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MANUAL DE
DIAGNOSTICO
BACTERIOLOGIC
O.
INTRODUCCIÓN.
su respectivo control de calidad. Además está elaborado de tal manera que sea
laboratorio en Bacteriología.
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CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL
Lavarse las manos correctamente, después de haber tenido contacto con cada
paciente y al concluir cualquier procedimiento.
Vigile que los elementos de trabajo estén en perfectas condiciones físicas. Algún
elemento en mal estado, podría causarle una herida.
ESTERILIZACIÓN
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
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MÉTODOS QUÍMICOS
Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. Estos
compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehído: Este método tiene la ventaja
de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Formaldehído: Las
pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gas-
plasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de esterilización a baja
temperatura la cual consta en la transmisión de peróxido de hidrógeno en fase
plasma.
MÉTODOS FÍSICOS
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Autoclave
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado
es el de Chamberland. Esteriliza a 121º C, 15Lb de presión, por 20 minutos.
Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por
niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas.
Estufas –Hornos
Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la
cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C
para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
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• Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada
procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno.
• Utilice en forma sistemática guantes plásticos o de látex en
procedimientos que con lleven manipulación de elementos biológicos
y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atención de
pacientes.
• Utilice un par de guantes por paciente.
• Absténgase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del cuerpo y
de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el
procedimiento.
• Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que
puedan generar salpicaduras góticas -aerosoles- de sangre u otros
líquidos corporales.
• Use batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se
esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros
líquidos orgánicos.
• Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de
su sitio de trabajo.
• Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones
de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.
• Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones
exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.
• Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios
expuestas al riesgo biológico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, deberán ser
muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y
cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en áreas de menor riesgo.
• Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia
necesarias.
• Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.
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• No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro.
• Absténgase de doblar o partir manualmente las hojas de bisturí, cuchillas,
agujas o cualquier otro material cortopunzante.
• Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de
bisturí.
• Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de
trabajo al final década procedimiento y al finalizar la jornada.
• En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros
líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro
material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o
cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la
superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después
limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma
concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado
de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.
• En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro
líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor,
nunca con las manos.
• Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material
irrompible y cierre hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de
rosca.
• Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes
seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias
para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes
herméticos de plásticos o acrílico que retengan fugas o derrames
accidentales. Además deben ser fácilmente lavables.
• En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe
lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.
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• Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no
autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal
necesarios y a los niños.
• La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material
orgánico debe ser enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.
• Disponga el material patógeno en bolsas resistentes de color rojo que lo
identifique con símbolo de riesgo biológico.
• En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el
reporte inmediato de accidente de trabajo.
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GENERALIDADES
A. OBJETIVO GENERAL
Conocer las técnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el
área de bacteriología dentro de un Laboratorio Clínico.
B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el área de
bacteriología.
de medios de cultivo.
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I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y
ENVIÓ DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS CLÍNICOS.
6. Los tubos, láminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las
muestras, deberán ser identificados inmediatamente después de tomadas o
recibida la muestra con el número correlativo de Laboratorio, nombre o
iniciales del paciente.
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7. Previo al envío de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con
éste para notificar del envió y saber quien recibirá la muestra.
8. Toda muestra clínica que se envíe a otro laboratorio, debe ser transportada
en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar
roturas, derramamientos de la misma o extravío.
RECEPCIÓN DE LA MUESTRA:
Comprobar que las muestras están bien identificadas y que correspondan a la
lista adjunta.
1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodón o
toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solución bactericida. Si se
comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o
incineración
2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y
cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envío.
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ENVIÓ DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.
ALMACENAMIENTO Y ENVIÓ:
2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la vía más
rápida, máximo una semana, además cada envío de muestra debe
acompañarse con la ficha epidemiológica correspondiente.
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NORMAS DE BACTERIOLOGÍA.
Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada
antes de la administración de antibióticos.
ORINA.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción
suprapúbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes
condiciones:
a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital
con agua y jabón.
b) Colectar la primera orina de la mañana o tener como mínimo 2 horas de
retención urinaria.
SECRECIÓN URETRAL.
Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción
luego exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos
estériles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martín o Agar
chocolate). Si la secreción es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y
raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para
coloración de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar
colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair. Si no se puede
sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de
transporte.
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SECRECIÓN VAGINAL.
Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el
especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se
recomienda sea tomada por el médico. El hisopo debe estar estéril e
impregnado con solución salina fisiológica al 0.85% estéril. Hacer de inmediato
un frotis para coloración de Gram y hacer un examen directo al fresco,
colocando una gota de solución salina en un porta objetos y suspender en ella
la secreción vaginal; cubrir con el cubre objetos y buscar Trichomonas
vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato
colocar el hisopo en 0.5 mL de solución salina, en refrigeración no más de 2
horas. En la coloración de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay
predominio de bacilos gram negativos.
HECES
La muestra debe tomarse en los tres primeros días de la enfermedad y antes de
comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el
hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solución
salina estéril ), dos o tres cms. en el ano imprimiéndole movimientos de
rotación amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del
recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del
hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con
sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es sólida y de 3 a 4 mL. si es
diarreica.
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SECRECIÓN FARINGEA.
