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TEMA 4. ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA CIRCADIANO HUMANO. Estructura

general . Núcleos supraquiasmáticos. Relojes moleculares.

1.-INTRODUCCIÓN

Como se vio en el capítulo anterior, los ritmos biológicos tienen dos propiedades
fundamentales: carácter endógeno y capacidad de sincronización; por tanto, el sistema
circadiano (conjunto de estructuras encargadas de generar y regular los ritmos circadianos
de un organismo) debe estar compuesto por los siguientes elementos formales (Figura 1):
-marcapasos, o generadores autónomos de los ritmos.
-sensores que detectan cambios ambientales o internos y envían la información a los
marcapasos produciendo su sincronización.
EFECTORES -efectores, que son
VÍAS DE ACOPLAMIENTO todos los órganos,
MARCAPASOS tejidos y células que
responden
VÍAS DE dmNSQ
ENCARRILAMIENTO modificando su
LUZ OJO
vlNSQ actividad en respuesta
a las señales emitidas
por los marcapasos.
PINEAL
ENCARRILAMIENTO La capacidad
del sistema circadiano
GENERACIÓN DE RITMOS RITMOS CIRCADIANOS de generar ritmos
endógenos implica que
Figura 1. Esquema de la organización del sistema circadiano. vlNSQ= núcleo
supraquiasmático ventrolateral; dmNSQ= núcleo supraquiasmático dorsomedial. los organismos deben
poseer marcapasos
endógenos capaces de generar autónomamente los ritmos biológicos.
En 1972, dos
grupos de
investigadores: Moore
& Erlich y Stephan y
Zuker publican
sendos trabajos en
los que proponen que
en los núcleos
supraquiasmáticos de
hipotálamo (NSQ)
reside el marcapasos
Figura 2.-Sección frontal a través del hipotálamo de rata mostrando los nú
cleos
supraquiasmáticos (flechas) sobre el quiasma óptico (OC) (Tomadode Inouye y circadiano más
Kawamura, 1979) importante de

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mamíferos. La lesión completa de NSQ por estereotaxia en roedores elimina los ritmos
circadianos de alimentación, actividad motora, bebida, ciclo estral, temperatura, cortisol,
etc. Aunque no engordaban ni nada, por lo que la constancia de los valores medios de los
ritmos se mantiene. Es decir, que los animales duermen el mismo nº de horas en 24 h,
comen la misma cantidad y realizan una actividad similar. Además, mueren antes.

Moore y Elrich marcaron la vía de la retina al NSQ (tracto retino-hipotalámico) inyectando

la peroxidasa del rábano o la toxina del cólera en la retina para dibujar la vía nerviosa
desde la terminación a la neurona. Es decir, que estas sustancias viajan retrógadamente.

2.- LOCALIZACIÓN DE LOS NÚCLEOS SUPRAQUIASMÁTICOS.

Los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) son dos núcleos simétricos, ovalados,

situados en la parte ventral de hipotálamo y dorsalmente con respecto al quiasma óptico
(lugar de entrecruzamiento de las fibras de un ojo con las del otro). En ratas está formado
por 8000 neuronas y en humanos por 16000. Tiene tan sólo 1mm de diámetro. También
existe en aves y reptiles. Los dos núcleos están conectados por numerosos circuitos
locales y actúan funcionalmente como una única estructura. Teniendo en cuenta criterios
anatómicos y neuroquímicos es posible diferenciar dos zonas en los NSQ: la zona
dorsomedial y la ventrolateral. Si usamos técnicas inmunocitoquímicas, usando un
anticuerpo contra el neurotransmisor, VIP, veremos que el área ventrolateral presenta
mayor radiactividad. En cambio, la dorsomedial está más radiactiva cuando ponemos un
anticuerpo contra vasopresina. Es el verdadero reloj, generando ritmos in vitro.

