基因治疗

从设想到实践
梁 旻
上海三 维生物技术 有限公司
 目 录

•基因治疗的概念

•基因治疗相关发展历程

•基因治疗的优点和应用领域

•基因治疗的技术路径

•基因治疗的载体技术

•基因治疗的临床应用

•基因治疗药物的产业化

•基因治疗与伦理学

•基因治疗的前景
 基因治 疗的 概念

• “Any procedure intended to treat or

alleviate disease by genetically modifying the
cells of a patient”
•基因治 疗是指 通过 改变人 体内 基因表 达
以达 到治疗 疾病 目的的 治疗 方法。

定义 越来越 宽泛
基因治 疗的 分类

体内 体外 / 体
内

•体细胞 基因治 疗
•生殖细 胞基因 治疗
 基因治疗基本原理

AAV
Nucleus

Adenovirus

Therapeutic
Retrovirus/Lentivirus Protein

Target
Naked DNA
Cell
 基因治 疗基本原 理

AAV
Nucleus

Adenovirus

Retrovirus/Lentivirus

Target Therapeutic
Naked DNA
Cell Protein
 分子生物 学发 展的历 程

• 1943 Avery 证实遗传 物质 是 DNA 。

• 1953 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋 结构。

• 1958 Crick 提出遗 传信息 流的 中心法 则。

• 1960 信使 RNA （ mRNA ）被 发现。

• 1961-66 M. Nirenberg 等破 译遗传 密码 。

• 1965 细菌质粒 中发 现耐药 基因 。

• 1968-71 W. Arbor, D. Nathans and H.O. Smith 发现利用 限制 性核酸 酶

切割 、 拼 接 DNA 片断 ，“ 上帝的 礼物 ”。
• 1972 Berg 在体 外切割 、连 接不同 物种 DNA ，产生 新的 DNA 。

• 1975 首次讨 论重 组 DNA 安全 性的 会议在 美国 加州 Asilomar 召开。

 分子生物 学发 展的历 程

• 1976 美国 NIH 颁布重组 DNA 研究指 导原 则。 第一家 基因 工程公

司 Genentech 在美 国加州 成立 。
• 1977 年 Sanger, 双脱氧 法 DNA 测序 。
• 1982 美国 FDA 批准 第一 个基 因工程 产品 人胰岛 素上市 。
• 1989 HGP-- 人类 基因 组计划 启动 。
• 1997 苏格 兰科 学家 获得第 一个 克隆绵 羊（ Dolly ）。
• 2000 人类 基因 组工 作草图 完成 。
• 2003 美、 英、 法、 德、中 、日 6 国科学家 完成 人类 基因组 序列

图的绘 制。
 世界著名生物技术公司

公司成立于 1976 年，位于

美国加州旧金山，由风险投
资家 Swanson 和生物化学家
Boyer 创建。是最早的生物
技术公司。 1982 年，开发
成功重组人胰岛素，并转让
给 Eli Lilly 公司。

公司产品线丰富，共
有九种产品上市，代
表产品 Activase(TPA),
Herceptin( 抗 Her-2 单
抗）。
 世界著名生物技术公司

公司成立于 1998 年，由 PE 公司投资

建立。是一家以研究基因组为主的技
术型公司，因参与人类基因组计划而
名声大噪，现定位于基因组及医药和
农业应用研究开发公司。
 基因 治疗 发展的 历程

•1967 年基因治疗首次提出， Nirenberg 声称用合成的遗传信使可改变

细胞生长发育，并由此带来益处和危险。

•1980 年，人类第一次尝试基因治疗，美国加州大学洛衫矶分校
（ UCLA ）的 Martin Cline 教授将重组 DNA 导入二个患血液遗传病
的病人（意大利和以色列）。当年 10 月份， Los Angeles Time 详细报
道了 Cline 的研究后， UCLC 勒令他辞去系主任、削减了他的研究经
费并三年内不得再申请。

• 1982 在美国展开了对基因治疗的伦理问题讨论。

• 1989 年 5 月 22 日 Rosenberg 首次将外源基因 - 新霉素抗性基因用逆

转录病毒导入肿瘤浸润淋巴细胞中。
 基因 治疗 发展的 历程

•1990 年 9 月 4 日 French Anderson 第一次成功的进行基因治

疗，两例由于腺苷脱氨酶缺失导致的免疫缺陷的女孩
经 逆转录病毒载体将该酶基因导入
骨髓而获救，并且存活至今。

•1999 年 9 月 17 日， 18 岁 Jesse Gelsinger 因 OTC （鸟氨酸甲酰氨基转

移酶）基因治疗临床试验的某些失误而死亡，他是 5000 多例临床试验
者中因基因治疗副反应发生死亡的唯一一例。 FDA 和 NIH 对此事件的
调查认为宾夕法尼亚大学的基因治疗临床试验存在违规行为。

• 2002.10 法国巴黎 Necker Enfants Malade 医院用逆转录病毒载体携带

的 IL2RG 基因治疗 SCID ， 2 个患儿发生白血病。这是由于携带
IL2RG 基因的逆转录病毒整合进了宿主基因组上人 T 细胞原癌基因
LMO2 的启动子附近，逆转录病毒的增强子活性导致了 LMO2 基因的
异常转录和表达。
基因 治疗 发展的 历程

Ashanti de Silva. Ashanti was

the first patient to be treated W French Anderson
with gene therapy. She
received infusions of T cells Father of Gene Therapy
that had been transduced with
a gene for ADA (an enzyme
that she lacks), resulting in an
amelioration of the symptoms
of her severe combined
immunodeficiency.
 基因 治疗的 优点

