tiempo determinado de incubacin (generalmente 24 horas) (8,9). 3.-Qu es el poder inhibitorio del suero (PIS)? R= (PODER INHIBITORIO DEL SUERO) Es la mayor dilucin de un ATB en el suero del paciente, capaz de inhibir el desarrollo visible de un microorganismo. 4.-Qu se entiende por poder bactericida del suero? R= (PODER BACTERICIDA DEL SUERO) Es la mayor dilucin de un ATB en el suero del paciente, capaz de matar al inculo en un 99,9 % 9

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5.-Qu se entiende por SISTEMA EXPERTO en microbiologa? R= Los Sistemas expertos sirven para resolver cuestiones complejas, en las cuales hay muchos
factores involucrados, se necesita tener en cuenta una amplia base de datos histricos, y donde se puede definir alguna regla que permita la toma de decisiones rpida.

Anlisis y discusin.
Segn la pruebas del antibiograma la salmonella es resistente a la ampicilina y a la cefalotina siendo etas dos betalactamasas. Esta especie de Salmonela no es suseptible a las betalactamasas. Al presentar una resistencia significativa este frmaco inhibi el crecimiento de la poblacin de salmonela en el medio de cultivo.

Conclusiones En esta prctica logramos observar la efectividad de algunos frmacos sobre una cierta bacteria especifica (en este caso la shigella) colocando un multidisco de sensibilidad para hacer el antibiograma, gracias a esta prueba se puede conocer con mayor seguridad el frmaco que acta mejor sobre determinada bacteria para as dar un tratamiento adecuado a la hora de preinscribir algn frmaco para cierta patologa. Bibliografa.
y R. Taroco, V. Seija, R. Vignoli. Metodos de estudio de la sensibilidad antibitica. Uruguay.

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