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NEURONAS NEURONAS

La zona dorsomedial actúa como

PRODUCTORAS PRODUCTORAS
DE VIP DE VASOPRESINA

un verdadero marcapasos,
generando ritmos de actividad
dmNSQ
nerviosa en condiciones
ambientales constantes, por el
Area ventrolateral contrario la zona ventrolateral es
Area dorsomedial
la que recibe las entradas
vlNSQ
procedentes de la retina y no es
capaz de generar ritmos en
Figura 3.-Citoarquitectura del núcleo supraquiasmático de rata. En el área dorsomedial abundan condiciones ambientales
las neuronas productoras de VP ( vasopresina ) mientras que en el área ventrolateral predominan
las productoras de VIP. El área ventrolateral recibe las conexiones del tracto retinohipotalámico . El
área dorsomedial es la responsable de la actividad marcapasos.
constantes.

3.-CONEXIONES ANATÓMICAS DE LOS NSQ.

3.1.- Vías aferentes: Mediante técnicas de marcaje retrógrado y anterógrado se han

trazado las vías aferentes (hacia los NSQ) y eferentes (salidas desde los NSQ). Las vías
aferentes se han marcado en rojo, mientras que las eferentes lo han sido en azul.

3.1.1.- Tracto
retinohipotalámico.
Los conos y bastones
se comunican con
neuronas, y al final
éstas hacen sinapsis
con una neurona
RAFE ganglionar. Y estas
envían la información a
la corteza visual (en la
Figura 4.-Vista longitudinal del cerebro de la rata ilustrando las conexiones nerviosas del núcleo
supraquiasmático. RHT= tracto retinohipotalámico, procedente de la retina; GHT= tractogeniculohipotalámico

zona occipital) para

procedente del núcleo geniculado lateral del tálamo (estría intergenicular= IGL) y conexión procedente delrafe.
En el mismo dibujo se han representado las salidas principales:sPVz= zona subparaventricular de hipotálamo;

que se forme la
DMH= núcleo dorsomedial de hipotálamo; PVT= núcleo paraventricular del tálamo.

imagen. Pero hay un tipo de células ganglionares que son directamente fotosensibles. Y
estas son las que envían información al NSQ. Por tanto está formado por un pequeño
grupo de axones procedentes de células ganglionares de la retina que se proyectan
fundamentalmente al área ventrolateral del NSQ. Este tracto es absolutamente necesario y
suficiente para la existencia de sincronización a la luz. Por eso los ciegos con lesiones en
el tracto visual pueden estar sincronizados a la luz. Los principales neurotransmisores de
esta vía son el glutamato (muy tóxico) y VIP, que son segregados por la célula ganglionar.
Su interacción con receptores de membrana de las neuronas de los NSQ producen
cambios en la concentración de Ca, que activa unas proteinkinasas, induciendo

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modificaciones en la expresión de genes reloj, con la consiguiente sincronización de los

ritmos neuronales al ciclo LD.
El pigmento de las células ganglionares especiales no es rodopsina (como en conos y
bastones), sino melanopsina. La célula ganglionar no reacciona a imágines, sino a
variaciones en la intensidad de luz. Y su reacción es muy lenta.

3.1.2.- Tracto geniculohipotalámico. Está formado por los axones de neuronas que
provienen del núcleo geniculado lateral. Estos núcleos también reciben conexiones
bilaterales de la retina informando de la luz y están conectados por la estría
intergenicular, lugar donde arranca el tracto geniculohipotalámico. Su principal
neurotransmisor es el neuropéptido Y. Esta vía se activa con las transiciones L-D y D-L.

3.1.3.- Vías procedentes de núcleos del rafe. En el tronco encefálico hay unas zonas que
se llaman rafe medio, relacionadas con el sueño y el dolor, y se une al NSQ. Su principal
neurotransmisor es la serotonina. Parece que es una vía no fótica, a través de la cual se
sincronizan otros factores (ejercicio, comidas, etc)

3.1.4.- Núcleo geniculado lateral: está dentro del tálamo. Se conecta con el NSQ por otra
vía. Esta vía se puede cortar y aparentemente no ocurre nada, así que es secundaria.

3.2.- Vías eferentes.

3.2.1.-Eferencias dentro del mismo hipotálamo.

