Universidad Politcnica de Puebla

Microbiologa microbiana

Reporte de prcticas: Actividad enzimtica Amilasa Peroxidasa

Maestra: Veronica Miroslava Alumno: Ivn Galindo Santiago Ingeniera en biotecnologa B A 4~ cuatrimestre

ACTIVIDAD DE LAS AMILASAS INTRODUCCION

La amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del glucogeno y el almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La amilasa rompe uniones C1C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de diastasa. Sirve en el diagnstico de enfermedades determinando sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un dao a las clulas productoras de la enzima en el pncreas, o bien, por una deficiencia renal (excrecin reducida) o tambin por paperas. Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin (especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos. Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. En la maduracin de frutas la amilasa es sintetizada en la maduracin, degradando el almidn de las frutas en azcar, y volvindolas ms dulces Para medir la actividad enzimtica de la amilasa, se utilizar un test colorimtrico que detecta el almidn. Para ello se contar con una solucin de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene una explicacin fsica: el iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (en las regiones hidrofbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de I2/IK ya no dar una coloracin azul. OBJETIVO Determinar cualitativamente la actividad de la -amilasa saliva( ptialina) MATERIAL Vaso de pp de 250 Termometro Embudo Pipeta serologica de 5ml Papel filtro o gasa Parrilla Solucion de almidon al 0.2% 6 tubos de ensaye Solucion de lugol Solucion de fehling (a/b)

PROCEDIMIENTO

Disponer de una gradilla con 5 tubos de ensaye numerados.

Colocar en cada uno de ellos 2ml de la solucion de almidon al 0.2%.

Blanco. Tubo 1: aadir de 3-4 gotas de la solucin diluida de Lugol (1:2) anotar resultado.

Blanco: Tubo 2: aadir 1 ml de la solucin de fehling( 1ml de A y 1ml de B) calendar a 100 C y anotar resultados.

Agregar al tubo 3,4 y 5 una pequea cantidad de saliva(0.5ml), para ello tras enjuagar la boca se mastica la gasa para estimular salivacin.

Incubar el tubo 3 durante 15-20 min en un bao a 35-40 C transcurrido el tiempo se saca del bao y se deja enfriar.

Incubar el tubo 4 durante 15-20mn en un bao a 35-40 C transcurrido el tiempo se saca del bao y se deja enfriar.

Agregar al tubo 3 de 3-4 gotas de la solucin de lugol y observar.

Incubar el tubo 5 durante 30mn en un bao a 35-40 C transcurrido el tiempo se saca del bao y se deja enfriar.

A los tubos 4 y 5 se agregan de 4-5 gotas de la solucin de fehling poner a calendar, observar y anotar resultados

RESULTADO Tubo 1 2 3 4 5 Sol. lugol

Morado oscuro (casi negro)

Fehling(A/B)

Saliva

Sol. Lugol
15min

Fehling
15min 30min

Azul fuerte

Morado claro (violeta) Marron (caf claro) Marron obscuro

DISCUSION Las coloraciones obtenidas no son el resultado de la practica, si no que las coloraciones permiten determinar si hubo o no activacin de la enzima. Por lo que puedo decir que las dos pruebas fueron positivas y que con ambas soluciones hubo un vire de color en la muestra con respecto al blanco lo que es igual a la reaccin de la enzima, se debi tambin a las condiciones como: pH, temperatura.

En la imagen se observan las muestras con el vire(cambio de color) que indica la actividad enzimtica.

CUESTIONARIO 1.- Explica las caracteristicas de la enzima amilasa.

Clasificacin -Amilasa: (Nombre alternativos: 1,4--D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa) Las -amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en maltotriosa y

maltosa desde la amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.0.1 En fisiologa humana tanto la procedente de la saliva como la pancretica son -Amylasas. Puede encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias. pero esto es a temperatura ambiente

-Amilasa: (Nombres alternativos: 1,4--D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarognica) Otra forma de amilasa, la -amilasa es tambin sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Acta desde el extremo no reductor de la cadena, catalizando la hidrlisis del segundo enlace -1,4, rompiendo dos unidades de glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduracin de la fruta la -amilasa rompe el almidn en azcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la produccin de malta. Muchos microorganismos tambin producen amilasa para degradar el almidn extracelular. Los tejidos animales no contienen -amilasa, aunque puede estar presente en microorganismos saprfitos del tracto gastrointestinal. Tiene un pH ptimo de 12. -Amilasa: (Nombres alternativos: Glucano 1,4--glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4--glucosidasa; glucoamilasa; -glucosidasa lisosmica; 1,4--D-glucano glucohidrolasa) Adems de romper el ltimo enlace (1-4)glicosdico en el extremo no reductor de la cadena de amilosa y amilopectina, liberando glucosa, la -amilasa puede romper los enlaces glicosdicos (1-6). A diferencia de las otras amilasas esta forma es ms eficaz en medios cidos y su pH ptimo es de 3. Tambin colabora en el momento de la excitacin.
Amilasa saliva Origen: glandulas salivales Sustrato: almidon Function: hidroliza los enlaces 1,4 produciendo dextrinas limitantes matotriosa y maltose

