抗体工程原理和人源化抗体的

制备及抗体工程的发展前景
中科院 上海生命 科学院
生化细 胞所分子 免疫室
孙 兵
电话： 54921376
E-mail:bsun@sibs.ac.cn
 第一节：抗体的基本概念
• 1 。由 B 淋巴细 胞产生， 能识别特异 性抗原
表位（ epitope) 的免疫球蛋白
（ Immunoglobulin:Ig) 。
– 每一种 B 细胞 克隆只 产生 一种抗 体。
– 抗原表 位是指 在抗 原结构 中决 定与抗 体特 异性
结合的 几个关 键性 氨基酸 序列 ，可分 为线 性表
位和构 型表位 。
– 不同的 免疫刺 激， 可诱导 产生 不同的 免疫 球蛋
白，而 发挥不 同的 免疫功 能。
A:sequential epitope
B:conformational epitope

B
 2. 免疫球蛋白的结构和分类
• 1 ） Two heavy chains and two light
chains.
• 木瓜蛋白酶 (Papain) 作用，产生 2 Fab
(fragment, Ag binding) and 1 Fc fragment
(Fragment, crystallizable)
• 胃蛋白酶 (Pepsin) 1F(ab’)2 and Fc 碎片
• 2- 巯基乙醇（ Mercaptoethanol) 二条重轻链。
2 ）有五种； IgM, IgG, IgA, IgD 和 IgE 。
Antibody Molecule
Antibody Specificity
抗原与 抗体的 结合 主要依 靠静 电引力 、氢 键、范 德
华力等 ，需要 合适 的温度 、 pH 、离 子强 度以及 完
整的抗 体，这 种结 合是可 逆的 。
 3 。抗 体的生 物学 活性

1 ）特异性结合抗原
与 Ag 的结合具有高度特异性，必需
是超变区与抗原的空间构像完全吻合。
与抗原结合后，可介导体内的多种
生理和病理效应（中和病毒、毒素，介导
炎症反应），体外可产生凝集、沉淀现象
用于检测等。
2 ）激活补体
当 IgG1~3 和 IgM 类抗体与抗原特异性结合后，
其构型发生改变，暴露 IgG 的 CH2 和 IgM 的 CH3 功
能域的补体结合位点，通过补体经典途径激活补体。
3 ）结合 Fc 受体
主要通过 IgG/IgE 的 CH3/CH4 功能域与位于不
同细胞上的 FcγR/FcεR 结合，介导不同的生物学效应
：
1) 与单核巨噬细胞和中性粒细胞上的 FcγR 结合介导调理吞噬
作用；
2) 与肥大和嗜碱性粒细胞上的 FcεR 结合介导 I 型超敏反应；
3) 靶细胞上的抗原决定簇结合 IgG 的 Fab 段，而抗体的 Fc 段
与 NK 细胞上的 FcγR 结合，发挥抗体依赖性细胞介导的细胞
毒作用（ Ab dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC ）。
4 ）穿过 胎盘
IgG 所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要原因
，主要借助胎盘滋养层细胞表面的 FcγR 进行的。
5 ）免疫 调节
高浓度的抗体通过封闭抗原、低浓度 IgG 抗体
与相应的抗原结合，以及高浓度抗独特型抗体都能对
免疫应答产生负调节作用。也可通过独特型与抗独特
型网络参与机体的正、负免疫调节作用。
Antibody-dependent cell-
Mediated cytotoxicity:ADCC
4 。抗 体的基因及 其表 达调控
B 细胞中 有 H 、 和 链 3 个编码
Ig 基因的 连锁群，每 个基因库中又 有许多
彼此连锁的 (V 、 C ）基因，以 及若干连
接（ J ）基因和多 样性（ D ）基因 ，这些
基因经过重排后 进行表达， 不同的基因 重
排和表达，决定 了 Ab 的多样性和能针 对
多种进行反应的 特异性。
小鼠 轻链基因 库的 组
成

小鼠 轻链基因 库的 组
成

小鼠重链 基因 库的组 成
轻链 基因 的重排 、 RNA 处理和 蛋白 质表达 的过 程
重链基因 的重排 、 RNA 处理和 蛋白 质表达 的过 程
Defects in cell interaction and signaling can lead to severe
immunodeficiency.The recombination –activating genes (RAG-1/2)
required for synthesis of the functional Ig and TCR that characterize
mature B and T cells. Such as SCID.
A child with
DiGeorge syndrome
Showing the displasia
Ears and mouth and
Abnormally long
Distance between
The eyes.
The complete absence
Of a thymus. Depression
Of T-cell numbers and
Absence of T-cell
Response.
Nude mice lack cell –mediated immune responses, and they are
Unable to make antibodies to most antigens.

