Micropropagacin de plantas

MEDIOS LQUIDOS Y SISTEMAS AVANZADOS DE MICROPROPAGACIN

Caractersticas de los medios lquidos Hiperhidricidad Bioreactores Reactores de Inmersin Temporaria

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Medios lquidos
Menores costos Mejor calidad de planta Mecanizacin del proceso

Tcnica ideal para produccin masiva de plantas

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Ventajas

Mayores tasas de crecimiento Mayor superficie de contacto

Toma de nutrientes y reguladores mas eficiente Dispersin mas efectiva de metabolitos txicos Facilidad de limpieza del material de vidrio

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Medios lquidos
Formacin de una capa estacionaria (Nernst). Tasa de absorcin de iones limitada. Espesor depende de la agitacin. Medios lquidos estticos/agitacin

Curtis, 2005. Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Medios lquidos
Concentracin de oxgeno, principal factor limitante del crecimiento. Heterotrofia de tejidos vegetales en cultivo. Oxidacin de azcares determinante principal de la demanda biolgica de oxgeno (BOD). Baja solubilidad del oxgeno en el medio de cultivo. Principal demanda: meristemos.

Curtis, 2005. Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Medios lquidos

Shaker rotatorio para Erlenmeyer.

Rotor para tubos de ensayo.

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Principal problemtica: VITRIFICACIN O HIPERHIDRICIDAD

Desorden fisiolgico, metablico y morfolgico en condiciones de cultivo in vitro.

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Caractersticas de los brotes hiperhdricos:

Apariencia turgente Superficie acuosa rganos translcidos Coloracin menos verde Brotes frgiles, se quiebran fcilmente Capacidad de enraizamiento reducida o nula

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Condiciones adversas

Altas concentraciones de citoquininas Alta HR en el recipiente de cultivo Recipientes hermticos

Bajas concentraciones de agar

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Principales sntomas
Micropropagacin de plantas

Morfolgicos Entrenudos cortos Arrosetamiento Tallos de mayor dimetro Hojas mas gruesas, elongadas, arrugadas Hojas translcidas y quebradizas Menor peso seco Color anormal

Anatmicos Epidermis y cutcula delgadas Grandes espacios intercelulares Hipertrofia del parnquima cortical y mdular Ausencia de parnquima en empalizada Menor desarrollo del sistema vascular Estomas anormales y en menor nmero

Bioqumicos Hipolignificacin Menor contenido de celulosa Mayor actividad de glutamato deshidrogenasa Menor contenido de Ca+2 Mayor absorcin de agua Menor contenido de clorofila Menor capacidad fotosinttica

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Planta normal

Planta vitrificada

Vaccinium corymbosum
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Micropropagacin de plantas

NORMAL

VITRIFICADO

Achyrocline flaccida

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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NORMAL

VITRIFICADO

NORMAL

VITRIFICADO

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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HIPOLIGNIFICACIN

VA DE SNTESIS DE LIGNINA Y FLAVONOIDES REDUCIDA POR VITRIFICACIN

Phenylalanine

c. cinamico

c. coumrico P-coumarato:CoA ligasa P-coumaryl-CoA

FLAVONOIDES

LIGNINA

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

(Adaptado de George, 1993)

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Cambios morfolgicos y anatmicos en Vanilla planifolia

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Sreedhar et al., 2009.

Micropropagacin de plantas

Cambios morfolgicos y anatmicos en Vanilla planifolia

Tejidos vasculares Endodermis

Tejidos vasculares Parnquima en empalizada

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Sreedhar et al., 2009.

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Cambios morfolgicos y anatmicos en Vanilla planifolia

A) Superficie del tallo, B) Sistema vascular, C) Aumento de B, mostrando engrosamiento de las paredes de los vasos, D) Estructura de estomas.
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA Sreedhar et al., 2009.

Aireacin cultivo ETILENO HR Elasticidad Pared Celular Disponibilidad PGRs

Densidad del medio

Disponibilidad nutrientes

Estrs aireacin

Constituyentes Pared Celular Efecto sobre microtbulos

Actividad enzimtica Pared Celular

Produccin etileno Propiedades mecnicas Pared Celular

Orientacin microfibrillas Forma de la clula

Engrosamiento Pared Celular

Tamao de la clula

Funcionamiento Clula Guarda

Aernquima e hiperhidratacin

VITRIFICACIN
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Como prevenirla
Medio de cultivo: Incrementar la concentracin de agar Disminuir concentracin de citoquinina Tapado de recipientes: Permitir intercambio gaseoso Condiciones ambientales: Enfriamiento basal Incrementar la aireacin Otras medidas

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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HIPOLIGNIFICACIN
COMPUESTOS QUE CONTRARESTAN LA VITRIFICACIN

VA DE SNTESIS DE LIGNINA Y FLAVONOIDES REDUCIDA POR VITRIFICACIN

Phenylalanine

c. cinamico Phloroglucinol

c. coumrico P-coumarato:CoA ligasa P-coumaryl-CoA Phloridzin FLAVONOIDES LIGNINA

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

(Adaptado de George, 1993)

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Bioreactores
Requerimientos fisiolgicos de los tejidos vegetales pueden se incompatibles con el diseo y funcionamiento de bioreactores tradicionales. Amplia gama de diseos, en funcin del tejido a propagar, escala de produccin, etc. Basados en los mismos principios de agitacin, demanda y transferencia de O2, etc.
Curtis, 2005. Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Bioreactores para la propagacin de plantas:

De inmersin temporal: BIT RITA De inmersin permanente Nalgene Life reactor , Osmotek

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Bioreactor de Inmersin Temporal (BIT) Centro de Bioplantas, Cuba.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Micropropagacin de plantas

Bioreactor de Inmersin Temporal (BIT) Centro de Bioplantas, Cuba.

