.

XIMREVSKA ANA

RIBOZIMI
osvrt kon kataliti~kite aktivnosti

Seminarska rabota

Skopje, 2010

VOVED
Ribozimite (RNA enzimi ili kataliti~ka RNA ) pretstavuvaat RNA molekuli koi poseduvaat dobro definirana tercierna struktura koja im ovozmo`uva da gi kataliziraat hemiskite rekacii. Golem del od poznatite ribozimi vr{at hidroliza ili na sopstvenite fosfodiesterski vrski ili gi hidroliziraat istite kaj drugi RNA molekuli, no isto taka ja kataliziraat i aminotransferaznata aktivnost na ribozomot. Porano, lu|eto smetaa deka RNA e samo dostojna kopija na pova`nata nukleinska kiselina odnosno na DNA. Vsu{nost dvojniot heliks na DNA molekulata e toa {to go gledame na naslovnite stranici i na televiziite, DNA e materijal od na{ite geni i hromozomi, taa go determinira na{eto genetsko nasledstvo. RNA e kopija od DNA koja slu`i kako informacija za direktna sinteza na protein, koj se uni{tuva otkoga }e ja zavr{i svojata funkcija.

DNA e kopirana vo RNA, koja pak pretstavuva ednoveri`na ni{ka, koja zavzema razli~ni sekundarni formi

Pogolemiot del od biolo{kite katalizatori se proteini nare~eni enzimi. Mnogu godini nau~nicite pretpostavuvaa deka proteinite poseduvaat kompleksna struktura koja im ovozmo`uva da bidat specifi~ni katalizatori vo kletkite, no vo ranite 80ti godini od minatiot vek, istra`uva~kite grupi na Tom Cech i Sidney Altman, nezavisno edni od drugi, otkrile deka nekoi biolo{ki katalizatori se vsu{nost RNA molekuli. Vakvite RNA molekuli se nare~eni ribozimi. Ovie nau~nici ja dobija Nobelovata nagrada za hemija vo 1989 god., za svoeto otkritie. Ottoga{ ribozimite se vo centarot na vnimanieto vo molekularnata biologija i medicinskite nauki. 2

RNA pretstavuva klu~na molekula na `ivotot. Va`en ~ekor vo navleguvaweto i razbiraweto na molekularnata biologija e vsu{nost razbiraweto na strukturata i funkcijata na RNA molekulata. Vo taa nasoka, ribozimite pretstavuvaat vetuva~ki terapevtski agensi, sposobni da ja inhibiraat genskata ekspresija i bi bile korisni vo genskata terapija vo borba so rakot. Vo poslednite nekolku godini istra`uvawata na RNA molekulite dostignuvaat novi celi. Sega e jasno deka RNA katalizata ima mnogu pove}e centralna uloga vo biologijata, otkolku {to bi mo`ele da pretpostavime. Pokraj toa, RNA ~esto ja kontrolira ekspresijata na genite, u{te edna uloga za koja se misle{e deka pripa|a na del od proteinite takanare~eni represori i transkripciski faktori.

KRATOK ISTORISKI PREGLED

Pred otkrivaweto na ribozimite, enzimite koi se definiraat kako kataliti~ki proteini bea edinstvenite biolo{ki katalizatori. Vo 1967 godina, Carl Woese, Francis Crick i Leslie Orgel bile prvite koi uka`uvaat na toa deka RNA mo`e da dejstvuva kako katalizator. Ovaa ideja be{e zasnovana vrz otkritieto deka RNA mo`e da formira kompleksni sekundarni strukturi. Prvite ribozimi bea otkrieni vo 1980 godina od Thomas P. Cech, koj go prou~uva{e RNA splajsingot vo cilijarnata protozoa Tetrahymena thermophila i Sidney Altman, koj rabote{e na bakteriskiot RNAaza P kompleksot. Ovie ribozimi bea pronajdeni vo intronot na RNA transkript, koj se otstranuva od transkriptot, kako i vo RNA komponentata vo RNAaza P kompeksot, koj e vklu~en vo zreeweto na tRNA molekulite. Terminot ribozim prv pat e voveden od strana na Kelly Kruger et al. vo 1982 godina vo trud objaven vo Cell. Cvrsto se veruva{e deka katalizata ja vr{at samo proteinite. No i kataliti~kata RNA ima smisla. Ova se bazira na staroto pra{awe vo vrska so potekloto na `ivotot. Koi se prvi, enzimite koi ja vr{at rabotata na kletkata ili nukleinskite kiselini koi {to gi nosat informaciite potrebni za sinteza na enzimite? Nukleinskite kiselini kako katalizatori go re{avaat ova pra{awe.