La muestra debe tomarse de amígdalas y faringe, colocar al enfermo en
posición cómoda y buscando la mejor iluminación, pedir al paciente que
pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el
hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amígdalas y
luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede
impregnado de exudado faríngeo, evite tocar con el hisopo lengua y úvula.
Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de
tripticasa soya, infusión cerebro corazón, o sembrar de inmediato en agar
sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por
Gram para investigar difteria.
EXPECTORACIÓN.
Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con
solución de bicarbonato de sodio o con solución salina estéril.
Tomar la primera expectoración de la mañana (este esputo debe ser purulento
no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapón de rosca y estéril, debe
taparse bien e identificarse correctamente. Enviarlo al Laboratorio
inmediatamente.
SECRECIÓN NASAL.
Introducir el hisopo con solución salina estéril profundamente en dirección
paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada
fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular
de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.
SECRECIÓN OCULAR.
La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que
inmovilice la cabeza del paciente. Previa separación del párpado inferior con el
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pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secreción conjuntival dirigida
hacia el ángulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno
para úlcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey,
tioglicolato y también un tubo de sabouraud. En este caso es recomendable que
el oftalmólogo, con anestesia local tome la muestra con careta. Siempre hacer
examen directo.
SECRECIÓN OTICA.
Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y
teñirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.
PUS DE HERIDAS.
En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el
absceso es abierto tomar con un hisopo o bisturí de las paredes internas y no
del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de
tioglicolato.
LESIONES DE LA PIEL.
Lavar con agua, jabón y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las
costras y la piel que cubre las pústulas o vesículas, frotar firmemente con
hisopo o bisturí dentro de la lesión. Si la lesión es seca usar hisopo húmedo y
colocarlo en caldo tioglicolato.
SANGRE.
Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabón y agua después
aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa
colectar 5 a 10 mL. y colocar en medio de cultivo líquido en volumen 10 veces
mayor.
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LÍQUIDOS CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS
LÍQUIDOS DE DERRAME.
1. PUS.
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con
yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar
con bisturí el pus del borde de las lesiones.
Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el
pus es abundante colocarlo en un tubo estéril con tapón de rosca.
2. SECRECIONES.
Lavado bronquial, líquidos de derrame, LCR, médula ósea y biopsia. Serán
colectadas por el médico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estéril
con tapón de rosca u otro recipiente estéril sin preservativo.
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Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible,
guardarlas en refrigeración no más de 24 horas.
EXAMEN DIRECTO.
3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.
Colocar una gota de secreción en un porta objeto y cubrir con laminilla-
examinar al microscopio. Es recomendable hacer simultáneamente un frotis
de la secreción y colorearla por Gram.
4. PUS Y MEDULA
Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.
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7. BIOPSIA
Macerar el tejido con 1 mL. de solución salina en un mortero o con un
homogenizador estéril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer
preparación al fresco.
8. SANGRE
Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15
minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa
de leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por
Giemsa.
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pulmones y que lo expulse violentamente con un esfuerzo de tos hasta
obtener no menos de tres esputos.
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CONTROL DE CALIDAD.
2. RECONSTITUCIÓN O REHIDRATACIÓN.
El grado de disolución del medio deshidratado, así como la eficacia del medio
de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado
en la rehidratación.
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Debe emplearse siempre agua recién destilada o completamente
desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a
la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad
indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se
mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea y luego, se
agrega el resto del agua asegurándose que cualquier partícula de medio
adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso.
Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este
propósito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potenciómetro
debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de éste y para medios
que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH.
3. ESTERILIZACIÓN.
El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario)
debe someterse al proceso de esterilización, excepto aquellos que no lo
requieran (agar SS, por ejemplo).
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Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para
asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que
la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.
De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben
tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.
5. PRUEBA DE ESTERILIDAD.
Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y
someterla a control de esterilidad a 35°C por 24 horas. Este procedimiento dará
una idea sobre la contaminación obtenida en la preparación del medio.
Esto a su vez permitirá determinar si se deben tomar medidas más rigurosas en
la limpieza y desinfectación del sitio en que se preparan los medios de cultivo y
en el procedimiento de distribución del medio.
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El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios. Sin
embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a
temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.
Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar
algunos de sus componentes. Para evitar la desecación los medios pueden
guardarse en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas
de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.
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PRACTICA No.1
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.
PRACTICA No.1
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.
COMPETENCIA.
Preparar adecuadamente, medios de cultivos líquidos y sólidos, a partir de medios
deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes.
MATERIAL.
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• Olla de presiona
• Mecheros
PROCEDIMIENTO.
MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO
1. se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se
observan las especificaciones en el frasco.
2. el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la
superficie de la balanza.
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PRACTICA No. 2
OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO
OBJETIVOS
1- Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y
Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.
2- Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los
resultados que obtenga en esos medios.
3- Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo cultivo
puro.
PARTE I.
MATERIAL POR LADO DE MESA.
- Una suspensión de heces 1:1000
- Una placa de Agar de tripticasa soya
- Una placa de Agar Mac Conkey
- Una placa de Agar sangre.
PROCEDIMIENTO
Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la
suspensión de heces utilizando el método de estrías para extenderlo.
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Incubar todas las placas a 36ºC +/- 1ºC, hasta la siguiente practica de
laboratorio.
PARTE II
MATERIAL:
- Colorante para Gram y dos placas de agar tripticasa soya.
