Biochimie Clinique

Biochimie clinique
Dans la mme collection r

l
Immunologie N. Genetet, coord., 3e dition, 1997
Hmatologie R. Fauchet, N. Ifrah, coord., 2e dition, 1995 Allergologie et immunologie clinique A.Sabbah, 1994 Virologie mdicale R. Crainic, J.-C. Nicolas, coord., 1993
Chez le mme diteur

Le technicien d'analyses biologiques : guide thorique et pratique J. Braud, coord., 2000 Le magnsium en biologie et en mdecine . Durlach, M. Bara, 2e dition, 2000 Aide-mmoire de biochimie et de biologie molculaire F. Widmer, R. Beffa, 2e dition, 2000 Les mitochondries : biologie et incidences physiopathologiques C. Delbart, 2000 L'assurance qualit dans les laboratoires agroalimentaires et pharmaceutiques M. Feinberg, coord., 1999
Collection Biologie mdic
Biochimie clinique
2e dition
COORDONNATEUR
Pierre Valdigui
professeur de biochimie mdicale l'universit Paul-Sabatier de Toulouse, facult de mdecine de Rangueil, mdecin biologiste des hpitaux de Toulouse, chef de service de biochimie hpital universitaire de Rangueil, mdecin rhumatologue
ditions Mdicales inter nationales

Alle de la Croix Bosse F-94234 Cachan cedex
COORDONNATEUR
Pierre Valdigui
professeur de biochimie mdicale l'universit Paul-Sabatier de Toulouse, facult de mdecine de Rangueil, mdecin biologiste des hpitaux de Toulouse, chef de service de biochimie, l'hpital universitaire de Rangueil, mdecin rhumatologue AUTEURS France de la Farge Docteur en pharmacie Marie-Laure Solera Docteur en pharmacie Michel Lagente Docteur en mdecine Jacques de Graeve Docteur en mdecine Matres de confrences l'universit Paul-Sabatier de Toulouse, facult de mdecine de Rangueil. Praticiens hospitaliers, biologistes des Hpitaux de Toulouse, hpital universitaire de Rangueil, service de biochimie. Thierry Levade Docteur en mdecine. Directeur de recherches Inserm. AVEC LA COLLABORATION DE Eve Duplantier Secrtaire mdicale Danile Dominguez Secrtaire mdicale
Introduction
Pierre Valdigui
La chimie des urines puis du sang et des humeurs a t pendant longtemps la seule discipline de la biologie mdicale . L'hmatologie, la microbiologie, l'immunologie se sont ensuite fortement dveloppes et se regroupent souvent maintenant au ct de la biochimie, dans le cadre moderne de la biologie molculaire. La biochimie clinique associe la chimie physiologique, la chimie smiologique et la biologie molculaire. Nous dcrirons seulement les deux premires dans cet ouvrage en les associant d'ailleurs dans chaque chapitre pour illustrer au mieux, aprs des rappels fondamentaux de physiologie, de physicochimie ou de biochimie mtabolique, les mthodes d'exploration utilises au laboratoire d'analyses mdicales et les variations observes chez l'individu malade. En effet la mdecine moderne s'appuie de plus en plus sur les examens paracliniques d'imagerie (radiographie et tomographie traditionnelles, tomodensitographie informatise ou scanner , chographie ultrasonore et imagerie par rsonance magntique) et de biologie multidisciplinaire. 1 Cet ouvrage doit donc tre considr comme un livre de smiologie mdi| cale, o de nombreux paramtres biologiques sont dcrits, pour tous lesquels le lecteur n'est pas ncessairement familiaris. Il peut toutefois servir aussi de complment d'approche clinique au lecteur issu d'autres formations que la mdecine ou la pharmacie.
Table des matires
Introduction...................................................................................................................
Chapitre 1
quilibre hydrolectrolytique
Rappels physiologiques et physicochimiques.......................................................... 1.1. Bilan de l'eau et des substances minrales..................................................... 1.1.1. Teneur des organismes en eau et sels minraux................................ 1.1.2. Besoins en eau et en sels................................................................... 1.1.3. Apports.............................................................................................. 1.1.4. tats de l'eau dans l'organisme......................................................... 1.1.5. Rles de l'eau.................................................................................... 1.1.6. limination de l'eau et des sels minraux......................................... 1.2. Units employes........................................................................................... 1.3. Rpartition de l'eau et des sels Grands compartiments liquidiens............ 1.3.1. Compartiment extracellulaire............................................................ 1.3.2. Compartiment intracellulaire............................................................. 1.4. changes d'eau et d'lectrolytes.................................................................... 1.4.1. Mcanisme des changes .................................................................. 1.4.2. Rgulation des changes................................................................... 2. Exploration de l'quilibre hydrominral.................................................................. 2.1. Mesures des volumes hydriques..................................................................... 2.1.1. Principes gnraux............................................................................ 2.1.2. Mthodes........................................................................................... 2.2. Mesures des lectrolytes................................................................................. 2.2.1. Osmolarit et osmolalit plasmatiques Cryoscopie ..................... 2.2.2. Dtermination spare des lectrolytes lonogramme Bilan lectrolytique........................................................................... 3. Applications pathologiques. Grands syndromes de perturbation de l'quilibre hydrominral............................................................................................................ 3.1. Hyperhydratation extracellulaire dmes................................................ 3.1.1. Mcanismes et physiopathologie ...................................................... 3.1.2. Principales tiologies......................................................................... 3.2. Syndromes de dshydratation......................................................................... 1.
1
1 1 1 2 2 3 3 3 5 5 6 7 8 8 9 11 11 11 11 13 13 13 16 16 16 17 18
Vffl____________________________________Biochimie clinique 3.2.1. Dshydratation extracellulaire........................................................... 3.2.2. Dshydratation intracellulaire........................................................... 4. Approche technologique Principales mthodes de dosage................................. 4.1. Cations plasmatiquessodium et potassium............................................... 4.1.1. Photomtrie de flamme..................................................................... 4.1.2. Potentiomtrielectrodes slectives............................................ 4.1.3. Techniques colorimtriques............................................................... 4.1.4. Techniques enzymatiques.................................................................. 4.1.5. Rpartition des mthodes de dosage en France................................. 4.2. Dosage de l'anion chlorure ............................................................................ 4.2.1. Mthodologies................................................................................... 4.2.2. Rpartition des techniques ................................................................ 4.3. Dosage de l'anion bicarbonate....................................................................... 4.3.1. Mthodes de dosage.......................................................................... 4.3.2. Rpartition des techniques ................................................................ 4.4. Dtermination de l'hmatocrite...................................................................... Rfrences bibliographiques........................................................................................... 18 20 21 21 21 23 25 25 25 25 25 27 27 27 28 29 30
Chapitre 2
quilibre acidobasique
Rappels physicochimiques....................................................................................... 1.1. pH................................................................................................................... 1.2. Systmes tampons et quation d'Henderson-HasselbaIch............................. 1.3. Formes de transport du CO^ sanguin ............................................................. 1.3.1. CO^ dissous....................................................................................... 1.3.2. CO^ l'tat de carbamate.................................................................. 1.3.3. CO, l'tat de carbonate acide (ou bicarbonate).............................. 2. Rgulation de l'quilibre acidobasique.................................................................... 2.1. Systmes tampons......................................................................................... 2.1.1. Systmes tampons plasmatiques....................................................... 2.1.2. Systmes tampons globulaires........................................................... 2.2. Rgulation physiologique du pH.................................................................... 2.2.1. Rgulation pulmonaire...................................................................... 2.2.2. Rgulation rnale............................................................................... 3. Exploration biochimique.......................................................................................... 3.1. Prlvement.................................................................................................... 3.2. Mesures de trois paramtres : pH, POy PCO^............................................... 3.2.1. Mesure du pH.................................................................................... 3.2.2. Mesure de la p0^............................................................................... 3.2.3. Mesure de la pCO^............................................................................ 3.3. Calcul des autres paramtres.......................................................................... 3.3.1. Concentration en bicarbonates.......................................................... 3.3.2. Bicarbonates standard ....................................................................... 3.3.3. Concentration en CO^ total............................................................... 3.3.4. Bases tampons................................................................................... 3.3.5. Excs de base .................................................................................... 3.3.6. Saturation en 0^................................................................................ 1.
31
31 31 32 33 33 34 34 34 34 35 36 37 37 39 41 41 42 42 44 46 48 48 48 48 48 49 49
Table des matires

3.4. Reprsentation graphique : diagramme de Davenport................................... 4. Dsquilibres acidobasiques .................................................................................... 4.1. Acidose mtabolique...................................................................................... 4.1.1. tiologies........................................................................................... 4.1.2. Compensation physiologique............................................................ 4.1.3. Tableau clinique ................................................................................ 4.1.4. Tableau biologique............................................................................ 4.1.5. Traitement......................................................................................... 4.2. Acidose respiratoire........................................................................................ 4.2.1. tiologies........................................................................................... 4.2.2. Compensation physiologique............................................................ 4.2.3. Tableau clinique ................................................................................ 4.2.4. Tableau biologique............................................................................ 4.2.5. Traitement......................................................................................... 4.3. Alcalose mtabolique..................................................................................... 4.3.1. tiologies........................................................................................... 4.3.2. Compensation physiologique............................................................ 4.3.3. Tableau clinique ................................................................................ 4.3.4. Tableau biologique............................................................................ 4.3.5. Traitement......................................................................................... 4.4. Alcalose respiratoire....................................................................................... i 4.4.1. tiologie............................................................................................ 4.4.2. Compensation physiologique............................................................ 4.4.3. Tableau clinique ................................................................................ 4.4.4. Tableau biologique............................................................................ 4.5. Syndromes mixtes......................................................................................... 5. Conclusion................................................................................................................ Rfrences bibliographiques...........................................................................................
IX*
49 50 51 51 52 53 53 53 54 54 54 55 55 55 56 56 56 57 57 57 57 57 58 58 58 58 59 59
Chapitre 3 Mtabolisme phosphocalcique

Mtabolisme du calcium et du phosphore................................................................ 1.1. Calcium.......................................................................................................... 1.1.1. Bilan des changes calciques : le cycle du calcium.......................... 1.1.2. Besoins calciques et apports alimentaires......................................... 1.1.3. Absorption intestinale ....................................................................... 1.1.4. Rpartition dans l'organisme............................................................. 1.1.5. limination........................................................................................ 1.2. Phosphore....................................................................................................... 1.2.1. Besoins en phosphates et apports alimentaires ................................. 1.2.2. Absorption......................................................................................... 1.2.3. Rpartition dans l'organisme............................................................. 1.2.4. limination........................................................................................ 2. Rgulation du mtabolisme phosphocalcique.......................................................... 2.1. Sites de rgulation.......................................................................................... 2.1.1. Tube digestif...................................................................................... 2.1.2. Os...................................................................................................... 1.
61
62 62 62 63 63 64 65 66 66 66 66 67 67 68 68 68
X___________________________________Biochimie clinique
2.1.3. Rein................................................................................................... Hormones permettant la rgulation................................................................ 2.2.1. Parathormone.................................................................................... 2.2.2. Calcitonine........................................................................................ 2.2.3. Vitamine D........................................................................................ 2.2.4. Autres hormones ............................................................................... 3. Exploration du mtabolisme phosphocalcique......................................................... 3.1. Exploration statique........................................................................................ 3.1.1. Calcium et phosphore sanguins......................................................... 3.1.2. Exploration de l'limination rnale du calcium................................ 3.1.3. Exploration de l'limination rnale des phosphates.......................... 3.1.4. Dosage du calcium ionis.................................................................. 3.1.5. Activit des phosphatases alcalines................................................... 3.1.6. Ostocalcine...................................................................................... 3.1.7. Propeptide C-terminal du procollagne I.......................................... 3.1.8. Hydroxyprolinurie (OHp)................................................................. 3.1.9. Tlopeptides C et N-terminaux......................................................... 3.1.10. Pyridinolines.................................................................................... 3.1.11. Dosage de la parathormone............................................................. 3.1.12. AMP cyclique nphrognique......................................................... 3.1.13. Dosage de la calcitonine.................................................................. 3.1.14. Dosages des mtabolites de la vitamine Dg .................................... 3.2. Exploration dynamique.................................................................................. 3.2.1. preuve la PTH exogne................................................................ 3.2.2. Test de PAK....................................................................................... 3.2.3. Hypercalciurie provoque................................................................. 4. Variations pathologiques.......................................................................................... 4.1. Variations de la calcmie................................................................................ 4.1.1. Hypercalcmies................................................................................. 4.1.2. Hypocalcmies.................................................................................. 4.2. Variation de la phosphormie......................................................................... 4.2.1. Hyperphosphormies......................................................................... 4.2.2. Hypophosphormies.......................................................................... 4.3. Perturbations mtaboliques de l'os ................................................................ 4.3.1. Ostomalacie ou hyperostodose..................................................... 4.3.2. Ostoporose ou hypo-ostoidose....................................................... 5. Mthodes de dosage................................................................................................. 5.1. Dosage de la calcmie.................................................................................... 5.1.1. Mthodes colorimtriques................................................................. 5.1.2. Mthodes physiques.......................................................................... 5.1.3. Mthodes potentiomtriques............................................................. 5.2. Dosage du calcium ionis............................................................................... 5.3. Dosage du calcium urinaire............................................................................ 5.4. Dosage des phosphates inorganiques sanguins et urinaires........................... 5.4.1. Rduction du phosphomolybdate...................................................... 5.4.2. Colorimtrie directe du phosphomolybdate...................................... 5.4.3. Colorimtrie du phosphovanadomolybdate....................................... 5.4.4. Mthodes enzymatiques.................................................................... 5.5. Rpartition des techniques de dosage en 1998............................................... Rfrences bibliographiques........................................................................................... 2.2. 72 73 73 74 75 79 79 79 79 79 80 81 82 82 82 82 83 83 83 84 84 84 84 85 85 85 86 86 86 88 89 89 90 91 91 92 94 94 94 94 95 95 96 96 96 96 96 96 97 98
Table des matires
XI
Chapitre 4
Mtabolisme du fer 99
1. Mtabolisme du fer .................................................................................................. 99 1.1. Rpartition dans l'organisme ......................................................................... 99 1.2. Cycle du fer.................................................................................................... 100 1.3. Besoins en fer................................................................................................. 101 1.4. Absorption du fer........................................................................................... 102 1.5. Transport du fer dans le plasma..................................................................... 102 1.6. Utilisation mtabolique. Fer actif................................................................... 103 1.7. Rserves en fer de l'organisme ...................................................................... 104 1.7.1. Ferritine............................................................................................. 104 1.7.2. Hmosidrine.................................................................................... 105 1.8. Rgulation du mtabolisme cellulaire du fer.................................................. 106 2. Exploration du mtabolisme du fer.......................................................................... 106 2.1. Dosage du fer srique : sidrmie.................................................................. 106 2.2. Capacit totale de fixation de la transferrine (CTF)....................................... 107 2.3. Capacit latente de fixation (CLF)................................................................ 107 2.4. Coefficient de saturation de la transferrine (CS)............................................ 107 2.5. Dosage de la transferrine................................................................................ 107 2.6. Dosage de la ferritine plasmatique : ferritinmie........................................... 108 2.6.1. Hypoferritinmie................................................:.............................. 108 2.6.2. Hyperferritinmie.............................................................................. 108 2.7. Dosage des rcepteurs solubles de la transferrine (RsTf).............................. 109 2.8. Les tudes ferrocintiques.............................................................................. 109 ^ 3. Variations pathologiques.......................................................................................... 109 3.1. Carences martiales.......................................................................................... 110 3.1.1. tiologies........................................................................................... 110 3.1.2. Biologie............................................................................................. 110 3.1.3. Cas particulier des anmies inflammatoires ................................. 111 3.2. Surcharges en fer............................................................................................ 112 3.2.1. Hmochromatose gntique.............................................................. 112 3.2.2. Surcharges secondaires en fer........................................................... 114 4. Techniques de dosage............................................................................................... 115 4.1. Fer plasmatique (ou srique).......................................................................... 115 4.2. Transferrine.................................................................................................... 116 4.3. Ferritine plasmatique...................................................................................... 116 Rfrences bibliographiques........................................................................................... 117 Chapitre 5
Mtabolisme du magnsium, du cuivre et du lithium Sous-chapitre 1 : Magnsium...............................................................................

1. Notions physiologiques et biochimiques fondamentales......................................... 1.1. Rpartition......................................................................................................
119 119
119 119
XII__________________________________Biochimie clinique 1.2. Origine du magnsium................................................................................... 1.3. Mtabolisme et action biochimique ............................................................... 2. Exploration............................................................................................................... 2.1. Mthodes de dosages...................................................................................... 2.2. Valeurs usuelles.............................................................................................. 3. Variations pathologiques.......................................................................................... 3.1. Hypermagnsimies....................................................................................... 3.2. Hypomagnsimies........................................................................................ 3.2.1. Spasmophilie..................................................................................... 3.2.2. Autres origines .................................................................................. 3.3. Variations urinaires......................................................................................... 120 120 121 121 121 121 121 122 122 123 123
Sous-chapitre 2 ; Cuivre.........................................................................................
Mtabolisme............................................................................................................. 1.1. Besoins........................................................................................................... 1.2. Apports, absorption........................................................................................ 1.3. Transport sanguin........................................................................................... 1.4. Rpartition dans l'organisme......................................................................... 1.5. limination..................................................................................................... 1.6. Rle mtabolique............................................................................................ 2. Exploration............................................................................................................... 2.1. Prlvement et techniques.............................................................................. 2.2. Valeurs usuelles.............................................................................................. 3. Variations pathologiques.......................................................................................... 1.
124
124 124 124 125 125 125 126 126 126 126 127
Sous-chapitre 3 : Lithium......................................................................................
1. Mtabolisme............................................................................................................. 2. Exploration............................................................................................................... Rfrences bibliographiques...........................................................................................
128
128 129 131
Chapitre 6
Mtabolisme des glucides

1.
133
Notions physiologiques et biochimiques fondamentales......................................... 133 1.1. Glycmie........................................................................................................ 133 1.1.1. Origine du glucose sanguin............................................................... 133 1.1.2. Facteurs de rgulation de la glycmie............................................... 136 1.2. Mtabolisme et action biochimique de l'insuline .......................................... 138 1.2.1. Mtabolisme...................................................................................... 138 1.2.2. Action biochimique ....................>...................................................... 140 2. Exploration de la glycorgulation............................................................................ 142 2.1. Glycosurie...................................................................................................... 142 2.1.1. Dpistage........................................................................................... 142 2.1.2. Mcanisme........................................................................................ 143 2.2. Glycmie........................................................................................................ 143 2.2.1. Mthodes de dosage.......................................................................... 144
Table des matires
Xffl
2.2.2. Valeurs usuelles................................................................................. 145 preuves dynamiques et dosages complmentaires....................................... 146 2.3.1. preuves d'hyperglycmie provoque.............................................. 146 2.3.2. Hyperglycmies provoques sensibilises ........................................ 148 2.3.3. preuves d'hypoglycmie................................................................. 148 2.3.4. Dosages et preuves complmentaires.............................................. 148 2.3.5. Autres examens................................................................................. 150 3. Variations pathologiques.......................................................................................... 153 3.1. Hypoglycmies............................................................................................... 153 3.2. Hyperglycmies.............................................................................................. 153 3.2.1. Dfinition.......................................................................................... 153 3.2.2. Physiopathologie............................................................................... 154 3.2.3. Classification..................................................................................... 154 4. Annexes.................................................................................................................... 157 Rfrences bibliographiques........................................................................................... 159 2.3.
Chapitre 7
Mtabolisme des lipides et des lipoprotines 161

1. Structure des lipoprotines....................................................................................... 161 1.1. Classification des lipoprotines...................................................................... 162 1.2. Classification des apolipoprotines................................................................ 163 2. Mtabolisme des lipoprotines................................................................................. 164 2.1. Apports lipidiques endognes........................................................................ 164 2.2. Apports lipidiques exognes .......................................................................... 165 2.3. Mtabolisme des lipoprotines riches en triglycrides.................................. 165 2.3.1. Origines des chylomicrons et des VLDL.......................................... 165 2.3.2. Devenir des chylomicrons et VLDL.................................................. 165 2.4. Devenir des LDL............................................................................................ 166 2.5. Mtabolisme des HDL ................................................................................... 167 2.6. Lipoparticules................................................................................................. 169 2.7. Rgulation hormonale.................................................................................... 169 3. Bilan lipidique.......................................................................................................... 170 3.1. Bilan lipidique systmatique.......................................................................... 170 3.2. Bilan lipidique orient.................................................................................... 170 3.3. Paramtres lipidiques..................................................................................... 171 3.3.1. Aspect du srum................................................................................ 171 3.3.2. Dosage des triglycrides.................................................................... 171 3.3.3. Dosage du cholestrol....................................................................... 172 3.3.4. Dosage des phospholipides ............................................................... 173 3.3.5. Dosage des acides gras libres............................................................ 174 3.3.6. Dosage du cholestrol HDL.............................................................. 174 3.3.7. valuation du cholestrol des LDL................................................... 174 3.3.8. Dosage des apoprotines AI et B ...................................................... 175 3.3.9. Dosage de la lipoparticule AI............................................................ 175 3.3.10. Dosage de la Lp (a)......................................................................... 176 3.3.11. lectrophorse des lipoprotines..................................................... 176 4. Principales dyslipoprotinmies............................................................................... 177
XIV__________________________________Biochimie 4.1.
clinique 177 178 178 179 179 181 181 182 183 183 183 185 186 186
Hyperlipoprotinmies familiales.................................................................. 4.1.1. Hypercholestrolmies essentielles................................................... 4.1.2. Hyperlipmies mixtes........................................................................ 4.1.3. Hypertriglycridmies familiales...................................................... 4.1.4. Autres hyperlipoprotinmies familiales........................................... 4.2. Dyslipoprotinmies secondaires................................................................... 4.2.1. Pathologies mtaboliques et hyperlipoprotinmies secondaires ..... 4.2.2. Pathologies hormonales..................................................................... 4.2.3. Hyperlipoprotinmies iatrognes..................................................... 4.3. Notions thrapeutiques................................................................................... 4.3.1. Traitement dittique......................................................................... 4.3.2. Traitements mdicamenteux.............................................................. 5. Conclusion................................................................................................................ Rfrences bibliographiques........................................................................................... Chapitre 8
Gnralits sur le mtabolisme azot

1. Besoins et apports protiques................................................................................... 1.1. Besoins quantitatifs........................................................................................ 1.2. Besoins qualitatifs.......................................................................................... 1.2.1. Aminoacides indispensables............................................................. 1.2.2. Vitamines........................................................................................... Digestion et absorption intestinale........................................................................... 2.1. Digestion des protines alimentaires.............................................................. 2.2. Absorption intestinale des acides amins....................................................... Utilisation mtabolique............................................................................................ 3.1. Biosynthses protiques................................................................................. 3.2. Noglucognse............................................................................................. Catabolisme et limination azote........................................................................... 4.1. Excrtion azote............................................................................................. 4.2. Origine de l'limination azote sous forme urique ...................................... 4.2.1. Thorie de l'usure et de la dgradation............................................. 4.2.2. Thorie du mtabolisme azot permanent......................................... 4.3. Catabolisme du radical amin des aminoacides............................................. 4.3.1. Dsamination des acides amins....................................................... 4.3.2. Urognse hpatique ....................................................................... Rgulation hormonale.............................................................................................. 5.1. Facteurs anabolisants...................................................................................... 5.1.1. Facteurs hormonaux.......................................................................... 5.1.2. Facteurs de croissance et cytokines................................................... 5.2. Facteurs catabolisants..................................................................................... 5.2.1. Glucocorticodes................................................................................ 5.2.2. Hormones thyrodiennes ...................................................................
187
187 187 188 188 188 189 189 189 190 190 191 191 191 191 192 192 194 194 194 195 195 195 196 196 196 196
2.
3.
4.
5.
Table des matires
__
XV
Chapitre 9 Protines plasmatiques

1. Principales protines plasmatiques.......................................................................... 1.1. Srum-albumine............................................................................................. 1.2. Glycoprotines............................................................................................... 1.2.1. Protines de transport........................................................................ 1.2.2. Antiprotases..................................................................................... 1.2.3. Immunoglobulines............................................................................. 1.2.4. Microglobulines................................................................................. 1.3. Marqueurs d'une pathologie cellulaire........................................................... 1.3.1. Protines de l'inflammation.............................................................. 1.3.2. Marqueurs tumoraux......................................................................... 1.3.3. Marqueurs non enzymatiques de la souffrance myocardique........... 2. Exploration............................................................................................................... 2.1. Dosages protiques......................................................................................... 2.1.1. Protidmie totale ............................................................................... 2.1.2. Dosage de protines particulires...................................................... 2.2. lectrophorse des protines plasmatiques.................................................... 2.2.1. Protinogramme................................................................................ 2.2.2. Immunolectrophorse et immunofixadon....................................... 2.3. tude de la protinurie................................................................................... Variations pathologiques.......................................................................................... 3.1. Hypoprotinmies.......................................................................................... 3.1.1. Hypoalbuminmies............................................................................ 3.1.2. Hypogammaglobulinmies................................................................ 3.2. Hyperprotinmies hyperglobulinmies.................................................... 3.2.1. Hyperglobulinmies diffuses et polyclonales.................................... 3.2.2. Dysglobulinmies monoclonales....................................................... Aperu technologique sur les immunodosages........................................................ p. 4.1. tude directe des effets de la raction antigne-anticorps............................. 4.1.1. Mthodes de prcipitation................................................................. 4.1.2. Mthodes d'agglutination.................................................................. 4.2. tude de la raction antigne-anticorps grce au signal mis par un ractif marqu............................................................................................................ 4.2.1. Dosages en phase htrogne. Mesure de la distribution du ractif marqu.............................................................................................. 4.2.2. Dosages en phase homogne. Mesure par modulation de l'activit du ractif marqu............................................................................... 4.2.3. Techniques de localisation microscopique........................................ 4.3. Observation d'un effet biologique de la raction immunitaire....................... Rfrences bibliographiques...........................................................................................
197
197 197 198 198 199 200 203 203 203 206 210 214 214 214 215 217 217 218 219 222 222 222 223 224 224 225 227 227 227 228 229 229 232 233 233 234
Chapitre 10
Enzymes plasmatiques
1. Classification des enzymes plasmatiques................................................................. 1.1. Enzymes spcifiquement plasmatiques..........................................................
235
236 237
XVI
______
_______________________Biochimie clinique 237 237 237 238 238 238 238 238 239 239 241 242 243 243 243 245 246 247 247 247 248 249 250 250 250 251 251 252 252 253 253 253 253 253 254 254 255 255 256 256 256 256 257 257 257 257 257 258
1.1.1. Cruloplasmine................................................................................ 1.1.2. Lipoprotine lipase............................................................................ 1.1.3. Enzymes de la coagulation et de la fibrinolyse................................. 1.2. Les enzymes non spcifiquement plasmatiques............................................. 1.2.1. Enzymes d'excrtion......................................................................... 1.2.2. Enzymes cellulaires........................................................................... 2. Problmes rencontrs en enzymologie clinique....................................................... 2.1. Spcificit d'organe........................................................................................ 2.2. Expression des rsultats ................................................................................. 2.2.1. Unit internationale........................................................................... 2.2.2. Principe gnral de la mesure d'une activit..................................... 2.2.3. Standardisation des mthodes de mesure d'activit enzymatique..... 3. Principales enzymes d'intrt clinique..................................................................... 3.1. Phosphatases................................................................................................... 3.1.1. Phosphatases alcalines....................................................................... 3.1.2. Isoenzymes des phosphatases alcalines............................................. 3.1.3. 5' nuclotidase................................................................................... 3.1.4. Phosphatases acides........................................................................... 3.2. Transaminases................................................................................................ 3.2.1. Transaminase glutamo oxaloactique ou L-aspartate : 2 oxoglutarate aminotransfrase...................................................................... 3.2.2. Transaminase glutamo-pyruvique ou alanine amino-transfrase...... 3.2.3. Variations pathologiques des transaminases ..................................... 3.3. Lactate dshydrognase.................................................................................. 3.3.1. Rle................................................................................................... 3.3.2. Variations pathologiques................................................................... 3.3.3. Dtermination de l'activit enzymatique de la lactate dshydrognase........................................................................................... 3.4. Isoenzymes des LDH ..................................................................................... 3.4.1. tude lectrophortique globale........................................................ 3.4.2. a-hydroxybutyrate dshydrognase.................................................. 3.5. Cratine kinase............................................................................................... 3.5.1. Rle................................................................................................... 3.5.2. Valeurs usuelles................................................................................. 3.5.3. Variations pathologiques................................................................... 3.5.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la cratine kinase......... 3.6. Isoenzymes de la CK...................................................................................... 3.6.1. CK^..........................................................-....-.................---3.7. Isoformes de la CK......................................................................................... 3.8. Macro-CK........................................................................................................ 3.9. Amylase.......................................................................................................... 3.9.1. Rle................................................................................................... 3.9.2. Valeurs usuelles................................................................................. 3.9.3. Variations pathologiques................................................................... 3.9.4. Dtermination de l'activit enzymatique de l'amylase..................... 3.10. Lipase........................................................................................................... 3.10.1. Rle................................................................................................. 3.10.2. Valeurs usuelles............................................................................... 3.10.3. Variations pathologiques................................................................. 3.10.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la lipase .....................
Table des matires___________________________________XVII 'y-glutamyl transfrase.................................................................................. 3.11.1. Rle................................................................................................. L 3.11.2. Valeurs usuelles............................................................................... P1' 3.}}.3. Variations pathologiques................................................................. 3.11.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la -y-glutamyl transfrase............................................................................................... 3.12. Aldolase........................................................................................................ 3.12.1. Rle................................................................................................. 3.12.2. Valeurs usuelles............................................................................... 3.12.3. Variations pathologiques................................................................. 3.12.4. Dtermination de l'activit enzymatique de l'aldolase................... 4. Synthse clinique ..................................................................................................... 4.1. Intrt des enzymes et des autres marqueurs en cardiologie.......................... 4.2. Intrt des enzymes en hpatologie................................................................ 4.2.1. Cytolyse............................................................................................. 4.2.2. Rtention biliaire............................................................................... 4.3. Enzymes musculaires..................................................................................... Rfrences bibliographiques...........................................................................................
1
3.11.
258 258 258 258 259 259 259 260 260 260 260 260 262 262 264 265 266
Chapitre 11
Constituants azots non protiques

1. Ure.......................................................................................................................... 1.1. Rappels physiologiques.................................................................................. ' 1.2. Mthodes d'exploration.................................................................................. 1.2.1. Dtermination de l'ure sanguine et urinaire...........................:........ 1.2.2. Interprtation du taux de l'ure sanguine et urinaire......................... 1.3. Variations pathologiques................................................................................ 1.3.1. Azotmies rnales ............................................................................. 1.3.2. Azotmies d'autres origines.............................................................. 1.3.3. Diagnostic tiologique d'une hyperazotmie chronique................... 1.4. Dosages de l'ure plasmatique et urinaire...................................................... 1.4.1. Mthode l'hypobromite.................................................................. 1.4.2. Mthode la diactylmonoxime.............................................'.......... 1.4.3. Mthodes enzymatiques.................................................................... 1.5. Rpartition des techniques. Contrle de qualit national............................... 2. Cratinine................................................................................................................. 2.1. Rappels physiologiques.................................................................................. 2.1.1. Origine mtabolique.......................................................................... 2.1.2. Comportement de la cratinine au niveau du nphron...................... 2.2. Mthodes d'exploration.................................................................................. 2.2.1. Dterminations de la cratinine sanguine et urinaire........................ 2.2.2. Clairance............................................................................................ 2.3. Signification des variations pathologiques..................................................... 2.3.1. Valeur diagnostique dans le cadre du syndrome biologique de rtention azote................................................................................. 2.3.2. Valeur pronostique et surveillance de la thrapeutique..................... 2.4. Mthodes de dosage....................................................................................... 2.4.1. Raction de Jaff. Coloration picrique..............................................
267
267 268 269 269 269 270 270 271 271 272 272 272 272 273 273 274 274 274 275 275 275 276 277 277 277 277
XVin_________________________________Biochimie clinique 2.4.2. Mthodes enzymatiques.................................................................... Contrle de qualit national........................................................................... 2.5.1. Techniques cintiques directes.......................................................... 2.5.2. Techniques enzymatiques.................................................................. 3. Ammoniac................................................................................................................ 3.1. Origines biochimiques et destines................................................................ 3.2. Exploration..................................................................................................... 3.2.1. Prlvement sanguin ......................................................................... 3.2.2. Valeurs physiologiques de l'ammonimie......................................... 3.2.3. Ammoniurie...................................................................................... 3.3. Variations pathologiques de l'ammonimie................................................... 3.3.1. Chez le nouveau-n........................................................................... 3.3.2. Chez l'adulte..................................................................................... 3.4. Mthodes de dosage....................................................................................... 3.4.1. Dtermination colorimtrique........................................................... 3.4.2. Dosage enzymatique ......................................................................... 4. Bilirubine.................................................................................................................. 4.1. Rappels biochimiques .................................................................................... 4.1.1. Transfert hpatique............................................................................ 4.1.2. Mtabolisme hpatique ..................................................................... 4.1.3. Sort intestinal..................................................................................... 4.2. Exploration..................................................................................................... 4.3. Variations pathologiques................................................................................ 4.3.1. Ictres bilirubine libre, non conjugue ou indirecte....................... 4.3.2. Ictres bilirubine directe. Ictres par rtention............................... 4.3.3. Ictres bilirubine mixte................................................................... 4.4. Mqthodes de dosage....................................................................................... 5. Acide urique............................................................................................................. 5.1. Rappels biochimiques et physiologiques ....................................................... 5.1.1. Origines endogne et exogne de l'acide urique............................... 5.1.2. tat de l'acide urique......................................................................... 5.1.3. limination........................................................................................ 5.2. Exploration..................................................................................................... 5.2.1. L'uricmie......................................................................................... 5.2.2. L'uricurie ou uraturie..........................................................;.............. 5.2.3. Clairance............................................................................................ 5.3. Applications pathologiques Hyperuricmies ............................................ 5.3.1. tiologies des hyperuricmies........................................................... 5.3.2. Manifestations cliniques.................................................................... 5.4. Mthodes de dosage....................................................................................... Rfrences bibliographiques........................................................................................... 2.5. Chapitre 12 277 279 279 279 279 279 280 280 280 280 280 280 281 282 282 282 282 283 283 283 283 284 284 285 286 286 287 288 288 288 289 290 290 290 291 291 291 291 291 292 293
Exploration fonctionnelle hpatique

1. Rappel des grandes fonctions hpatiques................................................................. 1.1. Fonction excrtrice......................................................................................... 1.1.1. Fonction biliaire ................................................................................ 1.1.2. Fonction d'puration plasmatique.....................................................
295
295 295 295 296
Table des matires____________________________________XIX 1.1.3. Fonction de dtoxication et de conjugaison...................................... 1.2. Fonctions mtaboliques. Recherche de l'insuffisance cellulaire.................... 1.2.1. Mtabolisme glucidique.................................................................... 1.2.2. Mtabolisme protique...................................................................... 1.3. Recherche d'une cytolyse............................................................................... 1.4. Tests divers..................................................................................................... 2. Choix des tests hpatiques indispensables............................................................... 2.1. Dosage de la bilirubine srique...................................................................... 2.2. Dtermination de l'activit des transaminases............................................... 2.3. Mesure de l'activit de la -y-GT ..................................................................... 2.4. Dtermination de l'activit des phosphatases alcalines ................................. 2.5. lectrophorse des protines sriques............................................................ 2.6. Autres analyses............................................................................................... 3. Quelques applications cliniques............................................................................... 3.1. Crise de foie ............................................................................................. 3.2. Ictre............................................................................................................... 3.3. Gros foie......................................................................................................... 3.4. Ascite.............................................................................................................. 3.5. lvation isole de la -v-glutamyl-transfrase ............................................... f rfrences bibliographiques........................................................................................... 296 296 296 296 297 297 297 297 298 298 298 298 299 299 299 300 300 302 302 302
Chapitre 13 Exploration fonctionnelle rnale
303
303 303 303 303 304 304 305 306 307 307 307 309 309 309 310 310 310 310 310 311 311 311 311 312 312
1. Introduction.............................................................................................................. 1.1. Examen des urines au cabinet du mdecin............................................':........ 1.1.1. Examen macroscopique..................................................................... 1.1.2. Examen par les bandelettes............................................................... 1.2. Examens biochimiques de routine.................................................................. 1.2.1. Urines................................................................................................ 1.2.2. Sang, plasma, srum.......................................................................... Notions de clairance................................................................................................. Exploration fonctionnelle du glomrule................................................................... 3.1. Mesure de la filtration glomrulaire............................................................... 3.1.1. Clairance de l'inuline........................................................................ 3.1.2. Clairance de la cratinine endogne.................................................. 3.1.3. Cystatine C plasmatique.................................................................... 4. Mesure du flux plasmatique rnal............................................................................ 5. Exploration fonctionnelle du tubule.......................................................................... 5.1. La fonction de scrtion tubulaire.................................................................. 5.1.1. tude de la (i^-microglobuline.......................................................... 5.2. Fonction de rabsorption tubulaire................................................................. 5.2.1. Clairance de l'ure ............................................................................ 5.2.2. Cas de la rabsorption du glucose..................................................... 5.3. Fonction de concentration-Dilution............................................................. 5.3.1. Pouvoir de dilution, preuve de charge hydrique.............................. 5.3.2. Pouvoir de concentration, restriction hydrique ................................. 5.3.3. Eau libre............................................................................................ 5.3.4. Clairance osmolaire...........................................................................
XX__________________________________Biochimie clinique 5.3.5. Clairance de l'eau libre ..................................................................... Physiopathologie des variations de la diurse.......................................................... 6.1. Pouvoir de concentration................................................................................ 6.2. Pouvoir de dilution......................................................................................... 7. Lithiases................................................................................................................... 7.1. Lithiase calcique............................................................................................. 7.2. Lithiase de phosphates ammoniaco-magnsiens............................................ 7.3. Lithiase urique................................................................................................ 7.4. Lithiase cystinique.......................................................................................... 8. Exploration du systme rnine angiotensine au cours de l'hypertension artrielle... 8.1. Mthodologie................................................................................................. 8.1.1. Activit rnine plasmatique (ARP)................................................... 8.1.2. Aldostrone sanguine et urinaire....................................................... 8.2. Intrt clinique................................................................................................ 8.2.1. Hyperaldostronisme primaire.......................................................... 8.2.2. Stnose de l'artre rnale.................................................................. Conclusion....................................................................................................................... Rfrences bibliographiques........................................................................................... 6. Chapitre 14 312 312 313 313 313 313 314 314 314 314 315 315 315 315 315 315 315 316
lments d'organisation du laboratoire

1. Introduction.............................................................................................................. 2. Prlvement.............................................................................................................. 2.1. Paramtres lis au sujet.................................................................................. 2.2. Paramtres lis au constituant dos................................................................ 2.3. Paramtres lis au spcimen........................................................................... 3. Traitement du prlvement....................................................................................... 4. RsultatInterprtation......................................................................................... 4.1. Erreurs analytiques......................................................................................... 4.1.1. Erreurs alatoires............................................................................... 4.1.2. Erreurs systmatiques........................................................................ 4.2. Mode d'expression des rsultats .................................................................... 5. Assurance de qualit ................................................................................................ 6. GBEA, certification, accrditation........................................................................... 6.1. Guide de bonne excution des analyses......................................................... 6.2. Certification.................................................................................................... 6.3. Accrditation.................................................................................................. Rfrences bibliographiques............................................................................................
317
317 317 318 318 318 320 321 321 321 323 324 326 330 330 331 331 332
Equilibre hydrolectrolytique
Pierre Valdigui
L'eau reprsente, de trs loin, le constituant le plus abondant de notre organisme : 55 70 % du poids du corps. Elle participe par ses molcules autant que par ses ions OH~ et H4" tous les changes et de trs nombreuses ractions, Son mtabolisme et son tude ne peuvent tre dissocis de ceux des lectrolytes, en particulier le sodium (Na) et le chlore (Cl).
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V
I.
.1.
[U.
Rappels physiologiques et physicochimiques