• 基因 水平的 治疗
• 长效 、经济
• 克服 目前无 法解 决的疾
病
 基因治 疗的应 用领 域

• 遗传性 单基因 缺
陷病
• 恶性肿 瘤
• 传染性 疾病， 艾
滋病
• 其它疾 病，糖 尿
病、 心脏 病
基因 治疗的 技术 路径：

策略很多，大致分六种：

1 ．基因置换（ gene replacement ）：用正常的基因原位替换致病基因，使

细胞内 DNA 完全恢复正常。这是最理想的基因治疗方法，但目前的技术
水平尚难达到。

2 ．基因修复（ gene correction ）：纠正致病基因的异常部分，正常部分

保留，最终使致病基因完全恢复，这种基因治疗方式操作上要求高，实践
上有一定难度。

3 ．基因修饰（ gene augmentation ）：又称为基因增补，将目的基因导入

病变细胞或其它细胞，其表达产物能加强或纠正缺陷细胞的功能。这种治
疗方法中，缺陷基因仍然存在。目前的基因治疗多采用这种方式。

　　
基因治 疗的 技术路 径：

4 ．基因失活（ gene inactivation ）：利用反义技术特异地封闭基因表达的

特性，抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。如利用反义 RNA 、
核酶或核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细
胞的分化。用此技术还可以封闭肿瘤细胞耐药基因的表达，增加化疗效果。

5 ．免疫调节（ immune adjustment ）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导

入患者体内，改变免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介
素 -2 （ IL-2 ）导入肿瘤病人体内，提高 IL-2 的水平，激活体内免疫系统
的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤的目的。

6 ．其 它：为增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性，通过给予前体药物以
减少化疗药物对正常细胞的损害。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷
激酶（ HSV-tK ）基因，然后给予无毒性的单磷酸 GCV 药物，由于只有
含 HSV-tK 基因的细胞才能将单磷酸 CGV 转化成有毒的三磷酸 CGV 药物
（可终止可分裂细胞内 DNA 链的合成），因而肿瘤细胞被杀死，而对正
常细胞无影响。
基因治 疗的载体技 术：
•病毒性载体
•非病毒性载 体
病毒 性载体

•逆转录 病毒载 体
•腺病毒 载体
•腺相关 病毒载 体
•单纯疱 疹病毒 载体
•痘病毒 载体
•慢病毒 载体
 基因治疗载体

病毒 载体 非病 毒载体
• Retroviral vector • Naked DNA
• Adenoviral vector • DNA-liposome
• Adeno-associated viral vector • DNA-polyplex
• Herpes simplex viral vector • DNA-peptide
• Pox viral vector

Packaging in cell Cell-free packaging

各种 载体临 床应 用统计
 病毒载体 的顺 式作用 元件 和经典 包装方 式
顺式作 用元件 经典包 装方式
载体
反转录病毒载体 •两个长末端重复序列（ LTR ） 载体质粒转染整合了所有必需
：含有整合和调节转录的必需 基因（ gag,pol,env ）的包装
序列；含有转录增强子和启动 细胞系如 PA317 ，经选择培养
子； 获得产病毒细胞系（ VPC ）；
•tRNA 引物结合位点 p ； 细胞不裂解，病毒不断分泌至
3 ）包装信号序列 ψ 。 培养上清中。
腺病毒载体 两个末端倒转重复序列 载体质粒与辅助质粒共转染
（ ITR ）； 293 细胞获得重组腺病毒。重
包装信号序列。 组腺病毒感染 293 细胞而扩增
；细胞每次被感染后发生裂解
腺病毒伴随病毒载体 两个末端倒转重复序列 。
AAV 载体质粒和辅助质粒共转
（ ITR ）；其中包括了病毒复 染 293 细胞，并加辅助病毒
制起点、包装信号及整合和拯 （腺病毒或单纯疱疹病毒）感
救所必需的顺式元件。 染。
单纯疱疹病毒载体 HSV 病毒复制起点 ori ； 重组病毒在宿主细胞上传代；
病毒包装信号 pac 。 扩增子病毒在辅助病毒存在下
传代。
腺病 毒载体 ：
特点 ：
•可感染 分裂和 非分 裂细胞
•不整合 到染色 体中
•外源基 因表达 水平 高
•表达时 间较短
•免疫原 性强

适用范围 ：
In vivo 基因治 疗
肿瘤基因 治疗
疫苗
 腺病毒载体
36 kb Double Stranded DNA Genome
Entry through CAR receptor and integrin co-receptor
 Structure of Adenovirus

Fibre
Penton

Core Hexon The genome of Adenovirus is a linear

double strain DNA, the molecular
DNA weight of Ad5’s genome is
23~24MD, contains ~36kb.