Existen amplias conexiones nerviosas entre los NSQ y el resto de núcleos

hipotalámicos. Destacan especialmente las conexiones con el núcleo paraventricular, del
cual salen eferencias hacia la glándula pineal, haciendo relevo en el ganglio cervical
superior. También hay conexiones con el área preóptica y área retroquiasmática y el
núcleo dorsomedial.
En el hipotálamo hay núcleos que regulan muchas funciones vegetativas. Estas eferencias
no son necesarias para regular los ritmos de curso libre.

3.2.2.- Eferencias fuera de hipotálamo.

Al núcleo paraventricular del tálamo, al sistema límbico y al núcleo geniculado

lateral.

A pesar de la gran cantidad de eferencias las conexiones nerviosas no son

necesarias para la generación de ritmos por los NSQ.

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3.3.- Neurotransmisores.

GABA. Presente en todas las neuronas.

Péptidos de la zona ventrolateral
„ Péptido intestinal vasoactivo (VIP). Presenta un ritmo con máximo nocturno
que desaparece en DD.
Péptidos de la zona dorsomedial
„ Vasopresina (VP). Presenta un ritmo circadiano endógeno, en DD.

La mayoría de las neuronas de NSQ son productoras de GABA, un neurotransmisor

inhibidor ampliamente extendido en otras regiones del cerebro (es un depresor).
Específicamente, el área ventrolateral de los NSQ produce VIP (péptido intestinal
vasoactivo), mientras que el área dorsomedial produce VP (vasopresina).

4.- ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA CIRCADIANO

La luz se conecta con el ojo, y éste con el tracto retrohipotalámico (encarrilamiento), y

éste con el marcapasos (NSQ), con la zona ventrolateral, que se encarga de generar
ritmos. Y luego hay vías de acoplamiento. NSQ: liberan muchas sustancias para generar
ritmos. La pineal distribuye las órdenes de los NSQ. Envía melatonina, dando señales de
oscuridad.
El sistema circadiano de mamíferos está formado por todas aquellas estructuras que
intervienen en la generación y sincronización de los ritmos circadianos. Está compuesto
por la retina que conecta por células ganglionares portadoras de melanopsina siendo
fotosensibles con NSQ (principalmente el TRH por VIP y Glutamato por el receptor NMDA,
el cual hace que entre Calcio activándose Tirosinquinasas que fosforilan CREB y se
expresan más los genes reloj y secundariamente el TGH). Los NSQ constituyen el
marcapasos circadiano principal. Este se encarga de regular unos pocos ritmos básicos
como el ritmo de sueño-vigilia, el de temperatura y actividad motora. Colaborando con
esta actividad se encuentra la glándula pineal que genera el ritmo de melatonina y difunde
por el organismo el mensaje de oscuridad química. Recientemente se ha demostrado que
la mayoría de los tejidos poseen osciladores secundarios que son gobernados por NSQ al
parecer mediante mecanismos indirectos como los ciclos de temperatura o el ritmo de
sueño vigilia.
Las estructuras que generan ritmos se llaman efectores.
Casi todos los tejidos tienen marcapasos secundarios, que normalmente funcionan
acoplados al NSQ pero también funcionan aislados.

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5.- PRUEBAS QUE DEMUESTRAN EL CARÁCTER DE MARCAPASOS CIRCADIANO PRINCIPAL

EN MAMÍFEROS.

4.1.- La lesión de NSQ

R IT M O S D E AC T IV ID A D EL É C T R IC A
D E L A S N EU R O N A S D E L N Ú C L E O
S U PR A Q U IAS M Á T IC O M A N T EN ID A S
produce arritmicidad
IN V IT R O
en la mayoría de los
ritmos circadianos.

4.2.- Las neuronas de

los NSQ mantenidas in
vitro son capaces de
generar ritmos de
curso libre (tienen
picos a las 18, las 12,
Figura 5.- Frecuencia de potenciales de acción de neuronas de NSQ de rata
mantenidas in vitro.
por lo que tienen un
periodo menor de 24
horas) de potenciales de acción durante varios días seguidos.
En la figura 5 se pueden ver los resultados de un experimento en el que se
determina la frecuencia de potenciales de acción espontánea de un núcleo

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supraquiasmático de rata. El periodo del ritmo de actividad nerviosa es inferior a 24 h y se

mantiene, al menos, durante 4 días seguidos.