Bilan de l'eau et des substances minrales
Teneur des organismes en eau et sels minraux
^ ^
.1.1.1. Teneur en eau Elle varie : - suivant l'ge (nourrisson 75 %, vieillard 60 %), par extension du tissu fibreux ; - suivant l'adiposit, le tissu adipeux tant trs pauvre en eau ; - suivant les tissus, les tissus mous et les muscles en particulier tant, bien sr, beaucoup plus riches que le tissu osseux (20 25 %) (tableau 1.1). 1.1.1.2. Teneur en sels minraux h "l La teneur en Na'1' et Cl" est identique : 0,08 % du poids du corps soit environ 3 500 4 300 mmol pour chacun. Le K reprsente 0,2 %, soit 3600 mmol.
2_____________________________________Biochimie clinique
Tableau 1 Teneur en eau de quelques tissus Sang total Plasma Rein Cerveau Muscle Poumon Foie Squelette Tissu adipeux 79% 89-90 % 79-83 % 75-82 % 73-76 % 79% 70% 20-30 % 15-20 %
En moyenne l'eau reprsente 55 60 % du poids du corps chez l'adulte. 7.7.2. Besoins en eau et en sels L'apport quotidien d'une certaine quantit d'eau est indispensable la vie. Les besoins sont valus en fonction de l'limination qui varie elle-mme en fonction des conditions extrieures, ou des conditions pathologiques. Le besoin moyen d'eau chez l'adulte est de 2 litres/24 heures, soit 30 ml/kg environ. Il est beaucoup plus lev chez l'enfant : - 180 ml/kg pour le nouveau-n ; - 125 ml/kg 6 mois ; - 100 ml/kg 1 an. Les besoins en sels sont de l'ordre de : - 4 6 g/24 h pour le sodium et les chlorures ; - 3 4 g/24 h pour le potassium. 1.1.3. Apports 1.1.3.1. Apports d'eau Ils sont endognes et exognes. L'apport endogne nat de ractions mtaboliques de dshydratation de substrats divers et surtout des ractions d'oxydation au cours de la respiration cellulaire. Ainsi environ 300 ml d'eau sont fournis. L'apport exogne est obligatoire (environ 2 000 ml/24 h) sous forme d'eau de boisson (500 1 000 ml) et sous forme d'aliments solides (800 1 200 ml). 1.1.3.2. Apports de sel Outre le sel utilis pour la cuisson et l'assaisonnement, l'eau potable apporte : - des sels minraux alcalins (NaCl, KC1) ; - des sels alcalinoterreux (bicarbonates de a et Mg) ; - de l'iode sous forme d'iodures.
quilibre hydrolectrolytique________________________________3
Les vgtaux, les fruits, le lait apportent aussi de nombreux anions et cations. En pratique, l'alimentation normale apporte suffisamment de sel (9 15 g/24 h) et il ne serait pas ncessaire de saler nos aliments. Cet apport correspond une charge osmolaire d'environ 800 mOsm. Certains aliments sont cependant pauvres en NaCl, comme le riz, et ils seront utiliss dans les rgimes dsods. & 1.1.4. tats de l'eau dans l'organisme r n faut diffrencier d'une part : - l'eau libre ou eau solvant comprenant l'eau de circulation du sang et des humeurs, eau de transport pour les substances du mtabolisme, pour les calories, l'eau lacunaire des liquides interstitiels, des sreuses qui est une eau de soutien, de reserve et d'change ; - l'eau lie ou eau de combinaison, faisant partie intgrante du protoplasme E encore appele eau d' imbibition des gels , analogue l'eau de cristallisation d'un corps cristallisable (CuS04, 5 HÔ), par exemple. Cette eau rsiste la conglation et reprsente environ 10 % du poids du corps. 7.7.5. Rles de l'eau Ils sont trs nombreux, associant : - rle mcanique de transport de calories et de substances varies, de protection dans le cas du LCR ou de l'amnios, de glissement et de lubrification pour la plvre, le pricarde ou les articulations ; I - rle chimique pour les ractions d'hydrolyse, d'hydratation ou d'oxydorduction par ses ions H'1" ; - rle physique enfin par ses ions qui participent au maintien de l'quilibre acidobasique et par ses molcules (eau solvant). Ainsi, on peut grossirement considrer le plasma sanguin comme une solution aqueuse glucose de sels minraux et de protines.
1.1.6. Elimination de l'eau et des sels minraux
1.1.6.1.
limination digestive
Elle est faible (100 200 ml/jour) du fait de la rabsorption intestinale, alors que prs de 8 1 sont dverss chaque jour dans la lumire intestinale par les diverses scrtions. Les laxatifs salins augmentent l'eau fcale par appel osmotique, les laxatifs huileux s'opposent la rabsorption en crant un film lipidique entre la muqueuse et le contenu colique. 1.1.6.2. Elimination pulmonaire et cutane La perspiration pulmonaire reprsente l'eau qui sature l'air expir. Elle est proportionnelle la ventilation pulmonaire.
La perspiration cutane est l'limination permanente d'eau par vaporation la surface du corps, indpendamment de la sueur. Le tout constitue la perte insensible d'eau, value environ 800 ml/jour. Ces conditions basales peuvent tre largement perturbes par : - la sudation, qui peut entraner une spoliation importante de sels et d'eau ; - la fivre 38 C, provoquant une perte d'environ 1 200 1 400 ml ; - la fivre 40 C, environ 1 600 ml ; - la fivre avec polypne, 1 800 ml ; - la fivre avec sueur et polypne, 2 000 ml. Ces valeurs devront tre prises en considration lors de la ranimation et de l'quilibration des patients. 1.1.6.3. limination urinaire Elle est, pour l'eau, de 1 200 1 500 ml/24h du fait de la filtration glomrulaire, de la rsorbption tubulaire passive, lie la rabsorption saline, et active par l'hormone antidiurtique au niveau du tube distal et du tube collecteur, qui constituent le site essentiel du contrle de l'limination de l'eau. Quant l'limination minrale urinaire, elle est sous la dpendance de la cortico-surrnale et de l'activit de certaines enzymes comme l'anhydrase carbonique (activit diurtique des inhibiteurs de cette enzyme) qui participe par ailleurs l'quilibre acidobasique (cf. chapitre suivant). - Le Na^ entirement filtr au niveau du glomrule est rabsorb obligatoirement pour 80 85 % dans le tube proximal. Cette rabsorption active entrane l'absorption passive d'eau et de chlorures, ce qui aboutit une urine isotonique l'entre de l'anse de Henl. Le long de la branche descendante de l'anse, il y a concentration progressive de l'urine en face du tissu mdullaire hypertonique (gradient osmotique corticopapillaire). Le long de la branche ascendante, il y a au contraire dilution progressive de l'urine qui est hypotonique l'entre du tube distal. Dans celui-ci, 10 % environ du Na+ peuvent encore tre rabsorbs en change avec H4' et K+, sous l'influence de l'aldostrone. Dans le tube collecteur enfin, l'ajustement terminal hormonodpendant aboutit des urines hyperou hypotoniques. Finalement la natrurie est minemment variable, dpendant principalement de l'apport alimentaire, oscillant donc entre 5 et 400 mmol/24 h. - Pour le potassium, l'limination est urinaire et digestive, galement fonction de l'apport exogne. Une ration alimentaire normale apporte 50 100 mmol /24h de K"1' dont 45 90 sont limines dans les urines ; les 5 10 mmol restantes sont retrouves dans les selles. - Au total, l'osmolalit maximale de l'urine ne pourra dpasser 1 200 mOsm/1.
B
w
Units employes
Ce sont essentiellement les millimoles, les milliquivalents, les milliosmoles.
Millimole (mmol/l ou mM)
C'est le rapport du poids en mg sur le poids molculaire. Ainsi une millimole reprsente le millime de la masse de 6,02 x 1023 atomes ou molcules.
t
L* MUliquivalent (mEq)
f C'est le rapport en mg x valence sur le poids molculaire ou atomique. Ainsi pour les ions monovalents, comme Na"*" ou Cl", mmol et mEq sont identiques. Pour apprcier les concentrations, le litre est utilis, dans le systme d'units internationales SI, et les concentrations de Na'1" plasmatique seront, par exemple, ainsi exprimes : p Na+ = 138 mmol/l ou 138 mM ou 138 mEq/1 Le mEq est en fait une masse dfinie par la quantit d'lectricit qu'elle transporte et cette unit ne sera utilise que pour les lectrolytes o les charges + et - se combineront entre elles, afin que les liquides biologiques soient lectriquement neutres.
i Milliosmole (mOsm)
Une osmole est la pression osmotique exerce par une molcule-gramme, quelle que soit sa nature chimique, dissoute dans 1 litre d'eau (osmolarit) ou dans 1 kilogramme de solvant (osmolalit). La mOsm (10~3 Osm) est aussi le millime de la masse qui, dissoute dans 1 kg de plasma, est capable d'abaisser son point de conglation de 1,86 C. titre d'exemple, pour obtenir du solut sal physiologique 9 g/1 de NaCl, soit 300 mOsm/1, il faut dissoudre 161,5 mmol de NaCl dans 1 litre d'eau et non 150 mmol car le facteur de dissociation thorique de 2 devient, ces concentrations, 1,856. Ces notions sont capitales car elles expriment la tonicit des liquides biologiques ou des soluts injectables usage thrapeutique, qui seront iso-, hyperou hypotoniques.
1.3.
Rpartition de l'eau et des sels Grands compartiments liquidions
L'eau, ignorant les barrires cellulaires, est l'objet d'changes incessants entre les cellules et les milieux extracellulaires. L'tat des liquides de l'organisme est rgi par les rgles fondamentales suivantes :
- ils sont isotoniques, c'est--dire que le rapport eau/lectrolytes est constant ; - ils possdent une neutralit lectrique, c'est--dire autant d'anions que de cations.
1.3.1. Compartiment extracellulaire
Le compartiment extracellulaire reprsente 20 % du poids du corps chez l'adulte, 40 % chez le nourrisson. Il est compos des compartiments plasmatique (5 %) et interstitiel (15 %).
1.3.1.1. Compartiment plasmatique
Outre ses 5 % deau, ce compartiment renferme de nombreuses substances dissoutes (glucose, ure, cratinine etc.) et des lectrolytes, cations et anions.
^- CATIONS PLASMATIQUES
Le plus important est le sodium Na'1" (138 145 mmol/1 ou mEq/1). Il est le principal cation extracellulaire et il est le reflet de l'lectrolytmie totale, et de la pression osmotique efficace du plasma. De plus, la natrmie participe la rgulation de l'quilibre acidobasique (le Na tant un lment alcalin) aux mouvements de l'eau et sa dtermination en biologie clinique occupe une place fondamentale. Le potassium K"1" (4,5 5 mmol/1 ou mEq/1) est le principal cation intracellulaire, ce qui explique sa concentration basse dans le plasma. Le calcium a'1""1' est prsent au taux de 2,3 2,5 mmol/1 soit 4,7 5 mEq/1. Le magnsium Mg^ enfin, principal cation intracellulaire, reprsente 1 1,2 mmol/1 soit 2 2,5 mEq/1.
> ANIONS PLASMATIQUES
Le chlorure Cl~ est le principal anion des liquides extracellulaires. Son taux est de 98 103 mmol/1 ou mEq/1. En raison de ses affinits avec l'ion sodium, leurs mtabolismes sont le plus souvent lis. Le bicarbonate CO^H" exprime l'ancienne rserve alcaline . Sa concentration normale est de 26 28 mmol/1 ou mEq/1. Les protines sont, au pH du plasma, ionises sous forme de protinates, R-COO", et peuvent donc intervenir comme anions. Leur taux est de 65 75 g/1 et peut tre artificiellement converti en mEq/1 grce un facteur multiplicatif de 0,243. Une valeur moyenne de 66 g/1 correspond donc 16 mEq/1. Les acides organiques, issus du mtabolisme intermdiaire, (pyruvate, lactate, oxaloactate, oxoglutarate...) reprsentent environ 6 mEq/1. Phosphates et sulfates forment environ 3 mEq/1.
L'ensemble des cations (155 mEq/1) et des anions (155 mEq/1) est reprsent par le schma classique des colonnes quilibres ci-dessous :
E
Tableau 1.2 Composition lectrolytique du plasma exprime en mEq/1. Na K a Mg 143 4,5 5 2,5 Cl CO-H Protins Acides organiques Phosphates Sulfates Total 103 27 16 6 2 1 155
Total 155
Le compartiment plasmatique communique avec l'extrieur grce aux | changes digestifs, pulmonaires, rnaux et cutans. 1.3.1.2. Compartiment interstitiel
| II est en quilibre avec le compartiment plasmatique au travers de la paroi des capillaires et avec le compartiment intracellulaire au travers des membranes cellulaires. 1 Sa composition est grossirement celle d'un ultrafiltrat plasmatique, c'est-dire que seules les protines sont absentes et remplaces par des chlorures. Le sodium est discrtement diminu (135 mmol/1) en raison de l'quilibre de Donnan.
1.3.2.
Compartiment intracellulaire
L'eau intracellulaire compte pour 35 40 % du poids du corps et 55 60 % de l'eau totale de notre organisme. Son osmolalit est identique celle du compartiment extracellulaire mais la nature des substances dissoutes est diffrente. Le principal cation est le potassium, libre ou li aux protines cellulaires. Il participe activement la contraction musculaire, la transmission de l'influx nerveux et, d'une manire gnrale tous les potentiels de membrane. Le magnsium vient en deuxime place pour les cations cellulaires. Les anions sont essentiellement des phosphates et des protinates.
8___________________________________Biochimie clinique
(1) Eau totale : environ 60 % du poids du corps (2) Compartiment extracellulaire : environ 20 % du poids du corps (3) Compartiment plasmatique : environ 5 % du poids du corps (2-3) Compartiment interstitiel : environ 15 % du poids du corps (4) Compartiment intracellulaire : environ 40 % du poids du corps
Figure 1.1 Les grands compartiments liquidiens de l'organisme.

(a) Tube digestif, b) Peau, c) Poumon, d) Rein.
1.4.
changes d'eau et d'lectrolytes
1.4.1. Mcanisme des changes Ils se font par le jeu des phnomnes osmotiques. 1.4.1.1. Mouvements d'eau L'eau diffuse librement travers la membrane cellulaire et la paroi des capillaires en obissant aux lois de l'osmose. Les principaux responsables de l'osmolalit sont le Na et le Cl, les bicarbonates qui, eux trois, exercent 85 % de la pression osmotique totale. Dans le lit vasculaire, les protines du fait de leur taux lev exercent une pression osmolaire importante, dnomme pression oncotique. Les mucopolyosides des espaces interstitiels, plus ou moins polymriss, jouent galement un rle. Les mouvements de l'eau sont simples : elle se dplace toujours du milieu le moins concentr vers celui qui est le plus concentr, ayant une osmolalit suprieure qui attire l'eau. 1.4.1.2. Mouvements et changes de sels Le passage des lectrolytes salins au travers de la membrane cellulaire se fait soit par diffusion passive, soit par transport actif. a) La diffusion obit aux rgles de l'quilibre de Donnan, cr lorsque deux solutions diffrentes sont spares par une membrane permable. L'quilibre
sera atteint lorsque les concentrations en ions diffusibles seront gales de part et d'autre de la membrane. Dbut
Secteur 1 Na* RCOO7,5 mEq 7,5 mEq Na+ ClSecteur 2 7,5 mEq 7,5 mEq
Fin Secteur 1 Ma* ClRCOOr 10 mEq 2,5 mEq 7,5 mEq Na* ClSecteur 2 5 mEq 5 mEq
Figure 1.2 Exemple de diffusion selon l'quilibre de Donnan
b) Le transport membranaire actif affecte essentiellement le sodium qui doit tre rejet hors du compartiment intracellulaire par le mcanisme de la pompe sodium (10 15 mmol/1 de Na"1" contre 70 150 mmol/1 de K-1-). Ce transfert actif consomme de l'nergie, luttant contre un gradient de concentration, et change le plus souvent 3 Na"1" contre 2 ions K"1" et un proton H"1". Ceci explique la polarisation membranaire eties relations avec l'quilibre acidobasique, toute acidose entranant une lvation du K"1" extracellulaire. 1.4.2. Rgulation des changes La rgulation de l'hydratation du compartiment extracellulaire est sous la dpendance du bilan du sodium, dont les modifications s'accompagneront de modifications parallles du bilan hydrique. La constance de Fosmolalit l'emporte en effet sur celle des volumes. La rgulation de l'hydratation du compartiment intracellulaire est sous la dpendance de l'osmolalit des liquides extracellulaires. On comprend ds lors l'importance du systme neuro-hormonal complexe, agissant essentiellement sur l'limination de l'eau et du sodium, charg de rguler surtout le bilan sod.
1.4.2.1. Hormone antidiurtique L'hormone antidiurtique, ou ADH, est la vasopressine, scrte au niveau des noyaux hypothalamiques, dverse dans le tronc porte hypothalamo-hypophysaire et stocke dans la post-hypophyse. Toute lsion de cet axe se traduira par un diabte insipide. Elle contrle en effet la rabsorption d'eau au niveau des tubes contourn distal et collecteur du nphron, assurant une limination plus ou moins grande d'eau libre par les reins, en rponse des variations de l'osmolalit plasmatique ou du volume circulant. 1.4.2.2. Rgulation de l'excrtion rnale du sodium
^ FACTEURS HMODYNAMIQUES FILTRATION GLOMRULAIRE
La filtration, et donc la rabsorption obligatoire du sodium, dpendent videmment du flux sanguin rnal et de la pression de perfusion artrielle rnale. En particulier doivent tre souligns le rle de la pression dans les capillaires pritubulaires vis--vis de la rabsorption sode et celui de la pression dans l'artriole affrente du glomrule qui participe la mise en jeu du systme rnineangiotensine.
> SYSTME RNINE-ANGIOTENSINE ET ALDOSTRONE
C'est le mcanisme essentiel de rgulation du bilan sodique qui agit selon deux mcanismes : - rabsorption tabulaire proximale grce l'angiotensine qui modifie la vasomotricit de l'artriole affrente du glomrule ; - reabsorption tubulaire distale grce l'aldostrone. Celle-ci est scrte par la zone glomrule du cortex surrnal sous l'influence de facteurs multiples parmi lesquels la kalimie, la natrmie, la concentration plasmatique d'ACTH et enfin l'angiotensine. Cette dernire est issue de l'hydrolyse d'une protine plasmatique, l'angiotensinogne, par une enzyme protolytique, la rnine, produite par l'appareil juxtaglomrulaire. Parmi tous les facteurs intervenant dans la mise enjeu de la rnine, citons : - des stimuli : l'hypovolmie, la baisse de pression dans l'artriole affrente, l'lvation du Na'1" dans l'urine tubulaire, absorb par la macula densa, l'orthostatisme ; - une inhibition : l'expansion des volumes extracellulaires.
> AUTRES HORMONES
Les hormones thyrodiennes interviennent faiblement en augmentant l'limination d'eau cutane et urinaire, par stimulation de la filtration glomrulaire et diminution de la rabsorption tubulaire. La carence hormonale du myxdme s'accompagne d'ailleurs d'une infiltration cutane d'eau et de mucopolyosides. Les catcholamines augmentent la pression artrielle, donc la filtration glomrulaire et donc la diurse.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________H Les strodes interviennent surtout par le cortisol exerant un faible effet de rtention sode (ncessitant cependant de mettre au rgime sans sel les malades sous corticothrapie au long cours) et par les strognes qui produisent une rtention hydrosode dans la deuxime partie du cycle, surtout en cas de dficit progestronique (syndrome prmenstruel).
2.
2.1.
Exploration de l'quilibre hydrominral

Mesures des volumes hydriques
2.7.7. Principes gnraux La dtermination des divers espaces de diffusion de l'eau peut s'effectuer grce aux diffrences de permabilit de la paroi cellulaire et de la membrane | cellulaire vis--vis de composs chimiques injects par voie veineuse. Les uns, retenus dans les vaisseaux car ne franchissant pas la paroi capillaire, serviront mesurer l'eau plasmatique. D'autres, traversant la paroi vasculaire mais non la membrane cellulaire, permettront d'valuer le compartiment extracellulaire, le compartiment interstitiel sera dduit par simple soustraction. Certains enfin diffusent l'intrieur des cellules, mais aussi dans tous les autres secteurs, et donnent l'espace de diffusion total dont l'espace intracellulaire sera dduit par soustraction. 2.7.2. Mthodes 2.1.2.1. Eau totale On peut utiliser l'ure, l'antipyrine, l'eau lourde ou l'eau tritie qui diffusent dans l'ensemble des secteurs. L'eau totale reprsente en valeur absolue 40 50 litres. En pratique, ces mthodes sont trop lourdes ou trop complexes et on apprcie donc l'eau totale par la simple pese (60 65 % du poids du corps). 2.1.2.2. Secteur extracellulaire On s'adresse aux substances ne traversant pas la membrane cellulaire : thiocyanate de Na, inuline, mannitol ou ^Na radioactif. L'eau extracellulaire (20 % du poids corporel) reprsente 12 16 litres. En clinique, l'hydratation du compartiment extracellulaire s'apprcie par le pli cutan et la tension artrielle. 2.1.2.3. Eau plasmatique On peut utiliser des colorants comme le bleu Evans, le rouge Congo, mais en pratique le volume d'eau plasmatique s'apprcie par la mesure de l'hma-
12___________________________________Biochimie clinique tocrite et accessoirement par le taux des protines ou le nombre des hmaties. Rappelons que l'hmatocrite est le rapport du volume globulaire sur le volume sanguin total. Sa valeur normale est de 40 50 % chez l'homme, de 35 45 % chez la femme. On obtient ainsi, pour le volume d'eau plasmatique (souvent confondu avec le volume sanguin total), 4,5 5 litres. D'autre part, rappelons que dans 1 litre de plasma, du fait des protines et lipoprotines, il n'y a que 930 ml d'eau pure. 2.1.2.4. Clairance de l'eau libre Elle se dfinit comme la quantit d'eau pure qu'il faudrait soustraire ou ajouter l'urine pour que son osmolalit soit gale celle du plasma. On peut en effet considrer que l'urine est la somme d'une diurse osmotique destine liminer, de faon isotonique au plasma, la charge osmolaire quotidienne (environ 800 mOsm pour une alimentation normalement sale) et d'une diurse aqueuse indpendante des substances dissoutes liminer. Elle correspond la diffrence entre le dbit urinaire V et la clairance osmolaire C^ : ^*osm = concentration osmotique du plasma en mOsm/1, ôsm = oncentration osmotique de l'urine en mOsm/1 V = dbit urinaire en ml/min.
Cosmôsm^ôsm011
Lorsque les urines sont concentres, la clairance de l'eau libre est ngative, alors qu'elle est positive lorsque les urines sont dilues. Ainsi la clairance est - 1 pour liminer les 800 mOsm quotidiens lorsque la diurse est de 1,4 1 ; elle est + 3,6 pour une diurse de 8 1 dans le diabte insipide. La dtermination au laboratoire des osmolalits plasmatique et urinaire permet donc un calcul facile de la clairance de l'eau libre. Au lit du malade, les osmolalits sont calcules de manire approche, utilisant les formules ciaprs.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________13^
Osmolalit plasmatique approche mOsm/1 Osmolalit urinaire approche mOsm/1
2.2.
Mesure des lectrolytes
2.2.1. Osmolarit et osmolalit plasmatiques Cryoscopie L'abaissement du point de conglation du plasma (cryoscopie) est proportionnel au nombre total d'ions et de molcules non dissocies. Les rsultats normaux, exprims en milliosmoles/litre (de plasma) sont de 300 mOsm/1 (osmolarit). Exprims en mOsm/kg de solvant (l'eau en fait), ils constituent l'osmolalit, pour laquelle l'abaissement du point de conglation est de - 0,56 C. L'osmolalit plasmatique approche est de 297 mOsm/1, en tenant compte de l'ure, du glucose, des ions Na4' et K^. Lorsque la natrmie x 2 est prise seule en considration, le nombre de mOsm/1 chute environ 286 (143 x 2). 2.2.2. Dtermination spare des lectrolytes lonogramme Bilan lectrolytique 2.2.2.1. lonogramme sanguin
> CATIONS
Sodium
Dos par photomtrie d'mission de flamme ou par potentiomtrie l'aide d'lectrodes slectives ou encore par colorimtrie, le sodium plasmatique ou srique est de 138 143 mEq/1 ou mmol/1. Il reprsente 95 % des cations extracellulaires.
Potassium
Dos de la mme manire que le sodium, ses valeurs sont plus basses car c'est un cation intracellulaire : 3,5 4,5 mEq/1 ou mmol/1. En pratique clinique l'ECG peut donner de bons renseignements sur la kalimie : onde T plate, sousdnivellation de ST signent une hypokalimie alors qu'une onde T pointue avec risque de fibrillation ventriculaire est l'apanage des hyperkalimies. Notons aussi que le dosage du K"*" ne peut se faire que sur plasma ou srum non hmolyse, en raison de la richesse potassique des globules rouges. Le garrot et le pompage musculaire au cours des prlvements risquent aussi d'lever le taux de la kalimie.
14___________________________________Biochimie clinique Calcium et magnsium plasmatique ne sont pas systmatiquement doss. Ils reoivent une valeur moyenne de 7 mEq/1 pour renforcer la colonne des cations.
> ANIONS
Chlorures
Doss par colorimtrie, par coulomtrie ou par potentiomtrie, les ions chlorures reprsentent l'anion extracellulaire le plus important : 95 105 mEq/1 ou mmol/1.
Bicarbonates
Les ions COgH" sont doss par gazomtrie ou manomtrie (libration du CO^ par un acide fort), par colorimtrie ou par raction enzymatique. Leur taux est 22 28 mEq/1 ou mmol/1. Ces quatre ions forment l'ionogramme classique, auquel on adjoint souvent les dosages des protines, de l'ure et de la cratinine. Protines Si le dosage par densimtrie est abandonn, la colorimtrie par raction du biuret est trs classique, de mme que la lecture par rfractomtrie directe. Le taux de 65 75 g/1 correspond 15 20 mEq/1 dans la colonne des anions. Les autres anions plasmatiques ne sont tiabituellement pas doss. Ce sont les acides organiques (6 mEq/1), les phosphates (2 mEq/1), les sulfates (1 mEq/1) qui reoivent donc, dans l'quilibre anions-cations, une valeur moyenne de 9 mEq/1. Ainsi la balance anions-canions peut-elle tre calcule ; physiologiquement 150 155 mEq/1 de cations doivent tre quilibrs par le mme nombre d'anions. En cas de dficit anionique, on parlera d'un trou anionique, le plus souvent observ au cours des acidoses mtaboliques. En pratique courante, le bilan est considr comme quilibre lorsque la balance cations-anions ne dpasse pas +/- 5 mEq/1.
Ure
Catabolite azot fondamental, son excrtion rnale l'a rendu pendant des dcennies indispensable pour apprcier le fonctionnement rnal. Son taux normal est de 3,3 6,6 mmol/1 (0,20 0,40 g/1). La variabilit de son limination rnale en fonction du dbit urinaire lui fait dsormais prfrer le dosage de la creatininmie. Cratinine Reflet de la filtration glomrulaire, c'est un excellent marqueur de l'tat rnal. Son dosage est colorimtrique ou enzymatique, donnant comme valeurs usuelles 70 120 |Jimol/l.
Equilibre hydrolectrolytique_______________________________15
Hmatocrite
Reprsentant le rapport du volume globulaire sur le volume sanguin total x 100, il est trs souvent ralis en mme temps que l'ionogramme car il donne des renseignements prcieux sur le volume liquidien plasmatique. Les valeurs moyennes sont : - 50 % chez l'homme ; - 45 % chez la femme. Le prlvement sanguin devra alors tre fait sur hparinate de lithium. On pourra ainsi parler d'hmodilution ou d'hmoconcentration suivant que l'hmatocrite sera lev ou abaiss. Les mmes donnes peuvent tre fournies par le taux des protines ou par le nombre de globules rouges. 2.2.2.2. Bilan lectrolytique urinaire II ne se conoit que sur des urines de 24 h, dont la qualit pourra s'apprcier par le dosage de la cratininurie dont on connat la constance (0,18 mmol/kg de poids chez la femme ; 0,22 mmol/kg chez l'homme). Il ne peut tre interprt que coupl l'ionogramme sanguin effectu simultanment et aprs avoir apprci la valeur de la fonction rnale par la clairance de la cratinine ou la cratininmie. Ce bilan comprend essentiellement trois examens : ure, sodium, et potassium urinaires.
> URE
La concentration urique urinaire est une bonne faon de savoir quel est le pouvoir de concentration du rein. Cependant, en dehors de l'insuffisance rnale ou du calcul d'une ration calorique, son intrt reste relativement limit. Les valeurs observes sont de 15 600 mmol/24 h en fonction de l'importance de l'apport protique alimentaire.
> SODIUM
La natriurie est le reflet du bilan de ce cation car, l'tat normal, le rein est le seul organe capable chez l'homme de rgler le bilan sodique en adaptant les sorties aux entres. Les valeurs du Na urinaire (0 300 ou 500 mmol/24 h) sont donc appropries ou inappropries. Approprie, la natriurie reprsente exactement la ration alimentaire sode, diminue des pertes sudorale et fcale, normalement faibles. Ainsi un sodium urinaire lev, en dehors de toute dshydratation, n'est que la consquence d'un rgime sal. Un sodium urinaire bas traduit soit un rgime peu sal, soit la rponse normale du rein une perte extrarnale de sodium (vomissements, diarrhe ou sudation abondante). Inapproprie, la natriurie indique que le rein n'est pas apte prserver la composition et le volume du secteur extracellulaire, comme par exemple au
cours d'une hyperhydratation extracellulaire lors d'une insuffisance cardiaque globale ou encore chez un patient avec des signes de dshydratation extracellulaire et une fuite urinaire sodique persistante.
^- POTASSIUM
Pour la kaliurie (0 150 mmol/24 h), le mme mode de raisonnement est valable mais le guide doit tre ici le taux de la kalimie. A kalimie basse, un potassium urinaire bas est appropri devant une dperdition en gnral digestive, un potassium urinaire lev atteste, par contre, de l'origine tubulaire de la fuite potassique (administration de salidiurtiques ou de corticodes, hyperaldostronisme). Avec une kalimie leve, un potassium lev est une rponse approprie une source endogne d'ions K'1", gnralement par hypercatabolisme ; un potassium urinaire bas est la marque d'une insuffisance rnale, d'une insuffisance surrnale ou de l'administration d'un diurtique dit d' pargne potassique .
3.
Applications pathologiques. Grands syndromes de perturbation de V quilibre hydrominral
3.1.
Hyperhydratation extracellulaire dmes
Infiltration et accumulation d'eau dans le tissu cellulaire sous-cutan, parfois dans les sreuses et les organes, les dmes concernent essentiellement le secteur interstitiel et sont la consquence d'un bilan sod positif. Ils sont trs frquemment observs et de causes trs variables. Sur le plan clinique, le premier signe de l'inflation hydrosode est une prise de poids rapide. Lorsque la variation dpasse 3 kg chez l'adulte soit une rtention de 400 mmol de sodium, les dmes sont facilement visibles. Le signe biologique constant est l'existence d'une natriurie basse (au dessous de 20 mmol/24 h) toujours infrieure aux apports. 3.1.1. Mcanismes et physiopathologie Le mcanisme le plus habituel est la rtention de NaCl qui augmente la pression osmotique extracellulaire, laquelle attire l'eau. Cette action hydropigne du sel, est confirme par l'efficacit usuelle du rgime sans sel. Cependant, d'autres facteurs physiopathologiques sont parfois associs comme l'abaissement de la pression oncotique des protines du plasma ou une perturbation de l'hmodynamique avec augmentation de la pression veineuse. L'intrication des mcanismes dpend des tiologies (figure 1.3).
quilibre hydrolectrolytique_______________________________\T_
SYNDROMES NPHROTIQUES
Lsion glomrutatre
Hypoprotinmie
(Chute de la pression oncotique)
DMES \ Volume plasmatique
|i. Rtention de Na"1" et eau
(,
Scrtion d'aldostrone J
INSUFFISANCE CARDIAQUE
/ Pression veineuse
^ \
Dbit cardiaque
\ Pression de filtration
Volmie )
( Scrtion d'aldostrone
Rtentfon d'eau et de sels

DMES
Figure 1.3 Exemples de mcanisme d'apparition des dmes
3.1.2. Principales tiologies L'insuffisance cardiaque, quelle qu'en soit la cause, entrane une diminution du flux rnal et donc de la filtration avec augmentation de la reabsorption tubulaire sodique par hyperaldostronisme secondaire. Les syndromes nphrotiques s'accompagnent d'une hypoprotinmie lie la fuite glomrulaire des protines plasmatiques et d'un hyperaldostronisme secondaire li la diminution relative du volume plasmatique. &
Les nphropathies glomrulaires aigus s'accompagnent souvent d'dmes lors d'une glomrulonphrite aigu ou d'une toxmie gravidique. Les cirrhoses dcompenses o l'dme dbute par une ascite associent rtention hydrosaline, hypertension portale, hypoalbuminmie et compression de la veine cave infrieure par l'panchement pritonal. La dnutrition avec carence protidique du kwashiorkor entrane un arrt de la croissance, un amaigrissement souvent masqu par l'dme. La rtention hydrosode est probablement due l'hypoprotinmie secondaire la ngativisation importante de la balance azote.
3.2.
Syndromes de dshydratation
En raison de leur extrme frquence aussi bien chez l'adulte ou le vieillard que chez le nourrisson (particulirement sensible puisque l'eau totale reprsente chez lui 75 80 % du poids du corps, avec un secteur extracellulaire d'environ 35 40 %), ces syndromes sont importants connatre, d'autant que les rgles de ranimation sont maintenant classiques. Il est habituel de dcrire la dshydratation extracellulaire, aprs l'hyperhydratation de ce secteur, puis la dshydratation et l'hyperhydratation cellulaires. En fait les dsordres sont trs souvent associs et quelques rgles gnrales doivent donc d'abord tre rappeles. L'apprciation de l'tat clinique donne dj de prcieux renseignements : - tension artrielle basse, pli cutan dans la dshydratation extracellulaire ; - sensation de soif, temprature leve, langue sche ou rtie , troubles neuropsychiques ventuellement dans la dshydratation intracellulaire. Au plan physiopathologique, les perturbations initiales se font toujours dans le secteur extracellulaire et les modifications du milieu intracellulaire sont donc toujours secondaires. Les variations du volume extracellulaire sont directement lies aux variations du contenu en sodium de l'organisme. La dshydratation extracellulaire n'est jamais lie un dfaut d'apport isol de sodium, quand le fonctionnement du rein est normal ; elle est donc toujours secondaire une fuite extrarnale de sodium. 3.2.1. Dshydratation extracellulaire C'est la diminution du volume du compartiment extracellulaire sans modification du volume du compartiment cellulaire lorsqu'elle est isole (ce qui implique une pression osmotique des liquides extracellulaires sans changement), ou avec hyperhydratation cellulaire associe (lorsque les liquides extracellulaires deviennent hypotoniques). - Les signes biologiques plasmatiques sont lis l'hmoconcentration : hmatocrite augment, protines totales leves, ure et cratinine augmentes par insuffisance rnale fonctionnelle,
quilibre hydrolectrolytique_______________________________19 S>- Va sodium est gnralement normal car l'hyponatrmie est masque par
l'hmoconcentration.
Perte isotonique \-
EC
IC
310 mmol/l
310 mmol/l
310
310
DSHYDRATATION EXTRACELLULAIRE PURE
Perte hypertonique ^ EC IC
310 mmol/l
310 mmol/l
200
310
DSHYDRATATION EXTRACELLULAIRE AVEC HYPERHYDRATATION INTRACELLULAIRE
Figure 1.4 Exemples de mcanisme de dshydratation extracellulaire. Les causes sont celles de toute perte saline : - rnales (Na urinaire > 30 mmol/24 h) lors de l'insuffisance surrnale, de l'insuffisance rnale chronique des nphrites interstitielles, de diurses anormales par effet osmotique (diabte, perfusion de mannitol) ou par diurtiques ; - extrarnales (Na urinaire < 10 mmol/24 h) lors de pertes digestives (vomissements, diarrhes, fistules, aspiration gastroduodnale) ou de pertes cutanes (hypersudation, brlures, mucoviscidose). Les mcanismes et la prsence ou l'absence d'hyperhydratation cellulaire associe sont expliqus par la nature de la perte. La thrapeutique sera adapte au type de syndrome en cause : - srum sal isotonique (9 g/1 de NaCl = 3,5 g de Na'1' =152 mmol pour 11) pour la dshydratation extracellulaire pure ;
- srum sal hypertonique ( 10 %, 10 ml = l(g de NaCl =17 mmol) dans le cas d'un syndrome de dshydratation hypotonique o l'hyperhydratation cellulaire existe. 3.2.2. Dshydratation intracellulaire C'est la diminution de volume du compartiment intracellulaire, due un mouvement d'eau vers le compartiment extracellulaire, du fait d'une augmentation de la pression osmotique de celui-ci. Le mcanisme est la perte d'eau > perte saline ou perte hypotonique. Le signe biologique fondamental est l'hypernatrmie, tmoin de l'hyperosmolalit plasmatique. La composition osmolaire et ionique des urines est variable et dpend des scrtions d'ADH et d'aldostrone, elles-mmes fonction de la cause du trouble.
DSHYDRATATION INTRACELLULAIRE
Figure 1.5 Exemples de mcanisme physiopathologique d'une dshydratation intracellulaire. Les tiologies principales sont l'apport insuffisant d'eau (naufrags, sujets perdus en zone dsertique, sujets comateux), le diabte insipide, les diurses osmotiques. La dshydratation cellulaire s'accompagne souvent d'une dshydratation associe du secteur extracellulaire donnant alors une dshydratation globale. L'origine en est une perte associe d'eau et de sodium, la perte d'eau prdominant. Les signes propres de la dshydratation de chaque secteur sont alors associs avec, sur le plan biologique, une hypematrmie de dshydratation intracellulaire et un hmatocrite lev, des protines totales augmentes tmoignant de l'hmoconcentration due la perte extracellulaire. Le traitement repose sur l'apport d'eau, soit par voie buccale, soit par voie intraveineuse grce l'utilisation de soluts glucoses isotoniques qui, aprs mtabolisation du glucose, laissent leur eau diluer le compartiment extracellulaire.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________21
titre d'exemple, la quantit d'eau apporter un sujet de 70 kg prsentant l'ionogramme Na'1' : 160 mmol/1 et K"1" : 5 mmol/1 soit (+ 7) 172 mEq/1 de cations et donc 344 mEq/1 d'ions soit un excs ionique de 344 - 310 = 34 mEq/1, sera donne par le calcul suivant : Nombre de ml d'eau apporter = 1 000 x 442/310 # 1 500 ml o 442 est l'excs total de mEq chez cet individu o le secteur extracellulaire est normalement d'environ 13 1 soit 13 x 34 = 442, qui doivent tre dilus pour obtenir l'isotonie 310 mEq/1.
4.
Approche technologique Principales mthodes de dosage
Nous dcrirons dans ce chapitre les principales mthodes de dosage des constituants suivants : - sodium ; - potassium ; - chlorure ; - bicarbonate ; - hmatocrite. Les nombreux autres constituants mentionns dans ce chapitre (protines, calcium, ure, cratinine...) seront dcrits plus tard l'occasion de leur dveloppement propre.
4.1.
Cations plasmatiques sodium et potassium
Ces cations peuvent tre doss par quatre techniques diffrentes : photomtrie d'mission de flamme, lectromtrie par lectrodes slectives, colorimtrie et mthode enzymatique.
i 4.1.1. Photomtrie de flamme
4.1.1.1. Principe La flamme est utilise pour convertir l'lment doser l'tat de vapeur atomique o les atomes subiront des transformations rversibles entre un tat de base et un tat excit : un lectron passe sur une orbitale plus externe niveau d'nergie plus lev et restitue ensuite cette nergie sous forme de photons en revenant son niveau initial. Les photons mis ont des frquences caractristiques de l'lment, qui constituent le spectre d'mission de cet lment (les mtaux alcalins lithium, sodium ou potassium n'ont en effet qu'un lectron sur la couche priphrique).
j2_____________________________________Biochimie clinique
4.1.1.2. Appareillage Quel que soit le fabricant, l'appareillage comporte toujours quatre lments principaux.
> NBUUSEUR
II permet d'envoyer dans la flamme la solution srique ou urinaire ou tout autre liquide biologique, sous forme d'un arosol de fines gouttelettes homognes.
> BRLEUR
Associ troitement au nbulisateur, il utilise habituellement le butane ou le propane qui donnent une flamme proche de 2 000C.
> ANALYSEUR OPTIQUE
Les photons mis ont une frquence caractristique du mtal vaporis. Chaque mtal met plusieurs raies et on choisit la plus caractristique et la plus intense : Na : 589 nm (raie jaune du sodium) K : 767 nm Li : 671 nm. Un slecteur de longueur d'onde, prisme, rseau ou gnralement filtres, est indispensable.
Filtres interfrentiels Phototubes et amplificateurs
Flamme
Systme de traitement des mesures
Carburant |
nm Chambre de prmlange Affichage des rsultats Impression Connexion informatique
Brleur Comburant
Nbuliseur
H P
l'vier Spcimen prdilu
Figure 1.6 Schma de principe d'un photomtre de flamme.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________'23
Les voies optiques sont au nombre de deux : - l'une possde un filtre 671 nm (Li) et sert de rfrence (talon interne) en effet l'chantillon est toujours dilu dans une solution d'talon interne, ce qui permet de tenir compte des variations de dbit des gaz, de l'chantillon, de la temprature de la flamme. Certains appareils utilisent le csium comme talon interne et permettent ainsi de doser le lithium srique au cours des traitements lithis en psychiatrie ; - l'autre voie est double et reoit au travers des filtres correspondants les signaux du sodium et du potassium.
> DISPOSITIF DE MESURE
II comprend les cellules photolectriques, les phototubes d'amplification, le dispositif de conversion du signal lectrique en affichage numrique exprim en mmol/1 avec dduction automatique du signal de l'talon interne.
> DISPOSITIFS OPTIONNELS
Ils amliorent grandement la praticabilit de l'appareillage : diluteur automatique, passeur d'chantillons, imprimante, connexion un systme informatique. 4.1.2. Potentiomtrie lectrodes slectives Depuis plus d'une dcennie la mesure lectromtrique des cations alcalins du sang est devenue habituelle. Ce dveloppement est d la commercialisation de petits analyseurs adapts l'urgence et aux courtes sries dont l'automatisme rend l'emploi facile et attrayant.
^ TRAITEMENT DE L'CHANTILLON
La mesure du sodium et du potassium par lectrode slective peut s'effectuer de deux faons : - soit sur des chantillons non dilus, ce qui donne accs l'activit de l'ion telle qu'elle existe dans le plasma et permet l'utilisation de sang total. On parle de potentiomtrie directe ; - soit sur des chantillons dilus o l'activit de l'ion est trs diffrente de celle du spcimen originel. On parle alors de potentiomtrie indirecte, abus de langage car la potentiomtrie elle-mme reste bien sr toujours directe.
> TRAITEMENT DES DOSAGES MODULE DE MESURE
Les lectrodes fonctionnent comme des piles de concentration et mesurent une diffrence de potentiel de part et d'autre d'une membrane slective, ddp qui est relie l'activit de l'ion. Pour la mesure, on a recours un module comportant, outre l'lectrode de mesure, une lectrode de rfrence caractrise par la
stabilit de son potentiel propre. Les lectrodes de rfrence sont le plus souvent des lectrodes au chlorure d'argent ou au calomel. Les lectrodes de sodium sont des lectrodes de verre (verres spciaux l'oxyde de lithium et d'aluminium jouant le rle de membrane). On obtient sur la membrane des sites anioniques tels que seul (ou presque) l'ion sodium va pouvoir pntrer et gnrer un potentiel de membrane qui est proportionnel la diffrence de concentration en ions Na4' des deux cts de la membrane. Toute la technologie des appareils lectromtriques vise dterminer cette diffrence de potentiel qui est trs faible. Les lectrodes de potassium sont toutes bases sur l'emploi de valinomycine incorpore, soit dans du PVC, soit dans une gomme de silicone. La valinomycine est un peptide cyclique solide, d'origine bactrienne, capable de squestrer les ions K'1" et de former avec eux un complexe stable.
> TRAITEMENT DES MESURES RELATION ENTRE ACTIVIT ET CONCENTRATION
Les lectrodes slectives rpondent l'activit des ions. La relation entre l'activit mesure par l'lectrode slective sur chantillon non dilu et la concentration de l'ion considr peut tre exprime sous forme mathmatique. En fait il suffira de comparer les diffrences de potentiel obtenues aux bornes du systme, d'une part avec un talon et d'autre part avec l'chantillon inconnu. Seule la potentiomtrie directe, avec chantillon non dilu, donne accs la valeur vraie de l'ion mesure. Si l'on utilise la potentiomtrie indirecte (dilution au 1720e en gnral) ou la photomtrie de flamme (dilution au 17200e), les rsultats devront tre corrigs en fonction de l'eau plasmatique vraie. Celle-ci reprsente 93 % du volume plasmatique, les 7 % restant sont dus aux protines et lipoprotines. En prsence d'hyperlipoprotinmies, en particulier triglycrides ou d'hyperprotinmies, le pourcentage d'eau plasmatique est modifi et la correction pourra tre apporte par la formule de Waugh : Eau plasmatique = 99,1 - 0,073 (P) - 0,103 (L) o (P) reprsente le taux de la protinmie en g/1 et (L) le taux de la lipidmie, apprci par la somme cholestrol + triglycrides en g/1.
> CONDUITE TENIR PRATIQUE
Chez le sujet normal, les concentrations obtenues par potentiomtrie directe sont suprieures d'environ 7 % par rapport celles obtenues par potentiomtrie indirecte ou par photomtrie de flamme. Or, ce sont ces dernires que les cliniciens ont l'habitude d'utiliser. Cela pose donc un problme pratique dans la mesure o la diffrence est trop importante pour tre ignore et qu'une adaptation des connaissances et des habitudes des utilisateurs cliniciens l'usage courant de l'expression en concentration par litre d'eau plasmatique vraie, n'est pas ralisable court terme.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________25
Ds lors, ce sont les rsultats de la potentiomtrie directe qui sont systmatiquement minores d'environ 7 % pour les corrler ceux de la photomtrie de flamme ou de la potentiomtrie indirecte. Dans le cas des appareils potentiomtrie indirecte (environ la moiti des analyseurs multiparamtriques de biochimie), il faudra corriger les fausses hyponatrmies des hyperlipidmies et des hyperprotidmies en calculant la valeur vraie de l'eau plasmatique selon la formule ci-dessus.
4.1.3. Techniques calorimtriques
Elles sont d'introduction rcente et bases sur la complexation trs slective des ions par des chromo-ionophores macrocycliques avec, par exemple, change quantitatif entre le lithium dj prsent et le sodium intgr sa place dans l'ionophore. L'change s'accompagne d'une variation de l'absorbance 500 nm proportionnelle la concentration du sodium prsent. 4.1.4. Techniques enzymatiques galement d'introduction rcente, elles sont encore peu utilises. 4.1.5. Rpartition des mthodes de dosage en France l'occasion des oprations de contrle de qualit national obligatoire on peut connatre le pourcentage des diverses techniques utilises par les quelques 4 000 laboratoires franais. Pour les dosages de sodium et potassium les photomtres de flamme et les appareils lectrodes slectives taient en 1999 rpartis de la manire suivante : - photomtrie de flamme : 25,2 % ; - potentiomtrie directe : 39,3 % - potentiomtrie indirecte : 29,2 %.
4.2.
4.2.1.
Dosage de l'anion chlorure