Human Adenovirus have 50 serotypes, belong to 6 subgroup,

Adenovirus type 5 belong to subgroup C.
 IL-6
IL-1
TNF

腺病毒 载体进入 细胞
 L1 L2 L3 L4 L5
E1A E1B E3

Therapeutic
transgene 36 Kbp DNA Ad Genome

E2B E2A E4

Early Generation Adenoviral Vector

replication defective
 L1 L2 L3 L4 L5
E1A E1B E3

Therapeutic
ITR ψ Stuffer DNA
Transgene
Stuffer DNA ITR

E2B E2A E4

Latest Generation Adenoviral Vector

“Gutless”; Helper-dependent; Minimal Ad

 Gelsinger 事件

•1999 年 9 月 17 日

•OTC （鸟氨酸 甲酰氨基转 移酶 ） 腺病 毒基 因治疗

•E1/E4- 删除的 腺病毒 载体

•6 x 1011 vps/kg via hepatic artery

•Systemic Immunologic Activation

•Multiple Organ Failure - Death

 Gelsinger 事件
18 岁的 Jesse Gelsinger 是世 界上首 位由 基因 治疗导 致丧 生的患 者。他
患先天 性鸟 氨酸甲 酰氨 基转移 酶（ OTC ）缺乏症 （ X 连锁 性遗 传病
）病症 ，在 男性较 严重 ，往往 引起 新生男 婴患者 死亡 。

美国 FDA 和美国 国立 卫生研 究院 （ NIH ）对此事 件进 行调 查的结 果

认为：

1 ）考虑到 男性 患者 的症状 较重 ，首批 18 例试验 者原应 只包 括女性

，但研 究人 员却把 Gelsinger 列为 第 18 例临床试 验者 ；

2 ） Gelsinger 参加临床 试验 前， 其血氨 值已 偏高，本 不应 列为 试验

对象， 但宾 夕法尼 亚大 学仍对 其实 施基因 治疗；

3 ）对 Gelsinger 采用了 门静脉 注射 最大剂 量的 重组 病毒（ 1X1014VP/ 公

斤体重 ）。临 床尸 检和实 验室 检查结 果表 明，门 静脉大 剂量 注射重 组病

毒激发 了机 体致命 的免 疫反应 ，导 致病人 多器官 衰竭 而死亡 。

4 ）结论： 临床 试验 存在违 规行 为，而 与进行 的基 因治疗 的制 品本身

无直接 关系 。
 逆转录 病毒载 体

逆转录病毒（ retrovirus ）属于正链 RNA 病毒，可

高效地感染许多类型的宿主细胞，并稳定地整合到
宿主细胞基因组中。它是最先被改造且应用最为广
泛（ >50% ）的基因治疗载体。反转录病毒基因组
大约 10kb ，含有三个最重要的基因： gag （编码核
心蛋白）、 pol （编码反转录酶）和 env （编码病
毒外膜蛋白）。基因排列顺序是 5’—gag—pol—env
—3’ 。两端存在长末端重复区（ LTRS ）用于介导
病毒的整合。 env 基因中含有病毒包装所必需的序
列。
逆转录 病毒 载体：
特点：
可感染分 裂细胞 ；
整合到染 色体中 ；
表达时间 较长；
有致癌的 危险；

适用范围 ：
Ex vivo 基因治 疗；
肿瘤基因 治疗。
逆转录 病毒载 体
逆转录 病毒载 体的 制备和 转染
Replication cycle:
2. Attachment
3. Entry
4. DNA
synthesis
(RT)
5. Form
provirus
6. RNA
7. Protein
8. Assembly and
budding
 Moloney 鼠白血病病毒载体

常用的是鼠源的 PA317 细胞。在 PA317 细胞

内已经转染了 gag 、 pol 、 env 基因。将含有目
的基因的缺陷病毒转入 PA317 细胞，就可以产生
完整的病毒颗粒，并分泌于培养基中。
3-10 Kb

Promoters
or IRES
X-Linked SCID Clinical Trial
Alain Fischer, Hopital Necker, Paris
• 11 patients
• 1-9 months old
• Bone marrow aspirate
- selection of CD34+
progenitors
• 3 daily exposures to retroviral vector
 X-Linked SCID Clinical Trial
Follow up 3-13 months
In 10 of 11 patients

T cells
Reconstituted to
NK cells
Normal Numbers
B cells

Normal immunological responses to vaccination

Return Home
 October 2002 - December 2002

1st child with T cell leukemia

• WBC 7,000 γδ T cells → 300,000 + splenomegaly

• Transgene insertion into the 1st intron of the LMO2 gene

2nd child with T cell leukemia - at 34 months

Insertion 40 kb upstream of LMO2

(3rd child with LMO2 insertion - currently well)

“Random” integration of Retroviruses
Science 17th October 2003
 腺相关 病毒载 体

优点
•无致病性
•可长期表达
•可感染分裂期和 非分裂期 细胞
•宿主范围光 : muscle, heart, retina, brain, liver, lung
•低免疫原性

缺点
•基因容量小 < 5kb
•延迟表达 , 表达水平相对 低
•需要高滴度产生 有效转染 , 10 5~6 particles/cell
•病毒制备困难
腺相关 病毒载体特 点适用范 围 :

•In vivo 基因治疗 ；

•Ex vivo 基因 治疗 ；
•遗传病 基因治 疗；
•获得性 慢性疾 病的 基因治 疗。
AAV 载体 电镜照 片
 Wild type AAV-2 integration

Journal of Virology, April 2003, p. 4881-4887, Vol. 77, No. 8

Helper function for AAV replication

Helper virus
adenovirus: E1a, E1b, E2a, E4, VA RNA

herpes simplex virus: UL5,UL8,UL52,UL29

Other reagent: hydroxyurea, UV

 Life cycle of adeno-associated virus

The bi-phasic life cycle of AAV. Infection results in replication in the presence of a helper virus
such as adenovirus or integration and latent infection.
 AAV 基因 组结构
ITR ITR
145nt palindromes

