Validacin de mtodos analticos

Fuentes: The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Eurachem Guide, 1998 y Gua para la validacin de mtodos de ensayo. OAA.DC-LE-05

Principios de la prctica analtica

1. 2. 3. 4. 5. 6. Las mediciones analticas se deberan hacer para satisfacer una necesidad acordada (por ej, algn objetivo definido) Las mediciones analticas se deberan realizar usando mtodos y equipamiento que han sido probados para asegurar que se ajustan al propsito de la medicin El personal dedicado a las mediciones analticas debera ser calificado y competente para realizar la tarea (y demostrar que pueden realizar el anlisis correctamente) Debera haber un ensayo independiente regular del desempeo tcnico de un laboratorio Las mediciones analticas realizadas en un lugar deberan ser consistentes con aquellas realizadas en otro lugar Las organizaciones que hacen mediciones analticas deberan tener procedimientos de control de calidad y de aseguramiento de la calidad bien definidos

Introduccin
La validacin de un mtodo es un requisito importante en la prctica de los anlisis qumicos. Sin embargo, se suele considerar a la validacin de un mtodo como algo que solamente se puede hacer en colaboracin con otros laboratorios y en consecuencia, no se hace. Esta gua apunta a los laboratorios que necesitan validar mtodos y que no tienen la posibilidad inmediata de participar en ensayos colaborativos

Qu es validacin de un mtodo?
Validacin es la confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista (IRAM 32)

Es el proceso de definir un requisito analtico y de confirmar que el mtodo en consideracin es apto para lo que requiere la aplicacin Est implcito que los estudios para determinar los parmetros de aptitud del mtodo se hacen
usando equipamiento que funciona y que est calibrado correctamente (within specification) El operador es competente en ese campo de trabajo y tiene el conocimiento suficiente tal que es capaz de tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones que surgen a medida que avanza el estudio

Muchos de los parmetros de la aptitud del mtodo que se asocian con la validacin son de hecho evaluados, por lo menos aproximadamente, como parte del desarrollo del mtodo
Muy frecuentemente no es posible determinar exactamente dnde termina el desarrollo de un mtodo y dnde comienza la validacin de ese mtodo

Por qu es necesario validar un mtodo?

1. Cuando la medicin analtica es importante (costo, salud, remediacin, legal, etc.)
1. 2. Virtualmente, cualquier aspecto de la sociedad se respalda de algn modo por una medicin analtica Es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de demostrar que es correcto

2.

Por la obligacin profesional del analista 1. El cliente espera confiar en los resultados informados y generalmente los cuestiona cuando aparece algn conflicto (aqu el analista debe demostrar que ha informado la respuesta correcta para la parte analtica del problema del cliente la validacin del mtodo permite demostrar que el mtodo is fit for purpose 2. Por la confianza con que el cliente necesita tomar decisiones en base a los resultados analticos aqu se debe validar la aptitud del mtodo y estimar la incertidumbre del resultado de un modo que sea ampliamente reconocido, internamente consistente y fcil de interpretar. (Mucha de la informacin requerida para evaluar la incertidumbre se puede obtener durante la validacin del mtodo) 3. La toma de muestras: si el laboratorio no puede tomar la muestra o no tiene influencia sobre ello, los resultados deben informarse sobre la base de las muestras como fueron recibidas y destacar este hecho en el informe

Cundo debera validarse un mtodo?

Cuando se necesita verificar que sus parmetros de aptitud son adecuados para usar para un problema analtico particular. Ejemplos:
Cuando se desarrolla un mtodo nuevo Cuando se revisa un mtodo ya establecido para mejorar o extender a un nuevo problema Cuando el control de calidad indica que el mtodo en uso est cambiando con el tiempo Cuando se usa un mtodo ya establecido en un laboratorio diferente o con diferente analista o con diferente instrumental Para demostrar la equivalencia entre 2 mtodos, por ej. Un mtodo nuevo y una norma

Quin realiza la validacin?

1. El laboratorio que usa un mtodo es responsable de asegurar que est adecuadamente validado. Si se usa un mtodo normalizado validado, el usuario solamente necesita establecer los datos de aptitud para el uso propio del mtodo Validacin mediante un estudio colaborativo. Es el modo preferido de realizar la validacin de un mtodo Cuando no es posible participar en interlaboratorios para validar el mtodo, surgen las siguientes preguntas:
1. 2. 3. pueden los laboratorios validar mtodos por su cuenta, y cmo? pueden estos mtodos validados ser reconocidos por otros laboratorios? Qu clase de reconocimiento se puede esperar para los mtodos caseros usados en un mbito regulatorio?