Mthodologies
Principal anion plasmatique, l'ion chlorure est trs communment dos par des mthodes chimiques et par des mthodes physicochimiques. 4.2.1.1. Techniques chimiques Elles utilisent des sels de mercure qui, en prsence d'indicateurs appropris, donnent aprs combinaison avec les ions Cl" une raction colore permettant un dosage colorimtrique.
26
__ __ _______________Biochimie clinique
> MTHODE DE SCHALES
Une solution de diphnylcarbazone, virant du jaune au violac, permet un dosage colorimtrique donnant des rsultats prcis.
> MTHODE DE ZALL
Mise au point pour les appareils automatiques, cette technique utilise le thiocyanate de mercure avec lequel les chlorures ragissent pour donner, selon la raction suivante, des ions sulfocyanures : Cl- + Hg (SCN)^ -> Hg CL, + 2 SCNqui ragiront leur tour avec du nitrate ferrique produisant du sulfocyanure ferrique.color en rouge-brun.
s_^
> MTHODE AU TPTZ (TRIPYRIDYL-TRIAZINE)
Elle utilise du nitrate mercurique et du sulfate ferreux qui donnent une coloration bleue lue 595 nm avec le colorant TPTZ. Ces mthodes sont trs prcises mais polluantes, des dchets de chlorure mercurique tant dverss l'vier. 4.2.1.2. Techniques physicochimiques
> TECHNIQUE COULOMTRIQUE
Par passage du courant entre deux lectrodes en argent, il se forme des ions Ag"1' qui se combinent aux ions Cl" de la solution et produisent un prcipit de chlorure d'argent. Quand tous les ions Cl~ sont prcipits, et que des ions Ag4" apparaissent en excs, la conductibilit de la solution augmente alors brusquement, indiquant la fin de la raction. La prise d'essai est de l'ordre de 20 u,l de plasma ou de srum ; la dtermination est trs prcise sous agitation constante. Des chloridomtres lectroniques ont t raliss selon ce principe.
> TECHNIQUE LECTROMTRIQUE PAR LECTRODE SLECTIVE
L'lectrode est constitue par une membrane compacte de chlorure d'argent. Les autres halognures (Br~, I~, F") interfrent sur le dosage. Cette lectrode quipe un assez grand nombre d'automates.
quilibre hydrolectrolytique_______________________________27.
Conductibilit
AgCI -> Temps (s)
Figure 1.7 Principe d'un coulomtre. 4.2.2. Rpartition des techniques En 1999, sur 3 500 laboratoires la rpartition tait la suivante : - mthodes chimiques (colorimtrie et mercurimtrie) : 27,6 % ; - mthode coulomtrique, 7,2 % ; - mthode potentiomtrique directe : 32 % ; - mthode potentiomtrique indirecte : 23,3 %. 4.3. Dosage de l'anion bicarbonate
Sous cette dnomination, on mesure, en pratique courante, le CO^ plasmatique. En effet, stricto sensu, les bicarbonates HCOg" correspondent la diffrence entre le CO^ total et le CO^ dissous, le CO^ li aux protines sous forme carbamine tant en effet mineur.
4.3.1. Mthodes de dosage
4.3.1.1. Techniques volumtriques Elles consistent librer l'anhydride carbonique partir des bicarbonates grce un ractif acide. L'talonnage est ralis partir de solutions de bicarbonate. Le systme seringue Harleco , conu sur ce principe, est encore rpandu. 4.3.1.2. Techniques enzymatiques Elles reposent sur la carboxylation enzymatique du phosphonoipyruvate partir des bicarbonates doser dans le plasma : HC03" + Phosphonoipyruvate 1 > oxaloactate + phosphate Oxaloactate + NADH+ H4- 2 -> malate + NAD-11 = Phosphonoipyruvate-carboxykinase 2 = Malate dshydrognase.
28_____________________________________Biochimie clinique La diminution d'absorbance 340 nm est donc proportionnelle au taux de bicarbonate. La mthode est adapte sur de nombreux appareils automatiques. 4.3.1.3. Techniques lectromtriques Elles mettent en uvre soit une lectrode spcifique rpondant slectivement aux ions bicarbonates, soit une lectrode de pH, le CO^ diffusant travers une membrane et modifiant le pH d'une solution alcaline, ce qui permet une mesure diffrentielle.
Electrode de rfrence Solution de bicarbonate de sodium lectrode de verre Membrane de silicones permable COg Nylon destin supporter un film de bicarbonate directement au contact du gaz
Figure 1.8 Schma d'une lectrode de pCO^. 4.3.1.4. Techniques catharomtriques Leur principe consiste mesurer la variation de rsistance ncessaire au rtablissement de l'quilibre thermique dans une cellule chauffe par une rsistance lors du passage du flux de CCL dgag partir de l'chantillon par de l'acide lactique. 4.3.1.5. Autres techniques Ce sont des techniques colorimtriques, soit aprs cintique enzymatique, soit aprs virage d'un indicateur color (rouge de crsol ou phnolphtaline). 4.3.2. Rpartition des techniques Au cours de l'change interlaboratoire de 1998 o 3 150 rponses furent traites, on observe les rpartitions suivantes : - volumtrie : 6,2 % ; - technique enzymatique UV : 54,2 % ;
quilibre hydrolectrolytique_______________________________29 - lectromtrie : 16,3 % ; - catharomtrie : 4,6 % ; - rflectomtrie : 12,1 %.
-4.4. Dtermination de l'hmatocrite

Rappelons que l'hmatocrite est le rapport du volume globulaire sur le volume sanguin total x 100. En pratique, ces volumes sont simplement apprcis en mesurant la hauteur du culot globulaire et la hauteur totale du sang incoagulable plac dans un tube soumis centrifugation. | L'agent anticoagulant est le plus souvent l'hparine sous forme d'hparinate de lithium lorsque le prlvement est utilis aussi pour le dosage de l'ionogramme et donc du sodium.
Plasma Hmatocrite =1L
Globules
Figure 1.9 Principe de dtermination de l'hmatocrite sanguin. La centrifugation est conduite : - soit dans un tube capillaire (microhmatocrite) ; - soit dans le tube originel du prlvement (macrohmatocrite). La lecture des hauteurs dans chaque tube est soit manuelle, soit semi-automatique l'aide de rgles prgradues. L'hmatocrite peut aussi tre obtenu par calcul partir du produit VGM x nombre de globules rouges fourni automatiquement par les automates d'hmatimtrie, quelles que soient les techniques employes pour mesurer ces deux valeurs. Les valeurs observes sont de 45 50 % chez l'homme, de 40 45 % chez la femme.
Rfrences bibliographiques
M. Legrain et J.M. Suc. Abrg de Nphmiogie, Masson, Paris, 1985 (3e d.). P. Mtais et al. Biochimie clinique. Tome 1, 2e dition, Simep, Paris, 1990. f D- >, t et* al. Equilibre L J -7 . ; . i E- ri. nydrelectrolytique G. Richet normal et pathologique, Les prcis du praticien, 4e dition, J.B. Baillire, Paris, 1979^ G. Siest, J. Henny et F. Schiele. Rfrences en Biologie Clinique, Eisevier, Paris, 1990. J. De Graeve et D. Grafmeyer. Annales du contrle national de qualit. Agence franaise, de scurit sanitaire des produits de . ' ' '
2
Equilibre acidobasique
s_J
Marie-Laure Solera, Michel Lagente
Chez l'homme le pH des cellules et des liquides physiologiques de l'organisme ne doit varier que dans des limites troites. Seules de faibles variations sont compatibles avec la vie. L'organisme humain est confront rgulirement un afflux d'acides provenant de l'alimentation, surtout si celle-ci est came, et de la respiration cellulaire. La rgulation peut tre prise en dfaut si l'organisme est inond de rsidus acides comme cela peut se voir par exemple dans un diabte ou un traumatisme grave. La tendance permanente l'acidose explique que l'organisme lutte plus efficacement contre les baisses de pH que contre l'alcalose. Les moyens de lutte comprennent : - un moyen quasi instantan, automatique, mais assez vite dbord : les systmes tampons, - la mise en jeu d'un couple d'organes plus lents ragir mais particulirement puissants : les poumons et les reins.
11. t
i 1.1.
Rappels physicochimiques
pH
Le pH exprime l'acidit ou l'alcalinit d'un milieu. Il est gal au logarithme dcimal de l'inverse de la concentration en ions H"1'.
"""^[iFT
Valeurs physiologiques = 7,36 - 7,42 Variations maximales compatibles avec la vie = 6,90 - 7,70
1.2.
Systmes tampons et quation d'Henderson-HasselbaIch
Ce sont des mlanges de substances en quilibre chimique s'opposant aux variations de pH avec une efficacit d'autant plus grande que leurs concentrations sont plus leves. Ces systmes assurent dans l'organisme une rgulation rapide et automatique. Un systme tampon comprend gnralement : - un acide faible et son sel de base forte - une base faible et son sel d'acide fort. La reaction d'quilibre s'crit avec K comme constante d'quilibre :
Le pouvoir tampon est maximum si pH = pK (pK = log 1/K) c'est--dire s'il y a quilibre des 2 composantes du tampon. Le tampon quantitativement le plus important dans l'organisme est le systme bicarbonate de sodium (NaHCOg), acide carbonique (H^COg). Ce dernier est form par CO^ et HÔ sous l'influence d'une enzyme, l'anhydrase carbonique, et lors de sa dissociation, conduit l'quilibre : anhydrase carbonique K HÔ + CO^ <> IL,C03 <> H+ + HCOg(1)
Si l'organisme est soumis un acide fort, RH (R'H'1") la partie alcaline du tampon va intervenir HC3- Na+ + H+ R- > ^CO^ + RNa > HÔ + CO^ un acide fort a t transform en un acide faible (CO^) qui sera limin par les poumons. Si l'organisme est soumis une base forte, ROH (R^'OH") la partie acide du tampon va ragir ^CO^ + R+ OH'> R+HC03- + HÔ une base forte a t transforme en une base faible (R'^HCOg") qui sera limine par les reins. Si nous appliquons la loi d'action de masse la reaction (1) on peut crire :
Iquilibre acidobasique__________________________________33_
Or la concentration d'acide carbonique est proportionnelle la concentration du CO^ dissous avec un facteur de proportionnalit trs faible que l'on peut intgrer dans la constante pK et qui ne change pratiquement pas celle-ci. On peut donc remplacer dans l'quation prcdente le terme (H^CO^) par la concentration de CO^ dissous. La loi de Henry (la quantit de gaz dissous dans un liquide est proportionnelle la pression partielle du gaz temprature constante) nous permet d'crire que : (H^COg) = a pCO^ o a est la constante de solubilit Ceci nous conduit l'quation d'Henderson Hasselbaich, fondamentale pour l'tude de l'quilibre acidobasique, dans laquelle on remarque que la partie .acide est reprsente par le CO^ et la partie alcaline par les bicarbonates :
pH = 6,1 + log
apCO^
quation d'Henderson Hasselbaich
1.3.
Formes de transport du CO^ sanguin
1.3.1. CO^ dissous Une trs faible quantit du CO^ sanguin (5 %) est sous forme de CO^ dissous dont la quantit est fonction de la pCOy par l'intermdiaire de la constante de solubilit a. Une infime partie de ce CO^ dissous est sous la forme d'acide carbonique par association une molcule d'eau et est donc compris dans le CO^ dissous. CO^+HÔ>H2C03 En pratique on dtermine la quantit de CO^ dissous par la mesure de la PCO^.
34___________________________________Biochimie clinique 1.3.2. CO^ l'tat de carbamate 5 % du CO^ sanguin peuvent se trouver sous forme de carbamate par combinaison aux protines plasmatiques ou l'hmoglobine globulaire. R - NH^ + CC>2 > R - NH - COOH 1.3.3. CO^ l'tat de carbonate acide (appel encore bicarbonate) 90 % du CO^ sanguin se trouvent sous forme de bicarbonates de sodium ou de potassium (HCO^'Na'1" et HCOg'K'1'), la majorit tant situe dans le plasma. Ces carbonates acides sont synthtiss dans le globule rouge sous l'influence de l'anhydrase carbonique et migrent ensuite dans le plasma. Le CO^ total plasmatique correspondra donc : CO^ total = HCOg" plasmatique + CO^ dissous (comprenant I-LCOg) + CO^ sous forme carbamine.
2.
Rgulation de l'quilibre acidobasique
Elle fait intervenir successivement deux mcanismes : - le premier correspond la mise en jeu des systmes tampons. Ces quilibres chimiques sont d'action quasi instantane mais sont limits par les concentrations de leurs divers composants. - Le relai est pris par l'intervention des moyens physiologiques que sont les poumons d'abord et les reins ensuite. Cette rgulation est plus longue se mettre en uvre mais est d'une plus grande efficacit et pourra permettre la restauration complte du pH. Cependant dans un certain nombre de cas, ces systmes seront dbords et le pH pourra sortir des valeurs de rfrence.
2.1.
Systmes tampons
Les systmes tampons de l'organisme les mieux tudis sont ceux du sang et sont dtaills dans le tableau 2.1 avec leur pourcentage par rapport aux tampons sanguins totaux et leur pK. Le milieu intracellulaire par sa teneur en protines et l'os par sa richesse en groupements phosphates jouent vraisemblablement un rle important cependant encore mal connu.
quilibre acidobasique__________________________________35
Tableau 2.1 Systmes tampons sanguins. Tampons HCOg-m^CO^ Hmoglobine/Hmoglobinate Oxyhmoglobine/Oxhmoglobinate Protines/protinates iy*04-/HP04 2
pK 6,1 7,83 6,60 variable 6,8
% Plasma 33
% Globules % total 10 43 36 36 12 7 9
12 2
2.7.7. Systmes tampons plasmatiques V^l.1.1. Systme acide carbonique-bicarbonates C'est quantitativement le plus important des systmes tampons plasmatiques. Il reprsente 25 30 mmol/1. Ce systme est surtout puissant pour lutter contre l'acidose puisque le rapport bicarbonates/acide carbonique est de l'ordre de 20. En prsence d'un acide RH nous aurons la raction : R-H+ + Na^CC^- > ^003 + RNa > CO^ + HÔ + RNa
M.7.2. Systme protines-protinates
II a une action surtout comme moyen de lutte contre l'acidose. Le pouvoir tampon des protines est du leurs diffrents groupements constitutifs. Les rsidus d'acides amins basiques comme l'arginine, l'omithine, la citrulline, la lysine, l'histidine permettent de lutter contre l'acidose en fixant un proton. Au contraire les rsidus d'acide aspartique ou d'acide glutamique permettent de lutter contre l'alcalose en librant un proton. Les protines plasmatiques reprsentant environ 70 g/1, leur rle dans cet quilibre acidobasique n'est pas ngligeable. 2.1.1.3. Systme tampon phosphate La concentration plasmatique des phosphates inorganiques (Pi) est de l'ordre de 1 mmol/1. C'est dire que ces molcules jouent un rle plasmatique mineur parmi les systmes tampons. 85 % des Pi sont, au pH du sang, sous forme de phosphates mono acides disodiques (PO^Hâ^) ce qui leur permet de fixer un proton pour donner des phosphates diacides monosodiques (PO.H^Na"1'). Les 15 % de phosphates diacides peuvent au contraire cder un proton pour lutter contre une alcalose. La raction globale s'crit : P04H=Na2+ + H-^ <> PC^H^-Na^ + Na4-
^6_____________________________________Biochimie clinique
2.1.2. Systmes tampons globulaires Les systmes des bicarbonates et des phosphates jouent un rle non ngligeable l'intrieur des globules rouges. Les systmes tampons lis l'hmoglobine sont cependant beaucoup plus importants si l'on se souvient que la quantit d'hmoglobine est de l'ordre de 150 g par litre de sang. Ils interviennent de deux manires diffrentes : - grce au pouvoir de fixation du gaz carbonique sur l'hmoglobine avec formation de drivs carbamins. HbNH2 + CO;, > HbNHCOO- + H+ - grce la ractivit du groupement imidazole des rsidus d'histidine capable de fixer les ions H'1". Au pH du sang l'hmoglobine et l'oxyhmoglobine se comportent comme des acides faibles pouvant se dissocier : HbH > Hb- + H+ HbO^H > HbO^- + H-1pK = 7,83 pK = 6,60
L'oxyhmoglobine est donc plus acide que l'hmoglobine. En fait ces deux dernires ractions sont intriques (figure 2.2). En effet l'oxyhmoglobine tant un acide plus fort que l'hmoglobine quand l'hmoglobine est oxygne au niveau des poumons, elle libre des ions H+. HbH + O^ + K+ > Hb02-K+ + H+ Au niveau des tissus l'oxyhmoglobine est rduite en hmoglobine et celle ci va laisser dans le milieu une base en captant un proton venu de la dissociation de l'acide carbonique. ^003>H++HCC>3Hb02-K+ +++ HC3-> HbH + HC^-K-^ + 0^ Au niveau des tissus la concentration leve en CO^ et la richesse des acides organiques vont diminuer le pH et cette acidit va permettre la libration de l'oxygne de l'oxyhmoglobine. Cette action du pH sur l'oxygnation de l'hmoglobine (figure 2.1) est appel effet BohrÂ pression partielle d'oxygne (pCy gale, par exemple 40 mm de mercure (Hg), la saturation de l'hmoglobine est moindre pour un pH 7,2 que pour un pH 7,6.
quilibre acidobasique__________________________________37^
20
40
60
Pa O; en mm de Hg
Figure 2.1 Effet Bohr.
2.2.
Rgulation physiologique du pH
Lors d'un dsquilibre acidobasique, la premire ligne de dfense est forme par les systmes tampons, la seconde est la rgulation pulmonaire et la troisime st la restauration long terme par les mcanismes rnaux. 2,2 .1. Rgulation pulmonaire 2.2.1.1. Centre respiratoire bulbaire Ce centre est sensible la variation de la concentration en protons du sang c'est--dire au pH. Une diminution du pH va entraner une augmentation du rythme et de l'amplitude respiratoires de faon liminer le CO^ en excs. L'augmentation du pH qui en rsulte freinera la stimulation bulbaire. Rciproquement une augmentation du pH sera responsable d'une diminution du rythme et de l'amplitude respiratoires. Dan^/ce dernier cas la reaction pulmonaire doit rester compatible avec une oxygnation correcte du sang. A un moindre degr interviennent des chmorecepteurs aortiques et carotidiens sensibles la p0^ sanguine et qui stimulent le centre bulbaire. Une diminution de la p0^ sera par exemple responsable d'une hyperventilation. Les caractristiques de cette rgulation pulmonaire sont une mise en uvre rapide et une grande sensibilit aux variations du pH. Cependant son efficacit est limite car l'hyperventilation ne peut tre augmente indfiniment et l'hypoventilation doit rester compatible avec la vie. De
J18___________________________________Biochimie clinique plus les poumons n'interviennent que sur la composante acide du systme bicarbonate/acide carbonique. 2.2.1.2. Les changes gazeux dans l'organisme
> AU NIVEAU TISSULAIRE
Les tissus de par leur mtabolisme fabriquent une grande quantit de CO^ qui doit tre pris en charge et limin au niveau des poumons. Les globules rouges (figure 2.2), ce niveau tissulaire, arrivent chargs d'oxyhmoglobine. Le CO^ tissulaire, aprs avoir t dissous dans le plasma, va pntrer dans le globule rouge : - une petite quantit de ce gaz se fixe sur l'oxyhmoglobine pour constituer un carbamate en librant l'oxygne. - la plus grande partie du CO, ragit avec de l'eau pour former en prsence de l'anhydrase carbonique, dont le globule rouge est riche, de l'acide carbonique. L'acide carbonique se dcompose immdiatement en H"1" et CO^~. Cet afflux de protons fait baisser le pH entranant la libration de l'oxygne de l'oxyhmoglobine. Les ions H"1" se fixent alors sur l'hmoglobine laissant les ions bicarbonates dont un grand nombre va sortir de la cellule permettant autant de chlorures de pntrer. Cet change bicarbonate/chlorure est appel effet Hamburger . Le CO^ tissulaire a donc t transform en bicarbonates dont le plus grand nombre ne reste pas dans le globule rouge et sera transport par le plasma vers les poumons (ou les reins) pour son limination.
^- AU NIVEAU PULMONAIRE
Les globules rouges arrivent ici chargs de doxyhmoglobine (HbH) et pour une petite part de carbaminohmoglobine. L'oxygne de l'alvole pulmonaire, aprs s'tre dissous dans le plasma pntre dans le globule rouge : - une petite partie se fixe sur la carbaminohmoglobine librant alors le CO^. - la part la plus importante vient se fixer sur l'hmoglobine librant alors un proton (rappelons que l'oxyhmoglobine est plus acide que l'hmoglobine). Ce proton, en prsence d'un bicarbonate plasmatique chang contre un chlorure, se retrouve sous forme d'acide carbonique qui se dissocie immdiatement en CO^ et FLD. Le gaz carbonique est alors limin dans l'air alvolaire aprs avoir t dissous dans le plasma. Le poumon est ainsi capable d'liminer normalement 20 moles de gaz carbonique par jour.
Figure 2.2 Schma des changes respiratoires. 2.2.2. Rgulation rnale
Elle est plus longue ragir en cas de perturbations car elle intervient en troiposition. Cependant elle peut durer plus longtemps et reprsente un o trs efficace de lutte aussi bien contre l'acidose que contre l'alcalose. ;lons que l'on peut considrer l'urine primitive comme un ultrafiltrat du plasma sanguin. Le rle du rein sur l'quilibre acido-basique est double :
40___________________________________Biochimie clinique - il peut rabsorber la quasi totalit des bicarbonates filtrs, ou bien excrter ceux ci en cas de surcharge alcaline, - il peut liminer des ions H4" en gnrant des bicarbonates qui seront absorbs. 2.2.2.1. Rabsorption ou excrtion des bicarbonates La cellule tubulaire proximale, riche en anhydrase carbonique, peut synthtiser de l'acide carbonique partir de CO^ et d'ELO. Celui-ci se dissocie immdiatement (figure 2.3) en protons et en bicarbonates. L'ion H"1" est chang contre un ion Na'1' de l'urine primitive laissant le bicarbonate qui sera rabsorb. Dans l'urine l'ion H'1" se combinera avec un bicarbonate pour former un acide carbonique qui se dissocie immdiatement en CO^ et eau. Ce CCL sera rabsorb et participera la raction catalyse par l'anhydrase carbonique. On peut donc dire qu' un bicarbonate filtr correspond un bicarbonate rabsorb. Normalement plus de 90 % des bicarbonates filtrs sont ainsi rabsorbs. La rabsorption des bicarbonates dpend en particulier de la pCO^ dont une lvation entrane une rabsorption accrue et rciproquement. C'est aussi ce niveau qu'est reabsorb en totalit le potassium filtr.
AC = Anhydrase carbonique | Tube proximal Tube distal
Anse de Henl
URINE
Figure 2.3 Rle du rein dans l'quilibre acidobasique
2.2.2.2.
limination d'ions H*
Elle se droule au niveau du tube contourn distal o la cellule rnale, riche ici aussi en anhydrase carbonique, limine un proton en l'changeant contre un ion sodium. Le bicarbonate gnr est ensuite rabsorb dans le sang. La rabsorption du sodium est sous le contrle de l'aldostrone.
^quilibre acidobasique__________________________________41
A ce niveau existe une comptition entre un ion H"1" et un ion K"1" dans l'change avec l'ion sodium rabsorb : si un H"1" est limin un ion K"1" est retenu et rciproquement. - Ces ions H"1' peuvent se fixer sur des phosphates monoacides pour donner des phosphates diacides. Il s'agit de ce que l'on appelle l'acidit titrable qui est dfinie comme la quantit de soude 0,1 N ncessaire pour ramener le pH urinaire au pH plasmatique. - Les ions H"*" peuvent se fixer aussi sur une molcule d'ammoniac (NHg), issue de la glutamine ou de certains autres acides amins, pour former un ion ammonium NI-L4' qui, trs peu diffusible, ne sera pas rabsorb. La comptition dans l'change contre un ion sodium, d'un proton ou d'un ion potassium, est responsable de l'interaction du mtabolisme du potassium avec l'quilibre acido-basique. Cette interaction rnale est complte par une dpendance des deux mtabolismes au niveau cellulaire (figure 2.4). - En cas d'excs d'ions H'1' ceux ci sont limins prfrentiellement par le rein la place d'ions potassium et de plus pntreront dans les cellules faisant sortir le potassium. Une acidose sera gnratrice d'hyperkalimie et rciproquement - En cas de dficit en ions H"1' le potassium sera limin prfrentiellement au niveau rnal et les ions H"*" sortiront des cellules en change avec des ions K"1'. Une alcalose sera gnratrice d'hypokalimie et rciproquement.
Acidose
Alcalose
Figure 2.4 changes cellulaires au cours des perturbations de l'quilibre acidobasique.
t.
^.l.
Exploration biochimique
Prlvement
^ DOSAGE PLASMATIQUE OU SRIQUE SUR SANG VEINEUX
Beaucoup d'automates dterminent, ct de nombreux autres constituants plasmatiques, les bicarbonates ou le CO^ total :
- les bicarbonates peuvent tre mesurs par une mthode colorimtrique (presque abandonne aujourd'hui) ou par une mthode enzymatique ; - le CO^ total est le plus souvent mesure par une mthode lectromtrique aprs que l'ensemble du CO^ plasmatique (bicarbonates compris) ait t libr par un acide. Dans ces conditions le prlvement est effectu normalement sur sang veineux et la deuxime mthode donne des rsultats lgrement plus levs que la premire.
^- SANG ARTRIEL
Une vritable exploration des gaz du sang, appele gnralement gazomtrie mesure le pH, la pCOy la p0^. Dans ces conditions le prlvement doit tre artriel ce qui permettra d'apprcier en particulier l'hmatose (l'oxygnation du sang). Le patient doit tre au repos pour viter les effets d'une hyperventilation de stress, et la ponction se fait au niveau d'une artre (fmorale, humrale...). Chez le nourrisson une micromthode peut tre pratique, et si l'accs artriel est dlicat, une ponction capillaire priphrique sera prfre (au niveau d'un doigt, du lobe de l'oreille, ou du talon aprs dilatation vasculaire par massage ou chaleur). Dans tous les cas, le sang est prlev sr hparine, sans introduction de bulle d'air, homognis par retournement, et maintenu en anarobiose stricte jusqu' son analyse. On pourra noter la temprature du patient ce qui permettra de faire d'ventuelles corrections. Le matriel le plus frquemment utilis est la seringue hparine, maintenue hermtique aprs ponction par un bouchon. Le capillaire utilis pour une micromthode devra contenir un petit barrau en fer permettant l'homognisation du sang avant analyse l'aide d'un aimant extrieur. Le capillaire sera bouch hermtiquement aux deux extrmits avec du mastic. Le prlvement sera analys sans dlai, et en cas de force majeure, devra tre maintenu au rfrigrateur + 4C pendant un maximum d'une heure.
3.2.
Mesures de trois paramtres : pH, POy PCO^
Bien que la mesure soit effectue sur sang total, les lectrodes slectives utilises sont sensibles aux lments contenus dans l'eau plasmatique et les rsultats sont donc ceux du plasma et non du sang total. 3.2.1. Mesure du pH Elle est faite l'aide d'une lectrode de verre schmatise dans la figure 2.5 thermostate 37 C et miniaturise (figure 2.6). La diffrence de potentiel est obtenue par rapport une lectrode de rfrence.
Systme de mesure de la ddp et microprocesseur associ LECTRODE DE MESURE DUpH VERS L'LECTRODE DE RFRENCE La jonction lectrique est assure par l'chantillon de sang, toutes les lectrodes baignant dans la mme chambre de mesure.
AgCI sur un fil d'argent Solution acqueuse - d'HCI Membrane en verre spcial Spcimen mesurer 1
Figure 2.5 lectrode de veire^ppur la mesure du pH associe une lectrode de rfrence. ence.
Solution tampon contenant des Joint ions chlorures torique Fiche d'lectrode
lembrane je verre sensible aupH
recouvert d'AgCI Enveloppe de plastique
fixation Joint torique Mercure Pte Hg. Hg^CIs. HCI. Tampon de coton Gaine protectrice Solution 20 % deKCI
burc2.
lectrode de mesure du pH et de rfrence (Socit Radiometer, Copen-
ague).
3.2.2. Mesure de la p0^ La p0^ est mesure par une mthode polarographique utilisant l'lectrode de Clark dont le principe est donn dans la figure 2.7 et un exemple de commercialisation dans la figure 2.8.
Systme de mesure de la ddp et microprocesseur associ
CATHODE
- en platin dans sa gaine de verre
ANODE -Ag/AgCI
Electrolyte en solution . (KCI) Membrane en polypropylne permable l'oxygne
Figure 2.7 lectrode de Clark
Les valeurs physiologiques sont : 70 95 mmHg sang A 37 40 mmHg sang V soit 9,31 12,63 kPa soit 4,92 5,32 kPa
II faut noter que la p0^ artrielle diminue avec l'geâvec l'altitude.
Equilibre acidobasique__________________________________45 Age (en annes) 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 pO^ (mmHg) moyenne et extrmes 94 (84-104) 91 (81-101) (78-98) 88 (74-94) 84 81 (71-91)
Membrane de polypropylne 20p.
Cathode de Pt Figure 2.8 lectrode de mesure de la p0^.

(Socit Radiometer Copenhague.)
Le principe de la mesure de la p0^ est bas sur le fait qu'une lectrode soumise un potentiel de polarisation constant (0,6 volt) fournit un courant directement proportionnel la p0^ diffusant au niveau de la surface de raction de l'lectrode. Ce courant est produit par la rduction de l'O^ au niveau de la cathode (fil de platine). 02 + 2HÔ + 4e- > 4 OHL'alimentation en lectrons la cathode, est assure par une anode en argent chlorur (Ag/AgCl). Ag>Ag + +e-
46___________________________________Biochimie clinique Le dbit d'lectrons consomms est proportionnel la pO^ prsente. L'lectrode est recouverte d'une membrane de polypropylne permable aux gaz et l'O^ ce qui la rend spcifique. Il faut la changer tous les 20 30 jours. Sur les nouveaux appareils, les lectrodes sont jetables. La dtrioration de la membrane se reconnat par une diminution de la sensibilit et une instabilit. La p0^ mesure est directement en rapport avec l'O^ dissous dans le sang et non avec l'O, combin l'hmoglobine. Au cours d'une asphyxie l'oxyde de carbone, dans laquelle l'hmoglobine n'est plus apte transporter l'oxygne, la p0^ peut tre normale. La p0^ est trs sensible aux variations de temprature. Il faut bien thermostater l'lectrode et tenir compte de la temprature du sujet. Si le prlvement a t conserv + 4, rchauffer rapidement celui-ci temprature ambiante avant le dosage. 3.2.3. Mesure de la pCO^ Elle est faite grce l'lectrode de Severinghaus (figure 2.9) dont un exemple de commercialisation est donn dans la figure 2.10.
lectrode de rfrence Solution de bicarbonate de sodium lectrode de ph en verre
Membrane permettant de maintenir le tampon bicarbonate au contact du gaz carbonique mesurer
Membrane de tflon permable CO;
Figure 2.9 lectrode de Severinghaus : le CO, du spcimen fait varier le pH de la solution de bicarbonate mesur paf l'lectrode de verre.
Valeurs physiologiques = 35 44 mmHg sang A soit 4,65 5,85 kPa 42 48 mmHg sang V soit 5,58 6,38 kPa La mesure de pCO^ se ramne une mesure de pH. Par mthode lectromtrique, on mesure les variations de pH d'une solution de bicarbonates spare du sang par une fine membrane en tflon (ou silicone) permable au CO^ uniquement. La diffusion du CO^ entrane un abaissement du pH qui est proportionnel la quantit de CO^ prsent. L'lectrode est compose d'une lectrode de mesure de pH en verre et d'une lectrode de rfrence miniaturise. Le CO^ de l'chantillon diffuse travers la membrane puis se dissout dans l'lectrolyte. CO^+HÔ>H2C03 B^>H++HCC3L'augmentation de H"*" fournit un potentiel variant logarithmiquement avec la pCO^.
Espaceur en nylon mont poste fixe
Bulle d'air
Figure 2.10 Electrode de mesure de la pCO,.