P5 p19 p40

Rep 78 4.2 kb An
Rep68 3.9 kb
An

Rep52 3.6 kb An

Rep 40 3.3 kb An

VP-1 87 Kda An

VP-2 73 Kda An

VP-3 62 Kda An
From Adeno-associated virus to AAV vector
非病 毒性载 体

• 裸 DNA 质粒、 噬菌体

• 脂质体 或质脂 复合物
• 聚合物 聚 -L- 赖氨酸、 聚乙 烯亚胺
• 复合载 体 脂质复 合物 、拟 病毒颗 粒
• 靶向基 因基因 传递系 统
 裸 DNA
•Purified DNA (Unlimited size)
– 优点 生产、贮存和质量控制简便，免疫原性
非常
低，在临床实验中表现出良好效果，非常安全。
– 缺点在大部分组织中表达时间非常短 ex vivo 和
in vivo
转染效率非常低无重定位 (retargeting) 转染能力。

•Gene gun ( 基因枪）微粒子轰击法

•DNA vaccine, with electric pulse （电击）
•Limited delivery area (e.g., 血管内皮细胞、肌肉细胞）
Gene gun ( 基因枪）微粒子轰击法
 脂质体

.Cationic liposome/DNA complex ；带 正电脂 质

体内包 DNA
.Controlled toxicity ；毒 性可 以控制
.Unlimited DNA size ； DNA 大小 沒有限 制
.Very low integration ；插 入染色 体几 率低
.Very low transfected efficient, below 1% ；基 因
传递效 率低
 脂质体

• 多种特性
–Thermo-sensitive
–pH-sensitive
– 适用于肺部细胞基因转导

• 已应用于肿瘤的基因治疗和囊性纤
维病变的临床试验
 反义核酸技术

反义核酸技术能够有效地调节肿瘤基因表达手
段的一种技术。原理是根据碱基互补配对的原
则设计出能够与靶基因特异结合 RNA 或 DNA
序列，以其影响靶基因表达，抑制其功能。
用反义 核酸技 术抑 制基因 表达 的几种 途径

1 、用质 粒载 体或病 毒载 体转化 或感 染细胞 ，

在细胞 内转化 出能 够与靶 序列 结合的 反义
RNA 。

2 、人工 体外 合成反 义寡 聚核苷 酸。

反义 核苷酸 技术 的机制 ：
1 、与 靶基因 结合 而被核 酸酶 H 所降解 。
2 、结 合靶基 因 5’mRN A 非编 码区， 抑制
mRNA 与 40s 小亚 基结合 。
3 、结 合到靶 基因 mRNA 的前 体，影 响它 的有
效拼接 。
4 、结 合到 mRNA 影响它 从细 胞核到 胞浆 的转
运。
5 、影 响 RNA 生成 和降解 的一 套程序 。
 反 义 核 酸 药 物 背 景

•进行了 20 年基础研究
•发表论文超过 10000 篇
•申请专利超过 1500 个
•约有 15 个反 义药 物正在 进 行临床 试验
•有约 60 个基因 靶 子 设计 了反 义 核酸 药 物
•欧盟、日本、美国等主要国家均投入了研
究
•第一个反义药物 1998 年 8 月在美国批准
上市
m
RNA
A A T A T T
G C G C

C G C G
T T A T A A
 反义核 酸对疾 病的 治
疗

1 份 200 ～ 300 份 100,000

份
反 义 药 物 治 疗 的 疾
病

•与基因 相关 疾病
肿瘤，心血管疾病，哮喘，关节炎
，牛皮癣，遗传性疾病等

•病毒病

肝炎， HIV ，流感，疱疹等

•传染病
 研 究 反 义 核 酸 的 公
司
IS IS 公司 Se qu it ur 公司
Hy br id on 公司 Gi le ad 公司

Ly nx 公司 In no vi r 公司

Ge nta 公司 AVI Biopharma 公

司
No vo P har m B io te ch
公司
 反义药物临床研究

代号/拥有者 靶/疾病 给药方式 阶段

3’-UTR/ICAM-1,节断性回肠炎,牛皮癣,类风湿
2302(ISIS) 静脉注射 IIA/B
关节炎,溃疡性节肠炎,肾移植
3521/CPG64128A
3’-UTR/PKC-2,卵巢癌 静脉注射 IIA
(ISIS/Novartis)
5132/CPG69846A C-raf,激酶乳腺癌,前列腺癌,结肠癌,脑瘤,卵巢
静脉注射 I/II
(ISIS/Novartis) 癌
2503(ISIS) Ha-ras 原癌基因,各种固体肿瘤 静脉注射 I
Bcl-2 原癌基因,非何杰金病,白血病,前列腺癌,
G3139(Genta) 皮下注射 I/IIA
乳腺癌
LR3280(Lynx) C-myc 原癌基因,Stent Restenosis 冠状静脉内注射 I
LR3001(Lynx) C-myb 原癌基因,白血病 骨髓内给药 II
LR4437(Lynx) IGF-IR, Ex-Vitro tumor Cells 腹膜下注射 I
GEM-132(Hybridon) Intron-exon,UL36/27,巨细胞病毒感染视网膜炎 玻璃体内给药 I/II
GEM-92(Hybridon) Gag/HIV-1,艾滋病 静脉注射 I
GEM-231(Hybridon) PKA-1 顽固肿瘤 静脉注射 I
GPI-2A(Novopharm) Gag/HIV-1,艾滋病 脂质体包装,静脉注射 I
13312(ISIS) IE-2,巨细胞病毒感染视网膜炎 玻璃体内给药 I
 美 国 ISIS 公 司