PROCEDIMIENTO
1- Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de
agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que
hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.
3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por
bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya,
incubarla a 36ºC hasta el próximo laboratorio. Hacer lo mismo con una
colonia Gramnegativa.
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PARTE III
PROCEDIMIENTO
1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer
frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo
cultivos puros.
2- Discusión
a) Método de estrías (fundamento y objetivo)
b) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación,
composición (sustratos, nutrientes e inhibidores)
c) Descripción de colonias.
d) Análisis de los resultados.
Frotis Bacteriano.
1. Se observa Morfología
2. Se observa tinción ( Gram, Acido resistencia).
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PRACTICA No. 3
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)
PROPOSITOS
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibióticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del
paciente.
Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base
científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento.
Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y
difusión en agar. La técnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y
fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas de
susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los
agentes antimicrobianos más apropiados para el tratamiento de las
enfermedades infecciosas.
OBJETIVOS
1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los
antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBY
BAUER).
2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas
recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.
3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la forma
de evitarlas.
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Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran
concentraciones de antibióticos superiores a las que pueden obtenerse en la
sangre por medio de un régimen usual de dosificación.
Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto
debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana
resistente.
PROCEDIMENTO
Por medio de la técnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones.
Es una técnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de
Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inoculo, humedad,
temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para
que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es
muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el
antibiograma a las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento
rápido:
1. Staphylococcus aureus
2. Enterobacterias
3. Pseudomonas
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2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas (de 2 a
8°C) por no más de 7 días.
Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no
pierdan su potencial:
PROCEDIMIENTO:
1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual
morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.
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4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Mac
farland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo o
solución salina estéril.
9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con
candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp)
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.
1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas
ya con crecimiento.
2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con una
regla por detrás de la caja petrí.
3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual
no debe tomarse en cuenta.
4. Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en
milímetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.
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INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE
INHIBICIÓN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
Agente Contenido del Resistente Intermedio Moderadamente Susceptible
antimicrobiano disco (meg) susceptible
Amikacina 30 14 15-16 14-17 17
Amoxicilina- 20/10 13 14-16 18
ácido
clavulánico
Ampicilina 10 13 12-14 17
Ampicilina- 10/10 11 16-21 15
sulbactan
Aztreonam 30 15 15-17 22
Cefamandol 30 14 15-17 18
Cefazolina 30 14 13-15 18
Cefmetazol 30 12 15-17 16
Cefonicida 30 14 16-20 18
Cefoperazina 75 15 15-22 21
Cefotaxima 30 14 13-15 23
Cefotetan 30 12 15-17 16
Cefoxitina 30 14 15-17 18
Ceftazidima 30 14 15-19 18
Ceftizoxima 30 14 14-20 20
Ceftriaxona 30 13 15-22 21
Cefuroxima 30 14 15-17 23
(oral)
Cefuroxima
30 14 15-17 18
(parenteral)
Cefalotina 30 14 15-17 18
Cloranfenicol 30 12 13-17 18
Ciprofloxacina 5 15 16-20 21
Gentamicina 10 12 13-14 15
Imipenem 10 13 14-15 16
Kanamicina 30 13 14-17 18
Mezlocilina 75 17 18-20 21
Netilmicina 30 12 13-14 15
Piperacilina 100 17 18-20 21
Tetraciclina 30 14 15-18 19
Ticarcilina 75 14 15-19 20
(Continuación)
Agente Contenido Resistente Intermedio Moderadamente Susceptible
antimicrobiano del disco susceptible
(mcg)
Ticarcilina-ácido 75/10 14 15-19 20
clavulánico
Tobramicina 10 12 13-14 15
Trimetoprim- 1.25/23.75 10 11-15 16
sulfametoxazol
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Reportar sólo
en Urocultivo
Carbenicilina 100 19 20-22 23
Cinoxacina 100 14 15-18 19
Nitrofurantoína 300 14 15-16 17
Norfloxacina 10 12 13-16 17
Ofloxacina 5 12 13-15 16
Sulfisoxazol 250 ó 300 12 13-16 17
Trimetroprim 5 10 11-15 16
Continuación
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Nitrofurantoína
300mcg 14 15-16 17
Norfloxacina
10mcg 12 13-16 17
Sulfisoxazol 250 ó
12 13-16 17
300mcg
Trimetroprim
5mcg 10 11-15 16
DISCUSION
1- Características del medio de cultivo.
2- Principio del método de difusión.
3- Elaboración del reporte.
4- Antibiótico. Quimioterapéutico.
5- Otros controles: inóculo, discos, siembra e incubación.
PRACTICA No. 4
COPROCULTIVO
PROPÓSITO:
Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es
decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
OBJETIVOS
1- Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la
muestra de heces.
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2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias
entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.
3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las
bacterias que aisle e intérprete los resultados obtenidos.
4- Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales
Enterobacterias patógenas.
5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las
tablas de referencia para la identificación de Enterobacteriaceae.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
Heces frescas (la mejor muestra)
Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
Material obtenido por proctoscopia.
Biopsia de mucosa intestinal.
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3
horas de ser emitidas.
El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible
obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se
encuentran dentro de la mucosa.