2.- Describe el mecanismo de reaccin realizado por la enzima de acuerdo al sustrato utilizado en esta practica. Interviene una reaccin de hidrolisis. Las amilasas( por que existe mas de una isoforma) son enzimas hidrolasas, que catalizan la hidrolisis de ciertos polisacridos concretamente amino pectina, amilosa, glucgeno, y productos parcialmente hidrolizados. 3.- Explica porque se usaron solucion de fehling y de lugol y el resultado a obtener de cada uno de ellos ananalitos estndar. El reactivo de fehling se utilize para determinacin de azucares reductores, para demostrar presensia de glucosa o sus derivados. Reaciona tambien con los monosacaridos y se trona verdoso, y si lo hace con

disacaridos el color es ladrillo porque se utiliza con esta practica pues la composicion de la amilasa es un derivado de la glucosa(como glucano,etc) y ademas son monosacaridos o disacaridos, las amlasas. La solucion de lugol no reacciona con azucares simples como la glucosa o fructosa pero sirve para identificar polisacaridos como almidones, glucogenoy cietos dextrinos formando un complejo termolabil que se caracteriza por presentar distintos colores, la coloracion va de morado a violeta esta entre estas tonalidades. 4.- De acuerdo a los resultados obtenidos en la practica compara los resultados estndar y emite CONCLUSIONES. En esta reaccin, al no estar desnaturalizada la protena contenida en el extracto de malta, sta reacciona con el almidn y da lugar a una disolucin que no se tie con lugol. El almidn est disuelto en agua. Almidn + Extracto de malta hervido + Lugol ! Coloracin violeta En esta ocasin, el extracto de malta est desnaturalizado a causa de haberlo hervido, por lo que el almidn se tie con el lugol. El almidn tambin est disuelto en agua. Y en la solucin de fehlign el vire indicado es a rojo ladrillo. Por lo tanto los resultados obtenidos tras realizar esta practica son favorables ya que los cambios de coloracin coinciden en considerablemente con los estndares, a acepcin de la muestra con solucin de fehling que el color es como marrn (obscuro y claro)

ACCION ENZIMATICA DE LA PEROXIDASA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES INTRODUCCION La peroxidasa, es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno. Donante + H2O2 Donante oxidado + H2O

Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo. Es utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin de metabolitos como glucosa, cido rico, colesterol o triglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza en inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del sida o el herpesvirus. La peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y protectores de radiacin magntica, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. Los genes de las peroxidasas humanas expresan una cadena ligera y una cadena larga. La enzimas activas son un heterotetrmero de 2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas. Como cofactores necesitan un ion de calcio por cada heterodmero formado de una cadana ligera y una cadena larga, y un grupo hemo B (hierro-protoporfirina IX) unido covalentemente a travs de enlaces tipo ster a grupos metilo hidroxilados. Estos enlaces se forman autocatalticamente con el perxido de hidrgeno en las posiciones C-1 y C-5 del hemo.

OBJETIVOS -Estudiar el efecto de la enzima peroxidasa en tejidos animals y vegetales. -Medir la actividad mediante el desprendimiento de burbujas y mediacion de calor. -Inactivacion de la enzima por efecto d la temperatura MATERIALES Y REACTIVOS Tejido animal(higado, pollo, res) Tejido vegetal(espinaca, lechuga, papa) Tubo de ensaye de 10ml Pipeta de 5ml Parrilla de calentamiento Pinzas para tubo Vaso de pp 250ml

Termometro

Congelador

Agua oxigenada (50ml)

Gradilla

PROCEDIMIENTO

Fraccionar el tejido animal y vegetal(corte apro 2gr

Colocarlo una muestra en tubos separados

Agreagr a cada muestra 2ml de H2O2

Observe reaccion

Observe reaccion

Colocar en otro tubo una fraccion similar a la anterior de cada muestra, coloque en bano maria por 10 min agrege H2O2

Colocar la muestra como en las anteriores y enfrie por 10min, agregar H2O2

Observe reaccion

En una table anote resultados y explique

RESULTADOS Muestra Higado de pollo Espinaca Lechuga 1=mucha reaccion(burbujeo) 2=poco burbujeo 3=casi nada de burbujeo 4=mediano burbujeo El hecho de que se aya obsevado mas burbujeo en los tubos donde se hizo reaccionar a temperature ambiente es por que q esa teperatura la enzima actua mas favorablemente, a temperature alta se desnaturaliza se supone que no debia de haber habido reaccion pero la observacion fue que no se calento totalmente la muestray lo mismo paso en el caso de los tubos a temperaturas bajas si se supone que , la enzima se inactiva no deberia reaccionar, por ello la explicasion que supongo, es la misma no se logro enfriar la muestra por que no estaba en contacto directo con el congelador. Temp baja 4 2 2 Temp ambiente 1 1 1 Temp alta 2 3 4

Muestras de espinacas a temperatura baja, ambiente y alta.

muestras de lechuga a temperatura baja ambiente y alta.

muesstras de higado a temperatura baja Ambiente y alta.