•1989 年成立于 San Diego, 从事反义药物开发和小分子

药物筛选
•1995 年与 Boehringer Ingelheim 合作开发细胞粘附因
子有关的反义核酸药物
•1997 年 7 月与 CIBA Vision 达成全球分销 VitraveneTM
的协议 , 获得里程碑收入 2 千万美元
•1998 年 12 月与 Zeneco 公司建立反义药物开发合作
•1999 年 1 月与 Abbott 公司建立合作
•1999 年与 Merk 公司合作开发治疗丙型肝炎类药物 , 合作
期三年
•截止 1998 年 9 月 ,ISIS 拥有现金 7300 万美元 , 债券
1700 万美元
第 一 个 反 义 药 物 上
市

•199 8 年 8 月 26 日，美国 FDA 批准第

一个 反义 药物 Vi tra ve ne TM 上市

•199 9 年 4 月， EM EA 批准 Vi tr av ene TM
在欧 洲上 市
 核酶
Cech 等在 1981 年发现，四膜虫 26S RNA 前
体中含有居间序列（ IVS ），在 rRNA 前体
成熟中， IVS 通过剪接反应被去除，而 rRNA
前体的剪接无须蛋白质催化的转磷脂反应，
作者认为这是一种自我剪接反应，同时提出
RNA 具有酶的活性的概念。 1983 年 Altman
又发现在较高阳离子浓度下， RnaseP 中的
RNA 本身即可催化 rRNA 前体成熟，而其蛋白
组分却不具备此功能。 Cech 称这种具有催
化作用的 RNA 为核酶。
 核酶的类型

核酶共有六种类型。
1 Ⅰ 类内含子
2 Ⅱ 类内含子
3 RNaseP
4 斧头状核酶（ axehead ribozyme ）
5 发夹状核酶（ hairpin ribozyme ）
6 锤头状核酶（ hammerhead ribozyme ）
锤头状核酶是目前基因治疗中应用最广泛的一种核酶。

催化活性中心（ 5‘CUGAUGAGUCCGUGAGGACGAA3‘ ）带有

亲和攻击的活性基团和活性稳定结构，负责对靶序列的
切割。

底物结合区通过碱基互补配对原则，选择特异序列，决
定对底物的特异性识别。

核酶的特异性切割点在 NUX 三联密码子的 3‘ 端，其中 N

可为 A 、 C 、 G 或 U ， X 可为 C 、 U 、 A ，但不能是
G ，当三联密码子为 GUC 时切割活性最高。
 锤头状核酶

Recognition
sequences
 锤头状核酶的设计

1 靶 RNA 的选择：有重要致病性的基因，存在
核酶的切割位点。要选择较为保守的靶 RNA 序列
，避免突变对切割效率的影响。

2 核酶切割位点的选择：一般而言，核酶的切割位
点可以位于靶 RNA 中的编码区或非编码区，由于
靶 RNA 在体内环境的复杂性，必须在体外证实核
酶的切割活性。体外实验表明，起始密码子周围
、 RNA 加工过程中反式作用因子的剪切位点和翻
译起始部位适于做核酶的切割位点。
3 核酶切割位点旁侧结合区域：一般认为，序列
越长，核酶与底物结合的特异性越好，但核酶
越不易与切割底物分离而影响切割效率。结合
序列过短，核酶与底物结合复合物则不稳定，
影响切割活性。一般认为， 12 ～ 14 个碱基长
度最佳。切割位点所在基因应处于全长 mRNA
中的单链环区内，而不是可发生碱基配对的茎
状结构内。
 核酶的转导系统

1 直接导入：用脂质体、电穿孔、显微注射和磷
酸钙沉淀等方法，将核酶基因直接导入细胞内，但
由于核酶在细胞内降解，实际应用困难较大。

2 间接导入：目前多采用构建核酶表达载体，将
核酶基因导入细胞内，利用细胞内 RNA 聚合酶使核
酶在体内表达，发挥剪切作用。这种方法的关键是
实现核酶在体内的高表达，能达到足够的浓度而发
挥作用。
 核酶的应用

应用领域极为广泛，包括病毒性疾病、肿瘤、心血管疾
病、遗传性疾病、移植排斥、骨关节炎及免疫性疾病。目
前，核酶主要应用于病毒感染性疾病和肿瘤治疗两个领域
。

1 病毒感染性疾病：研究最多的是抗 HIV 和肝炎病毒。

2 肿瘤：核酶用于肿瘤治疗方面的尝试刚刚开始并且最
为活跃，核酶作用的靶基因，包括癌基因（ ras 等）、融
合基因（ bcr-abl 等）、抗药基因（ MDR-1 等）及端粒酶
基因。
基因治疗在临床的应用

•恶性肿 瘤的基 因治 疗
•遗传性 疾病的 基因 治疗
•其它疾 病的治 疗
基因治疗临床试验情况

共有 636 个临床 基因 治疗项

目
基因治疗针对的临床适应症
基因治疗临床试验病例数

共 3496 例病人 接受了 各种 基因治 疗

各种基 因导入方法
肿 瘤 的 基 因 治 疗
 肿瘤基 因治疗的概
念

以适当 的基 因转移 技术 将特 定的
外源遗传 物质 导入肿 瘤细胞 或患 者的体 细胞
内，通过 外源 遗传物 质的表 达产 物或其 对宿
主细胞本 身遗 传物质 的影响 ，从 而直接 或间
接地杀伤 或抑 制肿瘤 细胞， 或为 其他肿 瘤治
疗方法创 造有 利条件 的一种 肿瘤 生物治 疗方
法。
临床肿 瘤治疗的 方
法