RNA HIPOTEZA
Iako pove}eto ribozimi se retki vo kletkata, nnivnite ulogi se esencijalni za `ivotot. Funkcionalniot del od ribozomite, molekularnata 3

ma{ina koja ja preveduva RNA vo proteini, vo osnova e ribozim izgraden od RNA tercierni strukturni motivi, koordinirani so metalni joni, Mg, kako kofaktor. RNA isto taka ima uloga i kako nasledna molekula, koja {to go motivirala Walter Gilbert da pretpostavi deka vo dale~noto minato kletkata ja koristela RNA i kako genetski materijal i kako strukturna i kataliti~ka molekula, pred ovie funkcii da bidat podeleni na DNA i proteinite kako {to e denes. Ovaa hipoteza e nare~ena Hipoteza na RNA svetot. Mnogu biolozi pretpostavuvaat deka ribozimite se ostatoci (odbele`ja, tragi) na star, prebioti~ki svet koj i prethodi na evolucijata na proteinite. Isto taka se smeta deka RNA svetot evoluiral vo DNA i proteinski svet. Vo ovoj RNA svet, RNA molekulite bea katalizatori na procesi kako replikacija, presekuvawe i spojuvawe na RNA molekuli. Se pretpostavuva deka proteinite evoluirale podocna i kako tie evoluirale gi prevzemale funkciite koi prethodno gi izvr{uvale RNA molekulite. Od druga strana pak, DNA so svojata podobra hemiska stabilnost ja prevzema ulogata na ~uvar na informacii, dodeka proteinite, koi {to se pofleksibilni vo svojata kataliti~ka funkcija zaradi raznovidnosta na aminokiselinite, stanale specifi~ni katalizira~ki molekuli. RNA hipotezata predlo`uva deka RNA vo modernite kletki, kako rRNA (RNA vo ribozomot koja ja katalizira produkcijata na proteinite) e evoluciski ostatok, traga od nekoga{niot RNA svet. Denes, prekursorot na pre-tRNA se dobiva od ribozimot RNAaza P, no vo nekoi hloroplasti, prekursorot se dobiva od protein koj {to ne sodr`i RNA. Ova moz`e da pretstavuva primer za evolucijata na proteinski enzimi koi gi zamenuvaat ribozimite. Ako ribozimite bea prvite molekularni ma{ini koristeni od po~etokot na `ivotot, toga{ dene{nite ostanati ribozimi-kako na primer ribozom ma{inerijata-mo`e da se smetaat kako `ivi fosili na `ivotot, bazirani pred se na nukleinskite kiselini.

RIBOZOM
Edna od najva`nite molekularni ma{ini vo `ivite kltki pretstavuva ribozomot. Ribozomot ja preveduva porakata kodirana vo mRNA (informaciska RNA) za sinteza na specifi~ni proteini, koi ja izvr{uvaat celata rabota vo biologijata. Proteinite mo`e da se hormoni kako insulinot ili seks hormonite, drugi proteini u~estvuvaat vo muskulnata kontrakcija, a sosema drugi ja kataliziraat razgradbata na hranata. Sekoja mRNA kodira specifi~en protein. Ribozomot e zna~aen po toa {to mo`e da dekodira neograni~en broj na mRNA molekuli. 4

Ribozomot e neobi~en katalizator, izgraden od tri RNA molekuli (4 kaj nekoi vidovi ) i duzina proteini. Vo tekot na izminatite trieset godini se pretpostavuva deka vsu{nost RNA le`i vo kataliti~koto srce ili aktivna strana na ribozomot zaedno so odredeni pomo{ni proteini. No, vo biohemijata va`i edna slika iljada zborovi i dobivaweto na strukturata na ribozomot pretstavuva{e proekt koj predizvika golem interes. Trodimenzionalnata struktura na golemata subedinica (50Y) na bakteriskiot ribozom, be{e objavena vo avgust 2000 godina. Taa jasno poka`uva deka formiraweto na peptidnata vrska koja {to ja povrzuva sekoja aminokiselina vo raste~kiot polipeptiden lanec, e katalizirana od 23Y RNA molekula vo golemata subedinica. 31-ot protein vo subedinicata najverojatno go odr`uvaat skeleto potrebno za da se zadr`i terciernata struktura na RNA molekulata.

Golemata subedinica na ribozomot. To~kata {to sveti pretstavuva aktivnata strana na proteinskata sinteza. Aktivnata strana e sosatvena od RNA (belite ni{ki), bez protein (portokalovite ni{ki), uka`uvaj} na toa deka ribozomot e ribozim.

Vo 2000 godina, dobiena e slika na ribozom na atomsko nivo, poka`uvaj}i klop~e od RNA molekuli obvitkani so pomo{ni proteini. Edna struktura ja poka`uva stranata kade se nao|aat aminokiselini koi se nani`ani vo proteini (peptidiltransferazniot centar), vsu{nost izgraden e od RNA bez proteini vo blizina. Ova poka`uva deka ribozomot e vsu{nost ribozim, RNA katalizator. Drugi strukturi poka`uvaat kako ribozomot e inhibiran so antibiotici, kako toj promovira interakcija pome|u mRNA i tRNA molekulite i kako celata struktura e organizirana. Celoto ova mo`e da zvu~i nejasno, no vsu{nost se postavuvaat novi pristapi za razvivawe na antibiotici protiv patogenite bakterii . Pokraj se, sintezata na proteinite e najva`na za `ivotot i ~ove~kite ribozomi se sli~ni no ne i identi~ni so ribozomite na bakteriite, i zatoa e vozmo`no da 5

se najdat lekovi koi }e gi inaktiviraat, t.e. soodvetna terapija za odredena bolest.