SCID(severe combined immunodeficiency disease):

No B-cells and T-cells. NK cells are normal.
 多克隆抗 体

Polyclonal antibody, PcAb

用抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血
清），是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原表
位，分别诱导多个不同 B 细胞克隆发生应答后产
生的多种抗体，因此叫多克隆抗体。
 单克隆抗 体
Monoclonal antibody, McAb
通常是指由一株 B 淋巴细胞杂交瘤增生而成的单
一细胞克隆所产生的一种高度均一、高度专一性的
抗体。
原理：小鼠免疫脾细胞可以产生抗体但不能在体
外无限增殖和传代，小鼠骨髓瘤细胞能产生不具抗
体功能的 Ig 且可在体外无限增殖和传代，借助化学
手段将两种细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，继承
了两种细胞的特性，既能产生抗体、又能无限增殖
；进一步将杂交瘤细胞稀释分离成单个细胞后再使
其培养增殖，即刻得到能针对一种抗原决定簇的单
克隆杂交瘤细胞；最后将此细胞接种到小鼠的腹腔
中，就可从培养上清液或腹水中大量得到单克隆抗
体。
次黄嘌呤鸟嘌呤核苷
酸转移酶 HGPHT

HAT medium
 单克 隆和多 克隆 抗体的 比较和
用途
1 、用于免疫学检测，辅助
pAb mAb 临床诊断
特异性 低 高
2 、 mAb 用于亲和层析，分
敏感性 好 弱
离微量可溶性抗原
均一性 无 有
3 、标记的 mAb 用于基础研
究，了解细胞分化等

4 、制备生物导弹用于肿瘤
、移植等的临床治疗
 第二节： 基因 工程抗 体
(antibody engineering)
目的：
保留抗体的抗原结合能力、易于大规模生
产、减小鼠源性成份，增加人源化，可用于临
床。
基本原理：
借助基因工程手段，将编码 Ab 的重轻链可
变区基因重组到真核或原核表达载体上并进行
表达。
 市
场需求
国外市场情况：
诊疗 单克隆抗体， 90 年代后期上市以来，经
过多年的开发，终于在某些疾病的治疗上取得
突破。据统计， 200 2 年，全球各大公司有
70 多种单克隆抗体进入临床研究，其中有 16
个已进 入市场 ， 2002 年销售 额达 29 亿美元
，预计 200 5 年将 达近 90 亿美 元。
　　 根据商业通讯公司（ BCC Inc . ）预测，
2002 年全球治疗与诊断用抗体市场为 73 亿
美元，预计将以每年 16.6% 的平均速度增长
，到 2007 年可达到 157 亿美元。 200 1 年诊
断用抗体市场为 4.41 亿美元。
有近 300 种抗体在进 行临床实验 。
 The mAb market is big and
growing
- by 2010, mAb is expected to sale $20 B
Total Therapeutic Antibody Sales ($m)
1995-2004

7,000
6,000
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
基因工程抗体的优点和缺点
• 优点：
– 1 。不受动物品系（ species) 和抗体类型
（ isotype) 的限制。
– 2 。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少
潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。
– 3 。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和
免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。
• 缺点：
– 抗体的亲和力减弱，与完整抗体结
构相比，功能明显降低。
 The development of
therapeutic antibodies:

Figure 1 | The modular structure of immunoglobulin

The development of
therapeutic antibodies:

Figure 2 | Antibody engineering

 制备人源化抗体的三种方法
• 1 。嵌合抗体。
• 2 。完全人源抗体。
• 3 。噬菌体抗体库技术。
Light and Heavy Chains Have Variable
Regions and Constant Regions
 1 。人 鼠嵌合 抗体
（ Chimeric Antibodies ）
• 利用基因重组技术，把人抗体和鼠抗体
的部分结构进行重组，减少鼠源结构，
增加人源结构，而保持抗体与抗原的特
异性结合。
– 1 。所有的骨髓瘤都是鼠源的。
– 2 。鼠抗体亦能作为一种抗原，多次反复使
用在人体产生抗体及过敏反应（ HAMS 反
应， human against mouse syndrome) 。
– 3. 嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原
降低，但亲和力明显下降。
Gene Libraries Encodings Fab Fragments
Chimeric Mouse-human Antibody
生物反应
器
2 。利用转 基因 小鼠制 备完
全人源抗 体。
• 1 。首先把小鼠编码 Ig 重轻链的基因剔
除。
• 2 。制备表达人的 Ig 重轻链的转基因小
鼠。
• 3 。上二种小鼠回交，获得只表达人 Ig
重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后
，小鼠可产生完全人源抗体。
• 4 。小鼠造价高，保种困难。尚无法商业
化。
 3 。噬菌体抗体库技术
Phage antibody library technique.
• 把人的 Ig 重轻链可变区基因片段展示在
噬菌体表面 , 组成抗体库。
• 通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶
联，易进行分子克隆和基因操作。
• 抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正
常人）。
• 高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和
力低。
 • Display of antibody fragments on
bacteriophage
- the favored format of antibody fragment is single-chain
FV (scFV)

antigen VH Fab
binding (50 kD)
site CH1
VL
CL
CH2
whole Ab
(150 kD) CH3
FV (25 kD) scFV (27 kD)

Schematic representation of different antibody formats

• Construction of antibody libraries
- DNA sequences encoding VH and VL domains are amplified
by PCR
- VH and VL domains are paired randomly, increasing
functional diversity in the library
- The scFV sequences are amplified by PCR using primers
incorporating restriction sites
- cloning into the phagemid vector

Display of Fab frag-

ments on filamentou
phage
- transformed into E. coli by electroporation
- after rescue with helper phage, the random combinatorial
library of antibodies is displayed on phage

Antibody display library

• Library size and diversity
- Specificity and affinity are desirable qualities in any antibody
- The larger the library, the greater the likelihood that it will contain an
antibody of very high affinity having the desired specificity
The potential diversity of antibody can be estimated as follows
(1) Diversity due to combinatorial integration: 300VK x 4JK = 1.2x103
and 200VHx15Dx4J=12x103
(2) Diversity due to junctional alternatives (alternative readings at
junction due to differences in reading frame, and lengths of J and D
segments): VK to JK~ 3 and VH to D to J~40
(3) Diversity due to N segment for heavy chain > 10
(4) Hence combined diversity for each chain: light chains=3x103 and
heavy chains > 5x106
(5) Conclusion: diversity due to combinatorial association of heavy and
light chains > 1010. Additional factor due to somatic mutation >1030
(Winter & Milstein 1991)
• Selection of specific antibodies from a phage library

Next panning
cycle
Antibody library
on phage

Antigen Amplification
column

Elute Selection of a binding specificity

Wash
from a phage display library
Naïve or
immunized
• High-throughput selections
- small volumes of liquid (100 μl) are required
- multiwell microtiter plates
- a different antigen may be coated onto each well

• Phage antibodies as reagents

- Phage antibodies have routinely been successful in
ELISA on protein or peptide antigens
ELISA on whole cells or subcellular fractions
flow cytometry
immunocytochemistry
 工程抗体的未来展望
• 1 。准确高通量，人源化和高亲和力抗体
。
• 2 。多种方法的集成，取长补短，优势组
合。
• 3 。研究目的明确，选定方法。
The development of
therapeutic antibodies:

Figure 3 | In vitro and in vivo human antibody

techniques exemplified by phage display and
transgenic mouse technologies
 Different formats of therapeutic
antibodies:

antibodies with Fc

Figure 4 | Natural immunoglobulin effector functions.

 Different formats of therapeutic
antibodies:

antibodies without Fc

Figure 5 | Different formats of antibody fragment.

return
Thank You!