CUESTIONARIO 1.- Explica las caracteristicas de la enzima peroxidasa.

Tipos de enzima peroxidasa humanos son los siguientes:

Eosinofil peroxidasa (EPX). Esta enzima se expresa en los grnulos citoplasmticos de los eosinfilos. La deficiencia de eosinofil peroxidasa (EPD) es un defecto autosomal recesivo en donde los eosinfilos anmalos estn caracterizados por hipersegmentacin nuclear, hipogranulacin y tincin negativa por peroxidasa y fosfolpidos. Lactoperoxidasa (LPO). Esta enzima es secretada al exterior y se expresa en las glndulas mamarias y salivales. Mieloperoxidasa (MPO). Esta enzima es parte del sistema de defensa de los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Es responsable de la actividad microbicida contra un amplio espectro de organismos. En los PMN estimulados, la MPO cataliza la produccin cidos hipohalogenosos, principalmente cido hipocloroso, y otros intermedios txicos que aumentan poderosamente la actividad microbicida. Cl- + H2O2 HOCL + H2O

La MPO se encuentra en los lisosomas y se conocen 3 isoformas (isoforma A, B y C). La deficiencia de mieloperoxidasa (MPD) es un defecto autosomal recesivo que produce candidiasis diseminada. Peroxidasa Vascular 1 (PXDN). Esta enzima es un homlogo de la peroxidasina de la drosophila. Se expresa en altos niveles en el corazn, pulmones, ovarios, bazo, intestinos y placenta, y en bajos niveles en el hgado, pncreas, riones, timo, msculos y prstata. Tambin se expresa en los tumores como el melanoma, cncer de mama, cncer de ovarios y glioblastoma. En todos los casos esta enzima es secretada por las clulas. Se conocen dos isoformas de esta enzima. Peroxidasa Vascular 2 (PXDNL). Esta enzima tambin es un homlo de la peroxidasina de la drosophila y tambin es secretada por sus clulas productoras. Se conocen 2 isoformas.

2.- Explica el mecanismo de la reaccion de esta enzima. Catalizan reacciones bisustrato de character redox, utilizando un peroxido como oxidante( a lo que deben su nombre) un segundo sustrato de caracteristicas reductoras que es oxidado por el peroxido. Practicamente todas las peroxidasas son hemoproteinas y tienen como sustrato comun el peroxido de hidrogeno, la gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro active el superior y el inferior dando lugar a una inibicion por exeso de sustrato ya que cuando ambas posisiones estan ocupadas por el peroxido de hidrogeno no es posible la union de otro sustrato.

3.- Como se explica el hecho de usar H2O2 para la determinacion de la actividad de la peroxidasa? Como mencionaba en la respuesta anterior, la peroxidasa persenta como grupo prosteico al grupo hemo, cuyo atomo central de hierro forma complejos con diferentes compuestos como los cianuros y la hidroxilomina, inibiendose su activiad enzimatica, y esto se da por el efecto de la reaccion de la enzima con el H2O2 ya que da lugar a la inibicion enzimatica por exeso de sustrato ya que cuando ambas proporciones estan ocupadas por el peroxido no es posible la union de otro sustrato. 4.- Al someter a tratamiento termico cada muestra. Que pasa a temperatura alta y a baja? Como la mayoria de las enzimas la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que presisa mayor temperatura y mas tiempo para su inactivacion posee ademas la propiedad peculiar de la regeneracion enzimatica esto consiste en que al inactivarla por medio de calor recupera parcialmente su

actividad despues de cierto tiempo. Por lo que al aumentar la temperatura sufre una desnaturalizacion, puede ser parcial o total y al disminuir la temperatura se inactiva la enzima y no reconoce sustrato.

5.- Cual perosidasa fue mas sencible al tratamiento termico de origen animal o vegetal? La animal Cual sera la posible explicacion? Se debe en principio al reactive que es H2O2 al pH y a la temperatura, pero en este caso la peroxidasa animal tuvo mas sencibilidad por que hubo mas reaccion o activacion e inactivacion observada ante los cambios de temperatura esto fue medido por el burbujeo. CONCLUSION Efectivamente pudo estudiarse el efecto de la enzima en ambos tejidos, la medicion de la reaccion con respect al burbujeo resulta complicado pues se deben realizar los experimentos al mismo tiempo para abservarlos con claridad, como se anoto en los resultados la inactivacion de la enzima no resulto apresiable pues se tuvieron deficiencias en el procedimiento. BIBLIOGRAFIA O REFERENCIA http://www.ferato.com/wiki/index.php/Amilasa http://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa http://www.quiminet.com/pr7/amilasas.htm http://cuidar-su-salud.blogspot.com/2009/10/la-amilasa.html http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte08/ 02.html