•手术疗法

•放疗

•化疗

•生物治疗 --- 基因治

疗
肿瘤基因治疗的类型

•表达肿瘤抑制基因 / 抑制激活的癌基因
•表达肿瘤免疫相关基因
•药物基因治疗
•肿瘤选 择性复 制病 毒
表达肿瘤 抑制 基因 / 抑制激 活的 癌基因

•反义核酸

用反义 核苷酸技 术抑制基因 转录和翻译

c-raf Bcl-2
Isis 公司 ISIS 2503,3521,5132 临床 II 期

•针对抑癌基因

导入抑 癌基因 RB,P53,BAX

Introgen 公司 Adp53 头颈部肿瘤
（ III 期）
 表达肿瘤 免疫 相关基 因

•针对免疫应答 细胞
目的基 因有白介 素、干扰素 、 TNF 、集 落刺激因子 等
Transgene 公司 Ad IFN-γ 皮肤肿 瘤 （ III 期）

•针对肿瘤细胞
肿瘤细 胞不表达 特异性抗原 ，缺乏 B7 分子表 达 ；
Vical 公司 DNA/lipid complex encoding HLA-B7 antigen
转移性 黑色素瘤 ， 头颈部瘤 (II 期 )
 药物 基因 治疗

•自杀基因疗法
自杀基 因将药物前 体转化而获 得对细胞的毒 性
Baylor 医学 院 HSV-tk/GCV 复发性 胰腺癌（ I 期）

•增敏和耐受基因
导入的 基因可增加 细胞对化疗 药物敏感性和 耐受性

Titan 制药 公司 MDRx1TM （ I 期）
增加骨 髓干细胞对 化疗药的耐 受性。
 溶瘤 病毒

•基因删除溶瘤 病毒
利用删 除病毒基 因使病毒特异 性杀伤癌细 胞
Onyx 制药公 司 ONYX015 头颈 部肿瘤 (III 期 )

•肿瘤特异性调 控溶瘤病毒
利用基 因表达调 控元件使目的 基因选择性 的表达于癌
细胞
Calydon 公司 (I 期 ) CN706 前列腺 癌
肿瘤选择性复制病毒
（溶瘤病毒）
基因 治疗 发展的 历程

Frank McCormick
 肿瘤的病毒基因治疗

第一类：非复制型病毒 第二类：可复制型病毒
将病毒作为转运载体，如： 如：
pro-drug genes 删除病毒部分基因造成选择性
death genes 肿瘤 / 组织特异性调控元件
tumor suppressors 野生型病毒
anti-sense against oncogenes

将两者结合：增强型可复制病毒
 各种溶瘤病毒载体

•腺病毒
•单纯疱疹病毒
•痘病毒
•VSV 病毒
•呼肠孤病毒（ Reovirus)
•新城疫病毒（ Newcastle disease virus)
 clinical phase
virus administration cancer type
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
ONYX intratumoral head and neck
015 injection +
chemotherapy
intratumoral pancreatic cancer
injection +
chemotherapy
hepatic liver metatases
artery infusion+ colorectal cancer
chemotherapy
intratumoral sarcoma
injection +
chemotherapy
intratumoral malignant glioma
injection
mouthwash oral leukoplakia
 clinical phase
virus administration cancer type
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
CV706 intratumoral prostate cancer
injection
CV787 intratumoral prostate cancer
injection
G207 intratumoral glioblastoma
injection multiforme
Reovirus intratumoral advanced tumors
injection
 野生型腺病毒感染正常细胞的过
程 病毒不复
失去活 控制细
E1A 性 RB 胞周期 制
P21
进入 S
期
野生型腺 P53 P53
病毒 正向调
控
失去活
性
E1B Bax 病毒复
55KDa 制
细胞凋 亡
E1B

E1B 细胞溶
19KDa 解

1 、野生型腺病毒感染正常细胞 (p53+) 后，最先转录出的 E1A 蛋白与细胞 RB 蛋白结合，释放细胞

转录因子 E2F ，导致细胞非正常进入 S 期，同时诱导 p53 表达量增加。 P53 蛋白通过控制细胞周期
和调控细胞凋亡来达到阻止腺病毒在细胞中复制的能力。
2 、野生型腺病毒随后表达出的 E1B 55kDa 蛋白与 p53 蛋白结合，使其失去活性，从而使野生型腺
病毒恢复复制、繁殖能力，最终导致正常细胞溶解。

资料 来源 于： Kirm DH & McCormick F, Replicating viruses as selective cancer therapeutics

 Onyx015 感染正常细胞 (p53+) 的过程
控制细
失去活 胞周期
E1A 性 RB 病毒不复
P21 制
进入 S
期
Onyx015 P53 P53
腺病毒 正向调
控
失去活
性
E1B Bax 病毒复
55KDa 制
细胞凋 亡
E1B