4.3.- Cada neurona individual de los NSQ es en sí misma un marcapasos (oscilador),

pudiendo generar ritmos de actividad nerviosa con independencia de las demás neuronas.

5.-¿Es verdaderamente un marcapasos el

NSQ?: Estudios in vitro
PERIODOGRAMA DE LA
ACTIVIDAD ELÉCTRICA DE
UNA NEURONA INDIVIDUAL
MANTENIDA IN V ITRO.
CADA NEURONA ES EN SI
UN OSCILADOR
CIRCADIANO, AUNQUE
PARECEN FORMAR
CLUSTERS CONECTADOS

4.4.- El transplante de NSQ a un animal cuyos NSQs se han lesionado previamente, le

transfiere las
características
propias, en cuanto a
sus ritmos biológicos,
wild Mut. tau trasplante del donante. Estos
experimentos han
lesiónSCN sido especialmente
concluyentes al
Tiempo (días)

trasplante trasplantar NSQ de

donantes mutantes
tau (periodo muy
inferior a 24 h) y
demostrar que en
pocas semanas
aparecen en un
Figura 6.- Efectos del trasplante de NSQ procedente de un hamster mutante tau
(periodo inferior a 24 h) sobre el ritmo de actividad motora de un receptor cuyos animal receptor de
NSQ han sido lesionados previamente. fenotipo salvaje, las
características del

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mutante (Figura 6). Es decir, recupera sus ritmos pero con las características del mutante
tau. Lo que ocurre es que normalmente después de un transplante no se sincroniza a la
luz, porque las conexiones nerviosas no se han desarrollado suficientemente.

Los NSQ transplantados en

DD
el tercer ventrículo son
capaces de generar ritmos
de curso libre en los
animales receptores en
muy poco tiempo. Además,
los animales son
suceptibles de ser
LD
sincronizados por la luz
Figura 7.- Efecto del trasplante de NSQ sobre la
igual que los controles no
recuperación del ritmo de bebida de una rata
previamente lesionada. El trasplante recuperó los trasplantados.
Es muy probable que las
ritmos circadianos tanto en LD como en DD. El
ritmo de curso libre al final del experimento parte
DD
de una fase previamente sincronizada por el ciclo conexiones de los NSQ no
LD. Lo que indica la existencia de una verdadera
sincronización. Tomado de Esseveldt y cols. sean absolutamente
2000. Brain Res. Reviews , 33:34 -77. necesarias para regenerar
los ritmos y la capacidad
de sincronización, dado que el trasplante de NSQ encapsulados, y por tanto incapaces de
regenerar las conexiones nerviosas, puede devolver los ritmos circadianos a los animales
receptores.

5.-
RESTAURACIÓN
DEL RITMO DE
ACTIVIDAD
MOTORA TRAS
EL TRASPLANTE
DE NSQ
ENCAPSULADOS

Microfotografía del trasplante de un NSQ encapsulado (g). Un hámster mutante tau con periodo de 21,4 h se
vuelve arrítmico tras lesión de sus NSQ, más tarde recibe un trasplante de un NSQ encapsulado procedente de un
hámster normal. Observe la recuperación de un ritmo de 24 h de la actividad motora. La restauración del ritmo de
actividad motora indica que las conexiones nerviosas no son imprescindibles para que los NSQ controlen los
ritmos circadianos, sin embargo, otros ritmos si requieren de conexiones.

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6.- RELOJES MOLECULARES.

RELOJ MOLECULAR DROSOPHILA MELANOGASTER:

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

DOUBLE TIM

TIM-PER

CYCLE CLOCK

criptocromos

En oscuridad se forman grandes cantidades de

proteínas PER y TIM, estas forman dímeros estables.
Los monómeros son rápidamente destruidos por la
enzima DOUBLE TIME

El reloj molecular de Drosophila constituye un modelo sencillo que permite entender el

funcionamiento del marcapasos circadiano. Las proteínas CLOCK y CYCLE son factores de
transcripción que favorecen la transcripción de los genes per y tim en las proteínas PER y
TIM. En el citoplasma TIM y PER forman heterodímeros que son resistentes a la
degradación por enzimas como DOUBLE TIM.

