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PRÁCTICA Nº 05
Determinación de bacterias, Coliformes
Totales y Fecales, Método de recuento
por dilución en tubo: NMP
ASIGNATURA :
DOCENTE :
ALUMNO :
CICLO :
2007 - II
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PRÁCTICA Nº 05
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS,
COLIFORMES TOTALES Y FECALES. MÉTODO
DE RECUENTO POR DILUCIÓN EN TUBO: NMP.
I. Introducción:
II. Objetivos:
III. Materiales:
- Muestra: Leche
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- Medios de cultivo: Caldo Brilla - Mechero Bunsen
- (presuntivo),
Caldo EC agar MacConkey, - Baño María
- agar Endo,
Tubos de dilución
EMB, CB. - Estufa
- Pipetas - Gradillas
- Bombilla de aspiración - Anzas microbiológicas
- Placas de Petri calibradas
IV. Procedimiento:
Diluciones
Método
3 mL de muestra para
+ alimentos
27 mL agua pept. 9 mL AP 9 mL AP Líquidos
Caldo Brila
Muestra de
agua total
Aquí no se 1 mL
realizan 10 mL
diluciones
1 mL
10-1
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- Luego, incubar a 35 ºC ± 1 por 24 h.
- Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). Ésta se observa en las
campanas.
- Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h más.
Tubo
Positivo
Caldo MK
10 mL 10 mL
- Sólo se tomará esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo
Peptonado) resultan positivos.
- Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para hacer la
prueba de Indol.
- Para ver coliformes termorresistentes, de los tubos que hayan salido positivos se
siembra una asada en agar MacConkey y se aíslan las colonias características.
- De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con campana
de Durham.
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V. Resultados:
DILUCIONES
-1 -1
10 A 10 B 10-2 A 10-2 B 10-3 A 10-3 B
+ + + + + +
2 2 2
DILUCIONES
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10-1 10-2 10-3
A B A B A B
L (+) L (+) L (+) L (+) L (+) L (+)
- Por lo tanto, se puede decir que el resultado del número más probable es: 2–2–2.
- Para este resultado las tabla de NMP con un límite de confianza de 95% para la
prueba de fermentación utilizando 3 diluciones con dos repeticiones (2 tubos),
nos da un valor de >1100 bacterias/mL de leche.
VI. Conclusiones:
- Los valores mínimos permisibles usados en México, por ejemplo, nos dan los
sgtes. valores de referencia para diversos alimentos:
LIMITE MÁXIMO
NOMBRE DEL PRODUCTO DETERMINACIONES
PERMISIBLE
Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Ensaladas verdes, crudas o de frutas *
Coliformes totales NMP/g 100
Mesofilos aerobios UFC/g 5,000
Salsas y purés cocidos *
Coliformes totales NMP/g 50
Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
Alimentos cocinados a base de carne
de mamíferos, aves, pescados *
Coliformes totales NMP/g menos de 10
Mesofilos aerobios UFC/g 150,000
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Coliformes fecales NMP/g 100
Mohos y levaduras
500
(UFC/g)
Staphylococcus aureus
1000
(UFC/g)
Listeria monocytogenes en
Negativo
25 g
Mesofilos aerobios UFC/g 100,000
Zumos, néctares, bebidas a base de
frutas y verduras no pasteurizadas ***
Coliformes totales NMP/g 100
- La muestra traída por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo
de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que “La Norma Venezolana para
Lácteos” da como valores límites los sgtes. valores:
- Vemos que el límite dado para Coliformes Totales en leche cruda está dada en
UFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra de leche, traída de un puesto
lechero del sector Santa Rosa – Chiclayo con las muestras dadas en el cuadro, la
podemos calificar como una leche DE TERCERA.
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- Pasado el tiempo se leyó los resultados.
- De los tubos positivos se pasó a placas con agar MacConkey, estas se incubaron
por 24 h a 37 ºC (se debió pasar a dos tubos uno con caldo peptona y otro con
caldo Brilla).
- Pasado el tiempo, se leen las placas y se realizan las pruebas bioquímicas para
las colonias lactosa positivas (L+).
RESULTADOS:
- Como todos los tubos del caldo Brilla salieron positivos, se sembraron en tubos
con caldo EC (seis tubos).
- Después de la incubación de los tubos con caldo EC se obtuvieron los sgtes.
resultados:
DILUCIONES EN CALDO EC
10-1 A 10-1 B 10-2 A 10-2 B 10-3 A 10-3 B
+ + + + - -
2 2 0
- De las colonias lactosa positivas se escogió una y se le realizó las sgtes. pruebas
bioquímicas: IMViC + descarboxilación de la lisina (LIA) + prueba de
fermentación de carbohidratos (TSI).
- Se obtuvieron los sgtes. resultados:
PRUEBA RESULTADO
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Indol Negativo
Rojo de metilo Positivo
Voges Proskawer Negativo
Citrato Positivo
LIA K/K (LIA +)
TSI A/A, ++++, -
Algunas sp. del género Klebsiella junto con otras de los géneros Citrobacter y
Enterobarter se cree que son las causantes de enfermedades gastrointestinales agudas y
crónicas. Estos microorganismos pueden ser recolectados de ambientes naturales tales
como los bosques, el agua fresca así como también de los productos provenientes de la
agricultura (vegetales) donde residen normalmente como microflora.
También pueden ser recolectados de las heces de individuos saludables que no
presentan síntomas de la enfermedad. También pueden ser recolectadas a partir de los
productos lácteos, los mariscos crudos y los vegetales frescos y crudos. Estos
organismos al contaminar las aguas pueden estar presentes en el suelo usado para la
producción de cultivos y en las aguas de pesca de mariscos; como resultado éstos
pueden constituir un peligro para la salud.
VII. Preguntas:
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o Para el conteo de coliformes totales se tienen tres métodos
principalmente.
o El primero se basa en la técnica del número más probable (NMP),
utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmación de
los tubos positivos de formación de gas en caldo Lactosa Bilis Verde
Brillante. La incubación es a 35 ºC.
o El segundo método emplea únicamente el caldo McConkey. La
incubación es a 37 ºC.
o El tercer método usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 – 37 ºC,
seguido de confirmación en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo.
VIII. Referencias:
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http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_m
icrolimentos.htm
- MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes
totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de
2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf
- THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los
Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.
- VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visión de la Industria Láctea.
Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf
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