RIBOZIMI-STRUKTURA I FUNKCIJA
RNA katalizatorite (ribozimite) se nao|aat vo nukleusot, mitohondriite i hloroplastite na eukariotskite organizmi. Nekoi virusi, vklu~uvaj}i i nekoi bakteriski virusi isto taka imaat ribozimi. Ribozimite poznati do sega, se grupirani vo pove}e hemiski grupi, no vo site slu~ai RNA e asocirana so metalni joni, kako {to se Mg ili K, koi imaat va`na uloga za vreme na katalizata. Re~isi site ribozimi se vklu~eni vo obrabotkata na RNA. Tie deluvaat ili kako molekularna no`ica za se~ewe na prekursorni RNA segmenti (segmenti od koi {to zapo~nuva sinteza na novi RNA ni{ki) ili pak deluvaat kako molekularna spojuvalka koja spojuva dve RNA molekuli vo edna. Iako target molekuli na pogolem broj ribozimi se RNA molekulite, mo`e da se zabele`i deka povrzuvaweto na amino k-te vo protein koe se slu~uva vo ribozomot za vreme na translacijata, e isto taka katalizirano od RNA. Taka, ribozomalnata RNA pretstavuva sama po sebe ribozim. Vo nekoi rekacii katalizirani od ribozimite, procesite na presekuvawe i spojuvawe na RNA molekulite se povrzani. Vo ovoj slu~aj RNA ni{kata e prese~ena na dve mesta i sredniot del (nare~en intron) e otfren, dodeka dvata strani~ni dela (nare~eni egzoni) se spojuvaat. Ovaa reakcija e nare~ena spojuvawe. Osven ribozim-posreduva~kiot splajsing (spojuvawe) koj {to vklu~uva RNA samo, postojat i drugi splajsing reakcii koi {to vklu~uvaat RNA-protein kompleksi. Ovie kompleksi se nare~eni mali jadreni ribonukleoproteinski ~esti~ki, skrateno snRNP. Ovoj vid na spojuvawe e mnogu ~esta karakteristika vo dobivawe na mRNA kaj vi{ite eukarioti kako {to se lu|eto. Se u{te ne e poznato dali snRNP posreduva~koto spojuvawe e katalizirano od RNA komponenti. Isto taka, nekoi RNA splajsing reakcii se katalizirani od enzimi koi imaat samo proteinska priroda. Nekoi prekursorni RNA molekuli imaat ribozimi vo nivnite sopstveni introni i ovoj ribozim e odgovoren za otstranuvaweto na intronot vo koj se nao|a. Tie se nare~eni samo-presekuva~ki RNA. Otkoga splajsing reakcija e gotova, intronot, vklu~uvaj}i go ribozimot, se degradira. Vo vakvi slu~ai, sekoj ribozim raboti samo edna{, za razlika od proteinskite enzimi koi kataliziraat reakcii postojano. Primeri za samo-spojuva~ki RNA se ribozomalnite RNA kaj ciliarnite protozoa i odredeni mRNA od mitohondriite kaj gabite. Nekoi RNA virusi, kako {to e hepatit delta virusot, isto taka vklu~uva ribozim kako del od nivnata nasledna RNA molekula. Za vreme 6

na replikacijata na virusnata RNA, dolgi lanci koi {to sodr`at povtoruva~ki segmenti od RNA genomot (viralnata geneti~ka informacija) se sintetizirani. Potoa, ribozimot gi se~e dolgite multimerni molekuli na par~iwa koi sodr`at samo edna kopija na genomot i go smestuva RNA par~eto vo virusnata ~esti~ka. Drugi ribozimi rabotat na drugi RNA molekuli. Eden ribozim od toj tip pretstavuva RNAaza P, koj se sostoi od edna RNA ni{ka i eden ili pove}e proteini (zavisno od organizmot). Kataliti~kiot mehanizam na RNAaza P be{e posebno ispituvan kaj bakteriite. Ovoj ribozim formira prekursorna tRNA so otstranuvawe na prodol`etok od 5krajot za da formira 5kraj na zrela tRNA molekula (dvata kraja na RNA molekulata se hemiski razli~ni i se nare~eni 5 3 kraevi odgovaraj}i na specifi~ni jaglerodi vo {e}ernata polovina na terminalnite nukleotidi). Koga RNA molekul od bakteriska RNAaza P e pro~isten od svojot protein, se u{te mo`e da ja prese~e prekursornata tRNA targetna molekula, iako mnogu posporo, doka`uvaj}i deka RNA e katalizatorot. Me|utoa, proteinot (proteinite) vo RNAaza P isto taka imaat va`ni funkcii, kako {to e odr`uvaweto na pravilnata konformacija na RNAaza P RNA i interakcijata so prekursornata tRNA. Mnogu funkcii na ribozimite se mo`ni zatoa {to prirodata na {iroko go koristi RNA splajsingot i so tekot na vremeto se dobile ribozimi so razli~ni ulogi. Me|u drugite enzimski svojstva za po~etokot na `ivotot se i -sposobnosta da se samo-dupliciraat ili da dupliciraat drugi RNA molekuli. Relativno kratki RNA molekuli koi mo`at da dupliciraat drugi, ve{ta~ki bea dobieni vo laboratorija. - sposobnosta da kataliziraat ednostavni hemiski reakcii so koi se podobruva dobivaweto na molekuli koi se gradbeni blokovi na RNA molekulite. - sposobnosta da katalizira sozdavawe na peptidni vrski i pritoa da sozdava kratki peptidi ili pak i celi proteini. Ova se slu~uva vo ribozimitekompleks od dve rRNA i protein. Se pretpostavuva deka rRNA molekulite se odgovorni za negovata enzimska aktivnost.