Sistema BIT
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Bioreactor de Inmersin Temporal (BIT)

Volumen de medio/explanto Tiempo de inmersin Frecuencia de inmersin

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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EJEMPLOS DE APLICACIN
Multiplicacin de Musa sp; sistema BIT

28 das

Coeficiente de multiplicacin se increment de 2 a 8 (promedio).

Escalona, 2005. Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Multiplicacin de Psidium guajava en BIT

Efecto del volumen de medio y frecuencia de inmersin.

El tiempo de inmersin fue de 3 min. en todos los tratamientos. Se utilizaron 20 explantos por recipiente, de 1,5 litros. Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA Npoles et al. 2009.

Micropropagacin de plantas

Reactor de Inmersin Temporal Automatico (RITA) CIRAD, Francia.

Sistema Vegetal Dpto. Biologa RITA FACULTAD DE AGRONOMA

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Reactor de Inmersin Temporal Automatico (RITA) CIRAD, Francia.

Sistema Vegetal Dpto. Biologa RITA FACULTAD DE AGRONOMA

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Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Las principales ventajas del sistema Rita

Disminucin del costo de mano de obra , debido a la facilidad de manipulacin de los explantes y del cambio de medio. Permite una mejor nutricin mineral. Un contacto estrecho entre la superficie de los explantes y el medio durante la fase de inmersin. Por capilaridad, una fina pelcula de medio se mantiene sobre los explantes. Fuerte disminucin de los problemas de asfixia o vitrificacin de los tejidos en comparacin con una inmersin permanente. Renovacin completa del aire dentro del recipiente durante cada inmersin. Mejor separacin de los tejidos o clulas bajo el efecto de las burbujas. Control de los procesos morfolgicos debido a la frecuencia y la duracin de inmersin. Proteccin de cada recipiente contra la contaminacin por los filtros. Manipulacin individual fcil. Abolicin de los riesgos de contaminacin cruzada.
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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EJEMPLOS DE APLICACIN Caf, tasa de multiplicacin en medio slido: 6-7 cada 3 meses. En RITA igual tasa en 5 semanas. Banana, 700 a 1000 embriones somticos por RITA. Eucalyptus grandis, tasa de multiplicacin 11,5 contra 3,5 en sistemas convencionales. Otros: papa, anan, Phalaenopsis, etc.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Multiplicacin de Musa sp; sistema RITA

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Regeneracin de frutilla transgnica por organogneis, sistema RITA.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Hanhineva, 2007.

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Embriognesis somtica de Hevea brasiliensis, sistema RITA.

Etienne, 1997.

Embriones/g de callo: En medio slido: 36 Sistema RITA: 255

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Bioreactores de inmersin permanente

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Bioreactores de inmersin permanente

Nalgene

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EJEMPLOS DE APLICACIN
Multiplicacin de Vaccinium corymbosum, BR de inmersin permanente.

La tasa de multiplicacin se increment de 4 a 28 (promedio).

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA Ross, 2006.

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Multiplicacin de Achyrocline flaccida, BR de inmersin permanente.

La tasa de multiplicacin se increment de 4 a 11 (promedio).

Ross, 2006.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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RESULTADOS

Explantos

Instalacin

30 das
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

60 das
Ross, 2006.

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BIOREACTOR
Tasa mult: 12/yema

MEDIO SLIDO
Tasa mult: 4/explanto

10 explantos

10 explantos 30 das 40 explantos

2 meses 30 das

480 microestacas

160 microestacas

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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RESULTADOS Cortes histolgicos

m m

Cortes transversales de tallo: (A) Sin phloroglucinol; (B) 40 mg.L-1 de phloroglucinol; m: mdula; x: xilema
Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA Ross, 2006.

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Enraizamiento

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Ross, 2006.

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Lifereactor , Osmotek
Recipiente descartable de polietileno preesterilizado, 1,5 o 5 litros. Sistema airlift. Accesorios para mantener esterilidad del sistema, purificacin y humidificacin del aire. Soporte.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

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Escalado

Panax ginseng

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Paek et al., 2005.

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Escalado

a) y b) Manzana c) Chrysantemum d) Ajo e) Vid f) Bulbos de Lilium

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA

Paek et al., 2005.

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Embriones somticos de Clematis sp.

Dpto. Biologa Vegetal FACULTAD DE AGRONOMA