Cuando las heces, que se encuentran a 37°C dentro del intestino, son
colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20°C),
el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente
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Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por
esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada,
debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios
bruscos de pH.
Para éste propósito colocar con hisopo estéril una porción de las heces (con
sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de
transporte:
Glicerol – Salino bufferado, (especialmente para Shigella).
Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).
Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para
efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen
inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y
diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se
produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de
sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfídrico.
38
Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con
moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.
2. Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfría.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
39
sulfhídrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña
verde azulado (lactosa-negativo).
2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa
en aguja bien recta, flameada y fría, toque la superficie de la colonia
seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flameé la
boca del tubo, luego pínche el medio en el centro y hasta el fondo a manera
de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del
tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con
la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estríe la superficie del
medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al
medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de
movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo
metilo y el Voges Proskauer.
40
COPROCULTIVOS
Incubar 8 horas
Heces frescas o Hisopo rectal
Subcultivar Mac Conkey
Inocular Mac Conkey, SS y
(placas standard)
Selenito
Incubar 18 – 24 horas a 36ºC
Crecimiento colonias lactosa
Lactosa Incubar de 18 a 24 horas a 36ºC
(-)
41
(-)
Incubar TSI-Movilidad - Urea
Reportar NBP (adultos)
Según crecimientos y
numero de Colonias
Identificar y hacer
antibiogramas en niños.
Urea Urea
(+) K/A (-)
Tipeo Serológico
(Antisueros: B.C.D.A.AD.
PRACTICA No.5
CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO
CHOLERAE O1
En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de éste resultado.
MATERIALES:
Hisopos estériles
42
Tubos de vidrio 15 x 100 mm
Tubos de vidrio 16 x 100 mm
Asa redonda
MEDIOS:
Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vómito.
Agua pectonada alcalina (APA)
Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).
MUESTRAS:
Heces líquidas
Hisopo rectal
Vómito
PROCEDIMIENTO:
1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo
otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35°C por
18 a 24 horas.
LECTURA:
43
Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y
Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en
y la prueba de oxidasa.
HIKOJIMA.
TCBS
Agar Mac Conkey Agua Peptona
44
Identificar Salmonella
o Shigella
Si No crecimiento
No se aísla
Vibrio cholerae
TSI
TSA
A/A ó K/A
Gas (-)
H-S(-) Si
Reporte
No TSA
NEGATIVO POSITIVO
POSITIVO NEGATIVO
V. cholerae V. cholerae
Serogrupo 01 No Serogrupo 01
DISCUSION
1. Definir coprocultivo. Casos especiales (niños menores de 5 años e
inmunodeprimidos)
2. Muestras clínicas: ¿Cómo se toman? ¿Cuándo se indican? Cuidados en el
manejo. Procesamiento.
3. Medios de cultivo: consistencia, composición, aplicación e importancia.
4. Reporte preliminar. Importancia, indicación, como se hace, como se reporta.
5. Análisis del resultado del cultivo.
45
6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubación e interpretación.
7. Antibiograma. Importancia. Antibióticos recomendados por la Organización
mundial de la salud.
8. Uso de tablas para identificación bacteriana. Reporte.
PRACTICA No. 6
UROCULTIVO
PROPÓSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se
efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias.
46
En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se
contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para
interpretar el crecimiento es cuantitativo.
De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de bacterias mayor o
igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina)
se considera infección verdadera, es decir es un recuento significativo. A
diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la
infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento
rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las
Enterobacterias (bacilos Gramnegativos).
La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aísla de
urocultivos positivos, luego tenemos:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).
OBJETIVOS
47
1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre
dicho procedimiento.
2. Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de orina
proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte
preliminar.
3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa
calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados.
4. Identificar los posibles microorganismos patógenos. Interprete los
resultados.
RECOMENDACIONES GENERALES.
48
En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la
muestra, ya que sus genitales están expuestos, por lo tanto hay una abundante
colonización de bacterias. Proceder de la siguiente manera:
a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos índices y medio de la mano derecha
izquierda debe separarse los labios genitales mayores.
b) Con una gasa empapada con jabón antiséptico no irritante, limpiar bien toda
el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada con agua estéril.
c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina
unos segundos y luego la tomar de la porción central de la micción. Tapar
rápidamente.
d) Sembrar antes de una hora ó refrigerar la muestra.
MATERIALES
Placas de agar sangre.
Placas de Mac Conkey
Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traerá el alumno)
Asa calibrada de 0.001ml
49
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del Asa calibrada.
Los medios de cultivo a utilizar son:
a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayoría de microorganismos
b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios
(Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que
tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear
la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina,
justamente por debajo de la superficie.
3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de
la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el
medio de Mac Conkey.
INTERPRETACIÓN:
50
1. Después de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados
de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.
UROCULTIVOS
Sembrar con Asa
calibrada de 0.001 mL
Agar sangre (carnero)
Agar Mac Conkey
Incubar 18 a 24 horas
Crecimiento No Crecimiento
51
Reporte
Recuentos mayores Recuentos menores Recuento de
de 50,000 de un solo de 50,000 de un solo más de un tipo
tipo de bacterias tipo de bacterias de bacterias
Recuento y
Reporte
cultivo negativo
Identificar bacteria
sensibilidad Identificar bacteria Crecimiento
mixto. Pedir
nueva muestra
Reporte Reporte
Recuento Recuento y
Bacteriano nombre de
Sensibilidad bacteria
DISCUSION
1- Muestra de orina. Obtención. Cantidad y procesamiento.