2. 3.

quin realiza la validacin? (cont.)

4. Ante un requisito regulatorio, un mtodo analtico casero debera demostrar: - las tolerancias de todas las mediciones realizadas (volumen, temp., masas, etc.) - las formas de la sustancia medida incluyendo su especiacin - el efecto de las interferencias y su cuantificacin - las fuentes significativas de error y los mtodos para controlarlas

Eleccin, desarrollo y evaluacin de mtodos

Problema que requiere de un anlisis qumico 1ro. Identificar el mtodo a usar o desarrollar uno nuevo 2do. Evaluar la aptitud del mtodo (fit for purpose) En esta etapa de evaluacin se encuentra la validacin fit for purpose se determina por cmo funciona el mtodo cuando es usado por un laboratorista determinado y con el equipamiento disponible

Eleccin, desarrollo y evaluacin de mtodos (cont.)

Requisitos analticos cualitativo o cuantitativo? Caractersticas de aptitud relacionadas Confirmacin de la identidad, selectividad/especificidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin Confirmacin de la identidad Recuperacin

El analito est disperso o localizado) El analito est presente en ms de una forma? Interesa si el analito es extractable, libre o total?

Cul es el analito de inters y en qu Confirmacin de la identidad, lmite de nivel ( %, ug, etc)? deteccin, lmite de cuantificacin, rango de trabajo Cun exacta y precisa debe ser la respuesta? /qu grado de incertidumbre se permite y cmo debe ser expresada? Recuperacin, exactitud, precisin de la repetibilidad, precisin de la reproducibilidad

Eleccin, desarrollo y evaluacin de mtodos (cont.)

Requisitos analticos Cul es la naturaleza qumica, biolgica y fsica de la matriz? Cules son las interferencias probables del analito? Se requiere muestreo y submuestreo (y esto se har en el laboratorio?) Los resultados necesitan ser comparados con los resultados de otros laboratorios? Los resultados necesitan ser comparados con especificaciones externas? Robustez Precisin de la reproducibilidad Exactitud Precisin de la reproducibilidad Selectividad/especificidad Caractersticas de aptitud relacionadas

Desarrollo del mtodo

Adaptar un mtodo existente y hacerlo adecuado para una nueva aplicacin Desarrollar un mtodo desde cero, aplicando el conocimiento y la experiencia, para lograr el mtodo adecuado

Los diferentes parmetros de desempeo de un mtodo y lo que muestran

Confirmacin de la identidad y selectividad/especificidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Intervalode trabajo y mbito lineal Exactitud Certeza Interpretacin de las mediciones del margen de error Repetibilidad Reproducibilidad Medicin de la incertidumbre Sensibilidad Robustez Recuperacin

Confirmacin de la identidad y selectividad/especificidad

Confirmar la identidad es establecer que la seal producida en la medicin, o que la propiedad medida que se atribuye al analito, solamente se debe al analito y no a la presencia de algo fsica o qumicamente similar. La efectividad del aislamiento o extraccin del analito y la selectividad/especificidad de la medicin determinan si otros componentes interfieren o no en la medicin del analito

Confirmacin de la identidad y selectividad/especificidad (cont.)

Selectividad y especificidad son medidas que calculan la fiabilidad de las mediciones en presencia de interferencias.
Selectividad (o especificidad) = aptitud de un mtodo para determinar exacta y especficamente el analito de inters en presencia de otros componentes en la matriz de la muestra bajo las condiciones establecidas del ensayo (NATA Tech) Especificidad = aptitud de un mtodo para medir solamente lo que se busca medir (AOAC-PVMC) Es la aptitud de un mtodo para valorar inequvocamente el analito en presencia de componentes que se sospecha que puedan estar presentes (impurezas, degradantes, matriz, etc.) (ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95) En general, se considera que especificidad = 100% selectividad

Confirmacin de la identidad y selectividad/especificidad (cont.)

Qu hacer? Cun tas veces? 1 Qu calcular/qu determinar? Usar los resultados de las tcnicas confirmatorias para calcular/evaluar la aptitud del mtodo para confirmar la identidad del analito y su aptitud par medir el analito aislado de las interferencias Examinar los efectos de las interferencias: si la presencia de la interferencia aumenta o inhibe la deteccin o cuantificacin de los mesurandos Comentarios Analizar las muestras y los materiales de referencia por el mtodo candidato y por otros mtodos independientes Decidir cunta debe ser la evidencia necesaria para obtener suficiente fiabilidad

Analizar muestras con cantidades agregadas de las interferencias esperadas en presencia de los analitos de inters

Si la deteccin o cuantificacin es inhibida por las interferencias, se necesitar desarrollar ms mtodos

Confirmacin de la identidad y selectividad/especificidad (cont.)