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RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Fosforilación de per

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Los dímeros PER-TIM entran en el núcleo y bloquean

la transcripción de los genes per y tim.

Cuando la oscuridad progresa, los dímeros PER-TIM entran en el núcleo e inhiben el

funcionamiento de los genes clock y cycle lo que induce a su vez un descenso en la
expresión de per y tim

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RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Los dímeros PER-TIM entran en el núcleo y bloquean la

transcripción de los genes per y tim.

Cuando desciende la proteina PER y TIM desaparece el feedback negativo y comienza de

nuevo la recuperación de sus niveles. Esto ocurre al final de la oscuridad y comienzo de la
luz.

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

La luz destruye la proteína TIM (por activación de

criptocromos) y más tarde desaparece la proteína PER
por acción enzimática.

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La luz sincroniza rápidamente el reloj ya que destruye la proteina TIM, lo que desestabiliza
a PER y esta puede ser degradada.

RELOJ MOLECULAR DE Drosophila melanogaster

Con la llegada de la oscuridad comenzará un nuevo ciclo

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En la última
RESUMEN DEL RELOJ MOLECULAR DE DROSOPHILA
década se han
producido
continuos avances
en el conocimiento
del sustrato
molecular implicado
en la sincronización
y génesis de los
ritmos circadianos
en diferentes
organismos, desde
CCG la mosca de la fruta
hasta mamíferos.
Afortunadamente,
PROTEINAS CCG los mecanismos
básicos que
explican la
ritmicidad se han conservado con muy pocas modificaciones a lo largo de la filogenia.

En relación con la sincronización a la luz, se ha descubierto muy recientemente

que la luz activa en la retina unas células ganglionares que son directamente
fotosensibles, al parecer el pigmento implicado es la melanopsina. Este tipo de células
ganglionares no interviene en la visión de imágenes, estando únicamente especializadas
en la detección de niveles de iluminación. Sus axones forman el tracto retinohipotalámico.
La liberación de glutamato y VIP altera la expresión de genes reloj en NSQ.
También se conoce, relativamente bien el funcionamiento del marcapasos
circadiano de Drosophila melanogaster y en menor medida del ratón. Dado que los genes
implicados y el mecanismo fundamental de funcionamiento son en parte comunes a
ambas especies, comenzaremos describiendo el reloj de Drosophila (Figura 8).

Hace unos 30 años se descubrió el primer gen relacionado con los ritmos en la
mosca de la fruta, fue denominado gen per, (de period). Se encuentra localizado en el
cromosoma X y presenta varios alelos mutantes (pers, tau= 19 h; perL, tau= 29 h y per0,
arrítmico). El gen per de Drosophila se expresa de un modo circadiano y el producto de su
síntesis, la proteína PER inhibe su propia transcripción. En 1994 se descubrió otro gen
implicado en el control de la ritmicidad circadiana, el gen tim (de timeless) en el
cromosoma 2 de Drosophila; al igual que per, el RNAm de tim se acumula rítmicamente y
su ritmicidad es dependiente de TIM y de PER. Los genes tim y per se expresan durante la
noche, generando las proteínas PER y TIM. La proteína PER es fosforilada y degradada por
la proteína DOUBLETIME. A su vez la proteína TIM es degradada por la luz y también por
un CRIPTOCROMOS (pigmento que se activa por la luz). Sin embargo, la formación de

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dímeros TIM-PER protege a ambos de su degradación. Estos dímeros entran dentro del
núcleo y se unen a los factores de transcripción CLOCK-CYCLE impidiendo la expresión de
tim y per al separarlos del promotor. Cuando llega la luz, TIM es degradado por
CRIPTOCROMOS y por la luz misma, siendo suceptible PER de degradación por
DOUBLETIME, con lo que dejan de inhibir su propia transcripción, uniéndose CLOCK-
CYCLE a su promotor, y todo comienza de nuevo. Es cíclico, un reloj, y el período es de
más o menos 24 horas.
Las fluctuaciones de la proteína PER son capaces de afectar a la transcripción de otros
genes (CCG, clock controlled genes) que son los responsables de los ritmos circadianos de
diferentes funciones (producen hormonas, neurotransmisores, etc)

Cualquier pequeña mutación en los genes hace que cambie el período, al cambiar la
afinidad de las proteínas. Por ejemplo, una mutación que provocaría un ritmo de más de
24 horas sería el que afectase a PER, haciéndola más resistente a la degradación.