2- Detección de bacterias por la coloración de Gram en orina no centrifugada.
Aplicación
3- Utilidad de usar agar sangre y agar Mac Conkey.
4- Cultivo. Inóculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de cultivo.
5- Uso del factor y reporte.
52
PRACTICA No. 7
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE
DERRAME.
PROPÓSITO:
Demostrar por medio de la tinción de Gram y el cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras que normalmente deben ser líquidos estériles ya
53
que son tomadas por el médico que las solicita en condiciones quirurgicas
estériles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patógeno. Las bacterias
de mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:
GRAMNEGATIVOS.
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)
Haemophilus influenzae (Meningitis en niños de 6 meses a 4 años de edad)
Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)
Pseudomonas aeruginosa
GRAMPOSITIVOS:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Staphyloccus aureus
Streptococcus sp
Streptococcus pyogenes.
OBJETIVOS
1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquideo, interpretar y hacer
su reporte.
2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros
líquidos de derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas.
3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados.
4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis.
5. Procesar otros líquidos de derrame.
MUESTRA:
54
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Líquido cefalorraquídeo
Líquido ventricular
Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)
Líquido pleural
Líquido pericardico
Líquido sinovial
Médula ósea.
PROCEDIMIENTO:
1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del
cual desee examen completo).
55
5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el
agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela
encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el sabouraud que se
incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patógenos
especialmente (Cryptococcus neoformans).
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista
que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes
con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo
cuidado. Observar las siguientes morfologías:
56
4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloración sólida, no pleomorficos, bacilos
alargados: morfología compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E.
Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa).
INFORME:
Agar sangre
Agar chocolate
Caldo, Tripticasa soya
Gram
Incubar 18 a 24 horas
57
Crecimiento No crecimiento
Reincubar 24 horas
más
Gram
Identificar bacteria
Sensibilidad Crecimiento No crecimiento
Reporte Reporte
Reporte
DISCUSIÓN
1- Muestra. Cantidad y procesamiento.
2- Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clínico.
3- Diagnostico preliminar.
4- Medios de cultivo.
5- Aislamiento e identificación bacteriana.
6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7- Reporte definitivo.
58
PRACTICA Nº. 8
HEMOCULTIVO
PROPÓSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las
bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema
retículo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se
59
diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el
torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana.
OBJETIVOS
1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e inocularlas
en los medios de cultivo apropiados.
2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento
bacteriano de un hemocultivo positivo.
3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de muestras
de sangre en el laboratorio, así como también los procedimientos efectuados
para la identificación bacteriana.
4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los
hay.
MUESTRA:
Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: Aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales,
escalofríos, postración y presión baja. Además la recuperación de las bacterias
de la sangre depende de los siguientes factores.
60
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:
PROCEDIMIENTO:
1. Incubar los hemocultivos por siete días, excepto en casos especiales en los
cuales debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de
Brucella spp.
2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los
frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles
que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de
bacteria que esta creciendo:
61
Signos Visible Posible Bacteria
Bacilos Gramnegativos aerobios
Turbidez Staphylococcus spp.
Bacteroides spp.
Estreptococcus spp.
Staphylococcus spp
Hemólisis Listeria spp
Clostridium spp.
Bacillus spp.
Bacilos Gramnegativos aerobios
Formación De Gas
Anaerobios
Colonias Visibles Como “Motas Staphylococcus spp.
de Algodón” Streptococcus
Pseudomonas spp.
Formación De Película Bacillus spp.
Levaduras
Pseudomonas aeruginosa
Coloración Verdosa (Raro)
62
no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos
gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey;
incubar aeróbicamente. Esto es especialmente importante para el
aislamiento o identificación de Salmonella typhi.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
typhi.
63
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:
Salmonella typhi
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Bacillus sp
Corynebacterium sp.
INFORME:
DE INCUBACIÓN A 36°C.
64
especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLÓ
____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.
penicilina.
Se aisló:__________________________________
Susceptible a:______________________________
Intermedio a:_______________________________
Resistente a: _______________________________
HEMOCULTIVOS
Muestra N° 1
Muestra N° 2
5 mL de sangre
45 mL de medio
Incubar 24 horas
Sub-cultivo en agar
chocolate y hacer
coloración de Gram
65
Subcultivo y Subcultivo y
Gram positivo Gram negativo
Incubar
Observar diariamente
Identificar bacteria
Sensibilidad
Reporte
Bacteria 7° día hacer Subcultivo en
Sensibilidad agar chocolate y
Gram
Cultivo negativo al
6° día de incubación
DISCUSION
1- Obtención de la muestra
2- Medios de cultivo utilizados e incubación
3- Elaboración del reporte preliminar
4- Resultado Final
5- Resultado del antibiograma
66
PRACTICA N0.9
IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS
Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tiñen con dificultad por el alto
contenido de grasa en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse
coloraciones con fenol y calor. Una vez teñidas con fucsina carbólica, no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les
llama “BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTES”.
67
asocian con enfermedad , en nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis
es la especie más importante
PROPOSITO.