Algunos protocolos de validacin confunden confirmacin de la identidad con repetibilidad. Repetibilidad = una medicin por una tcnica varias veces Identidad del analito = una medicin por varias tcnicas, preferentemente independientes Otro aspecto a considerar es si el analito puede existir en la muestra en ms de una forma: diferentes estados de oxidacin, en forma inorgnica u organometlica, etc.

Lmite de deteccin
Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con cierto nivel de confianza especificado.
Para un resultado analtico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real del analito. La seal de fondo es producida por el blanco y exhibe ruido. El lmite de deteccin (LD) corresponde a una seal k veces la desviacin estndar del ruido de fondo. Tpicamente el valor de K es igual a 4 (LD=3F). Los valores por encima del LD pueden ser atribudos a la presencia del analito y los valores por debajo del LD son indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables. (OAA; DC-LE-05)

Para una validacin normalmente es suficiente proveer una indicacin del nivel al cual la deteccin se vuelve problemtica.

Lmite de deteccin (cont.)

Procedimientos de determinacin posibles 3 veces la dispersin, expresada como desviacin estndar, a partir de mediciones repetidas del blanco o de soluciones del analito en agua pura 2,5 a 5 veces la relacin seal/ruido del instrumento de medida a utilizar

Lmite de cuantificacin
Es la menor cantidad que puede ser determinada cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza. Para el anlisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que slo se emplean valores atribuibles al analito. El lmite de cuantificacin es entre 3 y 10 veces el lmite de deteccin segn cada caso (OAA, DCLE-05)

Lmite de cuantificacin (cont.)

Se emplea cuando se realizan determinaciones de analitos a nivel de trazas
Procedimientos de determinacin habituales De manera anloga al LD, en el cual el lmite de cuantificacin es como mnimo 3 veces el LD, segn cada caso Por determinacin de una incertidumbre mxima permisible de los resultados (dada como dispersin relativa del 30% por ej) por medio de la determinacin de la concentracin ms pequea que se puede medir con este valor mximo. Este lmite depende entonces de las exigencias de la incertidumbre

Intervalo de trabajo y mbito lineal

Linealidad de un mtodo: define su aptitud para obtener resultados proporcionales a la concentracin de analito. Rango lineal: rango de concentraciones de analito para las cuales el mtodo brinda resultados proporcionales a la concentracin Notar que refiere al rango de concentraciones en las soluciones que se estn midiendo ms que a las concentraciones de analito en las muestra original En el extremo inferior del rango de concentraciones, los factores limitantes son los valores del LD y/o del lmite de cuantificacin En el extremo superior del rango de concentraciones, las limitaciones aparecen por efectos varios que dependen de la respuesta del instrumento

Intervalo de trabajo y mbito lineal (cont.)

Procedimiento segn el OAA a. Se preparan 1 blanco y 6 concentraciones diferentes del analito a determinar o 6 muestras fortificadas a varias concentraciones. Preferentemente, las soluciones se deben preparar independientemente y no a partir de diluciones sucesivas del material de referencia b. Se representa la seal obtenida en funcin de la concentracin y se determina el mbito lineal y los extremos superior e inferior del intervalo de trabajo c. Se repiten los pasos a y b dentro del mbito lineal y se efecta un estudio estadstico de los resultados obtenidos d. Es preferible trabajar dentro del mbito lineal e. Para la curva de calibracin, conviene utilizar polinomios de ajuste de grado 2 como mximo

Intervalo de trabajo y mbito lineal (cont.)

Analizar 1. Blanco + materiales de referencia o muestras fortificadas en vs concentrac Repetic. 1 Qu calcular Graficar en el eje y la respuesta de medicin y en el eje x las concentraciones de los mesurandos Comentarios Idealmente, las diferentes concentraciones deberan ser preparadas independientemente, y no a partir de alcuotas de la solucin madre Esto dar una confirmacin visual de si el intervalo de trabajo es lineal o no

Se necesitan al menos 6 concentraciones + el blanco

Examinar visualmente para identificar el rango lineal y los extremos sup e inf del intervalo de trabajo

Intervalo de trabajo y mbito lineal (cont.)