CONSECUENCIAS DEL RELOJ DROSOPHILA MELANOGASTER:

Si no saliera el sol, ¿Qué ocurriría?

Hay factores que de forma espontánea eliminan per y tim, pero se nota más su acción
cuando no se están expresando per y tim. El sol activa el criptocromo y éste degrada a
tim. Esto ocasiona un ciclo en la cantidad de per y tim. Y en el caso de per, la distancia
entre dos máximos en la concentración de per es igual al período de curso libre del animal
(cuando éste no está expuesto a un ciclo de luz-oscuridad)

DBT (doubletime): la mutación que se encontró en drosophila es que al mutar esa proteína
y bajar su actividad, todo se expande 8 en verde). Mantiene alto el nivel d per durante más
tiempo. Y por tanto, se alarga el ciclo.

Clock/cicle: si se ven afectados, no se pueden unir al promotor y ya no hay ciclo (el animal
se vuelve arrítmico).

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PULSO DE LUZ: si aplicamos un pulso de luz al final de un período, se produce un

descenso brusco de per, y un adelanto de fase (en naranja).
Si se lo damos antes del período, hay una bajada rápida de per, y en seguida empieza a
subir. Se produce un adelanto de fase (en rosa)

El punto clave es la mitad de la noche. Dependiendo de dónde demos el pulso con

respecto a ese punto se producirá un adelanto o un retraso.

En mamíferos, la
primera mutación de un
gen relacionada con los
ritmos circadianos fue
descrita en 1989, por
M. Menaker, la
mutación tau del
hámster; sin embargo,
ha sido el reloj del
BMAL1CLOCK ratón el más estudiado
desde el punto de vista
genético. En 1994
Takahashi publica un
trabajo en Science
describiendo el primer
gen mutante en el
ratón, el gen Clock,
capaz de alargar el
periodo de los ritmos
circadianos (+/+, tau= 23,3 h; +/Clock, tau = 24,4 h y Clock/Clock, tau= 27,3 h). Con
respecto a Drosophila, las principales diferencias estriban en que en lugar de un gen per

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existen al menos tres genes per, per1, per2 y per3 , dos genes criptocromos (cry1 y cry2)
y el gen bmal1 y el gen clock. Las proteinas CLOCK y BMAL1 regulan la expresión de per
y cry . Los dímeros TIM-CRY, PER-PER y PER-CRY bloquean a BMAL1 y a CLOCK.
La proteína que degrada per es CKI epsilon.

RELOJ MOLECULAR EN NEURONAS

DEL NSQ DE RATÓN

Expresión de los tres genes Period en el núcleo supraquiasmático de ratón

mantenido en LD 12:12, ZT0= encendido de la luz
Takahashi,1999

Las autorradiografías muestran la variación de la expresión de los tres genes per,

determinada mediante hibiridación in situ en cuatro momentos circadianos diferentes
(CT6, CT12, CT18 y CT24). Observe como varía la expresión zonalmente dentro del NSQ.

RELOJ MOLECULAR EN NEURONAS DEL NSQ DE RATÓN:

Para saber si en los NSQ se está expresando un gen, se usa hibridación in situ. Hacemos
una copia complementaria del mensajero del gen que queremos saber si se expresa.Esa
copia complementaria la unimos a un elemento radiactivo. Ahora la aplicamos a un corte
de cerebro donde existe ARNm. Coloco una película encima y la revelo y a mayor
expresión, mayor radiactividad en la película. Se puede cuantificar en función de la
coloración d la placa y sabemos cuánto per hay.

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