RIBOZIMITE NA HEMISKO NIVO

Istovremeno so site ovie otkritija vo vrska so RNA molekulata, golem napredok e napraven i vo razbiraweto kako raboti ribozimot na hemisko nivo. RNA molekulite ednostavno ne formiraat dobro organizirani kristali povolni za H rendgenska difrakcija. Ovoj problem be{e prv re{en za pomalite samo-presekuva~ki ribozimi, otkrivaj}i neo~ekuvano slo`eni izvitkani modeli i iskoristuvaweto

na RNA kako proton donori i akceptori so {to se zabrzuvaat hemiskite reakcii. Kone~no, prvite dobro-objasneti strukturite na samo-spojuva~kite introni bea re{eni. Dolgo-predviduvanite kataliti~ki metalni joni, sega mo`e da se vizueliziraat, fateni vo soodvetno mesto od fosfatnite grupi koi se zavitkani vo kompleksot izvitkan od RNA ni{kata. Metalnite joni na aktivnata strana ovozmo`uvaat da se stabilizira srednata to~ka ili transition state na reakcijata so neutralizirawe na polne`ot i orientirawe na reaktivnite atomi.

VIDOVI RIBOZIMI
Nau~nicite se u{te ne se vo sostojba precizno da go predvidat na~inot na svitkuvawe ili aktivnata tercierna struktura na RNA molekulite od nivnata primarna struktura. RNA molekulite poseduvaat hierarhiska struktura, primarnata sekvenca go determinira formiraweto na sekundarnata, dodeka sekundarnata, ponatamu go determinira terciernoto svitkuvawe. RNA mo`e da formira razli~ni inermedierni strukturi, no samo edna obi~no e stabilna. Ribozimite se interesni molekuli za istra`uvawe zaradi toa {to modifikaciite vo nivnite strukturi vlijaat vo nivnite kataliti~ki svojstva. Poprecizno, malite ribozimi se soodvetni za istra`uvawe so ogled na toa deka napraven e golem uspeh vo determinirawe na nivnata tercierna struktura. Vo ovaa podgrupa na mali samo-kataliti~ki RNA molekuli spa|aat tri vida i toa hairpin i hammerhead ribozimite dobieni od viroidite i viroid satelitski RNA od rastitelno poteklo, dodeka HDV samo-presekuva~kiot ribozim e dobien od HDV koj gi inficira lu|eto. Ovie samo-presekuva~ki RNA molekuli go kataliziraat se~eweto na RNA fosfodiesterskite vrski so reakcija na transesterifikacija, vklu~uvaj}i napad na sosednata 2-ON grupa na fosfatot, davaj}i 23cikli~en fosfat i 5OH kraevi kako produkti. Mehanizmot {to e vklu~en e nukleofilna supstitucija {to e naj~esto acido-bazno katalizirana. Kone~no, prisustvoto na metalni katjoni e va`no vo RNA svitkuvaweto so cel da se dobijat dobro organizirani strukturi i katalizatori. Ovie mali samo-presekuva~ki RNA molekuli se metaloenzimi vo fiziolo{ki uslovi, no tie se aktivni i vo otsustvo na divalentni joni pod odredeni uslovi kako {to e prisustvoto na visoki koncentracii na monovalentni metalni joni ili niski pH sostojbi. Generalno, pet klasi na ribozimi bea opi{ani spored nivnite specifi~ni svojstva vo sekvencite, kako i spored nivnata trodimenzionalna struktura. Tie se obele`ani kako: 8

1. RNAaza P, 2. Tetrahymena grupa i 2 intron 3. hammerhead ribozim, 4. hairpin ribozim 5. HDV ribozim

RNAaza P Site `ivi organizmi sintetiziraat enzim nare~en ribonukleaza P, koj {to e tip na ribonukleaza odgovorna za se~eweto na RNA. RNAaza P se razlikuva od drugite ribonukleazi po toa {to samo taa pretstavuva ribozim. Nejzinata funkcija e da gi otsekuva vi{okot ili prekursornite sekvenci od tRNA molekulite.

Kristalna struktura na RNAaza P so tRNA kako supstrat(zelena ni{ka)

Osven toa RNAaza P e eden od dvata poznati poprometni ribozimi vo prirodata(drugiot e ribozomot).Neodamne{nite otkritija poka`uvaat deka RNAaza P ima nova funkcija. Poka`ano e deka ~ove~kata nuklearna RNAaza P e potrebna za normalna i efikasna transkripcija na razli~ni mali nekodira~ki RNA geni, kako {to se tRNA, 5Y rRNA, SRP RNA i U6 snRNA geni koi se transkribirani od RNA polimeraza 3, edna od trite nuklearni RNA polimerazi vo kletkite na ~ovekot. Kaj bakteriite kako {to e E.coli RNAaza P e izgradena od dva dela RNA lanec nare~en M1RNA i polipeptiden lanec ili protein nare~en S5 protein. In vivo i dvete komponenti se potrebni za ribozimot da funkcionira pravilno, no vo in vitro uslovi M1RNA mo`e da funkcionira samostojno kako katalizator. Primarnata uloga na S5 e da go podobri afinitetot kon vrzuvawe na substratot i da ja podobri kataliti~kata stapka na M1RNA 9