Demostrar por medio de coloración y cultivos especiales la presencia de
bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, especialmente
Mycobacterium tuberculosis.
OBJETIVOS
1-Conocer las técnicas de laboratorio útiles para la identificación de M.
tuberculosis.
2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificación presuntiva de M.
tuberculosis.
MUESTRAS.
1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para
la investigación de tuberculosis.
El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al
despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días
alternos.
El primer esputo de la mañana es la más adecuada para el análisis, pues
es más concentrada y menos contaminada.
Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con
agua corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.
El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos
métodos:
68
b) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%,
sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,
generalmente diluido.
c) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para
extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable
para niños pequeños a los cuales no se les pude pedir una muestra
adecuada.
d) Broncoscopía: Puede ser usada para obtener las muestras
directamente del sitio infectado.
2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de
micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para
demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha
tragado.
3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la PRIMERA
ORINA DE LA MAÑANA colectar a “medio chorro” en un recipiente estéril de
boca ancha.
4. Otro tipo de Muestra:
Lavado bronquial
Fragmentos de pulmón
Hisopado faríngeo
Líquido cefalorraquídeo
Líquido pleural
Líquido articular
Pus
Raspado endometrial (sangre menstrual)
Médula ósea
69
Líquido pericardico
Trozos de tejido de biopsias.
PROCEDIMIENTO:
El diagnóstico de Micobacterias se basa en la observación de los bacilos
alcohol-ácido resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos
alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o
Kinyoun. Ambas técnicas dan buen resultado.
COLORACIÓN DE KINYOUN:
Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder así:
1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor.
necesario calentar.
rojo.
70
3- Decolorar con alcohol-ácido por 2 minutos.
4- Lavar con agua de chorro.
5- Cubrir el frotis con azúl de metileno por 1 minuto.
6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.
INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA:
Número de Bacilos Reporte
Alcohol-Ácido Resistente
0 No se observan bacilos Alcohol-Ácido Resistente
1 a 2 en todo el frotis Informar el número de BAAR encontrados y
DISCUSION
1- Medios de cultivo utilizados en la identificación de Mycobacterias.
2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.
71
3- Reporte preliminar.
4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clínica.
PRACTICA No. 10
CULTIVO DE GARGANTA.
72
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
microbiota normal.
OBJETIVOS
correspondiente.
3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus
compañeros.
MUESTRA:
73
Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los
Inflamación (Enrojecimiento)
Úlceras blanquecinas.
Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no
retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos
cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser
aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja.
El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para
alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.
2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin
necesidad de hacer sub-cultivos proceder así: Con pinza flameada y fría,
colocar en la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero
(primera estría), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 –10 mm de
distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus
pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico
neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de éste disco.
74
INTERPRETACIÓN.
Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados
faríngeos, tomar en cuenta lo siguiente:
REPORTE
Inhibición por Bacitracina Reportar
+ (Si produce halo) Se aisló Streptococcus pyogenes beta
hemolítico del grupo “A” de
Lancefield
75
PRACTICA No.11
SECRECIONES GENITALES
PROPÓSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que
infectan los órganos genitales femeninos y masculinos, tales como:
OBJETIVOS
76
1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la coloración de
Gram.
2. Elaborar el reporte preliminar.
3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha
bacteriológica correspondiente para la identificación del microorganismo
causante de la infección.
4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
5. Elaborar el reporte final.
LA TOMA DE LA MUESTRA
HOMBRES:
1. Tener listo: hisopos estériles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar
Thayer –Martin.
2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción.
3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo
rodar el palillo sobre la lámina, no frotar
4. Simultáneamente inocular los medios sólidos (agares)
MUJERES:
1. En las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo. Tener listo el
mismo material que en el caso de los hombres.
2. Hacer el mismo procedimiento.
PROCEDIMIENTO:
1. Colorear los frotis con coloración para Gram.
2. Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inoculo sobre la
superficie de las placas.
3. Incubar el agar sangre y el de Thayer –Martín durante 24 a 48 horas a 36°C
en jarro húmedo con candela encendida.
77
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y
Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de
los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)
DISCUSION
1- Toma de muestra.
2- Diagnostico preliminar.
3- Medio de cultivo. Composición. Incubación.
4- Interpretación del cultivo
5- Pruebas bioquímicas utilizadas.
6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7- Reporte final.
78
SECRECIONES
Agar Sangre
Agar Chocolate
Agar Mac Conkey
Tioglicolato
Gram
Incubar de 18 a 24 horas
Crecimiento
No crecimiento
Reincubar 24 horas más
79
Reporte Cultivo negativo a
Bacteria aislada las 48Gram
horas de
Sensibilidad Identificar bacteria
incubación
Sensibilidad
Reporte nombre de
bacteria y sensibilidad
BIBLIOGRAFÍA
80
Hospital Nacional de Niños Benjamín Bloom. “Manual de Técnicas de
Microbiología” Pág. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.
Anexos
81
Anexo 1
Coloraciones
COLORACIÓN DE GRAM.
1. Hacer un frotis.
2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto.
4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua
5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto.
6. Lavar con agua de chorro.
7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos.
8. Lavar con agua de chorro.
9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.
10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con
objetivo 100x.
INTERPRETACION
Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.
Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.
82
TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE.
(Ziehl- Neelsen).
Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias
que por su alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con dificultad
por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten el
colorante aún cuando se les lave con una mezcla de alcohol- ácido clorhídrico.
Esta tinción es importante para distinguir, entre otras las bacterias ácido
resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen
varias técnicas para este tipo de tinción, sin embargo nos referimos a la de
Ziehl- Neelsen.
REACTIVOS:
1. CARBOLFUCSINA:
Fucsina básica...................................... 0.3 g
Etanol 95°C........................................... 10.0mL
Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL
Agua destilada....................................... 95.0mL
2. ALCOHOL- ÁCIDO:
Etanol 95°C.............................................97.0mL
Ácido clorhídrico concentrado................ 3.0mL
Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura
ambiente.
3. AZUL DE METILENO:
83
Azul de metileno.................................... 0.3 g
Agua destilada....................................... 100.0mL
Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitación. Almacene en
frascos ámbar a temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.
4. Decolore con alcohol- ácido durante 2 minutos o hasta que queden sólo
trazas de color rosado.
RESULTADO:
Bacterias alcohol- ácido resistentes: rojas.
Bacterias alcohol- ácido sensibles: azules.
84
CONTROL DE CALIDAD:
Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol ácido resistentes
(Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- ácido sensibles (Staphylococcus sp.)
4. Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.
INTERPRETACIÓN.
85
En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades
invasivas.
REPORTE.
Contar 100 células y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de
PMN.
Si están escasas las células reportar: solo el número de células
encontradas sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.
Si no se observan células, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.
86
Anexo 2.
Otras pruebas bacteriologicas
PRUEBA DE LA COAGULASA.
87
La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a
la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo
la prueba en lámina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en
tubo. La prueba en lámina es presuntiva y a todos los cultivos que den la
prueba débil o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas
cepas de S. aureus sólo producen la coagulasa libre.
MEDIOS Y REACTIVOS.
1. Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estéril, no
nitratada.
2. Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite
en un balón aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca
de aforo.
3. Medio de cultivo: Cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse
para que crezca el microorganismo a probar.
PRUEBA EN LAMINA.
1. Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio.
2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido
en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsión homogénea en la
gota de solución salina.
3. Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.
4. Observe si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de
coágulos blancos.
PRUEBA EN TUBO.
1. Agregue asépticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estéril 12 x 75 mm.
88
2. Añada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusión de cerebro y corazón o
una asada de un cultivo crecido en un medio sólido.
3. Incube el tubo en un baño María a 35°C.
LECTURA E INTERPRETACIÓN
1. PRUEBA EN LAMINA:
PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un
período de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece
precipitado, monte la prueba en tubo.
CONTROL DE CALIDAD:
a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35°C.
b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de Cloruro de calcio
al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1
minuto.
89
c. Control positivo: S. aureus.
d. Control negativo: S. epidermidis.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
90
7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formación del
coágulo se evidencia hasta las 24 horas de incubación.
PRUEBA DE LA CATALASA.
CATALASA
H202 2H2O+O
91
REACTIVO
Peróxido de hidrógeno al 3%: Se prepara con peróxido de hidrógeno y agua
destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se
descompone fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color
ámbar. Además justo cuando se va a usar debe revisarse que dé bien con los
controles de calidad.
1. PRUEBA EN LAMINA.
a) Con una aguja bacteriológica o un aplicador estéril, pique el centro de una
colonia bien aislada y transfiera el inóculo a un portaobjeto limpio.
b) Añada 1 o 2 gotas de peróxido al 3%.
c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade
el reactivo.
d) Descarte la lámina en un recipiente con desinfectante.
CONTROL DE CALIDAD.
a) Control positivo: Staphylococcus sp.
b) Control negativo: Streptococcus sp.
PRECAUCIONES.
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de
platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de
nihcrome no interfiere.
92
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos
pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se debe
evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En
caso que ocurran, inunde de inmediato el área afectada con alcohol al 70%
para neutralizar la acción. NO DEBE USAR AGUA.
PRUEBA DE OXIDASA.
93
Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias Gram
negativas y en la diferenciación de cocos Gram positivos de importancia clínica:
Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S.
Sciuri).
REACTIVOS.
I. PARA GRAM NEGATIVOS.
1. REACTIVO DE KOVAC
Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g
Agua destilada................................................................... 10 mL.
Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro
aspecto, descártelo. Es más estable que el reactivo de Kovac pero MENOS
SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.
94
1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER:
Tetrametil – p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g
Dimetilsulfóxido.................................................................10 mL.
PROCEDIMIENTO
I. PARA GRAM NEGATIVOS
A. TIRAS DE PAPEL
A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino
o palillo de madera estériles y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro
impregnada con el reactivo para oxidasa
LECTURA E INTERPRETACIÓN:
95
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un período de
hasta 30 minutos.
c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un período de
hasta 2 minutos.
CONTROL DE CALIDAD:
a) Control positivo para:
Gram negativos: Aeromonas hydrophila.
Pseudomonas aeruginosa.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:
96
1. La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para
oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia
orgánica, ya que ésta contribuye a oxidar el reactivo.
97
Anexo 3.