E1B 细胞溶
19KDa 解

1 、由于 Onyx015 腺病毒的 E1B-55kDa 蛋白缺失。因此 H101 感

染正常细胞后 (p53+) ， p53 蛋白仍具活性，从而阻止 H101 在正常
细胞中的复制繁殖。
2 、 Onyx015 腺病毒表达的 E1B 19kDa 蛋白与 Bax 蛋白 合，使
其失去活性，从而抑制 p53 系统调控的细胞凋亡反应。
资料 来源 于： Kirm DH & McCormick F, Replicating viruses as selective cancer therapeutics
Response was assessed by radiological scanning in 22 patients and by physical exam in 2 patients
No. of patients
Patient group Total no. CRa PR MR SD PD P
b

p53 gene sequence

Mutant 12 2 2 3 3 2 0.017
Wild type 7 0 0 0 4 3
Not evaluable 5 0 1 0 2 2
Neutralizing antibodies (baseline)
Positive 14 1 2 2 7 2 0.76
Negative 10 1 1 1 2 5
Tumor diameter (maximum)
<3 cm 9 0 2 0 3 4 0.34
≥3 cm 15 2 1 3 6 3
CD4 cell count (cells/μl)
<500 14 2 1 1 5 5 1. 00
≥500 7 0 1 1 3 2
Not evaluable 3 0 1 1 1 0
Treatment regimen
Standard 19 2 2 2 6 7 0.71
Hyperfractionated 5 0 1 1 3 0
a
CR, complete response; PR,partial response; MR, minor response; SD stable disease; PD, progressive disease.
b
P based on comparison of tumors demonstrating antitumor activity (CR,PR,MR) versus no activity (SD,PD) for
each evaluable subgroup (Fisher’s exact test).
H100 系列溶瘤病毒
 Project
Target Disease: Cancer
Production development pipeline:

Preclinical Phase I Phase II Phase III

NDA

H101

H103

H102
 肿瘤基因治疗的有利和不利因
素
有利 因素
1. 外源目的基 因有更大的 选择余地， 只要对肿瘤 有效而对正 常细胞无害 的
基因均 可使用。

2. 肿瘤基因治 疗的对象多 数为成年人 ，不需像遗 传病基因治 疗需终身使 用

，而只 需较

短疗程。

3. 无需持续表 达，阶段性 表达可达到 杀伤肿瘤细 胞的目的。

4. 肿瘤基因治 疗对目的基 因的表达调 控不如遗传 病基因治疗 要求严格。

不利 因素
1. 基因转导的 靶向性要高 ，否则会杀 伤正常细胞 。

2. 治疗需要高 效性，否则 剩余的癌细 胞会继续生 长。

 肿瘤基 因治疗面临 的问题

1. 应用载 体进行 基因转 导的 安全性 问

题：
致癌性 （逆 转录病 毒） ；
引起机 体的 免疫反 应
2. 基因治 疗的 靶向性 问题 ：
建立特 殊的 靶向性 载体
基因治 疗载 体的体 内分 布
3. 基因治 疗体系 的有 效性问 题：
是否能 高效 的杀死 肿瘤 细胞
遗传性疾病的基因治
疗
适用基 因治疗的 遗传性疾病

•ADA （腺苷 脱氨 酶缺失 症）

•OTC （鸟氨酸 甲酰 氨基转 移酶 缺失 症）

•X-SCID （气 泡男 孩）

•血友病
血友病的基因治疗
 血友病
• 1:5000 男性发病
– 80% A 型血友病缺乏 VIII 因子
– 20% B 型血友病缺乏 IX 因子

• 造成自发性流血，可以致命。

• 输入缺乏的因子可以起到预防和治疗的作用

• 重建 1% 的基因活性可以减少自发性流血

• 重建 10% 的基因活性可以治愈自发性流血
血友病的基因治疗方法

• 经肝介导

• 经肌肉介导

• 经骨髓介导

• 移植经基因修饰的成纤维细胞
体外 / 体内 vs. 体内经肝介导方法
• Ex Vivo:
– Remove hepatocytes
– Modify in culture
– Reinject

• In Vivo:
– Inject vector
 经肝介导的不同载体
AAV (Adenovirus associated virus) Vectors
Good expression for hemophilia B
Safe

Retroviral vectors
Good expression for hemophilia A and B
Safe

Adenoviral vectors
Great expression for hemophilia A or B
No stable efficacy in large animals
 腺相关病毒 (AAV) 载体

• Small single-stranded DNA (4.5 kb) virus

of the parvovirus family

• Does not require replicating cells for gene

transfer
Effect of AAV-mediated Hepatic Gene
Therapy in Hemophilia B Dogs

Inject 1x1012 vector particles per kg into the portal vein of Hemophilia B dogs
Mount, Nichols, High, and others; Blood 99:2670, 2002
 逆转录病毒载体
• Single stranded RNA virus that gets copied into
DNA that integrates into the chromosome

• Classes of retroviral vectors:

– Oncoretroviral vectors
• require replication for gene transfer

– Lentiviral vectors
• do not require replication for gene transfer
 Ways for Oncoretroviral Vectors to
Transduce Hepatocytes:

• Adults:
Inject hepatocyte growth factor (HGF) prior to
injection of retroviral vectors

• Newborns:
Replication is already sufficient for gene
transfer due to the rapid rate of growth
 Oncoretroviral vector Transfer into
Adult Mice
h A A T -c F IX - W P R E

LT R
ψ+ hAAT c F IX W PRE LT R

Inject 1x1010
Gene Transfer as Adults IU/kg of RV
10 Normal
cFIX (g/ml)

Range
1

0.1
RV/HGF
0.01 RV/PBS
0.001
0 1 2 4 6 8 10 12
Months after Transduction
 Oncoretroviral Vector Transfer of
Canine FIX into Neonatal Mice:

Gene Transfer as Neonates Bleeding Challenge

10 Normal N=6 N=17

at 15 minutes
100

Hemostasis
cFIX (g/ml)