(Socit Radiometer Copenhague.)
4&___________________________________Biochimie clinique
33.
Calcul des autres paramtres
Les appareils modernes permettent, partir d'abaques mises en mmoire, de calculer un certain nombre de paramtres supplmentaires. Certains demandent la connaissance de la concentration en hmoglobine qui est souvent directement mesure par l'appareillage, mais qui parfois sur d'autres types de matriel doit tre introduite dans le calculateur si elle est connue. Si elle n'est pas connue il est possible de donner une valeur forfaitaire. 3.3.1. Concentration en bicarbonates C'est la concentration des ions HCO, en mmol/1 de plasma qui est dduite par le calcul de la mesure de pCO, et du pH l'aide de l'quation d'Henderson Hasselbalch. (HCC>3-) = a x lO-P1^ x pCO^ x 10P" a = coefficient de solubilit du CO^ Valeurs normales : 22 26 mmol/1. Diffrentes mthodes, par mthode enzymologique ou potentiomtrie sur automates effectuant l'ionogramme permettent de doser directement les bicarbonates (cf. chapitre 1 quilibre hydrolectrolytique). 3.3.2. Bicarbonates standard C'est la concentration plasmatique en bicarbonates (mmol/1) qu'aurait le sang de ce patient s'il tait quilibr une pCO^ de 40 mmHg et 37 C. Valeurs normales : 24 mmol/1 2 mmol/1. 3.3.3. Concentration en CO^ total C'est la quantit totale de CO^ plasmatique que ce spcimen possde. Elle correspond au CO^ qui pourrait tre extrait de ce plasma en prsence d'un acide fort. CO^ total = apCO^ + H^COg + (HCO^) + CO^ combin Valeurs normales : 25 mmol/1.
3.3.4. Bases tampons
C'est la somme des concentrations en mmoles des anions tampons d'un litre de sang total [(HCO^"), protines, hmoglobine, phosphates]. Valeurs normales : 46 48 mmol/1.
| quilibre acidobasique__________________________________49.
3.3.5. Excs de base
C'est la diffrence entre la valeur des bases tampons calcule du sujet tudi et celle des bases tampons d'un individu normal (47 mmol/1). Valeurs normales : 0 2mmol/l. Mme ngative cette expression s'appelle excs de base . 3.3.6. Saturation en 0^ La majeure partie de l'O^ sanguin est fixe sur l'hmoglobine. La capacit en 0^ l'tat combin du sang est la plus grande quantit d'oxygne qui peut tre fixe par le pigment. Le contenu en 0^ est la quantit d'oxygne rellement fixe par l'hmoglobine. Le rapport : Hb oxygne/Hb oxygnable = Saturation en 0^ (SaO^). Valeurs normales : 95 98 %.
3.4.
Reprsentation graphique : diagramme de Davenport
De nombreux diagrammes ont t proposs pour aider l'interprtation des rsultats. L'un des plus classiques est celui de Davenport (figure 2.11). Ce diagramme exprime la concentration des bicarbonates en fonction du pH.
Bicarbonates .6,90 7,00 7,10 7,20 7,30 7,40 7,50 7,60 7,70
A : Acidose ventilatoire B : Alcalose mtabolique C. Alcalose ventilatoire D : Acidose mtabolique E : Acidose mixte F : Alcalose mixte
6,90 7,00 7,10 7,20 7,30 7,40 7,50 7,60 7,70 pH
Figure 2.11 Diagramme de Davenport.
Il existe 2 lignes importantes sur ce diagramme : - la ligne tampon normale (ligne droite oblique) correspond aux diffrentes valeurs de la concentration en bicarbonates et de leur pH correspondant, d'un sang total quilibr diffrentes pressions partielles de CO^ ; - la ligne isobare paCO^ = 40 mm de Hg est exprimentalement dtermine en calculant avec l'quation d'Henderson Hasselbaich le taux des bicarbonates en fonction de la valeur du pH pour une pCO, de 40 mm Hg. Ces deux lignes dfinissent, avec la verticale du pH normal, 6 secteurs correspondant aux diffrentes perturbations rencontres (A F).
4.
Dsquilibres acidobasiques
,, , . (HCO,-) pH=6.1+log apCU^
La connaissance de l'quation d'Henderson Hasselbaich rappele ci-aprs :
permet de voir que le pH est directement li la valeur du rapport (HC3-) a x pCO^
}
~__--'
Les bicarbonates du numrateur sont d'origine mtabolique et sont lis la fonction rnale. La pCO^ du dnominateur est d'origine respiratoire et est lie la fonction pulmonaire. Les variations du pH peuvent tre la consquence : - d'une diminution des bicarbonates responsable d'une acidose mtabolique ; - d'une augmentation des bicarbonates responsable d'une alcalose mtabolique ; - d'une diminution de la pCO^ responsable d'une alcalose respiratoire ; - d'une augmentation de la pCO^ responsable d'une acidose respiratoire. En cas de perturbation de la valeur du pH l'organisme met en jeu un systme de compensation qui a pour but de ramener le rapport HCOo/a x pCO-, une valeur normale. - En cas d'acidose mtabolique la compensation se fera par une diminution de la pCO^. - Une alcalose mtabolique sera compense par une augmentation de la pCO^. - Une acidose respiratoire par une augmentation des bicarbonates. - Une alcalose respiratoire par une diminution des bicarbonates.
quilibre acidobasique__________________________________51_
Un pH qui est en dehors des valeurs de rfrence correspond une perturbation dcompense. Si malgr le dsquilibre acido-basique le pH est maintenu l'intrieur des valeurs de rfrence on dira que la perturbation est compense.
4.1.
Acidose mtabolique
Elle correspond un trouble du mtabolisme d l'accumulation d'acides (anions indoss ou trou anionique) ou une perte excessive de bases. Elle se caractrise par une diminution des bicarbonates plasmatiques et donc une baisse du pH. 4.1.1. Etiologies II s'agit habituellement de surcharges en acides avec augmentation du trou anionique. Trou anionique : (Na+ + K+) - (Prot + Cl- + 03 H- + 2) > 5 mEq/1. Les surcharges en acides sont dans la plupart des cas d'origine endogne.
4.1.1.1. Augmentation des corps ctoniques
La ctonmie normale doit tre infrieure 0,6 mmol/1. - L'jacidoctose diabtique est due une production excessive de corps ctoniques (acide actoactique et acide (3-hydroxybutyrique) provoque par l'utilisation hpatique d'un excs d'actyl CoA provenant de l'oxydation des acides gras. L'abaissement du taux de HCC^" peut descendre jusqu' 5 mmol/1 avec une menace vitale immdiate. C'est le coma mtabolique le plus frquent. - Le jene prolong provoque aussi une augmentation des acides actoactique et (3-hydroxybutyrique.
4.1.1.2. Acidose lactique
Le taux normal d'acide lactique est de 1 1,7 mmol/1. Le taux normal de l'acide pyruvique est de 0,05 0,07 mmol/1. L'acidose lactique est la consquence habituelle d'une anoxie cellulaire au cours des tats de choc svre. Elle peut tre retrouve dans le cadre d'une circulation extracorporelle. Elle est observe galement en cas d'exercice musculaire intense, dans les tats de mal pileptique, dans les cirrhoses, dans les pancratites, les leucoses aigus. Elle peut tre d'origine toxique, la suite de la prise de biguanides (traitement du diabte gras). Les acidoses lactiques par dfaut de certaines enzymes sont rares avec des
origines diverses (maladie de Von Gierke avec dficit en glucose 6 phosphatase, dficit en fmctose diphosphatase, de glycogne synthtase... t).
4.1.1.3. Acidose rnale par atteinte rnale
Lorsque la clairance de la cratinine est infrieure 0,5 ml/s, l'acidose est constante avec augmentation modre des indoss anioniques. En cas d'hypovolmie l'insuffisance rnale fonctionnelle qui en rsulte peut tre responsable d'une acidose mtabolique. La diminution de la filtration glomrulaire entrane une rtention des acides produits par le catabolisme protidique. 4.1.1.4. Apports d'acides exognes On les observe au cours des intoxications : - par l'thylne glycol, le mthanol, les salicyls... ; - par apport excessif de chlorure d'ammonium, de chlorhydrate d'arginine, de lysine ou de mthionine utiliss dans le traitement des alcaloses. 4.1.1.5. Pertes de bicarbonates Elles peuvent rsulter : - De pertes par voie digestive, d'origine surtout ilale et colique (diarrhes profuses). - De pertes par voie rnale : Dans l'acidose tubulaire proximale avec urines riches en HCO^" il y a dfaut de rabsorption du HCOg" au niveau du tubule proximal. Certains diurtiques tels que les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique (Actazolamide) peuvent tre responsables d'une acidose mtabolique. Dans l'acidose tabulaire distale il y a dfaut de scrtion distale d'ions H"1".
4.1.2. Compensation physiologique
La compensation respiratoire, ayant pour but la baisse de la pCO^, intervient rapidement dans les minutes qui suivent. Elle est dclenche par la baisse de pH note par les chmorcepteurs priphriques qui provoquent une stimulation du centre respiratoire jusqu' une rduction importante de pCO^ : La respiration qui en rsulte a pour caractristiques un rythme acclr avec une amplitude augmente et peut se traduire au maximum par la respiration de Kussmaul (respiration profonde et ample, gale aux deux temps et spars par une pause : respiration en crneau). La compensation respiratoire, bien que trs efficace, reste partielle pour des raisons de limitations anatomiques, physiologiques et biochimiques (le travail musculaire li la respiration est lui-mme gnrateur d'acides). Dans ces conditions c'est le systme tampon des bicarbonates qui est mis lar-
|"
gement contribution et il y a une baisse considrable de ceux-ci. Le rein va ainsi contribuer ramener le pH vers les valeurs de rfrence. La compensation rnale va se faire par l'augmentation de l'limination des ions H+ avec augmentation de l'acidit titrable de l'urine et de l'ammoniurie. Bien sr le rein doit tre fonctionnel. En cas d'acidose mtabolique intense, au cours d'un coma acido-ctosique par exemple, les possibilits d'limination rnale des ions H4' peuvent tre dpasses et l'organisme perd des quantits importantes de sodium et de potassium (pas d'change avec les ions H'1"). De plus la perte hydrique caractristique de ce syndrome entrane une hypovolmie responsable d'une insuffisance rnale fonctionnelle qui va aggraver l'acidose. 4.1.3. Tableau clinique Deux formes peuvent tre diffrencies : - les formes lgres qui sont soit asymptomatiques soit associes une asthnie et des nauses. - les formes graves qui prsentent une hyperpne avec respiration profonde (rythme de Kussmaul). L'acidose peut aboutir un tat de choc, obnubilation et coma. 4.1.4. Tableau biologique L'analyse des gaz du sang et du bilan lectrolytique prsente diffrentes perturbations : - Le pH sanguin artriel < 7,35 sauf s'il y a compensation. - Les bicarbonates sont trs diminus : < 15 mmol/1. - La pp^ et le CO^ total sont trs diminus du fait de la compensation. - Un trou anionique est toujours prsent dans les acidoses par perte de HCO^". Il est trs important dans l'acidoctose et l'acidose lactique. - La kalimie est augmente par changes cellulaire et rnal entre K"1" et H"1" ; ainsi un pH 7,20 entrane une kalimie de 7 mmol/1. - La kalimie peut tre normale dans l'acidose tubulaire proximale par perte rnale de K"*" ou au cours des diarrhes qui se traduisent par une perte digestive deK+. - La compensation rnale est efficace s'il y a augmentation de l'acidit urinaire et des ions NI-L^ Aprs dcompensation la situation de Ptt acido-basique du sujet apparat dans le quadrant D infrieur gauche du diagramme de Davenport. 4.1.5. Traitement Le traitemenfest tiologique. La ranimation d'une acidose s'effectue le plus souvent dans le cadre de l'urgence avec perfusion d'alcalinisants et hydratation, et si ncessaire puration extra-rnale.
54^_____________________________________Biochimie clinique
4.2.
Acidose respiratoire
Elle correspond une diminution de l'limination du CO^ avec augmentation de la pCO^ (hypercapnie) et diminution du pH sanguin.
4.2.1. tiologies
4.2.1.1. Diminution des mouvements de la cage thoracique Les principales causes sont : - une atteinte de la paroi par des traumatismes ; - une atteinte nerveuse ou musculaire par dystrophies musculaires, myasthnie, poliomylite ou curarisants. 4.2.1.2. Diminution de la surface alvolaire disponible Les pathologies au cours desquelles cette diminution peut tre rencontre sont les suivantes : - les bronchopneumopathies chroniques obstructives par emphysme ou asthme ; - les bronchopneumopathies restrictives par fibrose pleurale ou pulmonaire, pneumothorax ou dme aigu du poumon ; - la mucoviscidose dans laquelle est retrouve une dilatation des bronches avec hyperscrtion bronchique. 4.2.1.3. Hypoventilation par inhibition des centres respiratoires Dansâdre sont retrouvs : - un accident vasculaire crbral ; - une hypotension intracrnienne ; - une atteinte bulbaire par anesthsiques, morphiniques, tranquilisants, barbituriques ou alcool. 4.2.1.4. Air vici par augmentation du CO^ (caves, grottes...) 4.2.1.5. Insuffisance respiratoire aigu avec hypoxmie aigu et dtresse respiratoire (cause toxique, mdicamenteuse, traumatique). Il est important de distinguer le caractre aigu ou chronique des acidoses respiratoires. 4.2.2. Compensation physiologique La compensation sera rnale par une augmentation de la rabsorption des bicarbonates et limination des ions H4" (l'augmentation de la pCCL augmente la
concentration d'acide carbonique gnrateur d'ions H'1"). Ce mcanisme ayant une inertie relativement importante l'augmentation des bicarbonates n'apparatra qu'au bout de quelques jours, permettant de faire la diffrence entre une acidose respiratoire aigu bicarbonates normaux et une acidose chronique bicarbonates augments. Dans ces conditions la compensation est lente mais efficace. Si le taux des bicarbonates ne peut suivre l'lvation de la pCO^ le pH diminue et l'acidose est dcompense. Les acidoses aigus sont assez mal compenses alors que les acidoses chroniques sont bien compenses. 4.2.3. Tableau clinique Le patient prsente des cphales, une cyanose lorsqu'il y a hypoxie associe, une confusion, une somnolence pouvant aboutir un coma. L'acidose est grave dans les formes aigus o l'augmentation de la pCO^ est mal compense avec chute brutale du pHy 1 4.2.4. Tableau biologique Les examens sanguins et urinaires montrent : - Un pH artriel d'autant plus diminu que l'atteinte est aigu, - Une pCO^ augmente. - Des bicarbonates augments et des chlorures abaisss. - Une p0^ trs diminue. La p0^ basse est un signe d'insuffisance respiratoire plus discriminant que l'augmentation de la pCO^. En effet, le CCL diffuse beaucoup mieux travers la membrane alvolocapillaire et certaines insuffisances respiratoires ont une pCO^ normale mais une p0^ diminue. - Le pH urinaire est trs diminu et l'ammoniurie augmente si le rein compense. Aprs dcompensation la situation de l'tat acidobasique du sujet apparat dans le quadrant suprieur gauche A du diagramme de Davenport.
4.2.5. Traitement
Des analeptiques respiratoires peuvent tre prescrits associs ou non une ventilation assiste. Une trachotomie peut parfois tre pratique. L'oxygnothrapie est administrer avec prcaution chez les insuffisants respiratoires car la stimulation centrale due l'hypercapnie est alors diminue. Les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique (actazolamide), qui s'opposent la rabsorption de HCOg", sont dangereux car ils entranent une dcompensation rapide chez l'insuffisant respiratoire.
4.3.
Alcalose mtabolique
Elle est peu frquente. Elle est due une alcalinisation provoque par un excs de bicarbonates ou une perte d'ions H"1'. 4.3.1. tiologies 4.3.1.1. Pertes digestives d'ions H^ Elles sont provoques : - par des vomissements dus une stnose du pylore ou une obstruction au niveau du grle proximal (occlusion) ; - par une aspiration gastrique. 4.3.1.2. Pertes rnales d'ions-ff' Elles sont la consquence : - d'une dpltion chlorure par utilisation de certains diurtiques (Furosmide). Ceux-ci inhibent la rabsorption des chlorures au niveau de l'anse de Henl. Cette inhibition a pour consquence une non reabsorption du sodium ce niveau (maintien de l'quilibre anions-cations). L'afflux de sodium au niveau du tubule rnal entraine sa rabsorption liminant des ions H'1' et des ions K"1" ; - de certains hypercorticismes : dans le cadre d'un syndrome de Cushing primitif ou iatrogne ; dans l'hyperaldostronisme primitif (syndrome de Conn) ou secondaire ; - de l'ingestion excessive de substances effet minralocorticode (acide . glycyrrhiziûe-de la rglisse). 4.3.1.3. Charges en alcalins suprieures aux possibilits d'excrtion rnale Elles sont rencontres au cours de certains traitements (apport excessif de bicarbonates) ou de rgimes particuliers (buveurs de lait, rgimes vgtariens). 4.3.2. Compensation physiologique La compensation va se faire par une augmentation de la pCO^ par dpression des centres respiratoires (hypoventilation). Il y aura diminution des changes respiratoires et normalisation du pH. Lorsque les bicarbonates deviennent suprieurs 30 mmol/1, les urines deviennent alcalines. C'est la participation rnale la compensation par diminution de la rabsorption des bicarbonates et de la production de NH^"*".
4.3.3.
Tableau clinique
Le patient prsente une respiration lente et superficielle associe une hyperexcitabilit neuromusculaire due l'hypocalcmie ionise. Rappelons qu'en cas d'alcalose le calcium ionis se fixe en plus grande quantit sur les protines.
4.3.4. Tableau biologique
Les dosages sanguins et urinaires montrent : - un pH sanguin artriel augment mais rapidement et partiellement compens ; - une pCO^ augmente ; - des bicarbonates augments plus de 30 mmol/1 ; - une p0^ diminue ; - une hypokalimie ; ^ - un pH urinaire qui peuj>tre augment. Aprs dcompensation la situation de l'tat acidobasique du sujet apparat dans le quadrant suprieur droit B du diagramme de Davenport.
4.3.5. Traitement
II est avant tout tiologique. La ranimation visera : - liminer facilement les bicarbonates sous perfusion, - corriger l'hypokalimie.
4.4.
Alcalose respiratoire
Elle correspond une diminution de la pCO^ (hypocapnie) dont l'origine est respiratoire.
4.4.1. tiologie
L'alcalose respiratoire est habituellement due une hyperventilation et parfois un abaissement de la pression partielle en 0^. Les diffrentes causes sont : - une anxit ou une douleur violente ; - l'hyperventilation d'origine centrale : affections du systme nerveux central ; - l'hyperventilation d'origine hypoxique : on spare deux types d'hypocapnies hypoxiques par l'tude de la SaO^ et de la pO^. Le plus frquent est dit anoxmique et est la consquence d'une respiration en atmosphre rarfie ou d'une diminution des changes respiratoires par lsions pulmonaires tendues. Dans les deux cas la p0^ est trs diminue. Le deuxime mcanisme est dit anmique et correspond la perte du pouvoir
oxyphorique de l'hmoglobine (possibilit de transporter l'oxygne). La p0^ est augmente et ceci est secondaire une anmie ou une intoxication par l'oxyde de carbone (CO) ; - l'hyperventilation mcanique : ventilation artificielle mal contrle. 4.4.2. Compensation physiologique Le pH est augment car la pCO^ est diminue avec des bicarbonates normaux. Le rein intervient en diminuant la rabsorption des bicarbonates. Le pH redevient normal avec des bicarbonates diminus et une pCO^ diminue. Les changes entre Na"*" et H"1" sont ralentis et les urines deviennent alcalines. Les bicarbonates plasmatiques sont remplacs par des chlorures. Ces modifications ne sont mises en place que lors des troubles chroniques. 4.4.3. Tableau clinique II y a une hyperventilation souvent vidente dans les tats d'anxit (spasmophilie) mais qui peut tre inapparente si la respiration est profonde. L'irritabilit, les paresthsies et parfois des crises de ttanie ou des convulsions sont entretenues par l'alcalose et l'hyperpne volontaire. Le mal des montagnes se caractrise, lors de sjours en haute altitude, par des cphales, une insomnie, des nauses et des vomissements, et ventuellement un dme aigu pulmonaire. 4.3.4. Tableau biologique II associe les lments suivants : - un pH artriel augment, - une pCO^ diminue, - une diminution des bicarbonates associe une augmentation des chlorures qui traduisent la compensation rnale ; - l'urine devient alcaline avec une forte augmentation des bicarbonates et du Na-^. Aprs dcompensation la situation de l'tat acidobasique du sujet apparat dans le quadrant infrieur droit C du diagramme de Davenport. 4.5. Syndromes mixtes
II s'agit le plus souvent d'acidoses. Schmatiquement, il en existe deux types suivant que l'agression initiale est mtabolique ou respiratoire. 1er cas : elle survient chez une personne prsentant une acidose mtabolique partiellement compense par une hypocapnie et chez qui survient un trouble ventilatoire : la pCO^ s'lve et le pH chute.
Le tableau biologique montre un pH bas avec des bicarbonates bas et une pCO^ leve. 2e cas : chez un insuffisant respiratoire, hypercapnique, victime d'une insuffisance rnale l'empchant de rabsorber correctement les bicarbonates. Ce sont des sujets dont la situation sur le diagramme de Davenport se trouve dans le cadran E.
5.
Conclusion
Le bilan acidobasique complet implique aujourd'hui l'association des mesures de la pCOy de la p0^ et du pH, avec apprciation de la saturation en oxygne. L'ensemble forme dans le jargon mdical la gazomtrie . En raison de la frquence des perturbations de l'quilibre acidobasique en pathologie, le suivi biologique des malades est indispensable afin d'assurer rapidement une correction thrapeutique. Les appareils modernes associent souvent la mesure des gaz du sang d'autres lectrodes de mesure pour le sodium, le potassium, le chlorure, le calcium ionis et effectuent en plus un dosage de l'hmoglobine. Ils ont ainsi considrablement simplifi la tche des techniciens de laboratoire et apportent au clinicien un maximum d'informations biologiques contribuant une meilleure ranimation des patients.
P. Metais et al. Biochimie clinique. Tomes 1 et 2, 2e dition, Simep, Paris, 1990. M. Essig, G. Friediander. Troubles de l'quilibre acidobasique. La revue du Praticien, 1997,47,1607-1615.
B.A. Shapiro, R.A. Harrison, R.D. Cane, R. Templin. Gaz du sang. Applications cliniques. Ed. Frison-Roche, Paris, 1992.
3 '
Mtabolisme phosphocalcique
Michel Lagente
Le rle le plus vident du calcium et du phosphore est de constituer l'essentiel de la charge minrale du squelette. Ces deux lments exercent au niveau cellulaire et membranaire des actions sans doute plus importantes encore, puisque l'organisme n'hsite pas les puiser dans le squelette pour rguler leur taux sanguins. - Le calcium sous forme ionise (a"'"*") intervient dans l'excitabilit neuromusculaire, dans le bon fonctionnement de maints systmes enzymatiques et transports membranaires, dans la coagulation du sang, dans l'action de certaines hormones comme second messager cellulaire. - Le phosphore intervient dans l'activation de certaines molcules biologiques comme les ose-phosphates, dans la mise en rserve de l'nergie (ATP), dans certains processus de rgulation enzymatique, dans la composition de susbstances organiques indispensables (phospholipides, acides nucliques). Les mtabolismes de ces deux constituants sont troitement lis pour de multiples raisons dont la principale est la grande insolubilit du phosphate tricalcique [(P0^~)^ (Ca"1""1")^] au pH des liquides de l'organisme. Ce facteur est dterminant tous les stades du mtabolisme de ces deux constituants : - il limite l'absorption intestinale du calcium et du phosphore par ncessit d'un rapport Ca^/PO^3" favorisant leur solubilit intraluminale ; - il influe sur la vitesse de formation et de rsorption de l'os ; - il influe sur la concentration de ces ions dans le plasma par le produit de solubilit, a-"- x HPO^2- qui doit tre constant ; - il est responsable des calcifications pathologiques et de la formation des calculs de phosphate tricalcique dans les voies urinaires.
62__________________________[__________Biochimie clinique Sans doute en relation avec l'importance vitale de ces ions (surtout du calcium) il existe un contrle hormonal troit de leurs concentrations sanguines par l'intermdiaire de la parathormone (PTH), de la calcitonine (CT) et de la vitamine D.
1.
1.1.
Mtabolisme du calcium et du phosphore

Calcium
C'est un lment (a) alcalinoterreux de poids atomique 40. C'est l'lectrolyte quantitativement le plus important de l'organisme humain puisqu'il reprsente un poids d'environ 1 kg (25 moles) chez un adulte de 70 kg. 1.1.1. Bilan des changes calciques : le cycle du calcium Chez un adulte en quilibre calcique le bilan des changes calciques peut tre reprsent comme suit (figure 3.1) :
Alimentation 25 mmol/24 h
Pool changeable 30 mmol 10 mmol Liquides extracellulaires 8 mmol/24 h
4mmol
8 mmol/24 h
Selles 19 mmol/24 h
Urines 0,1 mmol/kg/24 h
Figure 3.1 Cycle du calcium.
Le calcium absorb par voie intestinale est distribu dans l'organisme par les liquides extracellulaires, dont le sang, qui font partie du pool changeable.
Mtabolisme phosphocalcique______\________________________63.
Sa destine essentielle est le tissu osseux o il est dpos (accrtion) mais aussi repris (rsorption) de manire quilibre. La partie non absorbe, augmente de la partie scrte, est limine dans les selles. L'limination urinaire reprsente normalement la partie nette absorbe. C'est chaque niveau d'change, tube digestif, os, rein que les actions hormonales permettront la rgulation de la calcmie. 1.1.2. Besoins calciques et apports alimentaires Les besoins d'un adulte sont d'environ 10 mmol (400 mg) de calcium par jour. Les enfants et les adolescents demandent 30 mmol/j (1,2 g) pour constituer leur squelette. Les besoins en calcium sont encore plus levs chez les femmes enceintes, ou chez celles qui allaitent, et aussi chez les femmes mnopauses (100 mmol/j soit 4g). Ces besoins sont largement couverts en Europe. Le calcium est apport essentiellement sous forme de lait et de fromages. Certaines eaux de boisson sont relativement riches en calcium (Contrexville en contient 467 mg/1). l.^S. L'absorption intestinale L'absorption intestinale du calcium a lieu essentiellement au niveau du duodnum en milieu acide. On admet que celle-ci s'effectue par l'intermdiaire d'un mcanisme actif, hormone-dpendant, et d'un mcanisme passif'ne dpendant que des concentrations relatives de calcium entre la lumire intestinale et celle du plasma. Le mcanisme actif fait intervenir la cellule intestinale dans laquelle le calcium rentre par la bordure en brosse, traverse le cytosol, et est rejet dans la circulation sanguine par l'intermdiaire d'une ATP-ase a et magnsium (Mg) dpendante. Un systme changeur Na/Ca intervient aussi dans ce rejet. Une protine dite CaBP (calcium binding protein) interviendrait dans ce transport, mais son rle prcis est encore dfinir ; La 1,25-dihydroxy vitamine Dg (1-25 diOH Dg) est le rgulateur de cette voie cellulaire. Elle augmente l'entre du calcium dans la cellule, active l'ATPase a et Mg dpendante et permet la synthse de la CaBP. Le mcanisme passif est paracellulaire et ne dpend que du gradient de concentration entre le taux du calcium de la lumire intestinale et celui du plasma. Ce mouvement passif peut tre une absorption (concentration de calcium suprieure dans la lumire intestinale) ou une scrtion (concentration suprieure dans le plasma). Notre alimentation apporte quotidiennement au moins 10 mmol de calcium (400 mg) ce qui suffit avoir un bilan nul. Au-dessus de cette valeur, l'absorption nette (quantit absorbe moins quan-
64_____________________~________________Biochimie clinique
tit scrte) devient positive mais n'augmente que faiblement avec l'augmentation des apports, par la mise en jeu d'une rgulation faisant intervenir une diminution de scrtion de la PTH ; si l'apport en calcium augmente dans les ingestats, l'absorption passive augmente entranant une augmentation du calcium plasmatique responsable d'une diminution de scrtion de la parathormone. Celle-ci sera responsable d'une diminution de production de la 1,25-dihydroxyvitamine D^ diminuant le calcium absorb par voie active (voir le mtabolisme de la vitamine D). Outre un taux optimal de phosphates vitant la prcipitation du phosphate tricalcique d'autres facteurs vont intervenir sur l'absorption du calcium. L'acidit, une teneur leve en sodium et en lactose, la prsence de citrates augmentent l'absorption du calcium. Au contraire la prsence de phytates, d'oxalates, de graisses, de fibres donnant des sels insolubles diminue l'absorption du calcium. 1.1.4. Rpartition dans l'organisme
1.1.4.1. Rpartition quantitative 99 % du calcium se trouvent dans les os o il est dpos sur la trame protique sous forme de cristaux d'hydroxyapatite. 1 % se retrouve dans les tissus mous (muscles, tendons, peau, viscres) et les liquides extracellulaires dont le sang. 1.1.4.2. Formes du calcium sanguin Dans le sang le calcium est essentiellement plasmatique, les globules rouges en contenant trs peu. La valeur habituelle normale de la calcmie (taux de calcium plasmatique) chez un adulte est comprise entre 2,75 et 2,55 mmol/1 avec une valeur moyenne de 2,3 2,4 mmol/1. Le calcium plasmatique se trouve sous deux formes (figure 3.2) :
a plasmatique : 2,4 mmol/1
Calcium ionis : 1,2 mmol/l
Figure 3.2 Rpartition du calcium plasmatique
Mtabolisme phosphocalcique______________________________65
- une partie non ultrafiltrable, peu prs 40 % soit 1 mmol/1, est lie aux protines en majorit l'albumine et un peu aux globulines. Une variation des protines totales donnera une variation de la calcmie dans le mme sens ; toute augmentation du taux des protines sanguines donnera une augmentation de la calcmie et toute diminution de ces protines donnera une diminution de la calcmie. Ce phnomne doit tre toujours prsent l'esprit lors de l'interprtation d'un rsultat de calcmie ; - une partie ultrafiltrable, se trouve sous forme de calcium ionis ( peu prs 50 %) et sous forme de calcium complex, ( peu prs 10 %). E Le calcium ionis (a"*"*") est l'lment rgul hormonalement dans des limites trs troites, 1,17 1,30 mmol/l. C'est le calcium important du point de vue physiologique ; c'est lui qui intervient dans la coagulation du sang, dans certaines permabilits cellulaires, dans beaucoup de systmes enzymatiques, dans la rythncit cardiaque et dans l'excitabilit neuromusculaire. Dans celleci, le calcium ionis intervient par l'intermdiaire du rapport suivant :
Une diminution du calcium ionis (ou du magnsium) entranera une augmentation de l'excitabilit neuromusculaire et pourra tre responsable d'une crise de ttanie. Le calcium li l'albumine est trs sensible l'quilibre acidobasique. Une acidose entrane une diminution de cette liaison et augmente le calcium ionis ; l'inverse, une alcalose augmente cette liaison et diminue le taux de calcium ionis. Cette proprit peut tre mise profit pour faire cder une crise de ttanie en provoquant une acidose respiratoire. Le calcium complex l'est sous forme de sels solubles mais peu dissocis : phosphates, bicarbonates, citrates et sulfates. 1.1.5. limination 1.1.5.1. Elimination fcale Elle est constitue du calcium alimentaire qui n'a pas t absorb, augment du calcium contenu dans les diffrents sucs digestifs. 1.1.5.2. limination urinaire Seul le calcium ultrafiltrable filtre travers le glomrule rnal et plus de 95 % sont rabsorbs dans les tubes rnaux. La rabsorption maximale a lieu dans le tube proximal o le calcium est rabsorb avec le sodium et l'eau. L'anse de Henl et le tube distal rabsorbent la quasi totalit du calcium rsiduel n'en laissant que moins de 10 mmol/24 h (0,1 mmol/kg/24 h) dans l'urine. Dans un tat
66___________________________________Biochimie clinique d'quilibre chez un adulte jeune, la calciurie reprsente la quantit intestinale nette de calcium absorbe. En fait la calciurie dpend pour beaucoup de la calcmie. Pour une calcmie basse la totalit du calcium est rabsorbe. Pour une calcmie normale, une trs petite partie du calcium filtr est limine. En cas d'hypercalcmie la moiti du calcium est rabsorbe et l'autre moiti est limine. Ceci revient dire qu'il n'existe pas de seuil maximum de reabsorption pour les calcmies les plus frquemment rencontres. Un certain nombre de facteurs peuvent influer sur cette rabsorption : - en l'augmentant ; la PTH et l'alcalose mtabolique ; - en la diminuant ; la calcitonine et l'acidose mtabolique.
1.2.
Phosphore
C'est un lment mtallode de poids atomique 31. Un adulte de 70 kg en possde environ 600 g ^soit-prs de 20 moles) essentiellement sous forme de phosphates. 1.2.1. Besoins en phosphates et apports alimentaires Chez un adulte ils sont de l'ordre de 31 mmol/24 h (1 g), davantage chez un enfant pendant sa croissance. En Europe l'alimentation couvre largement ces besoins en apportant des aliments riches en phosphates tels que le lait et les laitages, la viande (acides nucliques), les ufs (lcithines) et les crales. 7.2.2. Absorption L'absorption des phosphates se fait essentiellement au niveau du jjunum et de l'ilon o l'absorption nette est de l'ordre de 65 % des phosphates ingrs. Comme pour le calcium il existe une absorption passive para-cellulaire qui ne dpend que du gradient de concentration en phosphates entre la lumire intestinale et le plasma, et une absorption active, cellulaire, dpendant de la 1,25-dihydroxyvitamine D^. Cependant si les apports alimentaires augmentent, la fraction absorbe augmente dans les mmes proportions, l'absorption n'tant pas rgule comme pour le calcium. La quantit de phosphates absorbs quotidiennement est donc trs variable en fonction de l'alimentation.
1.2.3.
1.2.3.1.
Rpartition dans l'organisme