Analizar 2. Repetir materiales de referencia o muestras fortificadas, en al menos 6 concentraciones diferentes, dentro del rango lineal Repetic. 3 Qu calcular Graficar en el eje y la respuesta de medicin y en el eje x las concentraciones de los mesurandos Examinar visualmente los outliers que pueden no ser reflejados en la regresin Comentarios Esta etapa es necesaria para ensayar un intervalo de trabajo, que se piensa que es lineal y en el que se intenta usar un solo punto de calibracin

Calcular el coef de regresin apropiado. Calcular y graficar los valores residuales

La distribucin aleatoria sobre la lnea recta confirma linealidad Tendencias sistemticas indican no-linealidad

Exactitud
Proximidad entre el resultado de una medicin y el valor verdadero del mesurando (OAA DCLE-05) La validacin de un mtodo busca cuantificar la exactitud probable de los resultados evaluando los efectos sistemticos y azarosos sobre los resultados As, la exactitud se estudia normalmente como certeza y precisin

Exactitud (cont.)
Certeza (de un mtodo) es una expresin de cun cerca est la media de un conjunto de resultados (producidos por el mtodo) del valor verdadero. Normalmente se expresa en trminos de sesgo Precisin es una medida de cun cerca estn los resultados unos de otros, y generalmente se expresa por medidas como la desviacin estndar, que describe la dispersin de los resultados

Exactitud y certeza
Procedimiento segn el OAA - Usar material de referencia certificado, preferentemente con una matriz semejante a la de la muestra - Solo en el caso de no existir un material adecuado se puede realizar un ensayo de recuperacin - Cuando sea posible, se realizan un mnimo de 10 repeticiones del ensayo 3 das consecutivos - Se compara el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia certificado (), teniendo en cuenta la incertidumbre asociada de ese material - El mdulo de la diferencia da como resultado el sesgo del mtodo s = |X - |

Precisin
Proximidad entre valores de una magnitud obtenidos por mediciones replicadas, en condiciones especficas (IRAM 34552-1) Las dos medidas de precisin ms comunes son repetibilidad y reproducibilidad, que representan los dos extremos de la presicin que se pueden obtener

Precisin (cont)
Repetibilidad = la ms pequea precisin esperada. Da una idea del tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el mtodo es desarrollado por un mismo analista en un mismo equipo a lo largo de un periodo de tiempo corto. Ej., la variabilidad esperada entre los resultados cuando la muestra es analizada por duplicado Reproducibilidad = la precisin ms grande esperada. Una muestra analizada por varios laboratorios. Formalmente, excluye la variacin respecto del tiempo.

Precisin (cont)
(Precisin intermedia = un anlisis realizado por laboratoristas diferentes en un mismo laboratorio durante un periodo de tiempo prolongado) Generalmente la precisin se establece en trminos de desviacin estndar o desviacin estndar relativa La repetibilidad y la reproducibilidad dependen de la concentracin de analito y en consecuencia, debieran determinarse para varias concentraciones

Analizar

Repeticion es (independi entes

Calcular

Comentarios

Estndares, materiales de referencia o muestras fortificadas, en varias concentraciones a lo largo del intervalo de trabajo a. Mismo analista, equipo, laboratorio. Corto periodo de tiempo b. Diferentes analistas y equipos, mismo laboratorio, mayor tiempo c. Diferentes analistas, equipos, laboratorios, mayor periodo de tiempo 10 Desv estndar para cada concentracin Desv estndar para cada concentracin Desv estndar para cada concentracin Se determina la desv estndar de la repetibilidad para c/concent Se determina la desv estndar de la reproducibilidad intralaboratorio para c/concent Se determina la desv estndar de la reproducibilidad interlaboratorio para c/concent. Requiere estudios colaborativos

10

10

Repetibilidad y Reproducibilidad
A partir de la desviacin estndar de la repetibilidad ( o sr) es til calcular el lmite de repetibilidad r, el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de repetibilidad. A partir de la desviacin estndar de la reproducibilidad ( o sr) es til calcular el lmite de reproducibilidad R, el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre anlisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de reproducibilidad.

Medicin de la incertidumbre
Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando (OAA. DC-LE-05) Generalmente es una desviacin estndar o un intervalo de confianza y su estimacin toma en cuenta todos los efectos reconocidos que operan sobre el resultado

Medicin de la incertidumbre (cont.)