enzimot so zgolemuvawe na afinitetot sprema metalnite joni vo aktivnata strana. RNAaza P e ubikvitozna endoribonukleaza, najdena kaj arhei, bakterii, eukarioti, kako i vo hloroplastite i mitohondriite. Nejzinata najdobro poznata aktivnost e sozdavawe na zreli 5 kraevi na tRNA molekulite so se~ewe na 5 po~etnite sekvenci od prekursornite tRNA molekuli. RNA od bakteriskata RNAaza P ja zadr`uva svojata kataliti~ka aktivnost vo otsustvo na proteinskata subedinica, t.e. taa e ribozim. Izoliranite eukariotski i arhe RNAaza P RNA ne ja zadr`uvaat svojata kataliti~ka aktivnost, no sepak se va`ni za kataliti~kata aktivnost na holoenzimot, isto taka ovie imaat i pogolema sodr`ina na protein za razlika od bakteriskite. Kaj eukariotite, kako {to se lu|eto i gabite, pove}eto RNAaza P se sostojat od RNA lanec sli~en na toj kaj bakteriskite, kako i od 9-10 asocirani proteini (sprotivno na bakteriskata kade {to ima{e samo eden protein). Ovie proteinski subedinici na RNAaza P se delat so RNAaza MRP, kataliti~ki ribonukleoprotein vklu~en vo obrabotkata na ribozomalnata RNA vo nukleolusot. Samo RNAaza P od eukariotite se smeta{e deka e ribozim. Soodvetno na toa, brojnite proteinski subedinici od eukariotskata RNAaza P imaat pomal pridones vo sopstvenata tRNA obrabotka, dodeka pak, tie se smetaat deka se od su{tinsko zna~ewe za funkcijata na RNAaza P i RNAaza MRP za drugite biolo{ki podesuvawa, kako {to se genskata transkripcija i kleto~niot ciklus. Neodamna e otkrieno deka ~ove~kata mitohondrijalna RNAaza P e protein i ne sodr`i RNA.

Trodimenionalna struktura na ribozim, self-splicing intron na Tetrahymena. Zelenite i sinite lenti go poka`uvaat patot na RNA lanecot vo dvata golemi domeni na RNA i crvenata yvezda ja obele`uva aktivnata strana

Grupa 1 i grupa 2 introni

10

Grupa 1 introni- Nekoi rRNA geni kako na primer vo mitohondrijalniot genom na gabite, ili pak, nekoi hloroplastni genomi, ili vo nuklearniot genom kaj nekoi ni`i eukarioti, sodr`at introni koi treba da bidat spoeni za da se dobie finalniot proizvod. Reakcijata na spojuvawe e avtonomna, odnosno intronot so pomo{ na asociranite proteini, samiot se spojuva so RNA prekursorot. Otkako otse~uvaweto na intronot i spojuvaweto so sosednite egzonite e kompletno, prikaznata e zavr{ena. So drugi zborovi, iako aktivnosta e katalizirana od RNA, samo edna

molekula na substrat e vklu~ena (za razlika od kaj proteinite koi postojano ja kataliziraat reakcijata. Grupa 1 intronite se golemi samo-spojuva~ki ribozimi. Tie go kataliziraat sopstvenoto otstranuvawe od mRNA, tRNA i rRNA prekursorite kaj pove}e organizmi. Glavnata sekundarna struktura se sostoi od devet spareni regioni (R1-R9) Ovie se svitkuvaat vo dva osnovni domeni-R4-R6 domenot (formiran so grupiraawe na R5, R4, R6 i R6a heliksi) i R3-R9 domenot (formiran od R3, R7 i R9 heliksite) Grupa 1 intronite ~esto imaat dolga ramka na ~itawe vmetnati vo jamka (loop) regionite. Spojuvaweto na grupa 1 intronite se odviva so dve posebni estertransfer reakcii. Egzogeniot gvanozin ili gvanozin nukletidot prvo se spojuva so aktivnata G vrzuva~ka strana locirana na R7 i negovata 3OH ja napa|a fosfodiesterskata vrska na 5splajs stranata locirana na R1 i se dobiva slobodna 3OH grupa na sprotivodnite egzoni i egzoG e zaka~en za 5 krajot na intronot. Potoa terminalnata G na intronot doa|a na mestoto od egzoG i ja prevzema G vrzuva~kata strana za da ja otpo~ne vtorata ester-transfer reakcija, 3OH grupata na sprotivodniot egzon na R1 ja napa|a 3 splajs stranata vo R10, vodej}i kon ligacija(spojuvawe) na sosednite egzoni i osloboduvawe od kataliti~kiot intron.

Grupa 2 introni- Nekoi mRNA geni, primer vo mitohondrijalniot genom kaj nekoi gabi i kvasci (koi gi kodiraat citohrom b proteinite i 11

subedincite na citohrom c oksidaza), kako i kaj nekoi hloroplastni genomi, isto taka sodr`at samospojuva~ki introni. Zaradi nivnata sekundarna struktura i karakteristikite na spojuvaweto, se razlikuvaat od rRNA intronite i zatoa se nare~eni grupa 2 introni.

Hammerhead ribozim Imeto hammerhead ribozim go dobiva poradi sli~nosta pome|u negovata sekundarna struktura i formata na ~ekanot (Y-forma), Tie se najdobro prou~ena podgrupa na ribozimi. Nekoi od ribonukleotidite vo sekvencata selektivno formiraat bazni parovi so drugi za da formiraat dr{ka, a ostanatite formiraat jamka. Trodimenzionalnata struktura se dobiva so H-rendgenska kristalografija.