Rpartition quantitative
- 85 % des phosphates sont lis au calcium au niveau de l'os sous forme de cristaux d'hydroxyapatite. - 14 % se localisent au niveau des cellules des tissus mous. - 1 % se retrouve dans les liquides extracellulaires dont le sang.
1.2.3.2. Phosphates plasmatiques Le plasma contient plus de 4 mmol/1 de phosphates sous forme de : - Phosphates organiques ; ATP, phospholipides. - Phosphates inorganiques (Pi) ; c'est ce qui est dos sous le nom de phosphormie ou phosphatmie ; 90 % des Pi sont ultrafiltrables et 10 % sont lis des protines. La valeur physiologique de la phosphatmie est de 0,8 1,3 mmol/l cependant avec des variations parfois plus importantes en fonction des apports alimentaires et du mtabolisme nergtique. Au pH du sang 15 % des Pi sont sous forme monomtallique (H^PO^") et 85 % sous forme bimtallique (HP042") ce qui leur permet d'intervenir dans l'quilibre acido-basique. 1.2.4. Elimination 1.2.4.1. limination fcale Comme pour le^ctemm les selles contiennent les phosphates non absorbs et ceux contenus dans les sucs digestifs. L'limination des phosphates est surtout rnale. 1.2.4.2. limination rnale Le phosphore inorganique ultrafiltrable est filtre au niveau du rein mais 90 % sont rabsorbs dans le tubule proximal. Cette rabsorption ne dpasse pas un taux maximum de rabsorption (TmPi) au-del duquel l'limination urinaire est proportionnelle la phosphormie. L'limination urinaire est donc largement dpendante de l'alimentation, et comme pour le calcium, on peut dire que chez un adulte jeune normal, la quantit de phosphates excrte dans les urines, de 10 25 mmol/24 h, correspond l'aborption nette intestinale. Cette reabsorption est influence par les besoins cellulaires en phosphates, sans que l'on sache prcisment le mcanisme, mais la rabsorption augmente quand les besoins cellulaires augmentent et rciproquement. Cette rabsorption est soumise, de plus, une rgulation hormonale et humorale : - la PTH entrane une diminution de la rabsorption des Pi, ainsi que les corticostrodes, la calcitonine fortes doses et l'acidose mtabolique ; - l'hormone de croissance va augmenter au contraire, la reabsorption des Pi.
2.
Rgulation du mtabolisme phosphocalcique
L'importance physiologique du calcium plasmatique et plus prcisment sa fraction ionise fait que ce paramtre doit tre maintenu dans des limites trs
troites, et de fait c'est l'un des lments les plus stables de notre plasma sanguin. Les Pi sont moins bien rguls. La rgulation fait intervenir trois sites : le tube digestif, l'os, et le rein au niveau desquels peuvent intervenir trois hormones : la PTH, la calcitonine, et la vitamine D.
2.1.
Sites de rgulation
2.1.1. Tube digestif
Tous les lments ont t donns dans la partie mtabolique. Rappelons que l'absorption du calcium et celle du phosphore sont influences par la 1,25-dihydroxy vitamine Dg, celle-ci tant ncessaire au transfert actif de ces lments travers la cellule intestinale. La parathormone et la calcitonine n'ont pas d'action directe sur le tube digestif. L'absorption du calcium est rgule en fonction des apports, alors que celle des phosphates ne l'est pas.
2.7.2. Os
On a cru pendant longtemps que l'os tait un tissu inerte jouant un rle de simple armature. Nous savons maintenant qu'il est en perptuel remaniement et qu'un phnomne de construction osseuse appel accrion doit compenser exactement un phnomne de destruction appel rsorption. Par ce biais il peut tre considr comme un vritable organe mtabolique participant activement l'homostasie calcique. 2.1.2.1. Rappel structural Le tissu osseux est un tissu conjonctif calcifi form d'une matrice protique, appele tissu ostode, dans laquelle sont inclus des cristaux de phosphate de calcium, surtout sous forme d'hydroxyapatie. - Le tissu ostode est essentiellement constitu d'une protine fibreuse, le collagne de type I, dispose en rseau au sein de la substance fondamentale. A ct du collagne d'autres protines ont t dcouvertes ; il s'agit de l'ostocalcine (bone Glaprotein ou BGP des Anglo-Saxons) et de l'ostonectine. - La fraction minrale de l'os est constitue par de petits cristaux hexagonaux disposs longitudinalement sur les fibres de collagne. Le calcium s'y trouve pour une grande part sous forme d'hydroxyapatite (Ca^(PO^)y Ca(OH)^ et un peu sous forme de carbonate apatite (Ca^PO^)^, CaC03. Chaque cristal osseux est form de trois couches : un noyau o le calcium est fix et trs difficilement mobilisable, une couche moyenne hydrate o le calcium est labile et mobilisable, une couche priphrique aqueuse travers laquelle se font les changes avec le milieu extracellulaire.
Mtabolisme phosphoculcique________________________________69
Ce tissu n'est pas fig mais en perptuel remodelage sous l'action des cellules osseuses. 2.1.2.2. Remodelage osseux II est le fait de trois types de cellules : les ostoblastes, les ostocytes et les ostoclastes. - Les ostoblastes sont des cellules de grande taille, mononucles, issues de cellules msenchymateuses. Ils sont responsables de l'dification du tissu osseux en formant une couche monocellulaire au contact du tissu ostode qu'ils viennent de construire. Ils synthtisent le collagne, l'ostocalcine, l'ostonectine, et les glycosaminoglycannes, ces derniers rentrant dans la structure de la substance fondamentale. Ces ostoblastes participent ensuite la minralisation du tissu ostode en scrtant certaines enzymes, les phosphatases alcalines, qui permettront la prcipitation puis la nuclation du phosphate tricalcique qui donnera l'hydroxyapatite. La progression de la calcification va englober les ostoblastes au sein du tissu osseux. Ils vont alors devenir des ostocytes. Toute augmentation de la synthse du tissu ostode pourra se traduire par une augmentation de l'activit sanguine des phosphatases alcalines accompagne de l'augmentation du taux sanguin de l'ostocalcine. - Les ostocytes sont des cellules emprisonnes entre les lamelles osseuses. Elles mettent de fines ramifications le long des lamelles et d'une lamelle l'autre l'intrieur de canalicules. Elles seraient capables d'accrtion et de rsorbption strictement localises et de ce fait elles semblent intervenir activement dans la rgulation de la calcmie. - Les ostoclastes sont des cellules gantes plurinucles naissant de la fusion des macrophages. Elles creusent l'os compact, crant des cavits de rsorption en solubilisant les cristaux d'hydroxyapatite et en hydrolysant le collagne. Ces cellules sont trs mobiles et s'appliquent contre l'os pendant la phase de rsorption. Frost a montr que les deux phnomnes de rsorption et d'accrtion taient intimement lis dans le temps et dans l'espace. A un instant donn, dans un endroit donn, un processus d'activation (A) inconnu (origine endocrinienne ou mcanique ?) conduit l'apparition d'un foyer de rsorption (R) occup par des ostoclastes. La cavit ainsi creuse sera secondairement comble par du tissu ostode labor par des ostoblastes au cours d'une phase de formation (F) et cette matrice sera enfin minralise. La squence est toujours la mme A -> R > F. Il y a toujours une zone antrieure de rsorption et une zone postrieure de formation et la dure de la rsorption est toujours beaucoup plus courte que celle de l'accrtion. L'ensemble du foyer forme un basic multicellular unit (BMU). L'activit des BMU dont les volutions sont dcales dans le temps (figure 3.3) ne concerne simultanment que 20 % au plus des faces osseuses. La dure de vie d'un BMU est
_70_____________________________________Biochimie clinique
chez l'homme normal estime trois ou quatre mois pour l'os cortical haversien. Chez l'adulte, rsorption et reconstruction doivent s'quilibrer l'tat normal. Un dsquilibre peut exister : - soit par manque de minralisation qui se traduit par un excs de tissu ostode, c'est l'ostomalacie de l'adulte, quivalent du rachitisme chez l'enfant ; - soit par un excs de rsorption portant sur la fraction protique et sur la fraction minrale, c'est l'ostoporose.
1 i Basic Multicellular Unit
2 i
3 i
Temps en mois
---------->
Activation
Figure 3.3 Dynamique du remodelage osseux.
Ce renouvellement osseux permanent est l'origine d'un certain nombre de dosages sanguins et urinaires permettant d'apprcier l'quilibre qui doit exister entre la destruction et la reconstruction de l'os. Ces marqueurs du remodelage osseux sont d'une grande utilit en particulier pour le dpistage d'une destruction trop importante (ostoporose). - Les marqueurs du remodelage osseux s'apprhendent mieux s'ils sont replacs dans le contexte de la synthse du collagne 1 (figure 3.4). Au niveau osseux les ostoblastes synthtisent des chanes polypeptidiques qui vont s'assembler par 3 (2 chanes al et une chane a2 pour le collagne I) au sein d'une triple hlice constituant le procollagne. Ces polypeptides sont riches en certains acides amins comme l'hydroxyproline et la lysine (LYS). Des peptides appels peptides d'extension sont ensuite coups aux 2 extrmits : PICP du ct C-terminal (propeptide C-terminal du procollagne I) libr dans la circulation sanguine et peptides N-terminaux vraisemblablement rincorpors dans l'os. On obtient ainsi le tropocollagne qui possde aux extrmits non hlicodales des tlopeptides C et N-terminaux. Le PICP pourra servir de marqueur de formation osseuse.
Mtabolisme phosphocalcique______________________________1\_
: a "1^ ~3
Chanes polypeptidiques Procollagne - Peptides d'extension - Tlopeptides Tropocollagne
Pont pyridinoline Fibrille de collagne
Figure 3.4 Biosynthse du collagne.
Au sein de l'hlice certaines lysines seront oxydes en hydroxylysines (HYL) et celles ci pourront participer la cration de ponts . En effet plusieurs molcules de tropocollagne s'assembleront ensuite pour constituer la fibrille de collagne et seront runies par des ponts pyridinolines (crossiinks). Deux types de ponts sont retrouvs : - le pont pyridinoline (Pyr) unissant 2 rsidus hydroxylysyl (un sur al un sur a2) des tlopeptides de 2 tropocollagnes diffrents une hydroxylysine de la partie hlicodale d'un troisime procollagne (Pyr = HYL(al)-HYL (a2)-HYL) ; - le pont dsoxypyridinoline (D-Pyr) qui voit le remplacement de l'hydroxylysine de la partie hlicodale par une lysine (D-Pyr = HYL(al)-HYL (a2)LYS). La formation osseuse sera donc apprcie par les dosages sanguins des phosphatases alcalines, de l'ostocalcine et du propeptide C-terminal du procollagne I. Au contraire lors de la destruction du collagne on pourra doser un certain nombre de molcules dans les urines comme Yhydroxyproline, les tlopeptides C ou N-terminaux et les pyridinolines associant pyridoline et dsoxypyridinoline. Ces pyridinolines sont retrouves soit sous la forme du pont seul (40 %) soit sous la forme du pont associ des petits peptides (60 %). 2.1.2.3. Systme ostocytes/cellules de revtement Toutes les surfaces au repos (donc en dehors d'un BMU) sont recouvertes d'une membrane fenestre forme de cellules de revtement, possdant des proprits ostocytiques, et communiquant avec les ostocytes plus profonds par leurs ramifications (figure 3.5). Selon une-thorie rcente ces cellules joueraient un rle trs important dans l'homostasie calcique. Un transport passif du calcium ionis s'effectue du
72_____________________________________Biochimie clinique liquide extracellulaire extra-osseux en quilibre avec le sang (1,20 mmol/1) vers le liquide extracellulaire intra-osseux (0,4 mmol/1) qui est en quilibre avec les ostocytes et l'os environnant. Dans le but d'quilibrer cet influx de a"1""1", un mcanisme actif sensible la PTH et la calcitonine est localis dans les cellules de revtement et rejette le a'1"1" vers le liquide extracellulaire extra-osseux et donc le sang. La possibilit de pompage d'un tel systme peut aller jusqu' 240 mmol/24 h et contribue donc trs fortement la rgulation du calcium ionis plasmatique.
Vaisseau sanguin Cellule de revtement
Figure 3.5 Systme ostocytes/cellules de revtement
La PTH augmente le rejet par les cellules de revtement alors que la calcitonine le diminue.
2.1.3. Rein
Le rein par sa possibilit de filtration et de rabsorption du calcium et du phosphore va jouer un grand rle dans l'homostasie phosphocalcique. Les l-
ments de la fonction rnale ont t donns prcdemment. Rappelons qu'il existe un taux de rabsorption maximal pour le phosphore alors qu'il n'en existe pas pour le calcium.
2.2.
Hormones rgulatrices
Elles sont au nombre de trois : la parathonnone, la calcitonine, et les drivs de la vitamine D qui peuvent tre considrs comme de vritables produits hormonaux.
2.2.1. Parathonnone
2.2.1.1. Mtabolisme La parathortnone est synthtise par les cellules principales des parathyrodes sous forme d'un prcurseur (pr-pro PTH) de 115 acides amins (AA). Celui-ci est ensuite cliv pour donner la pro-PTH de 90 AA qui est stocke dans les granules cytoplasmiques. Aprs protolyse elle est finalement scrte dans la circulation sous forme d'hormone active compose de 84 AA. Cette PTH 1-84 est clive dans le foie et dans les reins pour donner un fragment N-terminal 34 AA qui est porteur de toute l'activit biologique, et dont la demi-vie est trs courte, (moins de 5 minutes). Ce fragment stimule la production intracellulaire d'AMP cyclique (AMPc) par l'intermdiaire duquel il manifeste son action au niveau des organes cibles. C'est ainsi qu'il fait scrter de l'AMPc par les cellules du tube proximal qui vont ensuite l'excrter dans les urines : c'est l'AMPc nphrognique qui est considr pour cette raison comme un bon reflet de la scrtion de la PTH. Ce fragment 1-34 est dgrad dans les tissus cibles. La partie C-terminale peut tre reprsente par un ou plusieurs fragments qui sont tous dpourvus d'activit biologique. Leur clairance mtabolique est assure par filtration glomrulaire puis catabolisme dans les cellules du tubule rnal. Auparavant la plupart des dosages de la PTH utilisaient des antisrums dirigs contre les fragments C-terminaux ce qui expliquait les variations importantes observes en fonction de l'tat rnal. Il est possible maintenant de doser la PTH 1-84 ce qui permet de connatre la scrtion relle parathyrodienne. 2.2.1.2. Fonctions biologiques Elles ont t prcises au fur et mesure du mtabolisme. Elles sont rsumes dans la figure 3.6. Le stimulus de la scrtion de PTH est le taux plasmatique de C"1""1'. Une diminution du a'1'4" entrane une augmentation de scrtion de la parathonnone et au contraire une augmentation du a"1"1' est responsable d'une diminution de scrtion de la PTH. Le taux des phosphates n'a aucune action sur la scrtion de la PTH.
'.________________________________Biochimie clinique Au niveau de l'os la PTH augmente le nombre de sites de remodelage ce qui explique que pour des concentrations physiologiques cette rsorption soit suivie d'une accrtion osseuse secondaire. Cependant pour des concentrations trs leves la rsorption l'emporte sur l'accrtion et l'action de la PTH aboutit une destruction progressive de l'os. Au niveau du rein, outre les actions sur le mtabolisme du calcium et du phosphore la PTH stimule la production rnale du mtabolite le plus actif de la vitamine D, le la, 25-diOH Dy
Pas d'action directe
Rsorption ostoclastique PTH Rejet du a par le systme des ostocytes
Rabsorption du calcium Rabsorption des phosphates
Figure 3.6 Fonctions biologiques de la parathormone.
Au total la PTH est une hormone hypercalcmiante et hypophosphormiante. 2.2.2. Calcitonine 2.2.2.1. Mtabolisme La calcitonine (CT) est synthtise et scrte par les cellules parafolliculaires de la thyrode. La scrtion est surtout rgule par le calcium extracellulaire mais la prise alimentaire et certaines hormones comme la gastrine et le glucagon jouent un rle. Une augmentation du calcium extracellulaire entrane une augmentation de la scrtion de CT, alors qu'une diminution de calcium extracellulaire inhibe cette scrtion.
Mtabolisme phosphocalcique______________________________75. La calcitonine est scrte sous forme d'une pro-hormone qui sera coupe pour donner un peptide circulant de 32 AA. 2.2.2.2. Fonctions biologiques La CT a des fonctions complexes qui ne sont pas encore bien connues. Le rle principal de cette hormone est de stimuler les capacits corporelles s'adapter une surcharge calcique. Certaines fonctions de cette hormone sont regroupes dans lajigure 3.7. Au niveau du rein une injection unique de calcitonine augmente l'excrtion de calcium par diminution de sa rabsorption. Une injection continue va augmenter la calciurie dans un premier temps, mais la diminuer ensuite du fait de la diminution de la rsorption osseuse. Elle a de plus, une action freinatrice sur la transformation rnale du mtabolite 25-OH de la vitamine D.
Pas d'action directe
a
extracellulaire
La rsorption ostoclastique
CT Le rejet du a par le systme des ostocytes
La rabsorption du calcium La rabsorption des phosphates
Figure 3.7 Fonctions biologiques de la calcitonine. Au total, c'est une hormone hypocalcmiante. 2.2.3. Vitamine D Ce sont les mtabolites de la vitamine Dg (D^) qui ont une action dans le mtabolisme phosphocalcique. On continue les dnommer vitamines bien que
l'organisme humain soit capable de les synthtiser et de ce fait il faut les considrer comme de vritables hormones.
2.2.3.1. Mtabolisme
Le mtabolite le plus actif est le la, 25-dihydroxyvitamine Dy dont la synthse est reprsente dans la figure 3.8. L'hormone active est synthtise partir de la vitamine D,, ou cholcalcifrol. Le cholcalcifrol est soit d'origine alimentaire (vitamine Dg naturelle) soit synthtis partir du 7-dhydrocholestrol de la peau sous l'action des rayons ultraviolets. Le 7-dhydrocholestrol est un prcurseur direct dans la synthse du cholestrol, mais se retrouve aussi dans le jaune d'uf, les poissons et le lait. Aprs une premire hydroxylation hpatique sur le carbone 25 du cholcalcifrol, la synthse se poursuit par une hydroxylation rnale en position a sur le carbone 1 et aboutit au la, 25-dihydroxyvitamine Dy ou calcitriol.
Alimentation
Synthse du cholestrol
7-dhydrocholestrol de la peau
Vitamine Dg naturelle
FOIE
25-hydroxylase
Rein
|||
1 -a hydroxylase
Figure 3.8 Mtabolisme de la vitamine D3.
Mtabolisme phosphocalcique______________________________77^ Cette dernire hydroxylation est le fait d'une enzyme rnale, la 1 a hydroxylase. Il existe d'autres-hydroxylases rnales et en particulier la 24 hydroxylase qui synthtise le 24, 25-diOH Dy mtabolite dont on ne connat pas encore prcisment le rle. L'activit biologique maximale est le fait du calcitriol mais comme l'organisme fabrique cent fois plus de 25-OH Dg ce mtabolite peut avoir quelques effets biologiques directs. La synthse du la, 25-diOH D^ est rgule par l'activit de la la hydroxylase comme le montre la figure 3.9.
Hypocalcmie
Parathormone
Hypophosphatmie Prolactine
25-OH D,
Hypercalcmie
Calcitonine
Hyperphosphatmie
Figure 3.9 Rgulation de la synthse du calcitriol. Celle-ci est active par la parathormone, l'hypocalcmie et l'hypophosphatmie. L'hormone de croissance et la prolactine stimulent aussi cette enzyme comme cela est observ chez l'enfant pendant la croissance et chez la femme qui allaite. Au contraire l'hypercalcmie, l'hyperphosphormie importante et la calcitonine inhibent l'action de l'enzyme. Enfin le taux circulant de calcitriol rgule l'activit de l'enzyme par un mcanisme de feed-back. La rduction de la masse nphronique observe au cours du vieillissement ou de l'insuffisance rnale entrane toujours une diminution de production du calcitriol. La demi-vie de cette hormone est de 12 heures.
78
___________________________Biochimie clinique
2.2.3.2. Fonctions biologiques L'effet principal du calcitriol est de fournir des quantits suffisantes de calcium et de phosphore au niveau de l'os pour permettre la minralisation de ce dernier. Elle agit surtout sur l'intestin et sur l'os (figure 3.10).
Absorption du calcium Absorption des phosphates
Calcitriol
Rsorption ostoclastique de l'os ancien Minralisation du tissu ostode Effet permissif sur la parathormone
Figure 3.10 Fonctions biologiques du calcitriol. Au niveau de l'intestin elle favorise l'absorption du calcium et du phosphore. Au niveau de l'os la carence en vitamine D entrane un dfaut de minralisation du tissu ostode responsable du rachitisme chez l'enfant et de l'ostomalacie chez l'adulte. Son action sur les ostoblastes est responsable de la synthse du collagne et de l'ostocalcine avec stimulation de l'activit des phosphatases alcalines favorisant la minralisation. De plus sa prsence est indispensable pour que la parathormone puisse exercer son action ostolytique. Le calcitriol est aussi capable d'activer les ostoclastes de l'os ancien pour fournir le calcium et le phosphore ncessaires la minralisation du tissu ostode de l'os nouveau.
2.2.4. Autres hormones
2.2.4.1. Hormones sexuelles Elles augmentent l'absorption intestinale du calcium et favorisent la synthse de la trame protique de l'os ainsi que sa minralisation. L'ostoporose postmnopausique est en grande partie explique par la disparition des strognes cette priode de la vie.
2.2.4.2. Cortisol
II freine la minralisation de l'os ainsi que la synthse de la trame protique. Par ailleurs, il diminue l'absorption intestinale du calcium.
3.
Exploration du mtabolisme phosphocalcique
Elle revt une importance fondamentale, en particulier dans les affections squelettiques car les renseignements cliniques et radiologiques sont souvent peu suggestifs. Il existe des mthodes d'exploration statique et dynamique.
3.1.
Exploration statique
Le mtabolisme dj dcrit permet de comprendre la liste des dosages rpertoris dans le tableau 3.1 et permettant l'exploration statique de ce mtabolisme. Ces dosages ne doivent pas tre demands systmatiquement mais slectionns en fonction de l'tat clinique et des rsultats de la calcmie et de la phosphormie. Certains dosages peuvent tre raliss dans la plupart des laboratoires (calcmie, phosphormie, exploration de l'limination rnale du calcium et du phosphore, phosphatases alcalines) et permettent une premire orientation. Tous les autres dosages sont raliss par des laboratoires plus spcialiss. 3.1.1. Calcium et phosphore sanguins Ils rentrent le plus souvent dans le cadre des bilans standards et permettent dans un grand nombre de cas de dpister une pathologie du mtabolisme phosphocalcique. 3.1.2. Exploration de l'limination rnale du calcium - La calciurie des 24 heures prsente l'inconvnient du prlvement urinaire sur cette priode, avec souvent des pertes d'urines difficilement mesurables.
Tableau 3.1 Dosages d'exploration statique du bilan phospho-calcique Sang Examen Calcmie Calcium ionis Phosphatmie Phosphatases alcalines Ostocalcine Parathormone (1-84) Calcitonine 25-OH D, Calcitriol AMPc Valeur de rfrence 2,15-2,55 mmol/1 1,17-1,30 mol/1 0,8-1,3 mmol/1 * 2-10 u.g/1 10-55 ng/1 8-35 ng/1 7-35 ^g/l 20-96 ng/1 14-23 nmol/1 Phosphaturie des 24 h Hydroxyprolinurie Pyridinolines ** Tlopeptides C et N-terminaux ** AMPc total AMPc nphrognique 2-6 |JimoV24 h 1,5-2,5 p.mol/24h 10-30 mmol/24 h 75-300 (Jimol/24 h Marqueurs du remodelage osseux Propeptide C-terminal du procollagne 1 ** Examen Calciurie des 24 h Urines Valeur de rfrence 2,5-10 mmol/24 h
Facteurs de rgulation du mtabolisme phospho-calcique
Mtabolites de la vitamine D^
* La valeur de rfrence dpend de la mthode employe. Au CHU de Toulouse (Rangueil) les valeurs de rfrence sont les suivantes : 30-125 UI 37 C. ** Les valeurs de rfrence dpendent de la mthode employe.
- Afin d'viter les erreurs dues au recueil des urines, il est plus facile de rapporter la concentration urinaire de calcium d'un chantillon d'urines la concentration de cratinine du mme chantillon. Ce rapport dnomm indice de Nordin reflte assez fidlement le calcium libr par la rsorption osseuse, surtout si le patient tait jeun depuis la veille au soir et si le recueil des urines se pratique le matin le plus souvent entre 8 h et 10 h. Ce rapport est habituellement compris entre 0,08 et 0,25 si les concentrations sont exprimes en mg/1. Un indice plus lev est le tmoin d'une ostolyse accrue.
3.1.3. Exploration de l'limination rnale des phosphates
L'limination urinaire des phosphates dpend pour une bonne part des apports alimentaires. En l'absence d'un contrle strict de l'alimentation d'un patient, il est de bonne rgle de refaire les examens trois jours d'affile. Diverses explorations peuvent tre demandes. - La phosphaturie des 24 heures prsente le mme inconvnient pour le recueil des urines que la calciurie, avec en plus la fluctuation due l'alimentation. - Dans ces conditions on peut calculer l' indice de Nordin qui correspond
au rapport des concentrations urinaires (en mg/1) des phosphates sur la cratinine. Le prlvement est le mme que celui du calcium et les valeurs usuelles sont comprises entre 0,3 et 0,8. - La clairance des Pi peut tre un test intressant condition de soumettre le malade un rgime phosphore bien dfini. Elle se calcule suivant la formule suivante : U (Pi) = concentration urinaire des Pi V = volume urinaire par unit de temps P (Pi) = concentration plasmatique des Pi - L'excrtion fractionnelle des Pi rapporte la clairance du phosphore la clairance de la cratinine. Ceci permet d'liminer les fluctuations de la clairance du phosphore dues aux variations du flux glomrulaire lequel est valu par la clairance de la cratinine.
Cette excrtion fractionnelle correspond au phosphore filtr qui n'est pas rabsorb par les tubules rnaux. Elle n'est pas interprtable en soi mais permet de calculer le RTP % et le PEI de Nordin dfinis ci-dessous. - L'indice de rabsorption tabulaire des Pi (RTP %) correspond au pourcentage de phosphore filtr et rabsorb. Il se calcule d'aprs la formule suivante : RTP % Pi = (1 - excrtion fractionnelle des Pi) x 100 L'indice normal est de 85 95 %. - L'indice d'excrtion du phosphore (PEI) de Nordin tient compte du phosphore sanguin. Il se calcule en utilisant la formule suivante : Excrtion fractionnelle des Pi - 0,055 x P (Pi) + 0,07 Le rsultat physiologique doit tre : - 0,09 < PEI < + 0,09 en exprimant le P (Pi) en mg/100 ml (mmol/1 x 31 = mg/1).
3.1.4. Dosage du calcum ionis
Le taux des protines affectant la valeur du calcium total et le calcium ionis tant le calcium physiologiquement actif, son dosage est indispensable pour affirmer une pathologie du mtabolisme phosphocalcique. Il est ncessaire dans tout changement quantitatif (mylomes...) ou qualitatif des protines (brls, dnutrition, syndrome nphrotique, affections malignes...), dans toute modification de l'quilibre acidobasique (insuffisance rnale...) ou par la prsence d'anions susceptibles de complexer le calcium (prsence de citrate dans les sangs transfuss).
Kl_____________________________________Biochimie clinique
3.1.5. Activit des phosphatases alcalines
Dans le plasma, les phosphatases alcalines peuvent tre de diverses origines et il est assez difficile d'isoler avec prcision celles qui sont d'origine osseuse. L'activit globale des phosphatases alcalines plasmatiques dpend du ractif utilis, et de la temprature de mesure. Chaque laboratoire possde donc ses valeurs de rfrence. Cf. chapitre 10. Les phosphatases alcalines osseuses ont comme origine les ostoblastes. Une activit accrue de ces cellules lors de la construction osseuse a pour reflet une augmentation de l'activit des phosphatases alcalines (par exemple chez l'enfant pendant sa croissance). Tout renouvellement osseux important et acclr se traduira par le mme signe. Cependant c'est un test peu sensible. Les deux pathologies osseuses au cours desquelles on voit une augmentation importante des phosphatases alcalines sont l'ostomalacie et la maladie de Paget. Celle-ci prsente cycliquement une destruction osseuse importante suivie d'une reconstruction anarchique de l'os.
3.1.6. Ostocalcine
Cette protine non collagnique de l'os est de dcouverte rcente. Elle est synthtise par les ostoblastes en mme temps que les phosphatases alcalines. C'est un tmoin fiable de l'activit du remodelage osseux. Elle est augmente dans les affections caractrises par un hyper-remodelage osseux (maladie de Paget, mtastases osseuses, hyperparathyrodie primitive, ostodystrophie rnale) et diminue dans celles qui prsentent un hyporemodelage (hypoparathyrodie). 3.1.7. Propeptide C-terminal du procollagne 1 C'est un marqueur de formation du collagne 1 et donc de l'os. Son limination est hpatique et une insuffisance de cet organe peut entraner une augmentation sans rapport avec la synthse osseuse. 3.1.8. Hydroxyprolinurie (OHp) L'hydroxyproline urinaire a t le marqueur de rsorption le plus utilis. Cependant ce dosage est peu spcifique de la rsorption osseuse car l'limination urinaire de cette molcule reprsente une fraction seulement de tout le catabolisme du collagne de l'organisme. Par ailleurs la dgradation de certaines molcules autres que le collagne peut aboutir une limination de cet acide amin. On lui prfre maintenant d'autres marqueurs comme les tlopeptides terminaux et les pyridinolines
3.1.9. Tlopeptides C et N-terminaux Ils constituent des marqueurs sensibles et spcifiques de la rsorption osseuse. Ils sont constitus d'une courte chane polypeptidique qui peut tre ou non associe un pont pyridinoline ou dsoxypyridinoline. Avec les pyridinolines ils permettent de mettre en vidence une perte osseuse importante. Dans le cadre de la mnopause ils aident au dpistage des femmes ayant un risque ostoporotique majeur afin de les faire bnficier d'un traitement prventif. Ils offrent, de plus, la possibilit de suivre l'efficacit d'un traitement chez une femme mnopause. 3.1.10. Pyridinolines (se reporter la figure 3.4) Ce sont des marqueurs de destruction osseuse. Ce terme de pyridinolines regroupe en fait 2 types de molcules de pontage : les pyridinolines proprement dites et les dsoxypyridinolines. Ces molcules de pontage peuvent tre associes des peptides (forme lie) ou non (forme libre). - le pont pyridinoline, qui peut tre du cot C ou N-terminal, associe 3 rsidus hydroxylysyl. Il est retrouv plus spcifiquement dans l'os et le cartilage. - Le pont dsoxypyridinoline, lui aussi du ct Cou N-terminal, associe 2 rsidus hydroxylysyl un rsidu lysyl. Il est retrouv plus spcifiquement dans l'os. Actuellement les techniques immunoenzymatiques permettent le dosage en bloc des pyridinolines ou le dosage des dsoxypyridinolines libres. Ils ont la mme valeur diagnostique dans l'ostoporose que les tlopeptides. 3.1.11. Dosage de la parathormone Actuellement, le dosage s'effectue par une technique radio-immunomtrique et permet de dterminer le taux de PTH intacte c'est--dire de PTH 1-84. Les ractions croises avec les fragments sont totalement limines et les dosages de ces fragments n'ont plus d'intrt. Certaines pathologies (voir les hypercalcmies) voient la scrtion d'un peptide, le PTH-rp (PTH related peptide) ayant dans sa partie NH^ terminale 8 des 13 premiers acides amins de la PTH ce qui lui permet une liaison aux rcepteurs de la PTH et donc lui octroie toute l'activit biologique de la PTH (activit F-like) sans pour autant tre reconnu par les anticorps de la technique radioimmunomtrique. Ce dosage permet donc de faire la diffrence entre les hypercalcmies par hyperparathyrodie dans lesquelles la PTH est augmente, et les hypercalcmies dues la scrtion d'une PTH-rp (hypercalcmies paranoplasiques) qui ont un taux bas de PTH.
84_____
__________________________Biochimie clinique
3.1.12. AMP cyclique nphrognique L'AMPc urinaire est constitu de l'AMPc filtr et non reabsorb, augment de l'AMPc scrt par les cellules tubulaires rnales sous l'influence de la PTH (AMPc nphrognique). Le taux de VAMPc nphrognique est un bon reflet de la scrtion de l'hormone parathyrodienne. L'AMPc nphrognique se calcule par la diffrence entre l'AMPc excrt et l'AMPc filtr dans le mme temps. L'AMPc excrt se calcule en faisant le produit du dbit urinaire par le taux de l'AMPc urinaire. L'AMPc filtr se calcule en faisant le produit de la filtration glomrulaire (exprime par la clairance la creatinine) par le taux de l'AMPc sanguin. L'intrt biologique de la dtermination de l'AMPc rside dans le cadre des hypercalcmies paranoplasiques avec scrtion de PTH-rp. En effet chez cellesci l'hypercalcmie s'accompagne d'un dosage de la parathormone normal ou abaiss. Une augmentation de l'AMPc est en faveur d'une scrtion de PTH-rp. Il existe cependant depuis peu un dosage de la PTH-rp qui permettra le diagnostic de ces pathologies. 3.1.13. Dosage de la calcitonine Encore peu demand, il peut cependant tre ralis dans certains laboratoires spcialiss. 3.1.14. Dosages des mtabolites de la vitamine Dy Le dosage spar du 25-OH D3 et du calcitriol (la, 25-diOH D3) permet de faire la diffrence entre les hypocalcmies dues un dfaut d'apport ou d'ensoleillement (25-OH D3 bas) et les hypocalcmies dues un dfaut du mtabolisme de la vitamine (25-OH D3 normal et calcitriol bas). Certaines hypocalcmies peuvent tre dues un dfaut d'utilisation du calcitriol (25-OH D3 normal et taux lev de calcitriol).
3.2.
Exploration dynamique
La qualit et la diversit des diffrents dosages exposs dans l'exploration statique a permis de diminuer la batterie des tests dynamiques autrefois trs nombreux. Les rares tests dynamiques qui sont encore pratiqus ne font que prciser et complter les informations obtenues par les dosages.
Mtabolisme phosphocalcique______________________________g5
3.2.7. preuve la PTH exogne Cette preuve consiste administrer 100 units/m2 de surface corporelle de PTH et suivre la rponse tubulaire rnale par l'exploration de la rabsorption des phosphates et la scrtion de l'AMPc nphrognique. Ce test permet de faire la diffrence entre l'hypoparathyrodie dans laquelle la scrtion de PTH est diminue et la pseudohypoparathyrodie qui voit une scrtion quantitativement normale de PTH mais une insensibilit des organes cibles cette hormone. Une interprtation plus prcise de ce test sera faite avec les hypocalcmies pseudoparathyrodiennes.
3.2.2. TestdePAK
Ce test se fait chez un sujet prsentant une hypercalciurie avec lithiase rnale et pour lequelle aucune cause n'a pu tre retrouve (tous les autres tests statiques sont normaux). Pendant 10 jours, on soumet le patient un rgime pauvre en calcium. Le 1 lme jour on dtermine sur une miction sa calciurie de base, soit a Ul, on lui fait ingrer 1 g de calcium et 4 heures aprs sa calciurie est mesure, soit CaU2. Si a Ul est augmente et si a U2 est trs augmente, l'hypercalciurie est d'origine rnale (le rein n'est pas capable de rabsorber le calcium). Si a Ul est normale et si a U2 est trs augmente, l'hypercalciurie est d'origine digestive (le tube digestif absorbe trop de calcium). 3.2.3. Hypercalciurie provoque Ce test n'est plus qu'exceptionnellement pratiqu. Il permet de faire la diffrence entre les ostomalacies et les ostoporoses (voir les perturbations mtaboliques de l'os). Il consiste en l'injection de 180 mg de calcium sous forme de gluconate chez un patient dont on connat la calciurie de base. La calciurie de ce sujet est dtermine pendant les 24 heures qui suivent l'injection du gluconate de calcium. Un sujet normal doit liminer environ 40 45 % du calcium inject. Un sujet prsentant une ostomalacie fixera au niveau de l'os pratiquement tout le calcium inject et 5 10 % seulement de celui-ci se retrouveront dans les urines. Un sujet ostoporotique est incapable de fixer le calcium et ses urines contiendront environ 70 80 % de la dose injecte.
S6_____________________________________Biochimie clinique
4.
4.1.
Variations pathologiques
Variations de la calcmie
4.1.1. Hypercalcmies Elles correspondent une calcmie suprieure 2,55 mmol/1 avec un taux de protines normal. Dans le cas contraire l'affirmation de l'hypercalcmie se fera sur le rsultat du calcium ionis. Cliniquement on peut trouver : - des signes digestifs : anorexie, nauses, vomissements ; - des signes neurologiques : asthnie physique et psychique pouvant aller jusqu'au coma ; - des signes cardiovasculaires : troubles du rythme, hypertension. Ces signes n'ont pas de caractres spcifiques et sont souvent mconnus si la calcmie n'est pas dose. Au point de vue tiologique, elles peuvent tre classes en : - hypercalcmies noplasiques (60 % des hypercalcmies) ; - hypercalcmies non noplasiques (40 % des hypercalcmies). 4.1.1.1. Hypercalcmies noplasiques L'hypercalcmie constitue une complication frquente des noplasies et apparat assez tard dans l'volution. Elle est toujours due une augmentation de la rsorption osseuse, celle-ci pouvant tre due une ostolyse locale engendre par la tumeur ou une scrtion par la tumeur d'un peptide PTH-like ayant toutes les fonctions biologiques de la PTH. L'hypercalcmie sera responsable d'une diminution de la scrtion de PTH accompagne d'une diminution du calcitriol. La diminution de la rabsorption rnale du calcium (due l'abondance du calcium filtr) permet de lutter contre l'hypercalcmie, mais le rein ne peut s'adapter que dans une certaine limite au-del de laquelle une insuffisance rnale peut survenir. Les hypercalcmies noplasiques par ostolyse locale (10 % des hypercalcmies) - Tumeurs solides avec mtastases osseuses ; principalement cancer du sein chez la femme, mais aussi dans les deux sexes, cancers du poumon, du rein, de la thyrode. La rsorption osseuse est due soit l'action des cellules carcinomateuses elles-mmes, soit l'action des ostoclastes activs par certains peptides synthtiss par les cellules cancreuses ou les cellules inflammatoires qui sont autour des mtastases. - Mylomes multiples. La rsorption osseuse est due une hyperactivit ostoclastique vraisembla-
Mtabolisme phosphocalcique______________________________yi_
blement en rapport avec la scrtion par les cellules mylomateuses d'activateurs des ostoclastes appels OAF (osteoclast activating factors). Les hypercalcmies paranoplasiques par scrtion d'unpeptide PTH-like
(50 % des hypercalcmies).
Trs souvent au cours d'un certain nombre de cancers (larynx, pharynx, poumon, col utrin, vulve, peau, rein, vessie, ovaire) les cellules carcinomateuses peuvent scrter un peptide qui possde 141 AA et dont la partie NH^ terminale comporte 8 des 13 premiers AA de la PTH. Ceci lui permet de se lier aux rcepteurs de la PTH et lui donne toute l'activit biologique de la PTH. Cependant la technique de dosage qui prend en sandwich la PTH entre deux anticorps ne reconnat pas la PTH-like (la partie NH^ terminale est reconnue mais non la partie COOH terminale). Cette substance parathormone-like disparat avec l'ablation de la tumeur noplasique. 4.1.1.2. Hypercalcmies non noplasiques
Hyperparathyrodie primitive (25 % des hypercalcmies)
La scrtion exagre de PTH est le plus souvent due un adnome parathyrodien, plus rarement un cancer. L'hypercalcmie est la rsultante de l'action de la PTH et de l'augmentation de la synthse de calcitriol. En effet l'excs de PTH est responsable d'une diminution de la rabsorption rnale des phosphates se traduisant par une hypophosphormie, son tour responsable (avec la PTH) de l'augmentation de synthse du calcitriol. Malgr la rabsorption intense du calcium la calciurie est augmente, consquence d'une filtration glomrulaire trop importante.
Causes rares d'hypercalcmie
- Intoxication par la vitamine D : peut se voir dans les traitements chroniques par les drivs de cette vitamine. - La sarcodose de Besnier-Boeck-Shaumann : on attribue l'hypercalcmie une augmentation de la synthse du calcitriol par les cellules du tissu sarcodien. - La maladie des buveurs de lait : l'hypercalcmie est observe chez des patients ulcreux traits par des produits alcalins et buvant beaucoup de lait (le lait par son alcalinit lutte contre la douleur). - Hyperthyro'die : 20 % des hyperthyrodies s'accompagnent d'une hypercalcmie dont serait responsable l'augmentation du remodelage osseux d aux hormones thyrodiennes. - L'immobilisation prolonge : elle peut entramer une diminution de la formation osseuse au profit de la rsorption.
88___________________________________Biochimie clinique - Insuffisance rnale chronique au stade terminal : la physiopathologie de celle-ci sera expose avec l'hypocalcmie de l'insuffisance rnale. 4.1.2. Hypocalcmies Elles correspondent une calcmie infrieure 2,15 mmol/1, pour une protidmie normale. L'affirmation de l'hypocalcmie se fera ici aussi par le dosage du calcium ionis. Cliniquement on trouve des signes d'hyperexcitabilit neuromusculaire donnant au maximum, surtout chez l'enfant, le syndrome ttanique. L'intensit des manifestations cliniques dpend en grande partie de la brutalit des changements de la calcmie, les diminutions lentement progressives tant assez bien supportes. Les tiologies permettent de les classer en : - hypocalcmies extraparathyrodiennes ; - hypocalcmies parathyrodiennes ; - hypocalcmies pseudoparathyrodiennes. 4.1.2.1. Hypocalcmies extraparathyrodiennes Elles peuvent tre dues un dfaut d'apport en calcium, un dfaut de son absorption digestive ou un dfaut de sa rabsorption rnale. La diminution des apports est extrmement rare sous nos climats, puisque mme un rgime dpourvu d'apports laitiers apporte le minimum ncessaire pour avoir un bilan nul. Les carences en drivs de la vitamine D sont responsables du rachitisme chez l'enfant et de l'ostomalacie chez l'adulte. Elles peuvent tre dues : - une carence d'apport, surtout dans les pays sous dvelopps ; - une carence en exposition au soleil, plus frquente chez les sujets gs ; - une malabsorption : maladie cliaque, malabsorption des graisses et des vitamines liposolubles, affections biliaires ; - une perturbation dans le mtabolisme de la vitamine D, (absence d'hydroxylation hpatique ou rnale). Certains patients n'ont pas de carence en vitamine D, mais il existe chez eux une rsistance, une insensibilit des rcepteurs au calcitriol. Ces hypocalcmies vitamino-rsistantes ne sont pas amliores par l'apport de vitamine D. L'insuffisance rnale chronique est la consquence de la rduction de volume de la masse nphronique. Celle-ci s'accompagne de la rduction de la filtration glomrulaire ainsi que de la diminution de la synthse de la la hydroxylase. La diminution du nombre de nphrons est responsable de la moindre filtration des Pi et de l'augmentation du taux sanguin de ce derniers. L'hypocalcmie qui est le rsultat de la diminution du calcitriol et du dpt de phosphate de calcium dans les tissus mous (vraisemblablement d l'hyperphos-
Mtabolisme phosphocalcique______________________________89 phormie) est responsable d'une hyperscrtion de PTH dveloppant une hyperparathyrodie secondaire. Il semble maintenant admis qu'il existerait, la longue chez ces malades, une prennit de cette hyperparathyrodie secondaire avec hyperrsorption de l'os, responsable, surtout si la diminution du calcitriol n'est pas trop importante, d'un remaniement osseux important correspondant une ostite fibreuse. Ce syndrome est appel ostodystrophie rnale et l'hypocalcmie du dbut peut faire place une hypercalcmie la fin de l'volution. Un trouble idiopathique de la rabsorption du calcium peut tre responsable d'une hypocalcmie. Ces patients, pour une raison inconnue, ne rabsorbent pas le calcium et sont atteints d'hypercalciurie. 4.1.2.2. Hypocalcmies parathyrodiennes Elles sont dues un dficit de scrtion de la PTH et associent hypocalcmie et hyperphosphormie. Citons : - l'hypoparathyrodie primitive idiopatique (de cause inconnue) ; - l'hypoparathyrodie chirurgicale, aprs ablation des parathyrodes. 4.1.2.3. Hypocalcmies pseudoparathyrodiennes II s'agit de pathologies dans lesquelles la scrtion de PTH s'effectue normalement, mais l'hormone n'a aucune action priphrique. On retrouve toujours dans ces cas de pseudohypoparathyrodies une augmentation de la PTH plasmatique en raction l'hypocalcmie. Ces pseudohypoparathyrodies peuvent s'expliquer par : - une PTH anormale (mais cependant dosable) ; - un dfaut de scrtion de l'AMPc en rponse la scrtion de la PTH ; - un dfaut de rponse l'AMPc des organes cibles priphriques. La distinction des hypocalcmies parathyrodiennes et pseudoparathyrodiennes se fait, aprs dosage de la PTH 1-84, par le test la PTH exogne en dosant, aprs l'injection de l'hormone, l'AMPc et la phosphaturie. Les lments du diagnostic diffrentiel sont regroups dans le tableau 3.2.
4.2.
Variation de la phosphormie
4.2.1. Hyperphosphormies Elles correspondent une phosphormie suprieure 1,5 mmol/1. Les trois principales causes sont : Insuffisance rnale Elle correspond une diminution de la filtration rnale au niveau des glomruies. Elle peut entraner des hyperphosphormies trs importantes allant jus-
qu' 3,80 mmol/1. Cependant l'hyperphosphormie de l'insuffisance rnale est trs variable.
Maladies endocriniennes
- Hypoparathyrodie associant hyperphosphormie et hypocalcmie. Le pourcentage de phosphore rabsorb par le tube rnal est lev malgr l'hyperphosphormie. - L'acromgalie s'accompagne souvent d'une phosphormie leve ou la limite suprieure de la normale. - Au cours des diabtes graves, on peut galement observer une hyperphosphormie que l'on peut expliquer par la diminution de la consommation de phosphore li au dfaut d'utilisation des glucides. Affections diverses - L'hyperphosphormie a t galement signale dans les suites immdiates de fractures multiples et souvent au cours de l'intoxication par la vitamine D.
Tableau 3.2 Diagnostic diffrentiel des hypocalcmies hypoparathyrodiennes et pseudohypoparathyrodiennes. PTH 1-84 Hypoparathyrodie Pseudohypoparathyrodie (PTH anormale) Pseudohypoparathyrodie (dfaut scrtion AMPc) Pseudohypoparathyrodie (dfaut rponse priphrique) ^~k. AMPc Pi Urinaires
aprs injection de PTH exogne /^ ^^ -^ pas de changement pas de changement
^
- ^
^-^
pas de changement ^
4.2.2. Hypophosphormies Elles correspondent une phosphormie infrieure 0,8 mmol/1.