PROCEDIMIENTOS BACTERIOLÓGICOS
PARA LA INOCULACIÓN O INTERPRETACIÓN DE LAS
PRUEBAS BIOQUÍMICAS.
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B- Producción de gas.
Positivo:
Burbujas dentro del medio
Rompimiento del medio
Desplazamiento del medio hacia arriba.
Negativo:
No se produce lo anteriormente descrito en el medio.
C- Producción de H2S
Positivo:
Todo el fondo del tubo se observa negro, ó se produce un precipitado
escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel).
Negativo:
No se observa ningún precipitado negro.
99
Se inocula el medio sólido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia
aislada, se estría únicamente el bisel.
Incubar por 24-48 horas a 35- 36°C, en algunos casos puede requerirse una
incubación de 4 días.
INTERPRETACIÓN.
Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter
freundii).
3. PRUEBA DE LA UREASA:
Inocular el medio de urea (caldo o sólido) a partir de una colonia pura, el
más utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estría únicamente en el
bisel.
Incubar a 35°C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 días si es necesario.
INTERPRETACIÓN.
Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis).
Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Colí ATCC 25922).
4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD.
Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de
18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriológica e introduciéndola en
el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35°C por 24-
48 horas y el otro se mantiene durante el mismo período de tiempo a
temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad
únicamente a temperatura ambiente.
INTERPRETACIÓN
100
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se observan los tubos inoculados
comparándolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es móvil.
CONTROL DE CALIDAD:
a) Control de esterilidad: 24 horas a 35°C.
b) Control positivo: Escherichia colí y Pseudomonas sp.
c) Control negativo: Klebsiella sp.
5. PRUEBA DE INDOL.
Inocular el microorganismo en un caldo o medio semisólido que contenga
triptófano.
Incubar a 36°C por 24 horas.
Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente.
INTERPRETACIÓN
Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio.
Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo
Control positivo: E. Colí ATCC 225922.
Control negativo: Enterobacter cloacae.
101
Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien
aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C.
INTERPRETACION
ROJO DE METILO (RM).
A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo
limpio.
Agregar a éste 5 gotas del indicador rojo de metilo.
Positivo:
El indicador permanece rojo.
Negativo:
El indicador cambia a un color amarillo.
VOGES-PROSKAUER (VP):
A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6
gotas del reactivo de alfa- naftol ( α - naftol) y luego 2 gotas de KOH al
40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos. Se
sugiere agitar de vez en cuando.
INTERPRETACION
Positivo: Color rojo o rosado en el medio.
102
TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.
ROJO
VOGES-
BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD DE
PROSKAUER
METILO
Proteus AóK A + 2-4+ +ó- + + + + -
vulgaris
Proteus K A + 4+ + ó (+) + - + + -/+
mirabilis
Morganella K A + - - -ó+ + + + -
morganii 1/2
Proteus K A -ó - + + + + + -
retgeri +w
Providencia K A + - + - + + + -
stuartii
Providencia K A - - + - + + + -
alkalifaciens
Edwarciella K A - + - - + + + -
torda
Yersinia A A - - - + - -A + -
pseudote-
berculosis
Yersinia A A - - - + +ó- -A + -
enterocolitica
Pseudomona K K - - + - - + - -
s aeroginosa
Pseudomona K K - - + - - + - -
flurorecens
Pseudomona K K - - - - - + - -
s multophilia
Pseudomona K K - - +ó- - - + - -
s cepacias
Pseudomonas K K - - + - - + - -
pseudomollei
103
Pseudomona K K - - + - - - - -
s mallei
Pseudomona K K - - - - - - - -
s stutzeri
Pseudomonas K K - + - - - + - -
putrefaciens
Alcaligenes K K - - +ó- - - +ó- - -
fecales
Alcaligenes K K - - + - - +ó- - -
odorans
Alcaligenes K K - - + - - + - -
Denitrificans
ROJO
VOGES-
BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD DE
PROSKAUER
METILO
Escherichia colí A ó K A +ó- - - - + -ó+ + -
Escherichia colí K A - - - - + - + -
–
Alcalescens
dispar
Shigella K A - - - - d - + -
dysenteriae
Shigella K A - -** - - d - + -
flexneri
Shigella boydii K A - -*** - - d - + -
Shigella sennei K A - - - - - - + -
Salmonella sp. K A d D - - - + + -
Salmonella K A - +w - - - + + -
Typha
Salmonella K A + - + + - + + -
paratyphi A
Salmonella d A + + - - - + - -
arizonae
Arizona sp. KóA A + 2-4+ + - - + + -
Citrobacter A A + - + d + + + -
intermedius
Citrobacter KóA A + 2-4+ + (+) - + + -
freundii
Klebsiella A A + - + + - - - +
pneumoniae
Klebsiella K A + - D d - - + -
ozonae
Klebsiella K A - - - - - - + -
rhinoschleronal
is
Enterobacter A A + - + + - + - +
cloacae
Enterobacter A A + - + - - + - +
aerogenes
Enterobacter K A + - +ó- - - + - -
hafnae
Enterobacter AóK A -ó+ - +ó- - ó +s -ó+ + -/+ +/-
agglomerans
104
NOMENCLATURA.
BIBLIOGRAFIA
105
Microbiologia Médica Jawetz, Brooks, Geo 1997, Manual Moderno, Mexico
15ª Edición.
106