Struktura na hammerhead ribozim

12

Sekundarna struktura na cis i trans hammerhead ribozim

Levo na slikata pogore, poka`ana e strukturata na diviot tip-cis. Trite heliksi i mestoto na se~ewe se opi{ani. Samospojuvaweto se slu~uva po nizata GUC pome|u heliks 1 i 3, i G i U se za~uvani {to e od su{tinsko zna~ewe za katalizata. Osven za samiot sebe, hammerhead ribozimot nema kataliti~ka funkcija vo kletkite zaradi prirodata na negovata intramolekularna reakcija. Vo sekoj slu~aj mnogu ribozimi mo`e hemiski da se dobijat so cel da se razdvojuvaat RNA, vo trans, so oddeluvawe na kataliti~kiot domen od ribozimot so dodavawe na prepoznava~ki sekvenci vo kataliti~kiot centar, so cel da se stigne do substratot. Vo sporedba so ve}e opi{anite RNA molekuli, ribozimite ovozmo`uvaat potencijalna realizacija(rotacija, dobivka), so edna edinstvena molekula mo`at da se inaktiviraat pove}e target RNA molekuli. Druga va`na karakteristika na ovie ribozimi e specifi~nosta, odnosno preciznosta vo presekuvaweto na specifi~na molekula.

Ciklus na RNA presekuvawe so hammerhead ribozim. Vrzuvaweto na enzimot i substratot dava kataliti~ki aktivna struktura. Po presekuvaweto, dvete dobieni ni{ki disociraat i ribozimot mo`e da otpo~ne nov ciklus.

13

Hairpin ribozim Hairpin ribozimot e eden od ~etirite poznati prirodni kataliti~ki RNA molekuli koi vr{at specifi~no presekuvawe na RNA. Ovoj ribozim e od posebno biohemisko zna~ewe, zatoa {to za razlika od klasi~nite(poznati) ribozimi, kako {to se grupa 1 intron ribozimite, nema potreba od metalni joni kako kataliti~ki kofaktori. Aktivnata strana na ribozimot e kako rezultat na potsekuvaweto na dva nepravilni dvojni heliksi. Rezultatite od presekuvaweto vo va`nite struturni preureduvawa na heliksite, vklu~uvaj}i go i istegnuvaweto(naru{uvaweto) na substratnata ni{ka koja {to ja menuva reaktivna konformacija. Ostanuva da se vidi dali ovoj RNA enzim ja koristi vrzuva~kata energija za kataliza, ili pak, postoi drug mehanizam, kako {to e acidobaznata kataliza koj {to se koristi. Hairpin ribozimot pretstavuva kataliti~ka RNA izolirana od satelitskata RNA kaj rastitelnite virusi. Katalizira presekuvawe na specifi~ni sekvenci i ligacija na RNA preku transesterifikacija na fosfatot. Maliot katalizator se sostoi od dva nepravilni dupli heliksi, dr{ka A i dr{ka B. Lesno raskinliviot fosfat le`i vo eden od koncite na dr{kata A. In vitro ovie dr{ki, mo`e da se dobijat kako odvoeni RNA molekuli i so me{awe da se preuredi(smeni) specifi~noto se~ewe. In vivo, sepak, dr{kite A i B se del od ~etiriheliksen kompleks. Lilley i sorabotnicite poka`aa deka vo prisustvo na fiziolo{ki koncentracii na bivalentni katjoni, ~etirite dr{ki od kompleksot ostanuva sparen. Plastovite (masata) asociraat so vkrstosuvawe na vlaknata A i B na aktivnata strana. Ne e iznenaduva~ki toa {to ribozimot spoen so kompleksot e pstabilen od toj izgraden samo od dr{kite A i B. So presekuvaweto se dobivaat RNA so 23-cikli~ni fosfati i 5OH kraevi. Ovie molekuli se produkti na reakcii katalizirani od tri drugi prirodno nastanati kataliti~ki RNA, hammerhead, hepatits delta virus i Varkud satelitskite ribozimi. Otkoga se vospostavi deka ovie ~etiri relativno mali ribozimi, se strukturno nepovrzani, tie gi pretstavuvaat evolutvno nezavisnite re{enija na istiot biohemiski problem. Karakterizacijata na ovie ribozimi dava va`en uvid vo strukturnata i kataliti~ka raznovidnost na RNA.

Sekundarna struktura na hairpin ribozimot (a). Kristalna struktura na prekursornata forma na hairpin ribozimot(b)