Hyperparathyrodie
Elle dtermine une hypophosphormie par fuite urinaire du phosphore. Malgr la diminution de la phosphormie, le pourcentage du phosphore rabsorb est infrieur la normale. Lorsque l'hyperparathyrodie a entran une insuffisance rnale, l'hypophosphormie fait place une hyperphosphormie, le rein ne pouvant plus excrter tout le phosphore en provenance de la lyse osseuse.
Mtabolisme phosphocalcique________________________ _____91 Ostomalacies nutritionnelles (vitaminosensibles) La diminution de la vitamine D circulante par manque d'apport vitaminique entrane une hypophosphatmie et une hypocalcmie. L'hyperparathyrodie secondaire qui en resuite ne fait qu'augmenter la fuite de phosphore et donc aggrave l'hypophosphormie. Ostomalacies vitaminorsistantes - Hypophosphormie du syndrome de Fanconi ou diabte phosphoglucoamin. C'est un trouble primitif de la rabsorption du phosphore au niveau des cellules tubulaires rnales. - Certaines entropathies avec atrophie de la muqueuse intestinale entranent une hypovitaminose D responsable d'une hyperparathyrodie secondaire. - Rachitisme familial hypophosphormique vitaminorsistant. Il s'agit d'une rsistance priphrique des organes cibles la vitamine D de cause inconnue. Causes diverses - Perfusion de glucose ou de fructose par stimulation de la glycolyse. - Reminralisations trs rapides dans les traitements d'une ostomalacie ou aprs parathyrodectomie.
4.3.
Perturbations mtaboliques de l'os
Ce sont essentiellement les syndromes d'hyper et d'hypo-ostodose. 4.3.1. Ostomalacie ou hyperostodose C'est une maladie osseuse dans laquelle il y a un dfaut de minralisation du tissu ostode. Celui-ci est en trop grande proportion par rapport au volume osseux global qui est respect car les traves et les corticales ont une paisseur normale. Tout se passe comme si l'organisme ragissait un dfaut de minralisation par un accroissement de synthse du tissu ostode, aboutissant un tissu osseux ramolli. Cette absence de minralisation est la consquence, dans la majorit des cas, d'une carence en vitamine D : c'est l'quivalent chez l'adulte du rachitisme chez l'enfant. Elle est vitamino sensible et curable par l'apport de vitamine D. Elle se traduit : Du point de vue clinique par des douleurs et une impotence fonctionnelle qui sont les principaux signes. Du point de vue radiologique par une dminralisation importante et les stries de Looser Milkman. Ces dernires (figure 3.11) sont des fissures radiotransparentes symtriques sigeant lectivement au niveau du bassin et des fmurs.
Exemples de fissures ou stries de Looser Milkman : (1) fissure iliaque postrieure ; (2) fissure ilio pubienne ; (3) fissure ischio-pubienne ; (4) fissure corticale fmorale ; (5) fissure au niveau du col fmoral
Figure 3.11 Aspect radiographique de l'ostomalacie du bassin.
Du point de vue biologique on trouve rgulirement les signes suivants : - hypocalcmie et ou hypophosphormie ; - hypocalciurie et ou hypophosphaturie ; - augmentation des phosphatases alcalines et de l'ostocalcine. 4.3.2. Ostoporose ou hypo-ostoidose Elle correspond une involution progressive de l'os aussi bien dans sa partie protique que dans sa partie minrale. Elle est caractrise par un volume total osseux diminu (figure 3.12), mais constitu par un os qualitativement normal. Les proportions de tissu calcifi et de tissu ostode sont respectes. Ce n'est donc pas une dminralisation vraie mme si la quantit de tissu calcifi est infrieure, quantitativement, la normale. Elle aboutit un os poreux et fragile dont les traves et les corticales sont amincies. Du point de vue clinique, elle se traduit par une trs grande fragilit du squelette responsable trs souvent de tassements vertbraux et de fractures (col du fmur en particulier). Du point de vue radiologique on trouve une dminralisation osseuse diffuse. Du point de vue biologique cette pathologie change actuellement de visage. Si les tests classiques (calcmie, phosphormie) sont le plus souvent normaux,
Mtabolisme phosphocalcique______________________________93^ les tests de remodelage osseux (voir ce chapitre) permettent de mieux diffrencier les ostoporoses volution rapide. Cette maladie concerne dans 90 % des cas la femme mnopause et est encore d'origine mal connue, mme si l'arrt des scrtions strogniques semble jouer un rle prpondrant, expliquant l'intrt du traitement hormonal substitutif aprs la mnopause.
Os normal
Os ostoporotique
Os ostomatacique
Cavit de l'os
Tissu ostode
Tissu calcifi
Figure 3.12 Schma d'une coupe histologique (en haut) ; schma du volume osseux absolu (en bas).
(D'aprs P. Le Goff : Ostoporose. Des traitements encore controverss. hnpact-Le praticien PPP n 15.)
Cependant un certain nombre d'ostoporoses sont secondaires et reconnaissent une cause : - corticothrapie au long cours ; - hypercorticisme spontan ; - hyperthyrodie ; - immobilisation prolonge.
5.
5.1.
Mthodes de dosage
Dosage de la calcmie
5.1.1. Mthodes calorimtriques
Elles utilisent diffrentes substances qui complexent le calcium en formant un driv dont la coloration est proportionnelle la concentration de calcium de l'chantillon doser. Il est ncessaire d'liminer l'interfrence du magnsium en utilisant l'hydroxyquinolne et en travaillant pH alcalin. Ces mthodes se prtent bien une adaptation sur les appareils automatiques multiparamtriques de biochimie. 5.1.1.1. Orthocrsolphtaline L'orthocrsolphtaline complexon se complexe en milieu alcalin avec le calcium pour donner un driv rouge prsentant un maximum d'absorption 575 nm. 5.1.1.2. Bleu de mthyl thymol Ce ractif chlate le calcium et vire au bleu avec un maximum d'absorption 612 nm. 5.1.1.3. Arsenazo III Le complexe color en noir prsente un maximum d'absorption 680 nm. 5.7.2. Mthodes physiques 5.1.2.1. Spectrophotomtrie d'absorption atomique C'est actuellement la mthode de rfrence pour le dosage du calcium. La longueur d'onde utilise est de 422,7 nm et la technique demande le rajout de chlorure de lanthane pour viter l'interfrence des phosphates. Ce dosage s'effectue sur un appareillage onreux, et peu de laboratoires de biochimie de routine l'emploient. Le schma de principe d'un spectrophotomtre d'absorption atomique est prsent sur la figure 3.13. Un faisceau lumineux spcifique mis par la lampe cathode creuse est absorb par les atomes de calcium de l'chantillon qui ont t amens sur son trajet par le gnrateur de vapeur atomique. Il existe un rapport entre le nombre d'atomes ayant absorb et l'intensit du faisceau aprs le gnrateur. Le monochromateur slectionne la longueur d'onde du dosage (ici 422,7 nm). Le modulateur permet d'liminer certaines missions parasites indsirables. Le photo-
Mtabolisme phosphocalcique______________________________95 multiplicateur et l'lectronique associe permettent, aprs calibration de transformer le rsultat en concentration.
5.1.2.2. Photomtrie 'mission de flamme
Son principe a t dcrit dans le chapitre 1. Les appareils permettant le dosage du sodium, du potassium et du lithium par cette mthode utilisent, pour la plupart, une flamme propane/air qui n'est pas assez chaude pour permettre l'excitation des atomes de calcium. Dans ces conditions il est ncessaire, si l'on veut doser le calcium par cette technique, d'acqurir un photomtre de flamme utilisant le mlange actylne/air. Ces appareils donnent de bons rsultats mais sont plus onreux et plus rares sur le march.
Gnrateur de vapeur atomique (brleur)
chantillon
Electronique associe, enregistreur
Figure 3.13 Schma de principe d'un spectrophotomtre d'absorption atomique. 5.1.3. Mthodes potentiomtriques Aprs acidification destine dplacer le calcium de sa liaison aux protines et de ses complexes, le calcium total peut tre mesur par potentiomtrie en utilisant une lectrode slective. Cette technique a t adapte certains analyseurs automatiques.
5.2.
Dosage du calcium ionis
Ce dosage a t dvelopp ces dernires annes et cette technique par letrode slective est maintenant intgre des instruments dont l'utilisation est la porte de-tous les laboratoires dans des conditions de fiabilit et de praticabilit satisfaisantes.
Le taux de calcium ionis est variable en fonction du pH, et il est prfrable de faire un prlvement en anarobiose pour viter tout changement de pH par perte de CO^.
5.3.
Dosage du calcium urinaire
Si les techniques sont les mmes que pour le sang, il est cependant ncessaire d'effectuer le recueil dans un rcipient contenant de l'acide chlorhydrique 1M pour acidifier les urines ce qui permet la dissolution des sels et des complexes que le calcium peut contracter avec des anions comme les phosphates ou les oxalates. L'homognisation des urines est indispensable avant tout prlvement d'un aliquot pour analyse.
5.4.
Dosage des phosphates inorganiques sanguins et urinaires
Ces techniques utilisent presque toutes ( l'exception des mthodes enzymatiques) un reactif molybdique. En prsence de ce ractif et en milieu acide l'ion phosphate donne un phosphomolybdate de coloration bleue instable. 5.4.1. Rduction du phosphomolybdate Le phosphomolybdate rduit va donner une coloration stable pendant au moins 30 mn et permet une lecture photomtrique 660 nm. Les rducteurs les plus utiliss sont le sulfate ferreux et l'hydroxylamine. 5.4.2. Colorimtrie directe du phosphomolybdate L'instabilit de la coloration n'est plus un facteur critique avec les appareillages modernes dans lesquels les calibrateurs et les spcimens sont traits exactement dans les mmes conditions. L'apparition de la coloration est suivie dans ces conditions 340 nm. 5.4.3. Colorimtrie du phosphovanadomolybdate Les ions phosphates en prsence de molybdate et de vanadate en milieu acide vont donner une coloration jaune dont le pic d'absorption est 360 nm. Cette technique est peu employe.
5.4.4. Mthodes enzymatiques
Plusieurs techniques ont t proposes, la plus rcente est dtaille dans le schma suivant.
Mtabolisme phosphocalcique______________________________97 r. ,, . nucloside .. -i. Phosphates +. inosine > ,hypoxanthine + nbose11r> P phosphorylase Hypoxanthine + 20, + 2H,0 xanthme> ac. urique + 2H,0. " oxydase - 2HÔ^ + aminophnazone + chromogne
peroxy ase
> driv color + 4HÔ
Ces mthodes ne sont pas trs employes dans la mesure o la colorimtrie directe du phosphomolybdate donne satisfaction un cot faible. 5.5. Rpartition des techniques de dosage en 1998
Elles sont prsentes dans la figure 3.14.
0, Crsol, Phta
Arsnazo III
Bleu demthyl Thymol
Autres Potentiometne techniques
Absorp, atom
Phosphomolybdate direct
Phosphomolybdate rduit
Autres techniques
Phosphovanadomolybdate
Figure 3.14 Rpartition des techniques de dosage du calcium et du phosphore.
9&___________________________________Biochimie clinique
P. Courdon et al. La dynamique du remodelage osseux explique par Harold Frost. La nouvelle presse mdicale, 1975, 40, 6. Exploration des troubles du mtabolisme phosphocalcique. Option/Bio n 52, Eisevier, 1991. B. Lacour. Homostasie phosphocalcique. Option/Bio n 28, Eisevier, 1990. P. Mtais et al. Biochimie clinique, tome 2, Simep, Paris, 1980. P. Mtais et al. Biochimie clinique, tome 3, Simep, Paris, 1988. C. Miura. Hypercalcmies paranoplasiques, physiopathologie, diagnostic et traitement Option/Bio n 55, Eisevier, 1991. B. Borderie, B. Cherruau, 0. Ekindjian. Les marqueurs biochimiques de la rsorption osseuse. Intrt de leur dtermination dans l'ostoporose postmnopausique. Immunoanal. Biol. Spec. 1997 ; 12 :24-28.
4
Mtabolisme du fer
Michel Lagente
Le fer (PA = 56) est le plus anciennement connu des oligolments, substances ainsi baptises par Gabriel Bertrand en raison de leur faible concentration dans la matire vivante et cependant indispensables au fonctionnement des organismes vivants. Si son rle essentiel est d'intervenir dans l'rythropose (synthse des globules rouges), une carence martiale peut tre responsable d'une sensibilit accrue aux infections, d'anomalies des pithliums ou des phanres, ou d'une diminution des performances physiques et intellectuelles. Tout ceci amne considrer la place majeure du fer dans l'organisme.
1.
1.1.
Mtabolisme du fer
Un adulte sain possde (tableau 4.1) environ 4 g de fer (71 mmoles) rpartis entre f e r hminique l'tat ferreux (Fe"1"1') et/<?r non hminique l'tat ferrique (Fe+++). La majeure partie du fer hminique entre dans la composition de l'hmoglobine (60 % du fer total) alors que les rserves sous forme deferritine et d'hmosidrine possdent un fer non hminique (35 % du fer total).
100____________________________________Biochimie clinique
Tableau 4.1 Rpartition du fer. - Hmoglobine - Myoglobine - Enzymes respiratoires cellulaires (cytochromes, oxydases, peroxydases, catalases, enzymes du cycle de Krebs...) - Fer plasmatique li la transferrine et fer des liquides extracellulaires - Fer des rserves (ferritine, hmosidrine) 2,4 g (60 %) 0,2 g (5 %) 0,01 g 0,005 g 1,4 g (35 %) FER NON HEMINIQUE (Fe"'"*"1") FER HEMINIQUE (Fe4"1")
TOTAL_________________________^4g_______________
1.2.
Cycle du fer (figure 4. l)
Plus de la moiti du fer de l'organisme est contenu dans les globules rouges (GR) au sein de l'hmoglobine (Hb). Ce fer est l'tat ferreux (Fe"1"1").
Figure 4.1 Cycle du fer.
Mtabolisme du fer
101
Les hmaties vieillies sont captes par les macrophages du systme rticulohistiocytaire (SRH) principalement du foie, de la rate et de la moelle osseuse. L'hmoglobine dtruite va librer le fer, dont une partie est stocke sous forme de frritine et d'hmosidrine (Fe""""*") et une autre partie est libre dans le plasma. Le fer plasmatique est transport par une protine, la transferrine qui est normalement sature au tiers de ses capacits de transport. Le fer plasmatique peut avoir deux destines : - la plus importante est son retour au niveau de la moelle osseuse o il sera incorpor au sein des rythroblastes, cellules prcurseurs des GR. - l'autre voie permet la mise en rserve sous forme de frritine et d'hmosidrine dans les cellules parenchymateuses du foie (hpatocytes). Le plasma est donc un passage obligatoire pour le fer contenu dans le SRH de la moelle osseuse et qui rentrera dans la synthse des GR. Le phnomne de la rophocytose qui est l'injection directe de la frritine des macrophages de la moelle osseuse dans les rythroblastes ne concerne en effet qu'une infime partie de cette frritine. Le fer plasmatique est par ailleurs la voie de passage entre le fer absorb au niveau du tube digestif, le fer mobilis partir des rserves et le fer limin au niveau des monctoires. Ce fer plasmatique est quantitativement trs faible, de l'ordre de 20 ixmol/l, mais qualitativement trs important car il est un carrefour obligatoire dans le cycle corporel de ce mtal. Par l'intermdiaire du fer plasmatique, les changes en fer entre les diffrents secteurs sont trs importants car le fer circulant est renouvel en moyenne 10 fois par jour.
13.
Besoins en fer
Le fer est recycl dans l'organisme et les besoins doivent juste compenser les pertes : - pertes rgulires dont la plus importante est la desquamation des cellules intestinales pithliales. S'y associent des pertes faibles par la bile, la peau et l'urine ; - pertes pisodiques lies aux hmorragies, aux pertes menstruelles, la grossesse, l'allaitement. Les besoins quotidiens sont d'environ : - 1 mg chez l'homme, - 2 mg chez la femme en priode d'activit gnitale. La grossesse demande pour la mre un apport supplmentaire de l'ordre de 3 mg/jour pour les deux premiers trimestres et de 10 mg/jour pour le dernier. Chez l'enfant les besoins sont plus importants pendant les deux premires annes et au moment de l'adolescence.
102__________________________________Biochimie clinique Le fer est apport principalement par la viande, le poisson, les lgumes secs, les fruits, les lgumes (les aliments les plus riches sont les abats).
1.4.
Absorption du fer
Elle a lieu dans le duodnum et un degr moindre dans le jjunum. Le taux d'absorption lors d'un rgime quilibr tant d'environ 10 %, l'apport alimentaire quotidien doit tre de 10 mg chez l'homme et de 20 mg chez la femme. Dans les pays dvelopps, les apports sont gnralement suprieurs aux besoins. Le fer hminique (viandes et poissons) est bien absorb. Le fer non hminique (crales, lgumes secs, fruits, lgumes, produits laitiers) est moins bien absorb. C'est ainsi que le fer contenu dans le foie de veau est 20 fois mieux absorb que celui se trouvant dans le riz. L'acide ascorbique (vitamine C) favorise l'absorption du fer non hminique alors que le th et le caf l'inhibent fortement. Dans tous les cas l'organisme n'absorbe que la quantit de fer dont il a besoin. Cette rgulation n'est pas encore lucide aujourd'hui. Elle comporterait deux tapes : d'abord la captation du fer de la lumire intestinale par la cellule puis son relargage par l'entrocyte vers le plasma. Un certain nombre de protines interviendraient dans cette absorption dont la ferritine intracellulaire. Pendant son transfert dans l'entrocyte une partie du fer serait stocke sous forme de ferritine et l'importance de celle ci rgulerait l'absorption du fer (c'est cette ferritine qui est perdue lors de la desquamation des entrocytes). Cependant la nature du signal permettant la cellule muqueuse de stocker plus ou moins de ferritine n'est toujours pas lucide. Quoiqu'il en soit, une surcharge de l'organisme en fer diminue son absorption et au contraire, toute augmentation de l'activit rythropotique (saignement, hmolyse...) augmente l'absorption du fer.
1.5.
Transport du fer dans le plasma
La plus grande partie du fer plasmatique est transporte par une glycoprotine, la transferrine, migrant l'lectrophorse au niveau des Pj-globulines. Cette molcule est capable de fixer deux atomes de fer ferrique, un chaque extrmit de la protine. Globalement la transferrine du plasma est sature environ au tiers de sa capacit. Il existe plusieurs isotransferrines plasmatiques (une vingtaine), mais cette htrognit ne semble pas avoir de signification physiopathologique, car la capacit de fixation du fer de ces diffrentes transferrines est identique. La synthse de la transferrine a lieu essentiellement dans l'hpatocyte mais aussi un peu dans les macrophages de la moelle osseuse et de la rate. La syn-
Mtabolisme du fer
__
103
thse de la transferrine par l'hpatocyte est fonction de la quantit de fer dans la cellule. Une diminution des rserves est responsable d'une augmentation de la synthse de la transferrine et inversement dans les surcharges en fer la synthse est diminue. Dans les surcharges en fer comme l'hmochromatose, dans laquelle il existe une trop grande absorption du mtal, la transferrine est totalement sature par le fer, et celui-ci peut tre transport par d'autres protines comme l'albumine ou la lactoferrine. 80 % du fer transport par la transferrine sont transfrs aux rythroblastes de la moelle osseuse pour la fabrication des hmaties. Les cellules rythrodes captent le fer de la transferrine par l'intermdiaire de rcepteurs appels rcepteurs de la transferrine (RTf). Toutes les cellules de l'organisme possdent des RTf mais les rythroblastes en sont les plus richement dots. Le nombre de RTf est le principal lment rgulateur du taux de captation du fer par les rythroblastes. Ces RTf membranaires rythroblastiques, dans leur mtabolisme, donnent naissance une forme tronque capable de passer dans le plasma o l'on peut la mesurer et que l'on appelle le rcepteur soluble de la transferrine (RsTf). Il existe une bonne corrlation entre l'activit prolifrative de la moelle et le taux srique des RsTf. Une toute petite quantit de fer du plasma normal n'est pas li la transferrine. Le fer y circule : - soit li des petites molcules comme le citrate ou l'actate ; - soit incorpore dans la ferritine plasmatique ; - soit fix sur l'haptoglobine s'il est au sein de l'hmoglobine non globulaire (hmolyse) ; - soit fix sur l'hmopexine s'il est au sein de l'hme. Les 3 dernires formes ne sont captes que par les hpatocytes.
1.6.
Utilisation mtabolique. Fer actif
L'emploi du fer radioactif a permis de montrer que 75 % du fer administr par voie veineuse sont utiliss pour la synthse de l'hmoglobine. Celle-ci utilise, pour 7g d'hmoglobine quotidiens, environ 24 mg de fer. La presque totalit est issue du catabolisme de l'hmoglobine dans le systme rticulohistiocytaire qui libre environ 23 mg de fer. Ainsi s'expliquent les trs faibles besoins journaliers, de l'ordre de 1 mg. Les 25 % restants sont destins la synthse de la myoglobine, des cytochromes, des enzymes catalases et peroxydases, molcules porteuses de ferro ou ferriporphyrines et des protines fer-soufre des chanes respiratoires mitochondriales. Ce fer actif provient donc de multiples origines ; rcupration du fer hmoglobinique, fer exogne alimentaire et si ncessaire fer des rserves.
1.7.
Rserves en fer de l'organisme
Elles reprsentent peu prs 35 % du fer total sous deux formes de stockage, la ferritine et l'hmosidrine dans laquelle le fer est sous forme ferrique. Ces deux types de rserves se trouvent surtout au niveau du foie, de la rate et de la moelle osseuse. La ferritine reprsente la forme de stockage rapidement disponible, alors que dans l'hmosidrine le fer est plus difficilement mobilisable. 2.7.7. Ferritine 1.7.1.1. Ferritine tissulaire La ferritine tissulaire est une structure ubiquitaire constitue d'une protine, l'apoferritine, et de fer l'tat ferrique (figure 4.2).
Sous-unit protique LouH
Atomes de fer
Figure 4.2 Schma de la molcule de ferritine.
L'apoferritine est une protine constitue de 24 sous-units, assembles en une structure compacte et sphrique dlimitant une cavit centrale qui peut contenir jusqu' 4 500 atomes de fer. Cependant les ferritines tissulaires ne sont satures en gnral qu' 50 %. Les 24 units protiques peuvent tre de deux types : L (liver) ou H (heart), et en fonction des proportions des deux sous units un grand nombre d'apoferritines (et donc de ferritines) peuvent tre retrouves. Bien qu'ubiquitaire, la ferritine est localise plus particulirement dans certaines cellules : dans les macrophages du SRH du foie, de la rate, de la moelle osseuse, et dans les hpatocytes.
Mtabolisme du fer
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_____
105
Le fer des ferritines des macrophages est le premier mobilis pour rentrer dans l'rythropose, aprs avoir t transport par la transferrine. Le fer des hpatocytes ne se mobilise que si la voie prcdente est puise. La libration du fer de la ferritine demande un systme d'oxydorduction qui est diffrent pour les macrophages et les hpatocytes. Dans la cellule macrophagique le fer ferrique est rduit par un systme qui dpendrait de la vitamine C, ce qui lui permet de traverser la membrane. Dans l'hpatocyte, le fer ferrique serait rduit par une ferrirductase. Le fer ferreux retrouv dans le plasma doit tre roxyd par la cruloplasmine (protine plasmatique spcifique du transport du cuivre) pour tre transport par la transferrine. La carence en vitamine C peut entraner un blocage du fer dans les macrophages et donc une hyposidrmie (taux plasmatique de fer abaiss). Un taux effondr de cruloplasmine (maladie de Wilson) sera de mme responsable d'une hyposidrmie. 1.7.1.2. Ferritine plasmatique Une trs petite quantit de ferritine ( peu prs 150 (xg/l soit 2,5 (Jumol/l) se trouve dans le plasma, o les mthodes de dosages rcentes permettent de la mesurer. Elle aurait deux origines : - une grande partie (80 %) viendrait des macrophages du SRH o, aprs une synthse spcifique (diffrente de la synthse des ferritines tissulaires), elle serait scrte dans le plasma. Cette ferritine est glycosyle (une partie glucidique est fixe sur la molcule) pendant le processus scrtoire et est pauvre enfer ; - une autre partie proviendrait de la lyse des cellules de diffrents tissus lors de la snescence de ceux-ci. Cette ferritine n'est pas glycosyle et est riche enfer. Si quantitativement cette ferritine est mineure, elle est particulirement importante dans le cadre de l'exploration du mtabolisme du fer, car la ferritinmie est un bon reflet des rserves martiales. 7.7.2. Hmosidrine Forme stable de rserve martiale elle ne libre son fer que trs lentement. C'est un complexe fer-protine qui driverait d'une digestion lysosomiale des agrgats de ferritine. Elle se trouve, comme la ferritine, dans les macrophages du SRH et dans les hpatocytes o on peut la mettre en vidence par la coloration de Pris au bleu de Prusse.
1.8.
Rgulation du mtabolisme cellulaire du fer
Cette rgulation intervient dans l'approvisionnement de la cellule en fer mais aussi dans la protection de celle ci contre une surcharge potentiellement toxique de ce mtal. C'est le stock de fer lui mme de la cellule qui rgule ces deux versants du mtabolisme du fer par l'intermdiaire d'une protine cellulaire appele IRP (ion regulatory protein). Celle ci en cas de stock cellulaire bas : - empche la synthse des sous units d'apoferritine ; - et permet la synthse des RTf de la cellule.
2.
Exploration du mtabolisme du fer
C'est un chapitre qui a beaucoup volu ces dernires annes par l'apparition de techniques permettant les dosages de la transferrine et de la ferritine plasmatiques auxquelles il faut rajouter le dosage plasmatique des RsTf. Le fer tant un lment indispensable l'rythropose il est ncessaire, pour tablir un bilan complet, de dterminer certains paramtres de la ligne rouge, au moins le taux d'hmoglobine, l'hmatocrite, et la numration des globules rouges.
2.1.
Dosage du fer srique : sidrmie
A l'tat normal ce dosage correspond la dtermination : - du fer li la transferrine (pour plus de 95 %) ; - du fer non li la transferrine (pour moins de 5 %) ; A l'tat pathologique le dosage peut inclure en plus : - le fer hmoglobinique (hmolyse) ; - le fer fix sur d'autres protines de transport que la transferrine (hmochromatose) ; - le fer ferritinmique (ncrose cellulaire intense).
Les valeurs habituelles de rfrence sont de 12 30 fJunol/l.
La sidrmie est sujette des variations nycthmrales importantes avec un maximum vers midi et un minimum vers minuit. Il est donc important pour l'interprtation d'une sidrmie de standardiser le prlvement. Il est conseill de prlever le matin entre 8 h et 10 h.
Mtabolisme du fer____________________________________107
2.2.
Capacit totale de fixation de la transferrine (CTF)
Cet examen consiste mesurer la quantit maximale de fer que la transferrine peut transporter. Pour cela on sature compltement la transferrine de l'chantillon par le rajout d'un excs de fer. Lorsque la tranferrine est sature (aprs une certaine incubation) le fer excdentaire non fix est retir du milieu. Un nouveau dosage du fer de l'chantillon permet alors de connatre la CTF. Valeurs de rfrence '.de 45 65 pmol/l
\
2.3.
Capacit latente de fixation (CLF)
C'est un calcul qui permet de connatre la quantit de fer que la transferrine est capable de transporter en sus de la sidrmie. Il correspond la diffrence suivante : CLF = CTF - fer srique
2.4.
Coefficient de saturation de la transferrine (CS)
D correspond au rapport :
es = Fersenque x 100
v-/ J. S.
Valeurs de rfrence : de 25 35 % La CTF, qui est un dosage relativement peu fiable, est de plus en plus remplace par le dosage direct de la transferrine.
2.5.
Dosage de la transferrine
Des mthodes immunochimiques permettent maintenant de doser la transferrine. L'intrt est double : - apprcier la capacit de synthse du foie, en rapport avec les rserves de fer de l'organisme, - calculer d'une faon plus correcte la capacit totale de fixation et le coefficient de saturation.
Valeurs de rfrence : de 2 4 g/l

La CTF et le CS se calculent facilement en sachant que le poids molculaire de la transferrine est de 80 000 et que chaque molcule transporte 2 atomes de fer.
CTF = X g de transferrine x 25
2.6. Dosage de la ferritine plasmatique : ferritinmie