Range
1 80
0.1 60
Hemophilia B 129xC57BL/6 (N=17)
0.01 C57BL/6 (N=10) 40
20
0.001 N=6
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Normal HB HB/RV
Months after Transduction

Inject 1x1010 TU/kg of Retroviral Vector IV

给新生小狗注射
Oncoretroviral Vector Transfer into
Newborn Hemophilia B Dogs
Plasma cFIX WBCT
10 HB
Normal 60
cFIX (g/ml)

WBCT (min)
1 50
40 G08
0.1 G18
30
G08
0.01 20
G18
10 Normal
0.001 HB 0
0 1 2 4 6 0 1 2 4 6
Months after Months after
Transduction Transduction

APTT Immune Response

40 20
35 HB
APTT (sec)

-cFIX IgG
15
30

(g/ml)
25 10
G08
G08
20 G18 5 G18
15
Normal 0
10
0 1 2 4 6 0 1 2 4 6
Months after Months after
Transduction Transduction
 对 B 型血友病新生狗基因治疗结果

• Achieved 10% to 35% of normal antigen;

about 30% was functional

• There was a reduction in bleeding in one

dog

• No antibody responses occurred

 人体临床试验
• IM injection of AAV for hemophilia B

• IV injection of RV for hemophilia A

• Implantation of genetically-modified fibroblasts

for hemophilia A

• Hepatic artery injection of AAV for hemophilia B

 肌肉注射 AAV 载体
Kay, High in Nature Genetics
24:257, 2000

Inject 10 to 12 sites with 0.5 ml

Of AAV vector with CMV promoter
(low dose; 2x1011 vg/kg; dogs got
1x1013 vg/kg for 2% of normal)

Patients that got higher doses had no

evidence of expression
静脉注射逆转录病毒载体治疗 A 型血友病

• Based on inconsistent results in animals, in

which some animals with high antibody
levels had high antigen levels, but no
coagulation activity
• Injected RV IV without a stimulus for
hepatocyte replication
• Activity was less that 1% of normal
• Trial has been stopped
• No adverse effects were noted
基因修饰的成纤维细胞移植
基因修饰的成纤维细胞移植
基因修饰的成纤维细胞移植
肝动脉注射 AAV 载体治疗 B 型血
友病
– Inject 1/10 of dose in dogs into the hepatic
artery
– No evidence of expression to date
– AAV was noted in semen for several months
due to contaminating WBC
– Trial recently resumed with a medium dose, but
there are concerns about germline transmission
 结 论
• No gene therapy approaches have evidence of
long-term efficacy in patients

• IM injection of AAV is too inefficient

• Implantation of fibroblasts is very laborious and

not very effective

• Liver delivery of AAV or RV should work

 尚待解决的问题
• Insertional mutagenesis or other
mechanisms causing cancer

• Immune response to the transduced cells or

a secreted transgene

• Germline transmission
其它疾病的基因治疗

•糖尿病
•心血管疾病
•艾滋病
 糖尿病的基因治疗

糖尿病的基因治疗最初只是将外源性胰岛素基
因转入体内任何细胞中，从而改善胰岛素分泌
不足。目前糖尿病的基因治疗策略主要包括：

1. 阻止胰岛 β 细胞的自身免疫损伤，抑制胰岛
β 细胞的凋亡，从而防止糖尿病发生；

2. 胰岛素的基因治疗；

3. 改善外周组织的胰岛素敏感性。
心脏病的基因治疗

•对抗缺血
•分子搭桥
•修复心肌细胞
 艾滋病的基因治疗

•转基因干细胞抑制 HIV 病毒
•反义核酸
基因治疗药物的产业化

•临床前 研究
•临床研 究
•产业化 研究
药品的开发周期
1980-2001 美国在医药业 R&D 的投
资
 医药开发各阶段的投资状况

药物合成、抽提
机理研究、药效学和药
理学试验
毒理及安全性试验

药剂学及药物稳定性试
验

临床试验： I 、 II 和
III 期

临床试验： VI 期

中试及建立质控标准

新药申请临床及申请上
市

生物利用度试验

其它
基因治疗药物的产业化

临床前研究
•体外试 验
•体内试 验
•安全性 评价
基因治疗药物的产业化
的
临床研究
•I 期临床试
验
•II 期临床试
验
•III 期临床
基因治疗药物的产业化

工艺研究
•培养（ 发酵）
•纯化
•制剂
•质量标 准
基因治疗药物的产业化

GMP 验
证
GMP 验
证•组织机构
•厂房建设
•工艺流程
•仪器设备
• SOP
•检定规程
•仓储制度
•公用设施
•供应商审计
•验证计量管理
•文件管理
•人员培训
•自查
基因治疗药物 的大规模 生
产
基因 治疗与 伦理
学
克隆人、定制儿童
人兽杂合体
人种的分离
基因治疗 的前 景
1. 从现 在到以 后数 年内， 第一 批基因
治疗的 产品 陆续上 市。

2. 基因治 疗在今 后的 20 年里会 成为

一种综 合治 疗手段 应用 于临床 实践 。
乐观的看法：
•2030 年，治愈肿瘤，人类
平均寿命可达 90 岁。
2070 年，各种疾病的有效控制。
2100 年，随着基因治疗、组织
工程及生物电子的进展，永生
成为可能。
 梁 旻
liangmin@hotmail.com
2004.12.23
 基
因
谢 治
从
疗
设
谢 想
到
实
践