14

Determinirana e kristalnata struktura na ribozimskiot inhibitoren kompleks na rezolucija od 2.4 angstremi. So cel da se dobie celosno sklopen ribizim, stabilniot 4-veri`en kompleks, be{e objekt na kristalizira~ki ispituvawa vo prisustvo na dovolna koncentracija na bivalentni katjoni za saturacija na vrzuva~kata strana. Reakcijata na ribozimot be{e inhibirana so sklopuvawe(spojuvawe) na ribozimot i toa ne so cel RNA susptrat, tuku so inhibitor, na koj 2-ON grupata sosedna na kr{liviot fosfat(nukleofil na reakcija na raskinuvawe)be{e smenet so inertna 2-metoksi funkcionalna grupa. Kristalnata struktura e sostavena od in vitro transkribirana RNA ni{ka so homogeni kraevi i sinteti~ki oligonukleotidna inhibitor- ni{ka. So cel da se poka`e formiraweto na dobroorganiziranite kristali, strkturno i funkcionalno neva`na jamka na krajot od dr{kata B, be{e modificirana za da sodr`i srodna(sli~na) vrzuva~ka strana za splajsozomalniot protein U1A. Dobienata ribozim-inhibitor struktura be{e spoena so RNA vrzuva~kiot domen (RBD) od U1A i potoa koristen za eksperimenti so kristalizacija. Upotrebata na U1A-RBD za olesnuvawe na RNA kristalizacijata be{e usovr{eno (razvieno) porano za strukturna determinacija na HDV ribozimot. Pove}e od dvaesetina hairpin-riboziminhibitorni konstrukti, koi {to se razlikuvaat vo dol`inata na ~etirite dr{ki, kako i vo brojot na (prostorni) bazni parovi, koi ja razdeluvaat U1A vrzuva~kata strana i ribozim-kataliti~koto jadro, bea skenirani (skrin) za kristalizacija, dodeka soodvetni kristali ne bea dobieni. [irokoto ureduvawe(postavuvawe) na strani~nite nukleotidi na fosfatot vo strukturata na ribozimot e mnogu sli~na so konformacijata na dinukleotidniot analog UpcA koga se vrzuva so ribonukleazata A. Posledniot e proteinski enzim koj ja katalizira istata reakcija kako i hairpin ribozimot. Taka imame primer na konvergentna evolucija na protein i na RNA {to ja izvr{uvaat istata funkcija. Ribonukleazata A koristi dva histidinski rezidui kako glavni acido-bazni katalizatori za deprotonizirawe na 2-ON nukleofilot i protonizirawe na 5 grupata {to si odi. Proteinot isto taka koristi pozitivni lizinski rezidui da ja stabilizira dianjonskata tranziciska sostojba elektrostatski. Za razlika od proteinite, nukleinskite kiselini nemaat funkcionalni grupi koi joniziraat blisku do neutralnost (uslov za vr{ewe protonski transfer). Niedna funkcionalna grupa na nukleinskite kiselini ne e pozitivno naelektrizirana na fiziolo{ka pH. Kako toga{ ribozimite ja kataliziraat transesterifikacijata? Mehanizmot na kataliza na Tetrahymena grupa 1 intron e {iroko opi{an. Ribozimot od Tetrahymena katalizira dve sukcesivni transesterifikacii so pomo{ na tesno vrzani Mg joni. Zaradi toa {to RNA baraat bivalentni katjoni za da gi prifatat funkcionalnite svitkani strukturi, ~esto pretstavuva problem da se razdvojat eksperimentalno katjonite koi {to ja stabiliziraat aktivnata konformacija na ribozimot od onie koi {to u~estvuvaat vo kataliti~kiot ~ekor. Bivalentnite metalni joni vrzani za 15

ribozimot vo aktivnata strana, u~estvuvaat vo katalizata so direktno aktivirawe na funkcionalna grupa na nukleinskata k-na, ili so promovirawe(unapreduvawe) jonizacija na (usoglasena,koordinirana) molekula na voda. Eksperimentite koi vklu~uvaat kobalt 3 heksamin poka`aa deka takvata uloga na vrzanite katjoni ne e svojstvena za hairpin ribozimite. Kobalt heksamin e izosteri~en so hidrirani joni na Mg, vo sekoj slu~aj amino ligandite se mnogu koordinirano usoglaseni i ne se menuvaat so drugi ligandi ili molekuli na voda. Hairpin ribozimot e aktiven i so kobalt heksamin i so Mg ili pak Ca. Ova podrazbira deka bivalentnite joni imaat isklu~ivo strukturni ulogi i toa vo forma na (nivnite) hidrati. Soglasno na ova, kristalnata struktura na ribozim-inhibitor kompleksot poka`uva deka nema metalni joni vo aktivnata strana. Dobroorganiziranite katjoni se najdeni pove}e na periferijata, otkolku vo jadroto na RNA. Ako hairpin ribozimot ne e metalen enzim, koi RNA funkcionalni grupi ja vr{at katalizata? Kristalografskata i biohemiskata karakterizacija na HDV ribozimot, poka`a deka katalizata vo (so ) toj ribozim se obavuva so citidil rezidua so popre~ena Pk. Dva purina vo aktivnata strana na hairpin ribozimot g8 i a36, se pozicionirani od dvete strani na kr{liviot fosfat, na na~in koj potsetuva na dvete histidinski rezidui od ribonukleaza A. Mo`no e da ovie dva nukleotidi ja nosat acido-baznata kataliza, no neodamne{nite biohemiski istra`uvawa ne donesoa kompleten dokaz za ovoj kataliti~ki mehanizam. Poradi toa, ostanuva mo`no toa deka pove}eto od kataliti~kata stapka na podobruvawe efektirano od hairpin ribozimot i doa|a od izvrtuvaweto na supstratot za da se naredat(izramnat) reaktivnite grupi, stabilizacija na procesot na promenata ili destabilizacija vo osnovnata sostojba. Razbiraweto na mehanizmot na ribozimot koj ne koristi metalni joni kako kofaktori ostanuva predizvikuva~ki problem.