Les valeurs de rfrence sont difficiles indiquer car variables d'une mthode l'autre. De plus la ferritinmie doit tre interprte en fonction de l'ge et du sexe. L'homme prsente une ferritinmie plus leve que la femme et chez celle ci les taux moyens de 30 |Jig/l augmentent aprs la mnopause aux environs de
80 |JLg/l.
En moyenne on peut donner les valeurs de rfrence suivantes : Homme : 50 350 |Jig/l Femme : 30 120 |JLg/l
2.6.1. Hypoferritinmie
C'est actuellement le meilleur marqueur des carences martiales. En cas de manque de fer l'hypoferritinmie est le signe le plus prcoce, bien avant l'hyposidrmie ou le retentissement rythropotique. C'est aussi un signe particulirement sensible car il n'existe pas d'autre pathologie induisant une hypoferritinmie. Sous l'influence d'une thrapeutique substitutive, la ferritine plasmatique est le dernier signe revenir la normale. Son dosage est donc ncessaire au contrle ultime de la restauration des rserves. 2.6.2. Hyper ferritinmie Si une surcharge en fer, comme dans l'hmochromatose, augmente la ferritinmie, une augmentation de la ferritine plasmatique peut aussi se voir en dehors de toute augmentation du fer de l'organisme. C'est le cas : - au cours des inflammations car la ferritine est une protine de la raction inflammatoire. L'hyperferritinmie ici est due l'augmentation de la scrtion par les macrophages du SRH. Cette hyperferritinmie contraste avec une hyposidrmie due une rtention du fer dans le SRH ; - au cours de l'alcoolisme chronique ou l'hyperferritinmie est due l'action directe de l'alcool sur la synthse de cette protine associe au retentissement hpatique et une surcharge en fer du foie. L'alcool a de plus un retentissement
Mtabolisme du fer____________________________________1Q9
sur certaines formes circulantes de la transferrine. On a remarqu que les isoformes les moins sialyles de cette glycoprotine (c'est--dire les moins riches en glucides) se retrouvaient avec un pourcentage plus important chez l'alcoolique chronique. Ce dosage appel transferrine dsialyle (ou CDT carbohydrate dficient transferrin) est un nouveau test qui vient s'ajouter la batterie des tests de dpistage de l'alcoolisme chronique ; - au cours des cytolyses hpatiques (hpatites) ; - au cours de certaines noplasies (cancer du sein, des poumons, des ovaires, leucmies) dans lesquelles l'hyperferritinne serait due une scrtion anormale de ferritine par les cellules tumorales.
2.7.
Dosage des rcepteurs solubles de la transferrine (RsTf)
Le rcepteur membranaire de la transferrine (RTf) port par presque toutes les cellules peut subir une protolyse donnant naissance des formes tronques qui passent dans le plasma. Ces structures plasmatiques, appeles rcepteurs solubles de la transferrine, peuvent tre doses par des techniques immunoanalytiques. Les RTf sont prsents sur toutes les cellules de l'organisme l'exception des rythrocytes, cependant ce sont les rythroblastes qui en sont les plus richement dots. Ce rcepteur capte la transferrine transportant le fer et permet son internalisation cellulaire. Le nombre de RTf membranaires est rgul par la concentration intracellulaire en fer. Les RsTf correspondent aux RTf ayant perdu leur domaine cytoplasmique et transmembranaire. La source principale des RsTf tant reprsente par les RTf des cellules rythrodes on peut constater qu'il existe une bonne corrlation entre l'activit prolifrative de la moelle et la concentration srique des RsTf.
2.8.
Les tudes ferrocintiques
Elles consistent injecter par voie intra-veineuse du 59Fe radioactif li la transferrine, et mesurer les cintiques de sa disparition plasmatique et de son incorporation dans l'hmoglobine des GR circulants. Ce test apporte des informations sur l'efficacit et le sige de l'rythropose.
3.
Ce chapitre traditionnellement dcompos en hyposidremie et hypersidrmie doit tre revis en fonction des connaissances rcentes du mtabolisme du fer, et plutt tre trait en carences martiales et surcharges en ce mme mtal.
3.1.
Carences martiales
C'est un phnomne frquent qui touche plusieurs centaines de millions d'tres humains dans le monde. En cas de pertes suprieures aux entres, l'organisme puise sur ses rserves et une carence s'installe. Elles relvent sous nos climats, davantage d'une perte excessive que d'un manque d'apport. 3.1.1. Etiologies 3.1.1.1. Saignements chroniques Chez l'homme et la femme mnopause on doit rechercher en priorit une perte digestive. Chez la femme en priode d'activit gnitale on recherchera d'abord une perte gnitale.
3.1.1.2. Utilisation intensive du fer
- Chez une femme au cours du dernier trimestre de la grossesse ou ayant prsent des grossesses rptes. 70 % de ces femmes prsentent, s'il n'y a pas de supplmentation, un tat carentiel. - Au cours de la premire anne de la vie pendant que les rserves sont faibles et l'alimentation lacte pauvre en fer. - Don du sang rgulier. Des dons rpts (suprieurs trois par an) peuvent petit petit puiser les rserves d'un organisme. - Hmodialyss. Certains insuffisants rnaux peuvent dvelopper une carence martiale (pertes au moment des dialyses, examens biologiques frquents...)
3.1.2. Biologie
La carence s'installe progressivement et passe par trois phases : (voir tableau 4.2) - carence latente ; - carence installe ; - anmie. Le terme ultime de la carence est en effet une anmie microcytaire hypochrome. Anmie : Diminution de la quantit d'hmoglobine circulante. Valeurs de rfrence : - Homme de 13 18 g/100 ml - Femme et enfant de 12 16 g/100 ml - Nouveau-n de 14 20 g/100 ml. Microcytaire : Les GR ont un volume globulaire moyen (VGM) infrieur la normale.
Mtabolisme du fer____________________________________m Valeurs de rfrence : 85 < VGM < 95 (xm3
Hypochrome : La teneur globulaire moyenne en Hb (TGMH) est infrieure la normale. Valeurs de rfrence : 27 < TGMH < 33 pg
Il est trs important de dpister une carence martiale avant son terme, qui est l'anmie. chaque stade de l'volution de la carence correspondent des signes biologiques particuliers. Ils sont regroups dans le tableau 4.2. Tableau 4.2 volution biologique au cours de la carence martiale. Carence latente Abaisse N N N N N N Carence installe Trs abaisse Augmente Abaiss N N N N Anmie Trs abaisse Augmente Trs abaiss Abaiss Abaisse Oui Oui
Ferritine Transferrine ou CTF
es
Fer srique Hmoglobine Microcytose Hypochromie N = Normal
3.1.3. Cas particulier des anmies inflammatoires Frquemment chez des sujets prsentant un syndrome infectieux svre, un syndrome inflammatoire ou une noplasie, une anmie se dveloppe. Celle-ci est au dbut normochrome normocytaire mais volue bientt vers une anmie hypochrome microcytaire faisant intervenir une carence martiale. La physiopathologie de ce manque de fer mettrait en cause une protine des polynuclaires neutrophiles, la lactofrrine. La dgranulation des polynuclaires au cours de ces pathologies libre la lactofrrine qui, prsentant une trs grande affinit pour le fer, dplace celui-ci de la transferrine. La lactofrrine sature en
112__________________________________Biochimie clinique fer est ensuite pige par les macrophages du SRH o le fer s'accumule sous forme de rserves. La moelle osseuse est donc prive du fer qui lui est normalement apport par la transferrine. Dans ces syndromes il n'y a pas de carence martiale vraie, mais un stockage du fer dans le SRH et un manque d'apport la moelle osseuse. Ceci explique la biologie (tableau 4.3), dans laquelle la ferritine n'est plus le marqueur de dpistage de la carence martiale. Celle ci, comme toute protine inflammatoire, est en effet augmente. Le fer srique est abaiss car pig par les macrophages et dans ces conditions la transferrine a tendance baisser. Comme le fer et la transferrine baissent tous les deux, le CS peut rester normal. Il est abaiss si le fer baisse proportionnellement plus que la transferrine. Les RsTf sont normaux puisqu'il n'y a pas de surcharge martiale. Si au cours de ces syndromes inflammatoires ou infectieux survient une carence en fer, notamment chez le vieillard, le diagnostic devient difficile tablir. La ferritine (tableau 4.3) n'est d'aucun secours (normale ou augmente) et le taux de transferrine peut tre trs variable. Dans ces conditions le dosage des RsTf trouve ici sa principale indication. En effet sa concentration est indpendante de l'inflammation ou de l'infection alors qu'elle augmente en cas de carence martiale.
Tableau 4.3 Biologie des anmies inflammatoires (N = normal). ' Ferritine Transferrine Fer srique Anmie inflammatoire et carence en fer Augmente Abaisse en gnral Abaiss N ou Abaiss Normaux Anmie inflammatoire Augmente ou N Variable Abaiss Variable Abaisss
es
RsTf
3.2.
Surcharges en fer
II convient de distinguer l'hmochromatose gntique des surcharges tissulaires secondaires. \2.1. Hmochromatose gntique
'est une maladie hrditaire transmise sur le mode rcessif. "e traduit par une surcharge enfer due une augmentation de l'absorp''wle sans lien avec les besoins de l'organisme.
Mtabolisme du fer____________________
____________113
Le fer va s'accumuler tout au long de la vie dans de nombreux tissus, notamment le foie, entranant un tableau clinique et biologique particulier. 3.2.1.1. Clinique Le tableau clinique complet, exceptionnellement observ dans nos rgions, associe : - un dpt de fer dans la peau entranant une mlanodermie (aspect bronz de la peau), et sur les muqueuses, en particulier dans la bouche ; - une hpatomgalie (augmentation du volume du foie) qui peut tre trs importante. L'volution se fait vers la cirrhose par sidroncrose d'o le nom donn cette maladie de cirrhose bronze ; - des troubles du mtabolisme des glucides avec diabte (atteinte du pancras et du foie) ; - des signes endocriniens domins par une insuffisance gonadique d'origine hypophysaire ; - des manifestations cardiaques avec des troubles du rythme et parfois une insuffisance cardiaque ; - des manifestations osseuses et articulaires (dminralisation, ostophytose...). 3.2.7.2. Biologie Le fer s'accumule d'abord beaucoup plus dans le foie que dans les macrophages du SRH ce qui permet d'expliquer le tableau biologique : - le fer srique est trs augment ; - le CS de la transferrine est trs lev ; - la transferrine est diminue ; - la ferritine plasmatique n'est augmente que dans les stades volus de la maladie, et dans le cadre d'enqutes familiales de dpistage elle n'est d'aucune utilit, les macrophages n'tant pas encore envahis. Ces malades relvent d'une thrapeutique qui consiste effectuer des saignes frquentes qui liminent du fer, en surveillant la ferritine qui doit rester basse. 3.2.1.3. Gntique Depuis le milieu de l'anne 1996 le clinicien dispose d'un test gntique direct permettant, partir d'un prlvement sanguin, d'tablir le diagnostic d'hmochromatose gntique. Il consiste en la recherche de la mutation C282Y porte par le gne HFE situ sur le chromosome 6 (remplacement de la cystine 282 par une tyrosine). Si C282Y est retrouv l'tat homozygote, le diagnostic d'hmochromatose gntique est port. Si C282Y est retrouv l'tat htrozygote, le diagnostic d'hmochromatose est retenu mais toute surcharge impor-
114__________________________________Biochimie clinique tante et volutive devra faire liminer une autre cause de surcharge martiale. Si C282Y n'est pas retrouv, on peut raisonnablement liminer, en l'tat actuel des connaissances, une hmochromatose gntique. 3.2.2. Surcharges secondaires enfer Ces surcharges peuvent tre secondaires certaines anmies, une insuffisance rnale, une maladie mtabolique, une maladie hpatique. 3.2.2.1. Surcharges des anmies Elles peuvent entraner une surcharge en fer par deux mcanismes : - des transfusions qui tentent de corriger l'anmie ; - un avortement de la maturation des GR et leur destruction prcoce (hmolyse) qui sont responsables d'une rythropose accrue mais inefficace, laquelle entrane une augmentation de l'absorption du fer. Rentrent dans ce cadre les anmies dues : - une hmoglobinopathie dans laquelle il y a synthse d'une hmoglobine anormale, par le remplacement d'un acide amin par un autre sur une des chanes de globine ; - une thalassmie dans laquelle un type de chane de la globine n'est pas synthtis (le plus souvent la chane (3 > (3-thalassmie) ; - une impossibilit primitive d'incorporation du fer dans le GR. Les dpts affectent surtout la moelle osseuse o l'on retrouve des rythroblastes chargs en granules de fer colorables par la coloration de Pris appels sidroblastes. La surcharge en fer peut voluer vers une vritable hmochromatose si une thrapeutique efficace n'est pas institue. Celle-ci fait appel un chlateur du fer, la desferrioxamine (Desfral) qui mobilise le fer des rserves et permet son limination urinaire et fcale. Tout ceci explique la biologie de ces maladies dans lesquelles on a : - une anmie hypochrome ; - un fer sanguin qui est souvent normal mais parfois augment ; - une ferritine circulante augmente. 3.2.2.2. Surcharge secondaire des insuffisants rnaux Les insuffisants rnaux peuvent dvelopper des carences en fer, mais le plus souvent par le fait de transfusions rptes ou par supplmentation titre systmatique lors des hmodialyses, ils vont prsenter une surcharge en fer. 3.2.2.3. Surcharge secondaire une maladie mtabolique - Syndrome d'hpatosidrose dysmtabolique qui associe un contexte polymtabolique (surpoids et /ou troubles du mtabolisme des glucides et / ou des
Mtabolisme du fer____________________________________115
lipides et /ou hypertension artrielle) une hyperferritinmie avec des taux de transferrine et de fer normaux. Le foie prsente une statose mais la physiopathologie de ce syndrome est inconnue. Il est cependant rencontr assez frquemment. - Porphyrie cutane - Atransferrinmie dans laquelle l'organisme ne synthtise pas de transferrine. Le fer absorb fuit immdiatement vers les rserves (maladie exceptionnelle). 3.2.2.4. Surcharge secondaire une maladie hpatique D est habituel de classer certaines hpatopathies, en particulier alcooliques, dans les surcharges secondaires. Il est en effet retrouv, par cytolyse hpatique, une augmentation du fer circulant et de la ferritinmie. Cependant des tudes rcentes ont montr que le fer global de l'organisme n'tait pas augment et que l'on ne pouvait pas parler dans ce cas de surcharge vraie.
4.
4.1.
Techniques de dosage
Fer plasmatique (ou srique)
Ce qui est dos, c'est le fer presque exclusivement transport par la transferrine. L'heure de la ponction veineuse doit tre standardise du fait de la variation nycthmrale : on prconise entre 8 h et 10 h du matin. Les techniques physiques telles que l'absorption atomique ou la coulomtrie ont une diffusion restreinte (1,5 % des laboratoires franais). Le fer est surtout dtermin par colorimtrie. Le principe de dosage est le suivant :
Deux grands types de mthodes coexistent : - celles dans lesquelles les protines sont prcipites, mais du fait de l'automation, ces techniques disparaissent du march ; - celles dans lesquelles on conserve les protines en suspension et qui sont appeles directes .
Ces techniques directes connaissent un trs grand succs en raison du dveloppement des automates. ^ L'adjonction de chlorhydrate de guanidine permet de maintenir les protines en solution malgr le pH acide. Tous les chromognes peuvent tre utiliss : BPS (Bathophnanthroline sulfbne, frne S, TPTZ (tripyridyltriazine), ferrozine, mais ceux qui ont une sensibilit leve (frne S et ferrozine) sont maintenant les plus diffuss, car concentration en fer gale, le produit color mesur prsente une absorbance plus leve.
4.2.
Transferrine
Son taux peut tre valu indirectement en saturant la transferrine par un excs de fer, suivi par un dosage de la sidrmie aprs limination du fer en excs (non fix) par sa rcupration sur de l'hydroxycarbonate de magnsium ou sur une rsine changeuse d'ions. C'est une technique qui ne donne pas de bons rsultats. Le dosage direct de la transferrine, technique qui doit tre prfre, se fait par une technique immunochimique qui peut tre automatise.
4.3.
Ferritine plasmatique
Le dosage de la ferritine plasmatique ou srique, est maintenant accessible tous les laboratoires par l'apparition d'automates appliquant une technique immuno-enzymologique avec marqueur non isotopique. Cependant certains laboratoires hospitaliers continuent de doser cette molcule par une technique radio-immunologique faisant appel des marqueurs radioactifs.
Mtabolisme du fer__________________
_______
117
Commission Fer et protines de transport (SFBC) : Modification de la technique slectionne pour la dtermination du fer dans le srum, ISB 1991, 4, 247-256. Fer et ferritine ; exploration et intrt mdical. Option/Bio n 1, 1992. P. Mtais et al. Biochimie clinique. Tome 1, Tome 3, Simep, Villeurbanne, 1988. M. Paris et al. Mtabolisme du fer. Exploration biologique actuelle. Le concours mdical 1991, 113,29-34. J.C. Renversez et al. La transferrine dficiente en acide statique : un marqueur biologique prometteur, sensible de l'thylisme chronique. Ann Biol Clin 1992, 50,1-7. M. Vemet. Ferritine. Aspects techniques, place de cet examen dans l'exploration du mtabolisme du fer et dans diverses pathologies. Feuillets de biologie 1989, 166, 3542. Biologie et gntique des anomalies du mtabolisme du fer. Ann Biol Clin, vol.56 n spcial, juillet 1998 M. Vemet. Le rcepteur de la transferrine : rle dans le mtabolisme du fer et intrt en biologie clinique. Ann Biol Clin 1999, 57,9-17.
5
Mtabolisme du magnsium, du cuivre et du lithium
Pierre Valdigui et Thierry Levade
Sous-chapitre 1 :
MAGNSIUM
Le magnsium est un mtal blanc argent, s'oxydant facilement l'air (d'o son important pouvoir rducteur) qui joue un rle important en biologie humaine, aussi bien sur le plan dynamique, comme cofacteur de nombreuses ractions enzymatiques, que sur le plan statique car il participe, avec le calcium, la structure de l'os.
1. 1.1.
Notions physiologiques et biochimiques fondamentales Rpartition
Un adulte de 70 kg contient en moyenne 1 000 mmol soit 2 000 mEq de magnsium soit environ 24 g (le magnsium tant un cation bivalent de poids atomique 24,31). Plus de 50 % de ce total sont constitus par le magnsium osseux qui se prsente sous forme de carbonate amorphe fix la surface des cristaux d'hydroxyapatite. Il ne peut, cependant, en aucun cas remplacer le calcium au sein de ces
120__________________________________Biochimie clinique cristaux. D contribue compenser rapidement les variations de la magnsimie, remarquablement stable. Dans le sang, le magnsium plasmatique n'atteint pas 1 % du capital global. Dans les tissus mous, le magnsium est surtout abondant dans le muscle o il participe la constitution des chanes d'actomyosine.
1.2.
Origine du magnsium
Les besoins quotidiens alimentaires sont chez l'adulte de 0,25 0,5 g et chez le nourrisson de l'ordre de 6 mg/kg de poids corporel. Les principales sources alimentaires sont le lait et les vgtaux verts (chlorophylle). Son absorption intestinale (qui a principalement lieu au niveau du jjunum et de l'ilon) dpend de conditions et de facteurs trs proches de ceux qui rglent l'absorption calcique. Elle est en effet favorise par un rgime riche en protines, l'acidit gastrique, la scrtion de parathormone, la vitamine D et est diminue par un rgime riche en acides gras, en phosphates et en phytates. Plus de la moiti du magnsium ingr est rejete dans les fces chez l'adulte.
13.
Mtabolisme et action biochimique
Dans le srum, le magnsium se prsente, comme le calcium, sous deux formes : - diffusible, comprenant le magnsium ionis (55 %) (au niveau du rein, on admet l'existence d'une filtration glomrulaire portant sur la fraction ionise puis d'une rabsorption tubulaire portant sur 90 % du magnsium filtr), et le magnsium complex li des anions comme les phosphates, citrate ou lactate (10 15%), - non diffusible correspondant au magnsium li aux protines (30 35 %). Cofacteur de nombreuses enzymes du mtabolisme intermdiaire, le magnsium est surtout un cation intracellulaire (principalement localis dans les mitochondries). Sa dtermination dans les rythrocytes sera ainsi un moyen indirect de l'apprcier. Il intervient galement dans les phnomnes d'excitabilit neuromusculaire en synergie avec les ions H'1" et a'1"1" (globalement l'ion Mg^ tant un ion sdatif ). Il joue probablement un rle dans les phnomnes d'agrgation plaquettaire et est antagoniste de certains effets du calcium.
Mtabolisme du magnsium, du cuivre et du lithium_________________121
2.
2.1.
Exploration
Mthodes de dosages
Le dosage du magnsium n'est rellement satisfaisant qu'en spectrophotomtrie d'absorption atomique (mthode de rfrence) ; cependant seulement 3,2 % des laboratoires utilisaient cette technique en avril 1989. Les mthodes colorimtriques sont les plus utilises avec pour indicateur colore la calmagite (77,9 %) ou le magon (11,4 %). Ainsi, en milieu alcalin la calmagite bleue forme avec le magnsium un complexe ros dont l'intensit de coloration, lue 538 nm, est proportionnelle la concentration du magnsium. L'EGTA (ethylne glycol ttra-actique) et le cyanure de potassium liminent les interfrences du calcium et des mtaux.
2.2.
Valeurs usuelles
Les valeurs usuelles sont : - dans le srum 0,65 1,15 mmol/l (1,3 2,3 mEq/l) ; - dans les rythrocytes 1,65 3,20 mmol/l ; - dans les urines 1 12 mmol/24 h. La concentration intra-rythrocytaire en magnsium exige l'absence d'hmolyse pour un dosage srique exact. La dtermination du magnsium intra-rythrocytaire est intressante effectuer, les rythrocytes tant les cellules permettant d'approcher la teneur en magnsium des autres cellules de l'organisme. Cependant, il faut savoir que la teneur intra-rythrocytaire est 2,5 3 fois plus faible que celle des autres cellules. Une augmentation physiologique de la magnsimie peut tre observe chez le nourrisson et la femme enceinte.
3.
3.1.
Hypermagnsimies
L'hypermagnsimie (au dessus de 2,5 mmol/l) entrane d'abord : - des troubles cardiaques lis l'allongement des temps de conduction sinoauriculaire et intracardiaque ; - des troubles respiratoires ; - des troubles nerveux avec somnolence et coma (narcose magnsienne) au del de 7,5 mmol/l.
122__________________________________Biochimie clinique
Les principales causes d'hypermagnsimie sont : - l'insuffisance rnale au cours de laquelle elle vite le plus souvent une ttanie (pour une clairance de la cratinine infrieure 0,5 ml/s, le magnsium peut atteindre 1,5 mmol/1). L'hypermagnsimie est habituellement lente ; - l'intoxication iatrogne la suite d'injections de srum glucose magnsie hypertonique intraveineux pour le traitement de l'clampsie.
3.2.
Hypomagnsimies
3.2.1. Spasmophilie
L'hypomagnsimie (au dessous de 0,7 mmol/1), associe ou non une hypocalcmie, peut entraner des mouvements anormaux, prdominant aux membres suprieurs, une ttanie vraie, une spasmophilie. La spasmophilie ou ttanie normocalcmique ou ttanie chronique idiopathique est un syndrome clinique trs frquent ou tout au moins trs frquemment diagnostiqu. Problme de mdecine praticienne plus que d'hpital, elle se manifeste par des signes trs variables selon les individus (souvent de sexe fminin) :
3.2.1.1. Signes
- Parfois une ttanie classique, sensitivomotrice avec son spasme carpopdal, la main d'accoucheur, les troubles centriptes de la sensibilit et jamais de perte de connaissance. - Le plus souvent ce ne seront que des signes fonctionnels regroups habituellement sous le terme de dystonie neurovgtative et participant une nvrose anxieuse : hypermotivit, paresthsies larynges, dyspne sine materie , sensation d'oppression thoracique, palpitations, cphales, dysphagie, atonie vsiculaire avec ballonnement post-prandial, ructations, colopathie spasmodique avec alternance de diarrhe et constipation, lombalgies et dorsalgies, etc. - Il y a cependant dans tous les cas une hyperexcitabilit neuromusculaire objective par le signe de Chvostek positif (attraction de la commissure labiale lors de la percussion mi-chemin entre le conduit auditif externe et l'angle buccal) et une activit rptitive l'lectromyographie (doublets, triplets, multiplets). - La baisse du magnsium srique est rare, un peu moins lors du dosage rythrocytaire et se pose alors le problme de savoir si la spasmophilie est une entit dfinissable. On parle alors de terrain spasmophile ou d' activit autorythmique survenant chez un sujet normal l'occasion d'un stimulus adquat, tel que l'hyperpne ou l'motion...
Mtabolisme du magnsium, du cuivre et du lithium__________________123
3.2.1.2. Traitement - Symptomatique : ne pouvant traiter toutes les plaintes du malade, seules seront prises en compte celles qui constituent une gne l'activit professionnelle ou aux relations socio-familiales. - Le traitement mdicamenteux associera aux anxiolytiques le magnsium, en cure longue, parfois du 25-OH-cholcalcifrol. 3.2.1.3. Etiologies Les principales causes sont : - en pathologie digestive, maldigestion, malabsorption intestinales, les pertes digestives lors de fistules ou de diarrhes au long cours ; - en pathologie rnale, toutes les causes entranant une diminution de la rabsorption tubulaire ; - les pertes cutanes importantes (brlures) ; - l'allaitement prolong. 3.2.2. Autres origines - Hypomagnsimie du nouveau-n. Elle peut s'observer : - Au cours de l'alimentation au lait de vache, qui, riche en phosphates, peut inhiber l'absorption intestinale. - A la naissance, avec un caractre familial idiopathique.
3.3.
Variations urinaires
Une hypermagnsiurie peut tre note, l'occasion d'une hypomagnsimie, quelle qu'en soit sa cause. Une hypomagnsiurie peut enfin s'observer en cas de dnutrition profonde voire de malabsorption svre, o d'autres signes prdomineront.
Sous-chapitre 2 : CUIVRE
Oligolment de poids atomique 63,55, le cuivre est indispensable la vie car il fait partie intgrante de la structure de diverses oxydases. Il appartient au groupe des lments trace car sa quantit totale chez un adulte de 65 kg n'est que de 100 mg.
1.
1.1.
Mtabolisme
Besoins
Ils sont de l'ordre de 2 3 mg/j chez l'adulte, de 4 7 mg/j chez le jeune.
1.2.
Apports, absorption
Les crales, le lait, les viandes (40 50 mg de cuivre/jour pour une ration protidique normale) reprsentent les apports les plus importants et largement excdentaires.
L'absorption est intestinale aprs ionisation par l'acide chlorhydrique gastrique. Ses modalits exactes ne sont pas connues. Ceci amne parler de la biodisponibilit du cuivre, c'est--dire la proportion de l'apport alimentaire qui, aprs absorption effective, sera capable d'assurer son rle biologique.
1.3.
Transport sanguin
Dans le sang le cuivre est prsent dans les globules rouges (sous forme d'rythrocuprine) et dans le plasma il est soit libre (< 5 %) ou fix sur la srumalbumine (2 %), soit surtout prsent dans une o^-glycoprotine, la cruloplasmine (95 %). C'est une htroprotine, de couleur bleue, contenant 6 8 atomes de cuivre selon les auteurs, pour un poids molculaire de 135 000 d soit 0,34 % de cuivre. La nature de la liaison cuivre-protine n'est pas totalement connue. Elle peut perdre in vitro la moiti de son cuivre sous l'action d'un rducteur comme l'acide ascorbique. La cruloplasmine possde l'activit d'une oxydase o le cuivre serait le coenzyme. C'est une protine de la reaction inflammatoire. (Cf. chapitre 9). Chez l'adulte les valeurs usuelles de cruloplasmine sont de 0,2 0,5 g/l.
1.4.
En dehors du cuivre globulaire et plasmatique, de nombreux tissus sont riches en cuivre (foie, muscles). Cependant le systme nerveux central vient indiscutablement en tte. La teneur en cuivre de la substance grise est beaucoup plus leve que celle de la substance blanche. Le locus niger a une charge cuprique particulirement importante. Une cuproprotine a t isole du cerveau et dnomme crbrocuprine.
1.5.
limination
Le cuivre normalement ne s'accumule pas dans l'organisme. Les voies d'limination sont de valeur trs ingale : - une part mineure (du fait de la faible part du cuivre diffsible) est limine par voie urinaire : environ 20 (xg/j, - une majeure partie est limine par les voies biliaires et par les fces : le cuivre fcal reprsente plus de 99 % du cuivre alimentaire. Son origine est double : - cuivre ayant simplement travers le tube digestif sans tre absorb, - cuivre absorb dans l'intestin et ensuite partiellement limin par la bile et les autres scrtions digestives.
1.6.
Rle mtabolique
Le cuivre fait partie, comme cofacteur, de divers systmes enzymatiques impliqus dans des ractions d'oxydorduction ou dans le mtabolisme de l'oxygne. Ce mtal n'agit jamais comme ion libre, mais - soit sous forme lie par valence la partie protique de mtalloenzymes, - soit sous forme de complexe non satur pouvant se lier au substrat. Les principales enzymes renfermant du cuivre sont la dopamine (S-hydroxylase, catalysant la synthse de la noradrnaline, la cytochrome C oxydase, maillon des chanes respiratoires, la cruloplasmine (implique dans le transport du cuivre et surtout dans une activit ferro-oxydasique maintenant le fer l'tat ferrique) et la superoxyde dismutase qui protge les cellules de l'effet toxique des radicaux libres de l'oxygne.
2.
2.1.
Exploration
Prlvement et techniques
Pour le prlvement sanguin et le recueil des urines, il est conseill d'utiliser du matriel plastique pour viter les phnomnes d'absorption qui ont lieu sur le verre. Le dosage s'effectue : - soit selon une technique de spectromtrie d'absorption atomique utilisant une flamme air actylne la longueur d'onde de 324,8 nm ; - soit par des techniques colorimtriques (bathocuprone, oxalyidihydrazide) moins sensibles et moins spcifiques.
2.2.
Valeurs usuelles
La cuprmie ou cuivre plasmatique est de 12 25 pmol/l. Pendant l'volution de la grossesse, la cuprmie augmente rgulirement jusqu'au terme, paralllement l'augmentation de la cruloplasmine, lie aux strognes. Les traitements aux strognes et les contraceptifs oraux produisent le mme effet. Les valeurs urinaires usuelles sont < 1,5 p.mol/24 h.
3.
Les carences en cuivre avec hypocuprmie s'observent : - soit dans le cas d'une maladie hrditaire trs rare, lie au chromosome X : la maladie de Menks, caractrise par un dfaut d'absorption intestinale du cuivre, de diagnostic prcoce trs difficile et de pronostic le plus souvent fatal avant 3 ans. - soit chez le nouveau-n soumis une alimentation parentrale exclusive. - soit dans des affections trs diverses : syndrome nphrotique (par fuite de cruloplasmine), syndromes de malabsorption (sprue et maladie cliaque) ou d'hypercatabolisme (brlures tendues), et enfin dans les svres dnutritions (kwashiorkor et marasme). Les hypercuprmies peuvent se rencontrer dans une foule d'affections : hmochromatose, cirrhose biliaire primitive, hmopathies malignes, maladies du collagne et enfin dans tous les tats inflammatoires o il y a lvation de la cruloplasmine. La maladie de Wilson est une maladie hrditaire rare, de transmission autosomique rcessive. Le gne a t identifi sur le chromosome 13 ; il code une ATPase membranaire transporteuse de cation. Cette affection est caractrise par une accumulation progressive de cuivre dans l'organisme et principalement dans le foie, le systme nerveux central et la corne. La symptomatologie associe une cirrhose hpatique, une dgnrescence des noyaux gris centraux (dgnrescence hpatolenticulaire), une atteinte rnale et un anneau vert pricomen (anneau de Kayser-Fleischer). Les signes biochimiques sont un abaissement du cuivre et de la cruloplasmine plasmatiques, une lvation de l'limination urinaire du cuivre et de sa concentration hpatique. Le traitement consiste en l'administration de la D-pnicillamine.
Sous-chapitre 3 :
LITHIUM
Le lithium est un mtal alcalin, comme le sodium ou le potassium, qui n'est normalement pas prsent dans le plasma, sauf l'tat de traces, et il n'a d'ailleurs pas de rle physiologique connu. Il est utilis en thrapeutique dans les psychoses maniaco-dpressives (troubles de l'humeur avec alternance de priodes d'excitation maniaque ou hypomaniaque et des priodes de dpression plus ou moins profonde). En mdecine gnrale, diverses autres indications ont aussi t proposes car il n'exerce aux doses thrapeutiques aucun effet dpresseur sur le systme nerveux central. La toxicit des sels de lithium, carbonate ou gluconate, commercialiss sous les noms respectivement de Tralithe et Neurolithium risque cependant d'entraner une pathologie iatrogne srieuse et le rle du laboratoire est important pour maintenir les concentrations plasmatiques aux valeurs correctes, justifiant ce chapitre particulier.
1.
Mtabolisme
Le lithium est habituellement prescrit par voie buccale. Aprs cette administration orale, le carbonate ou le gluconate de lithium est absorb totalement et
rapidement dans le tube digestif. L'absorption est associe celle du sodium et retentit donc aussi sur l'absorption de l'eau et de diverses substances dissoutes, comme le glucose. Ainsi s'expliqueront la diarrhe et les vomissements lors des intoxications lithies. Il diffuse ensuite dans tous les secteurs liquidions (diffusion gale celle de l'eau totale) mais la pntration cellulaire est beaucoup plus lente, ce qui explique le dlai d'environ une semaine avant l'obtention d'une rponse thrapeutique correcte. On observe d'ailleurs une rpartition trs variable suivant les organes et le temps total de transfert intracellulaire est faible dans le foie mais lev dans le cerveau (o certaines cellules sont capables d'accumuler ce mtal). Le lithium est aussi prsent dans la salive et dans le lait. La pntration intracellulaire se fait probablement par plusieurs mcanismes : - transport par les bicarbonates, qui serait le mcanisme le plus important ; - diffusion passive sans doute en mme temps que le sodium. En revanche l'expulsion du lithium par le mcanisme de la pompe sodium se fait beaucoup plus difficilement que pour le sodium, ce qui explique sans doute la rapidit de survenue des signes d'intoxication au niveau du rein, du cerveau et du cur. La demi-vie plasmatique est comprise entre 18 et 36 heures ; elle semble augmenter chez les patients soumis une lithiothrapie au long cours. Le mcanisme d'action du lithium est encore mal connu. Au niveau de l'extrmit des fibres adrnergiques du cerveau, une augmentation du turnover de la noradrnaline a t signale, lie peut-tre un effet stimulant sur la dopamine (3-hydroxylase, enzyme de la synthse des catcholamines noradrnaline et adrnaline. L'limination rnale du lithium se fait par filtration complte au niveau du glomrule puis rabsorption presque complte (environ 75 %) au niveau du tubule proximal suivie d'une excrtion distale peu modifie par l'aldostrone ou les diurtiques classiques. Cette excrtion rnale est lie au sodium car les deux ions Na"1" et Li"1' ont des mcanismes de transport certainement identiques. Ainsi s'explique la rtention lithie plasmatique rapide des rgimes sans sel. Toute lvation du taux plasmatique perturbe aussi l'limination de l'eau et des ions H'1", avec diabte insipide rsistant l'hormone antidiurtique.
2.
Exploration
Le sang pour dosage du lithium srique sera prlev sur un tube sec ; par contre le lithium rythrocytaire sera prlev sur tube contenant de l'EDTA.
Le prlvement est effectu avant une nouvelle prise et toujours la mme heure. Le lithium est dos par spectrophotomtrie d'mission de flamme, en utilisant du chlorure de potassium ou de csium comme standard interne, la longueur d'onde de 670 nm. Depuis peu des appareils quips d'lectrode slective lithium sont apparus, et permettent de doser cet lment avec une bonne fiabilit. ^ La zone thrapeutique est : - pour le srum de 0,6 1 mmol/1 - pour les rythrocytes de 0,2 0,4 mmol/1. La conduite du traitement, aprs contrle de l'intgrit rnale, ncessite une surveillance rgulire du taux de lithium plasmatique afin d'adapter la posologie par une augmentation progressive des doses. La posologie sera, bien entendu, adapte chaque individu et la rponse clinique. La lithimie efficace une fois atteinte, les dosages de contrle seront d'abord hebdomadaires puis ensuite mensuels. Les seules contre-indications majeures tiennent : - l'insuffisance rnale en raison de l'limination du mtal par le nphron ; - la prescription d'un rgime dsod pour asystolie, hypertension artrielle ou tout autre syndrome rnal ou cardiovasculaire ; - la prsence d'un traitement diurtique agissant sur la dpltion sode ; - la grossesse (premier trimestre) et l'allaitement. Les signes d'intoxication lithie sont lis aux concentrations plasmatiques du lithium : - au dessus du seuil de 1,2 mmol/1, les premiers signes apparatre sont digestifs, avec diarrhe, vomissements, suivis ensuite par des troubles neurologiques, avec troubles du comportement par confusion mentale, tremblements, obnubilation puis coma. Cette intoxication aigu devra tre traite par des perfusions de bicarbonate de sodium. Il est exceptionnel, hormis les cas d'intoxication volontaire, que l'on soit amen utiliser l'puration extra-rnale par hmodialyse ; - l'intoxication chronique s'installe progressivement avec des troubles du rythme cardiaque, hypotension mais surtout risque de diabte insipide. En pratique courante les doses initiales doivent tre faibles, habituellement 2 3 comprims rpartis dans la journe. Elles seront augmentes progressivement jusqu' obtenir la dose thrapeutique efficace.
S. Bernard. Biochimie clinique, Maloine, Paris, 1985. B. Flechet. Guide des Analyses Spcialises, 1990, Laboratoires CERBA. Dans la Banque Tlmatique de la Socit Franaise de Biologie Clinique. 0. Houot, P. Tarallo. Le cuivre. In P. Chappuis. Les oligolments en mdecine et biologie, p. 459, Lavoisier Tec et Doc, Paris,1991. C. Muguet. Guide des analyses spcialises. 1990 Laboratoire CERBA. G. Richet et al. Equilibre hydro-lectrolytique normal et pathologique, J.B. Baillire, Paris, 1979. G. Ulrich. Guide des analyses spcialises 1990, Laboratoire CERBA. Dans la banque tlmatique de la SFBC.
6
Pierre Valdigui et Thierry Levade
Par l'importance des glucides dans la ration alimentaire et dans le mtabolisme nergtique de la cellule, par la frquence trs grande du diabte sucr, on comprend l'intrt toujours soutenu de l'tude de la physiologie et de la biochimie du mtabolisme glucidique, des moyens d'exploration dynamique de la glyco-rgulation, visant essentiellement dpister le diabte au stade infraclinique. Si les traitements du diabte patent et de certaines de ses complications sont bien connus, par contre nous n'avons encore que des renseignements incomplets sur la physiopathologie et la gntique des diabtes non insuline-dpendants.
1.
1.1.
Notions physiologiques et biochimiques fondamentales