Segn OAA, es un parmetro de identificacin central e inalienable para preparar una acreditacin segn ISO 17025. Incluye los errores sistemticos y aleatorios. Para su determinacin y especificacin existen varias posibilidades: Indicacin acerca de la repetibilidad Resultados de las cartas de control Resultado de intercomparaciones Evaluacin por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto, autorizados

Sensibilidad
Cambio en la respuesta de un instrumento de medicin dividido por el cambio en el estmulo correspondiente (ejemplo de estmulo: cantidad de mesurando presente) (IUPAC) Es el cambio de la respuesta del instrumental que se corresponde con el cambio de la concentracin del analito. Dentro del rango lineal de un mtodo, si se intercepta la curva de respuesta, la sensibilidad es un parmetro til para calcular y usar en la frmula de cuantificacin. A veces se usa la sensibilidad para referirse al lmite de deteccin del equipo, pero esto no se aprueba generalmente.

Robustez
Medida de la capacidad de un procedimiento analtico para no ser afectado por variaciones pequeas pero deliberadas en los parmetros del mtodo y que provee una indicacin de su fiabilidad durante su uso habitual (ICH Q2A) Ensayo de robustez: interlaboratorio para estudiar el comportamiento de un procedimiento analtico cuando se hacen pequeos cambios en las condiciones ambientales y/o de operacin. Involucra variaciones deliberadas en el mtodo. Permite identificar aquellas variables que provocarn cambios significativos y que deberan ser controladas ms estrictamente Los ensayos de robustez generalmente se aplican para investigar los efectos sobre la precisin y la exactitud.

Recuperacin
Fraccin de analito que se agrega a una muestra de ensayo (fortificada o spiked) antes del anlisis. Objetivo: evaluar la eficiencia del mtodo para detectar todo el analito presente en una muestra

Uso de mtodos validados

En teora
Los mtodos normalizados son producidos mediante algn tipo de estudio en colaboracin, comparativo, y los organismos de normalizacin que los llevan a cabo, tienen frecuentemente expertos estadsticos que aseguran que esos estudios de validacin estn correctamente diseados, realizados y evaluados. Sin embargo es peligroso asumir que slo porque un mtodo est normalizado uno tiene la garanta de que esa validacin ser adecuada.

Reglas aconsejadas para cuando se usan mtodo validados

1. El analista debe familiarizarse completamente con el mtodo antes de usarlo por primera vez:
1. 2. 3. Lograr la repetibilidad, lmite de deteccin, etc. Conocer la teora del mtodo, identificar los puntos sensibles Estabilidad de los reactivos, soluciones, etc.

2. 3.

Evaluar cuntas muestras es conveniente procesar al mismo tiempo. Es mejor analizar bien pocas muestras que tratar de analizar muchas y tener que repetir casi todas Asegurarse de que todas las cosas (reactivos, equipamiento, etc.)para el mtodo estn disponibles antes de comenzar el trabajo Cuando se adapta o cambia un mtodo validado por otro, se necesita revalidar ese mtodo

Uso de los datos de validacin para control de calidad

 Aseguramiento de la calidad: se relaciona con todas las medidas que toma un laboratorio para asegurar y controlar su calidad Control de calidad: describe las medidas individuales relacionadas con el monitoreo y control de operaciones analticas particulares

La validacin de un mtodo brinda una idea de las capacidades y limitaciones de la performance de ese mtodo que se pueden experimentar durante el uso rutinario Durante la validacin el mtodo se aplica a muestras de contenido conocido Una vez que el mtodo tiene un uso rutinario, se aplica para muestras de contenido desconocido En la prctica, se recomienda continuar midiendo esas muestras de composicin conocida con cada batch de muestras como parte del proceso de control de la calidad. El control de calidad puede realizarse dentro del laboratorio o de manera externa (interlaboratorios)

Control de calidad interno

Incluye el uso de blancos, patrones de calibracin, muestras fortificadas, blind samples, rplicas de ensayos, muestras QC y cartas de control La clase de QC adoptado debe demostrar suficiencia para demostrar la validez de los resultados. Ej: muestras QC, analizadas a intervalos regulares, uso de varios tipos de blancos, rplicas para chequear la repetibilidad, etc Muestras QC: muestras que a lo largo de un periodo de tiempo dado son suficientemente estables y homogneas para brindar el mismo resultado y que estn disponibles en cantidad suficiente para usarse en anlisis repetitivos.

Control de calidad externo

Ensayos de proeficiencia
Mtodo reconocido para que un laboratorio monitoree su performance contra sus propios exigencias y la generalidad de los requisitos de otros laboratorios Ayudan a resaltar la reproducibilidad entre laboratorios y los errores sistemticos, por ej. Sesgo

Fin de esta presentacin

La bibliografa que complementa este resumen estar disponible en la pgina web de la AACS Muchas gracias a todos!! Ing. Ariel Soso, Bioq. Alejandro Rimini, Ing. Liliana Marbn y Lic. Viviana Fiorani