HDV ribozim Hepatitis delta virus ribozimot pretstavuva nekodira~ka RNA molekula koja e neophodna za viralna replikacija i se pretpostavuva deka e edinstvenata kataliti~ka RNA potrebna za opstanokot na ~ove~kiot patogen. Ribozimot funkcionira so sozdavawe na RNA transkripti so ista dol`ina vo proces na samo-presekuvawe. Njadeno e deka ribozimot e aktiven in vivo samo vo otsustvo na proteinski faktori i e najbrzata poznata prirodna samopresekuva~ka RNA molekula. Kristalnata struktura na ovoj enzim e dobiena so H rendgen kristalografija koja poka`uva 5 heliksi povrzani so dvoen pseudoknot ( RNA sekundarna struktura koja sodr`i najmalku dve dr{kovidni jamki kade polovina od ednata dr{ka e isprepletena pome|u dve polovini od druga dr{ka). Vo prilog na ova, site HDV virusi imaat i antigenomska verzija na HDV ribozimot. Ovaa verzija ja nema to~nata komplementarna sekvenca no ima sli~na struktura kako genomskata dr{ka. 16

HDV e

ribozimot

strukturno i biohemiski povrzan so CPEB3 ribozim kaj cica~ite.

Sekundarna (A)struktura na HDV ribozimot i tercierna struktura (V) na istiot ribozim

Drugi dosega poznati ribozimi se i

Peptidyl transferase 23S rRNA GIR1 branching ribozim Leadzyme - , Mammalian CPEB3 ribozim VS ribozim glmS ribozim CoTC ribozim

Intenzivnite istra`uvawa na ribozimite poka`aa nekoi pravila za toa kako ribozimite gi prepoznavaat svoite celni molekuli. Vrz osnova na ovie pravila mo`no e ribozimite da se menuvaat vo nasoka da prepoznaat i se~at novi celni mesta vo RNA molekulite, nesvojstveno za ribozimskoto se~ewe. Ovie rezultati poka`aa novi mon`nosti za koristewe na ribozimite vo humanata terapija. Na primer, mno{tvoto RNA molekuli-predizvikuva~i na bolesti kako HIV, predizvikuva~ot na AIDS, mo`e da se prevenira so ve{ta~ki ribozimi. Zna~aen uspeh e postignat vo testiraweto na vakvi ribozimi vo model-kletki. Vo sekoj slu~aj ostanuva da se odgovori na najgolemoto pra{awe a toa e kako ovie disease-fighting ribozimi da se vnesat vo pacient i da se iskoristat od soodvetnite kletki. 17

LITERATURA
1.A. R. Ferre, DAmare and P. B. Rupert: The hairpin ribozyme: from crystal structure to function, Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 1100 Fairview Avenue N., Seattle,WA 98109-1024, U.S.A. 2.Carl Woese, The Genetic Code (New York: Harper and Row, 1967)
3.Cedric

Reymond Jean-Denis Beaudoin, Jean-Pierre Perreault, Cell. Mol. Life Sci. (2009) 66:39373950 DOI 10.1007/s00018-009-0124-1 4.Evans D, Marquez SM, Pace NR (2006). "RNase P: interface of the RNA and protein worlds". Trends Biochem. Sci. 31 (6): 33341. doi:10.1016/j.tibs.2006.04.007 PMID 16679018 5.J. Holzmann, P. Frank, E. Lffler, K. Bennett, C. Gerner & W. Rossmanith (2008). "RNase P without RNA: Identification and functional reconstitution of the human mitochondrial tRNA processing enzyme". Cell 135 (135): 462474. doi:10.1016/j.cell.2008.09.013 6.Reiner R, Ben-Asouli Y, Krilovetzky I, Jarrous N (2006). "A role for the catalytic ribonucleoprotein RNase P in RNA polymerase III transcription". Genes Dev. 20 (12): 1621 35. doi:10.1101/gad.386706. PMID16778078. 7.Serganov A, Patel DJ (2007) Ribozymes, riboswitches and beyond: regulation of gene expression without proteins. Nat Rev Genet 8:776790 8.Tsai HY, Masquida B, Biswas R, Westhof E, Gopalan V (2003). "Molecular modeling of the three-dimensional structure of the bacterial RNase P holoenzyme". J. Mol. Biol. 325 (4): 66175. doi:10.1016/S0022-2836(02)01267-6. PMID 1250747 http://academic.brooklyn.cuny.edu/chem/zhuang/QD/toppage1.html http://en.wikipedia.org/wiki/Ribozyme http://en.wikipedia.org/wiki/Hammerhead_ribozyme http://en.wikipedia.org/wiki/RNase_P http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_world_hypothesis http://medicine.jrank.org/pages/2796/Ribozyme-Structure-Function.html http://medicine.jrank.org/pages/2798/Ribozyme.html http://medicine.jrank.org/pages/2816/RNA-Processing.html http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/articles/cech/index.html 18

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Ribozymes.html

SODR@INA
1. Voved................................................................................... ......................1 2. Kratok istoriski pregled...................................................................2
3. RNK

hipoteza............................................................................... ...........2
4. Ribozom...............................................................................

.....................3
5. Ribozim-struktura i

funkcija...........................................................5
6. Ribozimot na hemisko

nivo.................................................................6
7. Vidovi

ribozimi................................................................................ ....7
-RNAaza P

...7
-Tetrahymena grupa i 2 intron

.................................................................9
ribozim................................................................................10 19 -Hammerhead

-Hairpin

ribozim

.......................................................................................12 ..........................................................................................14 ...............16

9. Sodr`ina............................................................................... -HDV ribozim

8. Literatura.............................................................................

................17

20