Glycmie
C'est une des constantes biologiques fondamentales situe entre 4,45 et 5,55 mmol/l (0,8 et 1 g/1, PM = 180) soit 5 mmol/l en moyenne. De son maintien dpendent en particulier le fonctionnement crbral dangereusement atteint au dessous de 1,65 mmol/l et certains troubles hydrolectrolytiques (coma hyperosmolaire) lors de fortes hyperglycmies. 7.7.7. Origine du glucose sanguin Le glucose sanguin, mlange d' et (3-glucopyranoses provient de deux sources :
134__________________________________Biochimie clinique 1.1.1.1. Origine exogne L'alimentation humaine comporte un apport en glucides qui reprsente environ 50 % de la ration nergtique, soit un apport moyen de 200 300 g/jour. Les glucides alimentaires sont de source principalement vgtale. Les apports sont complts par les laitages et les sucres raffins (annexe 1). Une partie des glucides est apporte sous forme simple, fructose contenu dans les fruits, galactose du lait. Cependant la plupart des sucres simples sont reprsents par les diosides tels le saccharose et le lactose. Une autre partie des glucides, en particulier ceux contenus dans les pommes de terre, les fculents, est apporte sous forme de polyosides (amidon). Ils devront tre hydrolyses avant d'tre absorbs dans l'intestin. En effet seuls le glucose, le galactose, le fructose, le sorbitol peuvent franchir la barrire intestinale et passer dans la circulation sanguine. La digestion salivaire permet, sous l'action de l'amylase, d'hydrolyser les longues chanes d'amidon en oligosides et diosides. Elle se poursuit sous l'action de l'amylase pancratique La digestion intestinale est l'tape dfinitive. Elle a lieu tout au long du grle. Elle permet d'obtenir des oses partir des oligosides et des diosides. Une fois hydrolyses en sucres simples, les glucides sont absorbs, grce un phnomne actif, par la muqueuse intestinale et dverss dans la circulation porte. L'absorption des sucres ncessite l'intgrit de la muqueuse intestinale. Elle est aussi lie la temprature, au pH du milieu et la prsence conjointe d'autres produits absorbables (acides gras, peptides, acides amins). 1.1.1.2. Origine endogne
A partir des glucides
- Le glycogne reprsente la forme de rserve glucidique de toute cellule animale. Chez l'homme, le foie est l'organe dont la teneur en glycogne peut tre la plus leve (10 12 % du poids frais) mais les muscles (1 3 % du poids frais) renferment grce leur masse, la moiti du glycogne total de l'organisme. On appelle glycognolyse le processus par lequel le glycogne est dcompos dans la cellule : ou bien cette dgradation se poursuit par le catabolisme de radicaux glucose (glycolyse) ou bien le glucose est libr et s'chappe de la cellule pour passer dans la circulation sanguine. Le premier cas intresse tous les tissus, le second est limit au foie, mais son importance physiologique est trs grande dans la rgulation de la glycmie (transformation du glycogne en glucose sous l'action d'une enzyme dbranchante, d'une phosphorylase, dont l'activation est catalyse par l'adrnaline et le glucagon puis l'AMPc, donnant le glucose-1phosphate, d'une phosphoglucomutase formant du glucose-6-phosphate lequel subira l'action de la glucose-6-phosphatase pour donner finalement du glucose libre).
Mtabolisme des glucides_______________________________135
Figure 6.1 Origine et destines du glucose sanguin.
- A partir des autres hexoses, le glucose est normalement le prcurseur des autres oses de l'organisme mme si ceux-ci sont apports par l'alimentation, il est exceptionnel qu'ils soient utiliss comme tels et ils sont gnralement transforms en glucose au niveau du foie. A partir des lipides et des protides Noglycognse ou Noglucognse - En principe, la cellule animale trouve suffisamment de glucose dans son alimentation pour ne pas avoir besoin d'en synthtiser. Mais plusieurs circonstances peuvent l'y contraindre : le jene glucidique, un catabolisme protique excessif ou plus simplement le travail musculaire gnrateur d'un excs d'acide lactique que la cellule hpatique utilise pour la rgnration du glycogne. Les composs glucoformateurs autres que l'acide pyruvique et l'acide lactique sont essentiellement les protides par les acides amins glucoformateurs dont le catabolisme aboutit l'acide oxaloactique ou l'acide pyruvique. Leur catabolisme excessif (jene, diabte, action des hormones corticostrodes hyperglycmiantes) aboutit une formation de glucose et de glycogne. De mme l'acide a-ctoglutarique issu de la transamination est un excellent prcurseur du glucose. - Les lipides peuvent, par le glycrol, donner du glucose. La transformation des acides gras et de l'actate en glucose, n'est pas une voie classique. Le foie assure lui seul 90 % de la noglucognse dans l'organisme (le rein intervenant pour 10 %). La noglucognse peut fournir jusqu' 300 g de glucose par jour.
136__________________________________Biochimie clinique 1.1.2. Facteurs de rgulation de la glycmie 1.1.2.1. Facteur physico-chimique d'autorgulation Toutes les ractions chimiques entranant la disparition du glucose : Pyruvate <> Glucose <> Glycogne sont en quilibre et la loi d'action de masse rgira ces quilibres, orientant le sens des ractions pour les dvier du corps le plus concentr vers le moins concentr. 1.1.2.2. Facteur mtabolique - L'utilisation du glucose entrane rapidement une hypoglycmie (que le glucose provienne du glycogne ou du glucose circulant, la cellule ne l'utilise que sous forme de glucose-6-phosphate). - Pour fournir de l'nergie, aprs oxydation, la principale voie glycolytique est celle d'Embden Meyerhof caractrise par la formation d'un ester diphosphorique du fructose. La glycolyse aboutit la formation d'acide pyruvique qui constitue un aliment prfrentiel pour la mitochondrie. La dgradation complte du glucose comporte donc deux sries de ractions : la premire, catalyse par les enzymes solubles du cytoplasme, est ralise en anarobiose ; la seconde, au niveau des mitochondries, est strictement arobie. En anarobiose, l'acide pyruvique conduit l'acide lactique, phnomne prdominant dans la contraction musculaire. En arobiose, l'acide pyruvique est l'objet d'une dcarboxylation oxydative par les mitochondries avec formation d'actyl-CoA ; ainsi deux carbones de l'acide pyruvique sont incorpores dans une molcule d'acide citrique qui pourra suivre alors la voie du cycle tricarboxylique de Krebs. Le bilan de ce cycle est l'oxydation complte du radical actyle en gaz carbonique avec production de 12 ATP. - Pour fournir du NADPH+H"1", la deuxime voie glycolytique est une voie oxydative appele voie des pentoses car elle donne naissance plusieurs pentoses. Le principal intrt de cette voie oxydative directe du glucose-6-phosphate rside en ce qu'elle est gnratrice de NADPH+H"1", coenzyme spcifique de plusieurs ractions importantes : - Synthse de l'acide phosphonoipyruvique qui, aprs carboxylation, pourra contribuer au cycle citrique en lui fournissant l'acide oxalo-actique. - Biognse des acides gras, - Biognse des strols, hydroxylations diverses. - Pour fournir de l'acide glycuronique, aprs oxydation (lors des processus de dtoxication). - Le stockage sous forme de glycogne est aussi une autre forme de maintien, bien classique, de la glycmie.
Mtabolisme des glucides________________________________137
La glycognognse partir du glucose et la glycognolyse apparaissent comme un double processus quilibr, mais pas strictement rversible. La raction catabolique s'effectue plus facilement que la raction de synthse dans le milieu aqueux o vivent nos cellules. L'existence de deux voies catalyses par des enzymes diffrentes permet de comprendre la rgulation endocrinienne du mtabolisme du glycogne, dont la dgradation est active par l'adrnaline et la synthse par l'insuline. Ainsi finalement, chez un sujet en quilibre pondral o l'activit physique est mineure : - 67 % des glucides alimentaires sont dgrads, ' , - 3 % enrichissent les rserves glycogniques, ; > - 30 % sont stocks sous forme de rserves adipeuses. 1.1.2.3. Facteur nerveux. Les centres hypothalamiques commandent l'apptit et la satit, la production d'hormones hypophysaires. Le systme orthosympathique et les mdullo-surrnales enfin interviennent par les catcholamines (le stress et l'hypersympathicotonie inhibent la scrtion d'insuline induite par le glucose). Par opposition l'action du systme parasympathique dont la stimulation provoque une insulino-scrtion, le systme nerveux sympathique est directement impliqu dans la rgulation de l'quilibre glycmique puisque tous ses effets sont hyperglycmiants. Ceci a une importance trs grande chez le diabtique insuline-dpendant chez lequel les motions peuvent provoquer selon le cas hyper ou hypoglycmie. 1.1.2.4. Facteur hormonal II est tout fait fondamental, grce : - Un systme hyperglycmiant associant de multiples hormones. Les hormones de l'urgence ont pour rle de mobiliser dans un temps trs court le glucose dont l'organisme a un besoin urgent. Elles agissent donc essentiellement sur le foie et sur les muscles, mais leur action est videmment ubiquitaire ; - les catcholamines (adrnaline et nor&drnalme) favorisent : - la glycognolyse hpatique par un double mcanisme, (3 adrnergique AMPc dpendant (activant une protine kinase qui elle mme active les phosphorylases) et a adrnergique a"*"*" dpendant ; - la glycognolyse musculaire sous l'effet d'un mcanisme p adrnergique ; elle s'accompagne d'une lipolyse importante ; - la scrtion de glucagon ; inhibent l'insulinoscrtion par un effet adrnergique.
138
Biochimie clinique
- Le glucagon (scrt par les cellules a des lots de Langerhans) : - provoque une glycognolyse franche et massive par activation du systme des phosphorylases ; - active la noglucognse et la lipolyse ; - active puissamment la scrtion insulinique. - Les hormones d'action hyperglycmiante progressive interviennent pour maintenir le niveau normal de la glycmie. La somathormone ou hormone de croissance, alors qu' faible dose elle stimule la scrtion d'insuline, est au contraire diabtogne des taux plus importants. Elle freine l'action glucokinasique. Elle freine la lipognse. Le cortisol (le nom mme de glucocorticode montre bien l'action de l'hormone), a une action noglucogntique. Il active la lipolyse et la protolyse et stimule la noglucognse partir des aminoacides. - Un systme hypoglycmiant unique, oppos la multiplicit des systmes hyperglycmiants est reprsent par l'insuline.
1.1.
Mtabolisme et action biochimique de l'insuline
Ds le XIXe sicle, la notion de pancras endocrine apparat, puis celle de la production par cette partie de la glande, d'une substance contrlant le mtabolisme des glucides. Le XXe sicle voit apporter la preuve par Banting et Best (1922), de l'existence de cette substance tandis que Sanger tablit sa composition en acides amins et que Steiner dcouvre son prcurseur la pro-insuline (1967). 1.2.1. Mtabolisme 1.2.1.1. Structure (annexe 2) Polypeptide de PM 5800, l'insuline est constitue de deux chanes : la chane A (21 acides amins) et la chane B (30 acides amins) runies par deux ponts disulfures qui relient les cystines 7 et 20 de la chane A avec respectivement les cystines 7 et 19 de la chane B. La pro-insuline est compose des deux chanes A et B de la molcule d'insuline et d'un troisime polypeptide, de connexion, le peptide C (33 acides amins, PM environ 3 000), qui relie l'extrmit N terminale de la chane A l'extrmit C terminale de la chane B. La diffrence de structure primaire des diverses insulines de mammifres ne porte le plus souvent que sur trois acides amins. La configuration molculaire (structure quaternaire) de l'insuline est celle d'un hexamre form par trois dimres assembls autour d'un axe reliant trois atomes de zinc.
________
________________139
La molcule d'insuline est antignique mais son activit immunologique dpend plus de la structure polymrique, quaternaire, que de la structure primaire, c'est--dire la squence des aminoacides. 1.2.1.2. Synthse et stockage La cellule (3 des lots de Langerhans du pancras fabrique en premier la prproinsuline. Cette protine, qui reprsente le produit de transcription du gne de l'insuline, est constitue de proinsuline, allonge l'extrmit amine de la chane B par une squence signal de PM 2500. Aprs limination de cette chane, le produit obtenu est la proinsuline qui s'accumule dans le rticulum endoplasmique o l'tablissement des ponts disulfures lui donne sa structure dfinitive. La vitesse de cette tape est rapide, de l'ordre d'une minute. La proinsuline est ensuite transporte dans l'appareil de Golgi o commence sa conversion en insuline, qui se poursuivra dans les granules de stockage. Cette tape de conversion aboutit la formation d'insuline et de peptide C. Le zinc contenu dans la cellule (3 favorise la formation des hexamres d'insuline. Alors que la proinsuline n'est pratiquement pas scrte, insuline et peptide C par contre sont scrts en quantit gale. 1.2.1.3. Scrtion Les 1 000 5 000 cellules (3 de chaque lot de Langerhans fonctionnent comme des dtecteurs mtaboliques. La scrtion est provoque, physiologiquement par : - l'lvation de la glycmie (le glucose tant le stimulant fondamental), - certains acides amins (leucine, arginine), - certains ions : - L'lvation du taux du K^ extracellulaire ou le blocage des canaux K"*" dclenche la dpolarisation de la membrane et la stimulation de l'insulinoscrtion. - L'afflux intra-cellulaire du calcium ionis est donc indispensable pour que se manifeste la rponse insulinique un stimulus glucose. - Les hormones gastro-duodnales (l'action insulino-scrtrice du glucose est plus marque aprs ingestion qu'aprs injection intraveineuse). Au point de vue pharmacologique, enfin, sont insulino-stimulateurs : les sulfamides hypo-glycmiants, le glucagon ; sont insuline-inhibiteurs les catcholamines.
Insuline
Glucose
Figure 6.2 Mcanismes de scrtion de l'insuline (d'aprs Heuquin).
1.2.1.4. Circulation Distribution Dgradation Une fois scrte et libre, l'insuline circule de faon libre, non lie de faon significative aux protines plasmatiques. Sa demi-vie biologique est d'environ 10 minutes, l'espace de diffusion est * celui du secteur extracellulaire. L'essentiel de la dgradation de l'insuline (90 %) se fait au niveau du foie, le reste tant dgrad au niveau du rein. 1.2.2. Action biochimique 1.2.2.1. Rcepteurs membranaires de l'insuline La premire tape de l'action de l'insuline sur les organes cibles se produit par fixation de l'insuline sur des rcepteurs spcifiques membranaires. Leur affinit pour l'insuline est spcifique ; il existe un seuil d'action et un effet de saturation des sites (cooprativit ngative). Les rcepteurs sont des glycoprotines membranaires appartenant au groupe des rcepteurs tyrosine kinase . Ils sont constitus de deux sous-units a et deux sous-units (3. Le nombre de rcepteurs varie avec la structure cellulaire considre et les conditions physiologiques et pathologiques. L'affinit pour l'insuline est telle qu'elle ne ncessite pas la saturation de l'ensemble des rcepteurs pour une activit maximale. L'insuline se fixe la sous-unit a, la sous-unit (3 change alors de conforma-
Mtabolisme des glucides________________________________141 tion, ce qui active une tyrosine kinase qui phosphoryle l'unit (3 et d'autres tyrosines intracellulaires. L'activation persiste mme si l'insuline se dtache du rcepteur. L'insuline agit par l'intermdiaire de l'AMPc, du GMPc, du a ionis, des ractions de phosphorylation et de dphosphorylation des protines, des peptides messagers. Il est d'un intrt majeur de savoir s'il existe un messager cellulaire commun, capable d'expliquer les actions post-rcepteurs de l'insuline. Les actions cellulaires de l'insuline dpendent des cellules sur lesquelles elle agit. La rgulation du nombre de rcepteurs est sous la dpendance de l'insulinmie. On peut concevoir deux types de pathologie des rcepteurs de l'insuline : - une diminution du nombre absolu des rcepteurs ; - une anomalie de leur fonctionnement expliquant, par exemple, une diminution de l'activit biologique malgr une hyperinsulinmie. 1.2.2.2. Rle de l'insuline Sur le mtabolisme glucidique - Au niveau du foie La phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate, sous l'action de la glucokinase et/ou de l'hexokinase est contrle par l'insuline qui active aussi l'enzyme clef de la glycolyse, la phosphofructokinase responsable de la phosphorylation du fructose-6-phosphate en fructose 1-6 diphosphate. Elle favorise la glycognse en activant la glycogne synthtase et en inhibant en retour la glycogne phosphorylase. Elle inhibe fortement la noglycognse (effet anti-cortisol). Au total l'insuline favorise l'utilisation du glucose par le foie et son stockage sous forme de glycogne. - Au niveau du tissu adipeux : Elle augmente la captation et le mtabolisme du glucose par l'adipocyte. Elle a un effet antilipolytique. - Au niveau du muscle : Elle active le captage du glucose par la cellule et le mtabolisme du glycogne. Sur le mtabolisme lipidique - Au niveau des lipides plasmatiques Ils sont purs grce l'action de la lipoprotine Upase dont la synthse tissulaire ncessite la prsence d'insuline. - Au niveau du tissu adipeux L'insuline stimule la lipognse et inhibe la lipolyse.
142__________________________________Biochimie clinique - Au niveau du foie, l'action est grossirement comparable celle du tissu adipeux.
Sur le mtabolisme protidique
Elle diminue le taux des acides amins circulants en augmentant la captation cellulaire des acides amins, en augmentant la synthse protique (par stimulation de l'activation des aminoacides et de la lecture ribosomiale des ARN messagers), en diminuant la protolyse.
2.
Exploration de la glycorgulation
Du plus simple au plus complexe, trois moyens principaux sont dcrire : - dpister la glycosurie ; - doser la glycmie ; - pratiquer des preuves complmentaires. Ces examens sont complts par d'autres tests utiliss dans le cadre du typage du diabte, de sa surveillance et de ses complications.
2.1.
Glycosurie
2.7.7. Dpistage Elle est recherche en mettant en vidence le pouvoir rducteur de l'urine sur la liqueur de Fehiing ou de Benedict, ou sur des comprims ractifs renfermant les mmes constituants que cette dernire (Clinitest). Ces ractions mettent en vidence la prsence de corps rducteurs et ne sont pas spcifiques du glucose. C'est dire l'intrt de la raction enzymatique. Sous l'influence de la glucose oxydase, le glucose est oxyd en acide gluconique avec formation d'eau oxygne. En prsence de peroxydase, l'eau oxygne produite transforme un chromogne en un compos colore. Ces ractifs imprgnent une bandelette de papier filtre qu'il suffit de tremper dans l'urine en surveillant au bout de quelques secondes l'apparition de la coloration de l'extrmit de la bande. La comparaison avec une chelle colorimtrique permet un dpistage semiquantitatif. Cette mthode trs sensible est parfois fausse positivement par des oxydants comme les hypochlorites, eau de javel, solut de Dakin, ngativement par des rducteurs : acide ascorbique. Les contaminants bactriens peuvent consommer le glucose ventuellement prsent dans l'urine, entranant par l des rsultats sous-valus ou mme faussement ngatifs.
Mtabolisme des glucides_________
143
Le dosage de la glycosurie met en jeu les mmes techniques et ncessite les mmes prcautions que le dosage de la glycmie. 2.1.2. Mcanisme II est exclusivement rnal. Normalement pour des taux glycmiques allant jusqu' 9,44 et 10,00 mmol/1, la rabsorption tubulaire proximale est complte. En cas de seuil bas, la glycosurie peut apparatre pour des valeurs beaucoup plus basses de glycmie (grossesse, diabte rnal). En cas de seuil rnal lev, la glycmie peut dpasser 11 mmol/1, sans qu'il n'existe de glycosurie (sujet g, insuffisance rnale). Au-del du seuil, la cellule tubulaire accrot sa capacit de reabsorption mais celle-ci n'est plus complte et la glycosurie apparat. Pour des glycmies trs leves de l'ordre de 22 mmol/1, la cellule tubulaire est compltement sature et la glycosurie est alors proportionnelle la glycmie. Ceci permet de mesurer le pouvoir de saturation de la rabsorption tubulaire ou tolrance maximum du glucose ou taux maximum de rabsorption du glucose (TMG) qui est d'environ 1,94 mmol/minute. Le taux de la glycosurie, chez un sujet diabtique, sera donc minemment variable suivant les taux de la glycmie dans la journe. La surveillance de la glycosurie est encore l'unique auto-contrle exerc par de nombreux diabtiques. La surveillance de la glycosurie ne comporte qu'un seul avantage : elle est effectivement plus facile que l'auto-contrle glycmique. Cependant ses inconvnients sont trs importants : elle ne reflte qu'imparfaitement les glycmies, elle est constamment en retard sur le chiffre actuel de la glycmie puisque l'urine a stagn dans la vessie d'o la ncessit de faire l'examen sur des urines fraches, de 2e jet. Cependant, l'apprciation de la glycosurie reste trs utile, lorsque le diabtique a des glycmies stables, pour contrler l'absence de glycosurie nocturne et... pour reposer son doigt des piqres multiples.
12.
Glycmie
f : Glycmie et glycosurie sont des urgences techniques : tout milieu biologique contient toujours assez d'enzymes glycolytiques pour dgrader le glucose prsent et engendrer rapidement une erreur par dfaut : la conservation de l'chantillon prlev en l'absence d'agent inhibiteur de la glycolyse ne doit pas dpasser une heure. La glycmie peut tre dose aussi bien sur sang total hparine que sur srum. La glycmie est identique de part et d'autre de la membrane rythrocytaire : un certain degr d'hmolyse ne gne pas. Le contenu d'un tube capillaire hparine suffit largement, rcolt la pulpe du doigt aprs coupure par vaccino-
style (idal pour les glycmies itratives des hyper et hypoglycmies provoques) ou au talon pour le nourrisson. Lorsque l'chantillon doit attendre plus d'une heure, entre le prlvement et l'analyse, le sang doit tre recueilli sur un inhibiteur de la glycolyse (fluorure de sodium qui est un antiglycolytique par formation d'un complexe fluorophosphomagnsien liminant du milieu le magnsium indispensable l'action de l'nolase). Ce prlvement conserve son glucose intact pendant six heures. Cependant l'chantillon est hmolyse et la prsence du fluorure de sodium empche tout autre type de dosage sur ce prlvement. Le prlvement doit tre effectu chez un sujet strictement jeun depuis 10 heures. La principale cause d'erreur par excs ct de l'absence de cette prcaution est la classique perfusion intra-veineuse de srum glucose, erreur trs frquente en milieu hospitalier.
2.2.1. Mthodes de dosage
Les mthodes enzymatiques reprsentent 99 % des techniques utilises. 80 % utilisent la glucose oxydase, 7 % l'hexokinase. Parmi les principes mthodologiques les plus utiliss, nous citerons celui utilisant le ractif de Trinder et une technique mettant en jeu une lectrode.
GLUCOSE OXYDASE
PEROXYDASE
RACTIF RDUIT INCOLORE
COMPLEXE ROUGE absorbe 525 nm
Figure 6.3 Schma reactionnel par la mthode de Trinder.
l'aide d'un spectrophotomtre, l'intensit de la raction colore (absorbance) est mesure 525 nm. Cette mthode peut aussi tre ralise l'aide de bandelettes ractives (ressemblant celles utilises pour les urines) dont l'extrmit, imprgne de ractifs, reoit une goutte de sang. La variation de coloration est apprcie soit visi-
Mtabolisme des lucides
145
blement l'aide d'une chelle colore soit par un lecteur portable indpendant et elle permet d'estimer la valeur de la glycmie. Le prlvement au bout du doigt permet donc de raliser facilement cet autocontrle glycmique si important maintenant pour l'quilibrage de la glycmie des diabtiques, en particulier ceux porteurs d'une pompe insuline, implante ou non.
Figure 6.4 Schma ractionnel avec mesure de la production d'oxygne. La vitesse d'apparition de l'oxygne est mesure par polarographie l'aide d'une lectrode slective. D'autres mthodes mettent en jeu des ractifs base de cqenzymes nicotiniques comme indicateurs.
Figure 6.5 Schma ractionnel avec lecture 340 nm. On suit dans les deux cas 340 nm, la cintique d'apparition du coenzyme nicotinique rduit. 2.2.2. Valeurs usuelles La zone de normalit est comprise entre : - 3,9 et 5,8 mmol/l (soit 0,7 1,05 g/1) de 10 60 ans - -20% de 1 mois 4 ans
--5-10% de 4 10 ans - + 10 % aprs 60 ans. Le glucose veineux, du fait de l'utilisation priphrique, est lgrement infrieur celui du sang artriel. Chez le nourrisson, le prlvement doit tre fait au maximum 2 heures aprs le biberon. Les motions, le froid provoquent une lgre hyperglycmie d'origine adrnalinique. La prise d'alcool avant le prlvement peut entraner une augmentation de la glycmie de 20 50 %, la prise de cigarette de 10 %.
2.3.
preuves dynamiques et dosages complmentaires
Ces preuves dynamiques d'exploration et certains dosages (insuline, acides gras non estrifis) sont destins mettre en vidence des troubles du mtabolisme glucidique non ou mal dcels par les mthodes prcdentes d'exploration statique. 2.3.1. preuves d'hyperglycmie provoque
Le principe de cette preuve a t dduit de la constatation de l'hyperglycmie alimentaire. En effet, aprs chaque repas, de petites flches hyperglycmiques surviennent, qui, l'tat normal, ne dpassent jamais 8,30 mmol/1 (1,50 g/1). 2.3.1.1. Hyperglycmie provoque par voie orale (HGPO) Cette preuve, qui est la plus classique, permet d'apprcier la tolrance glucidique en suivant les variations de la glycmie aprs une charge en glucose administre per os. - Protocole : on administre une quantit de glucose standard de 75 g dans un minimum d'eau (au plus 250 ml), le sujet tant jeun depuis 12 heures avec une alimentation quilibre (200 300 g de glucides) dans les trois jours qui prcdent l'preuve. Proscrire (si possible) les corticodes, les diurtiques thiazidiques, les catcholamines, les stroprogestatifs qui diminuent la tolrance au glucose. Les glycmies sont doses avant l'absorption, puis de demi-heure en demi-heure pendant 3 ou 4 heures. La glycosurie est recherche et dose s'il y a lieu aprs 1 heure et 2 heures. - Normalement la glycmie augmente et atteint son maximum entre 30 et 60 minutes (il est donc quasi impossible de la matrialiser par les prlvements). Cette variation doit tre infrieure 2,8 mmol/1 (0,5 g/1) puis elle redescend son niveau initial en un temps infrieur 2 heures. Aprs le retour la normale survient une onde d'hypoglycmie, lie l'insulinoscrtion (baisse de 0,8 mmol environ pendant 20 40 minutes). La glycosurie doit tre nulle.
Mtabolisme des glucides________________________________147 Depuis 1980, l'on a propos des critres trs larges, mais unanimement admis, afin de permettre, dans la quasi totalit des cas, d'interprter les glycmies des diffrentes situations (tableau 6.1). Remarque : pour un enfant, la dose prescrite sera fonction du poids, (1,75 g par kg) sans dpasser 75 g. - L'interprtation est souvent difficile : courbe anormalement leve dans l'obsit, les hpatites, les pancratites sans qu'il s'agisse vritablement de diabte ; courbe plate dans les troubles de l'absorption intestinale. De plus, la notion d'ge intervient puisque la tolrance au glucose diminue progressivement avec l'ge, en dehors de toute affection chronique (pour interprter au dessus de 50 ans, il faut classiquement ajouter 0,5 mmol/1 par glycmie). Cette preuve quoique parfois insuffisante, n'en reprsente pas moins l'preuve de base de l'exploration fonctionnelle de la glycorgulation. Toute anomalie mme minime suffit pour justifier d'autres investigations. Tableau 6.1 Nouveaux critres de diagnostic du diabte sucr.
D'aprs, Diabtes Care 1997, 20, 1183-97 ; Ann. Biol. Clin., 1999, 57, 427-435.
Symptmes cliniques de diabte (polyurie, polydipsie...) associs une glycmie > 2 g/1 tout moment de la journe. ou Glycmie jeun > 1,26 g/1 (jene : absence de prise alimentaire calorique depuis au moins 8 h) ou Glycmie jeun > 2 g/1 la deuxime heure d'une HGPO (dans les conditions dfinies par l'OMS : 75 g de glucose dissous dans de l'eau). En l'absence d'une hyperglycmie franche avec troubles mtaboliques aigus, ces critres doivent tre confirms par une deuxime analyse un jour ultrieur. L'HGPO n'est pas recommande en routine. Au cours d'une HGPO* Valeurs normales TQ mmol/1 g/1 Tô mmol/l g/1 <6,1 <1,10 <7,8 <1,40 Impaired fasting glucose 6,1-7,0 1,10-1,26 7,8-<11,1 1,4-<2,0 Intolrance au glucose Diabte sucr >7,0 >1,26 >11,1 ^2,0
* pour le diagnostic du diabte gestationnel, une preuve de dpistage est pratique avec 50 g de glucose ; si la glycmie est > 1,40 g/1 T 60, un test de diagnostic avec 100 g de glucose est alors pratiqu (diabte si deux glycmies retrouves >. 1,05 g/1 pour TO, > 1,90 g/1 T 60, > 1,65 g/1 T 120, S 1,45 g/1 T 180). 2.3.1.2. Hyperglycmie provoque par voie veineuse Elle est destine supprimer la traverse digestive du glucose et la scrtion insuline-stimulante des hormones paritales.
148__________________________________Biochimie clinique Elle explore le coefficient d'assimilation du glucose K. Les mmes prcautions de base doivent tre prises que pour l'hyperglycmie provoque par voie orale. Une glycmie jeun temps zro est prleve, puis une injection intraveineuse de 25 g de glucose, sous forme de solut hypertonique, est effectue en 4 6 minutes. Les chantillons sont prlevs toutes les 10 minutes pendant 90 minutes pour dosage de la glycmie. Celle-ci s'lve en moins de 5 minutes et rejoint sa base en 60 minutes environ en dcroissance exponentielle, qui permet de calculer K, normalement autour de 1,74 10~2. 2.3.2. Hyperglycmies provoques sensibilises - Test la cortisone glucose : 50 mg d'actate de cortisone sont donns per os, 8 heures puis 2 heures avant une hyperglycmie provoque. Toute glycmie dpassant 7,75 mmol/1 la deuxime heure tmoigne d'un diabte latent. - Test l'insuline glucose : 30 g de glucose per os + 5 U d'insuline doivent se compenser et la glycmie ne bouge pas chez le sujet normal. 2.3.3. preuves d'hypoglycmie Les preuves d'hypoglycmies provoques sont dangereuses et doivent se drouler en milieu hospitalier et sous surveillance stricte : on doit pouvoir pratiquer dans la minute, une injection de glucagon ou une intraveineuse de srum glucose hypertonique ds l'apparition (souvent trs rapide) des signes cliniques d'hypoglycmie. 2.3.4. Dosages et preuves complmentaires 2.3.4.1. Insulinmie Jusqu'en 1960, seules les mthodes biologiques taient utilises. Elles consistaient mesurer la consommation de glucose par le tissu adipeux pididymaire du rat ou l'abaissement provoqu de la glycmie chez le lapin. Ainsi a t dfinie l'unit d'insuline d'usage courant en diabtologie : 1 unit U = 0,04 mg = 40 ^g. Chez l'homme, une unit d'insuline mtabolise 3 4 g de sucre, un adulte sain scrte environ 50 70 U d'insuline par jour, ce qu'il faut pour mtaboliser la consommation quotidienne courante de l'ordre de 200 300 g de glucides. La scrtion de base serait d'environ 1 U/heure soit 40 p-g. Actuellement les mthodes de dosage reposent : - soit sur des techniques radio-immunologiques. C'est en 1960 que S. Berson et R. Yallow ont propos cette mthode. Elle devait rapporter Rosalyn Yallow le prix Nobel de mdecine en 1977. Cette mthode met en comptition une insuline marque 125! et l'insuline froide prsente dans l'chantillon doser, au niveau d'un anticorps spcifique des sites immunologiques de l'insuline. L'insuline marque rsiduelle restant
__
149
libre sera spare, sa quantit sera inversement proportionnelle la quantit prsente dans l'chantillon ; la courbe d'talonnage sera hyperbolique et linarise par transformation mathmatique ; - soit sur des techniques immunoemymatiques (cf. chapitre 9). L'insuline doser est prise en sandwich entre un anticorps fix sur un support solide et un anticorps marqu par une enzyme dont l'activit facilement mesurable, est proportionnelle la quantit d'insuline prsente dans l'chantillon. L'insulinmie de base matinale aprs plus de 10 heures de jene se situe entre 10 et 20 mU/1 (0,4 0,8 (xg/1). Aprs un repas mixte habituel elle s'lve entre 100 et 160 mU/1. Les rsultats n'ont de sens que dans la mesure o ils sont compars ceux de la glycmie en particulier sous stimulation. Au cours d'une hyperglycmie provoque, les valeurs moyennes sont donnes dans le tableau 6.2 : Tableau 6.2 Valeurs moyennes de la glycmie et de l'insulinmie au cours d'une hyperglycmie provoque. Temps 0 30' 60' 90' 120' Glycmie 5 mmol/1 8 mmol/1 7 mmol/1 6 mmol/1 5 mmol/1 Insulinmie 10 20 mU/1 30 50 mU/1 60 70 mU/1 30 50 mU/1 20 30 mU/1
Remarque : l'insulinmie est totalement dpourvue de valeur chez le diabtique insulinodpendant. 2.3.4.2. Peptide C. Test au glucagon Les dosages du peptide C permettent de remplacer les dosages d'insuline lorsque ceux-ci ne peuvent tre faits (par exemple sujet insuline). En effet, le peptide C est scrt par la cellule (3 en mme temps et en quantit quimolaire de celle de l'insuline. Sa dure de vie est plus longue et facilite les dosages. On tudie souvent le peptide C sous stimulation du pancras endocrine par le test au glucagon (1 mg par voie intraveineuse ou intramusculaire). Les dosages sont faits au bout de 4, 6, 10, 20 minutes. Les taux sont de 1 2 ng/ml jeun et s'lvent rapidement vers la 4e la e 6 minute o ils atteignent le double du taux de base.
150____________________________________Biochimie clinique 2.3.5. Autres examens Ces examens seront utiliss dans le cadre de la surveillance du diabte, de ses complications, de son typage. 2.3.5.1. Protines glyques On sait que toutes les protines sanguines ou tissulaires sont susceptibles de se lier spontanment au glucose sanguin et que cette liaison est d'autant plus facile que la concentration en glucose est importante. Biochimiquement, il s'agit d'une raction spontane en deux temps : - Liaison du glucose avec un acide amin N-terminal et formation d'une aldimine instable (ou base de Schiff), raction qui est rversible. - Formation d'une ctoamine (ou ctamine), par rarrangement d'Amadori, raction qui est pratiquement irrversible. L'exemple le plus reprsentatif (figure 6.5) est celui de la globine, partie protique de l'hmoglobine, qui en se liant au glucose forme l'hmoglobine glycosyle . Ce terme est mauvais car il suppose une glycosylation enzymatique, ce qui n'est pas le cas. C'est la raison pour laquelle la traduction de l'anglais glycated est utilise donnant le terme d'hmoglobine glyque .
Figure 6.6 Glycation de la chane B de l'hmoglobine A.
Compte tenu de la dure de vie des hmaties qui est de 120 jours, nous avons l'intgration des variations glycmiques de 6 8 semaines prcdentes.
Ainsi, la multiplication des pousses hyperglycmiques entranera l'augmentation du taux de ce marqueur dont le rsultat reprsente l'ambiance glycmique moyenne dans la priode glycmique considre. Le globule rouge contient normalement de l'hmoglobine adulte A. Cette hmoglobine est faite de plusieurs fractions diffrentes Ala, Alb, Aie. Normalement les hmoglobines glyques Al reprsentent 4 6 %. Cependant l'hmoglobine glyque Aie est plus stable et pratiquement spcifique. t Son taux normal habituel est d'environ 5 % (tableau 6.3).
F la fin des annes 1970, plusieurs mthodes chromatographiques, sur mini colonnes avec rsine changeuse de cations faiblement acide, se sont dveloppes pour sparer les hmoglobines rapides (HbAl^.^). Malgr quelques problmes de reproductibilit dus l'influence de la temprature, l'interfrence des lipides et la non limination de l'aldimine (pr HbAl^), ces mthodes ont t largement utilises en routine par les laboratoires d'analyses. Au dbut de l'anne 1983, un systme utilisant une double lution sur microcolonne a t dvelopp. Il permet la mesure de la fraction HbAlc spcifique et n'est pas affect par l'interfrence des hyperlipmies ou de l'aldimine. Les problmes de reproductibilit dus la temprature ont t limins par l'utilisation d'talons secondaires inclus dans chaque srie d'analyse et utiliss pour calculer le pourcentage de l'HbAlc. Ces dernires annes, la ncessit d'amliorer l'exactitude et la prcision des dosages de l'hmoglobine Aie a fait dvelopper des mthodes de chromatographie liquide haute performance (HPLC) par change d'ions qui permettent une mesure spcifique avec automatisation de la technique sans interfrence de l'hyperlipmie, de la base de Schiffni des variations de temprature (Annexe 3). Tableau 6.3 Composition des hmoglobines de l'adulte normal.
(Source BIO-RAD. Document Diamat.)
Sous-unit Hmoglobine Hmoglobine Ay Hmoglobine HbA^ Hmoglobine HbF Aî ^ HbA; A;b A,c A,d A,e
Structure
"2?2 ^2
a^ a^-F-D-P)^ a^-G-6-P)^ 7
"2(P-G)2
7 ?
Hydrate de carbone Fructose 1 6 diphosphate Glucose-6phosphate 7 Glucose ?
Concentration >90% < 1,5 % <0,8,%
<1%
X.
4-6% Trace 7
De la mme faon, l'ensemble des protines plasmatiques glyques, sous forme de cto-amine, reprsente ce que l'on appelle les fructosamines. Le dosage des fructosamines repose sur la rduction en milieu alcalin d'un sel de ttrazolium par les fonctions cto-amines des protines glyques pour produire un formazan dont la coloration est value par spectrophotomtrie. Ce dosage permet une tude rtrospective de l'ambiance glycmique sur une priode plus courte de 2 3 semaines.
Normalement le taux est de 165 285 fJimol/l.
Ce taux dpend de la concentration en protines. Pour viter les erreurs d'interprtation dues de trop grandes variations de ce taux, la concentration des fructosamines peut tre rapporte la concentration en protines.
La zone de rfrence est alors de 230 390 /imol/lOO g de protines.
Le phnomne de glycation des protines a un rle trs important dans la pathognie des complications long terme du diabte, diminution de la dformabilit des globules rouges (troubles hmorrhologiques), atteinte du collagne sous-endothlial des vaisseaux (angiopathies) et de la basale glomrulaire (nphropathies), altration molculaire des protines soufres du cristallin (cataracte).
2.3.5.2. Corps ctoniques urinaires et sanguins
La prsence de corps ctoniques provient du catabolisme lipidique lorsque les cellules manquent de glucose. On peut les observer dans les urines dans deux circonstances : - le diabte sucr dcompens ; ils accompagnent alors une glycosurie importante et une hyperglycmie ; - une ctose djeune et dans ce cas la glycosurie est absente. Au niveau du sang, normalement l'acto-actate est situ entre 20 et 80 pmol/l et le /3 hydroxy-butyrate entre 60 et 170 îmolll. Cependant ces derniers dosages n'ont que peu d'utilisation clinique.
2.3.5.3. Lactate et pyruvate
Ces anions se dosent en cas de coma par acidose lactique. Normalement le lactate reprsente 0,3 1,3 mmol/l. Son augmentation est parfois l'origine du trou anionique que l'on peut mettre en vidence en effectuant un BES. Le prlvement doit tre fait sans garrot, en prsence d'un inhibiteur de la glycolyse et centrifug dans les deux heures qui suivent. Le pyruvate doit tre prlev dans les mmes conditions, dans un tube contenant de l'acide perchlorique (qui prcipite toutes les protines et en particulier les enzymes). Dans les deux cas, il est prfrable d'amener le prlvement au laboratoire dans de la glace fondante et dans les dlais les plus brefs. Normalement le pyruvate est un taux de 30 70 amolli.
Pour l'interprtation il faut tenir compte du rapport lactate/pyruvate qui est voisin de 10/1. Le jene fait chuter la lactatmie, l'exercice l'augmente.
p.
3.1. Hypoglycmies
(Glycmies < 2,8 mmol/1 (0,50 g/1)) Qu'elles soient fonctionnelles (souvent induites par l'absorption digestive de glucose ou hypoglycmie post stimulative de CONN) ou organiques (adnome langerhansien, tumeur extrapancratique, hypopituitarisme, atteintes hpatiques virales, toxiques, cancreuses et glycognoses), les hypoglycmies ont gnralement un aspect clinique bien prcis : sueurs, obnubilation, vertiges, sensation de faim, convulsions et coma. Leur exploration biologique s'appuie sur les preuves suivantes : - tude de la glycmie dans la journe, f . - hyperglycmie provoque par voie orale prolonge sur 5 heures, r - hypoglycmie provoque au tolbutamide, L - dosage de l'insulinmie.
|8.2.
Hyperglycmies
II n'existe pas de classification entirement satisfaisante du diabte sucr. Cependant une classification de l'OMS a le mrite d'exister, d'tre comprise par tous et elle est la plus utilise en attendant le moment o une meilleure classification interviendra. I 3.2.1. Dfinition Les travaux des diffrentes commissions internationales recommandent de dfinir le diabte sucr comme une augmentation chronique anormale du taux de glucose sanguin (hyperglycmie). Cette hyperglycmie peut s'accompagner de symptmes tels que soif, polyurie, amaigrissement, troubles de la conscience et voluer en l'absence de traitement vers le coma et la mort. Dans d'autres cas, les symptmes sont beaucoup moins marqus, voire absents. Les risques long terme rsident dans la survenue de complications rtiniennes, rnales, des nerfs priphriques et l'augmentation du risque d'athrosclrose au niveau des artres crbrales, coronaires et des membres infrieurs.
154__________________________________Biochimie clinique 3.2.2. Physiopathologie Elle est rsume dans la figure 6.7, d'aprs Reach et Assan (5).
INFLAMMATION OU LYSE CELLULAIRE Insulite virale Toxiques Cancer Pancreatite
ANTICORPS ANTI-RECEPTEURS DFICIT EN RCEPTEURS ANOMALIES DE STRUCTURE DES RCEPTEURS
ANTICORPS ANTI-INSULINE
Pancras endocrine Cellules bta des lots de Langerhans
Insuline plasmatique
Cellules cibles Foie, Tissu adipeux, Muscle stri surtout ANOMALIES DU SYSTME TYROS1NEKINASE (signal)
Rcepteurs (Chanes alpha)
Dficit insulinique Diabte insulinodpendant
Rsistance l'insuline Diabte non insulinodpendant
Figure 6.7 Physiopathologie du diabte sucr.

(D'aprs Reach et Assan (5).)
3.2.3. Classification internationale du diabte sucr selon l'OMS

> CLASSIFICATION CLINIQUE
Diabte sucr : Diabte insulinodpendant (DID) Diabte non insulinodpendant (DNID) - sujet obse - sujet non obse Diabte de malnutrition Diabte secondaire ou associ : - maladies pancratiques - maladies endocriniennes - traitements ou chimiothrapies - anomalies de l'insuline ou de ses rcepteurs
_________________ 155
- syndromes gntiques - divers * Anomalie de la tolrance au glucose : Sujet obse Sujet non obse Associe certaines situations ou syndromes Diabte gestationnel ~> CLASSIFICATION STATISTIQUE (sujet ayant une tolrance au glucose normale mais avec des risques importants de dvelopper un diabte) : - Anomalie antrieure de la tolrance au glucose - Anomalie potentielle de la tolrance au glucose En pratique sont retenir DID, DNID, intolrances au glucose et facteurs de nsque. - Le diabte insulinodpendant (DID) est caractris par son dbut en gnral rapide ou brutal survenant surtout chez le sujet jeune. Il est en gnral dfinitif, du fait de la destruction complte du pancras endocrine. Les complications rtiniennes, rnales et nerveuses surviennent au bout de plusieurs annes. Les mthodes de traitement et d'autosurveillance permettent d'augmenter la longvit et de diminuer la frquence et la gravit des complications (figure 6.8) - Le diabte non insulinodpendant (DNID) reprsente 80 85 % des cas de diabte. Il comporte un lment gntique non encore compltement lucid. Il est le plus souvent associ une obsit. Son dbut est progressif et il est souvent dcouvert lors d'un examen systmatique. L'hyperglycmie est longtemps modre. L'volution se fait souvent vers le diabte insulinodpendant, par puisement du pancras endocrine restant. En cas d'obsit la rduction pondrale permet souvent d'obtenir une rmission. Les complications micro-angiopathiques peuvent survenir comme en cas de DID mais sont en gnral moins svres. En revanche les complications cardiovasculaires sont plus frquentes. - La diminution de la tolrance au glucose est d'volution difficile prvoir car 1/3 des sujets peuvent revenir la normale. - Les facteurs de risque de diabte doivent tre pris en compte lorsqu'on surveille un sujet pour toute raison mdicale.
I
CARENCE EN INSULINE
Absence de pntration cellulaire du glucose Hyperglycmie d'adaptation Carence cellulaire en glucose Diurse osmotique
Glycosurie Ctonurie - Ctonmie+-
Protolyse Lipolyse Corps ctoniques
Hyperlipmie Amaigrissement
Soif
Dshydratation
Acidose mtabolique
Cachexie
Figure 6.8 Consquences de la carence en insuline.
Ces facteurs sont : - existence de diabtiques dans la famille (surtout s'il en existe la fois du ct du pre et de la mre) ; - obsit importante (> 25 % du poids idal) ; - antcdents obsttricaux chez une femme, d'enfants pesant plus de 4 kg la naissance ; - augmentation franche de la glycmie lors de la prise de certains mdicaments : pilule contraceptive, corticodes, diurtiques ; - certains groupes tissulaires HLA (DR3, DR4). Au total les deux grands types de diabtes sont rsums dans le tableau 6.4.
____ _________________________157
Tableau 6.4 Comparaison entre DID et DNID (4). DID Clinique ge Dbut Poids Ctose Complications pidmiologie Prvalence Gntique Jumeaux HLA Anatomie Pathologique Lsions d'insulite < 30 ans Rapide N +++ +++ 0,5% 50% DR3, DR4 + DNID < 40 ans Progressif ++ 0 ++ 2% >80% ? 0
4.
Annexes
Annexe 1 :
COMPOSITION EN GLUCIDES DES PRINCIPAUX ALIMENTS Aliments avant cuisson Fromage Graisses uf Poissons Viandes Glucides en pourcentage 0% 0% 0% 0% 0% 5% 5% 5% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 15% 15% 20% 20% 20% 20% 55% 75%
- Lait - Laitage - Lgume vert Artichaut Betterave Carotte Cleri Navet Petit pois
- Fruit frais - Raisins - Banane - Ptes - Pomme de terre cuite - Riz - Pain - Biscotte
158____________________________________Biochimie clinique Annexe 3 :

CONVERSION ENZYMATIQUE DE LA PRPROINSULINE EN PROINSULINE PUIS EN INSULINE NH^ Squence signal NAME A1A AIB F A1C AO EXEMPLE DE TRAC D'HPLC HEMOGLOBIN REPORT TIME 91-09-25 11:32 SAMPLE N0. 006 % 0.6 0.8 0.3 6.1 92.1 TOTAL HBA1C 6,1 % TIME 1,6 2.3 3.0 4.2 5.8 AREA 25.34 29.84 13.49 221.12 3590.72 3898.19 HBA1 7,5%
Prproinsuline
Proinsuline
Insuline + Peptide C
rfrences bibliographiques
a-nard S. Biochimie Clinique, Maloine, Paris, 1989 (2e d.) ocument BIO-RAD. Diamat Hb Aie ReorderPack, rf. 961-204, avril 1988, p. 25. mbel S. et Pugeat M. Diabte non insulinodpendant. Rev. Prat-, 1992, 42, 2245. iriemuter L. et Collin de l'Hortet G. Abrg de diabtologie, Masson, Paris, 1987. Reach G. et Assan R. Physiopathologie du diabte sucr. Gazette Md. France, 1981, 88,4035. American Diabtes Association : Self-monitoring of blood glucose : Diabtes Care, 1994,17, 81. Henquin J.C. et Gilon P. Mdecine et science, 1995,11,1235.
7
Mtabolisme des lipides et des lipoprotines
Marie-Laure Solera
L'importance du mtabolisme lipoprotique est lie la frquence des hyperlipoprotinmies et leur retentissement sur la paroi artrielle. En effet, diffrents facteurs de risque cardiovasculaire ont pu tre identifis : - des facteurs cliniques : obsit, sdentarit, hypertension artrielle, tabagisme, stress rpt, r - des facteurs biologiques : hyperlipoprotinmie, hyperglycmie, hyperuricmie, une augmentation de l'hmatocrite et du fibrinogne. Parmi tous ces facteurs, trois sont particulirement importants : l'hypertension, le tabagisme et l'hypercholestrolmie. Il a t tabli une relation certaine entre le niveau de la cholestrolmie et la frquence des atteintes cardio-vasculaires. Ainsi l'athrome peut provoquer des coronaropathies, des accidents vasculaires crbraux et une artriopathie des membres infrieurs.
|J.
Structure des lipoprotines
Les lipides plasmatiques insolubles en milieux aqueux circulent dans le plasma lis des protines spcifiques les apolipoprotines et forment des complexes macromolculaires : les lipoprotines. Les lipides polaires constituent la zone priphrique : cholestrol libre (CL), phospholipides (PL) et apoliprotines ; le noyau est form de lipides hydro,phobes : triglycrides (TG) et esters de cholestrol (CE).
162______________________ ____________Biochimie clinique
Apoprotines Phospholipides Cholestrol libre
CE = Cholestrol estrifi TG = Triglycrides
Figure 7.1 Structure des lipoprotines.
1.1. Classification des lipoprotines

Les quatre classes de lipoprotines : chylomicrons, very low density lipoproteins (VLDL), low density lipoproteins (LDL), high density lipoproteins (HDL), peuvent tre spares selon leur densit de flottation. Leurs diffrentes proprits physiochimiques sont regroupes dans les tableaux 7.1 et 7.2 Tableau 7.1 Caractristiques physiques des diffrentes lipoprotines. Lipoprotines CHYLOMICRONS VLDL LDL LDL^ (IDL)* LDL^ HDL HDLi HDL, HDLg Densit (g/ml) <0,94 0,94 1,006 1,006 1,019 1,019 1,063 < 1,063 1,063 1,125 1,125 1,210 3,9.105 1.9.105 6-14 6-10 Poids molculaire moyen 5.109 7,5.106 2,5.10
6
Dia mtre (nm) lO^lO 3 30-70 15-25
* IDL = intermediary density lipoproteins.
Mtabolisme des lipides et des lipoprotines______________________153
Tableau 7.2 Composition des principales lipoprotines. lipidiques ; TG chylomicrons 86-94 % Fractions ( % poids) CL CE 0,5-1 % 1-3 % PL 3-8 % Apoprotines Majeures 1-2 % AI, AU AIV, B48 5-10% B100 CI, Cil, CIII 20-24% B100 45-50%
VLDL
55-65%
6-8%
12-14%
12-18%
LDL HDL
8-12% 3-6%
5-10% 3-5%
33-40% 14-18%
20-25% 20-30%
AI, AU ci, en, cm

1.2. Classification des apolipoprotines
Situes la priphrie des lipoprotines, elles permettent leur solubilisation et leur transport sanguin. Elles ont un double rle : Un rle structural de maintien du complexe macromolculaire pour le transport des sites de synthse vers les sites d'utilisation ; Un rle mtabolique : - en permettant la reconnaissance des sites rcepteurs apolipoprotines B etE, - en tant effectrices d'enzymes, par exemple : l'apo AI est activatrice de la lcithine cholestrol acyl transfrase (LCAT), enzyme estrifiant le cholestrol des HDL ; l'apo Cil est activatrice de la lipoprotine lipase (LPL), enzyme situe sur l'endothlium des capillaires, hydrolysant les triglycrides des chylomicrons et des VLDL. L'apolipoprotine E a galement un rle important dans l'puration hpatique des remnants et des IDL par sa liaison avec le rcepteur Apo E alors que l'apo CIII inhibe la captation de ces lipoprotines et s'oppose l'effet activateur de l'apo Cil sur la lipoprotine lipase. Leurs caractristiques et principales proprits sont regroupes dans le tableau 7.3. Les apolipoprotines les plus importantes sont Papolipoprotine B et l'apolipoprotine Al. L'apo B est l'apoprotine des lipoprotines athrognes, les LDL et VLDL ; l'apo AI est la principale apoprotine des lipoprotines protectrices de l'athrome, les HDL.
Tableau 7.3 Caractristiques des principales apolipoprotines. Apoprotines ApoAl Poids molculaires 28000 Fonctions Concentrations plasmatiques l,102g/l Sites de synthse Foie, intestin VLDL LDL HDL % % %
de la fraction protique 4 67
activateur LCAT permet efflux du cholestrol stmcture des HDL permet efflux du cholestrol scrtion VLDL ligand du rcepteur LDL scrtion chylomicrons activateur LCAT (in vitro) activateur LPL inhibiteur LPL mtabolisme des esters du cholestrol ligand du rcepteur LDL et du rcepteur IDL
Apo AU ApoAIV ApoB100
17000 45000 550000
0,4 g/1 0,15 g/1 0,6 1,40 g/1
Foie, intestin Intestin Foie 35 90
22
ApoB48 Apo CI Apo CT Apo CM ApoD
264000 6600 8800 8700 33000
0,03 0,05 g/1 0,04 0,06 g/1 0,03 0,05 g/1 0,12 0,14 g/1 0,06 0,07 g/1
Intestin Foie Foie Foie Gonades, rein, foie, placenta, intestin Foie, intestin, surrnales, macrophages cerveau 13 i 40 5-9
ApoE
34000
0,03 0,05 g/1
2.
Mtabolisme des lipoprotines
Les lipoprotines sont synthtises avec des lipides d'origine endogne ou exogne.
2.1.
Apports lipidiques endognes
La synthse endogne de triglycrides est effectue dans le foie partir du glucose. Les acides gras libres peuvent tre librs par l'adipocyte et transports par la srum albumine jusqu'au foie o ils participeront galement la synthse endogne des triglycrides. Le cholestrol peut tre synthtis partir de l'actyl CoA et cette synthse reprsente 800 mg/jour.
2.2.
t-
Apports lipidiques exognes
Les lipides alimentaires sont d'origine vgtale (riches en acides gras (AG) insatures) et animale (AG saturs). Ces AG sont apports sous forme de triglycrides et de phospholipides. L'apport de cholestrol est de 200 mg/j. Ces lipides sont dgrads dans le tube digestif avec la lipase pancratique et l'intervention des sels biliaires. Ces sels biliaires permettent la fixation de la colipase activatrice de la lipase et ont une action mulsionnante sur les graisses (en absence de sels biliaires lors de l'obstruction du canal choldoque par des calculs ou une tumeur, les selles seront riches en graisses non dgrades ce qui provoquera une statorrhe). Les catabolites lipidiques obtenus, AG, Glycrol, monoglycrides et diglycrides sont absorbs par la muqueuse intestinale.
^
2.3. Mtabolisme des lipoprotines riches en triglycrides
2.3.1. Origines des chylomicrons et des VLDL Les lipoprotines riches en triglycrides sont synthtises par l'intestin pour les chylomicrons et une faible partie des VLDL (20 %) avec des lipides d'origine exogne. Ces lipoprotines d'origine intestinale sont libres dans la lymphe puis circulent dans le sang. Les VLDL sont principalement synthtises par le foie avec des triglycrides d'origine endogne. Chylomicrons et VLDL vont subir l'action de la lipoprotine lipase (LPL) de l'endothlium des capillaires qui dgradera leurs triglycrides en AG et glycrol. La LPL est active par l'apo Cil cde pralablement par les HDL, vritables rservoirs d'apo C . Les AG librs peuvent soit subir la (3 oxydation Let librer de l'nergie pour diffrents tissus, soit tre stocks par les adipocytes tous forme de triglycrides de rserve. \.3.2. Devenir des chylomicrons et VLDL Aprs l'action de la LPL sur ces deux lipoprotines, les chylomicrons sont transforms en particules rsiduelles ou remuants et les VLDL en lipoprotines intermdiaires, les IDL. Les remnants sont reconnus par le rcepteur apo B/E du foie et sont dgrads. Plusieurs types de rcepteurs ont t dcrits proches du rcepteur-LDL en particulier le LDL Receptor Related Protein ou LRP qui permet aussi l'puration des remnants avec reconnaissance de l'apo E. De mme les lipoprotines intermdiaires IDL tout en continuant subir l'action de la LPL, viendront galement se fixer sur les rcepteurs hpatiques. Les apo E3 et E4 sont reconnues par ces rcepteurs mais pas l'apo E2 ce qui
166__________________________________Biochimie clinique pourra provoquer une hyperlipoprotinmie avec accumulation d'IDL. Les IDL subissent alors l'action probable de la triglycride lipase hpatique pour tre transformes en LDL.
2.4.
Devenir des LDL
Les LDL ainsi formes se composent d'apo B, de cholestrol libre et estrifi. Elles circulent dans le sang vers les tissus priphriques et le foie. Elles sont reconnues par les rcepteurs apo B/E. Une anomalie quantitative ou qualitative du rcepteur apo B/E ou une modification de la LDL pourra entraner une dyslipoprotinmie. Aprs fixation sur le site rcepteur, la LDL est intemalise et dgrade en cholestrol libre, acide gras et acides amins de l'apo B. Le cholestrol libre pourra : - tre utilis pour la structure des membranes, - tre stock sous forme de cholestrol estrifi. Une enzyme, l'acyl cholestrol acyltransfrase (ACAT) permet en effet d'estrifier le cholestrol intracellulaire avec des acyl-coenzymes A ; - inhiber la f S hydroxy f 3 mthylgiutaryl CoA rductase, enzyme rgulatrice de la synthse du cholestrol, - inhiber la synthse des rcepteurs apo B/E.
Figure 7.2 Goldstein).
Captation et mtabolisme intracellulaire du cholestrol (selon Brown et
Certaines LDL ne sont pas captes par les rcepteurs apo B/E car elles sont modifies, surtout par peroxydation ou actylation. Elles sont alors catabolises par la voie du rcepteur scavenger des macrophages. Ce rcepteur n'est pas rgul par le taux de cholestrol et le macrophage pourra absorber un excs de LDL et se transformer en cellule spumeuse. Ce mcanisme peut tre une des causes de l'installation de la lsion athrosclreuse. Le cholestrol libre cellulaire en excs pourra tre pris en charge par les HDL ( efflux du cholestrol) pour tre ramen au foie et y tre dgrad.
2.5. Mtabolisme des HDL

Les HDL plasmatiques ont plusieurs origines : scrtion par l'intestin et par le foie, formation partir des chylomicrons et des VLDL. Au cours de la lipolyse, il y a en effet des changes permanents de lipides et d'apoliprotines entre les diffrentes classes de lipoprotines. Phospholipides et apo A sont dtachs de la surface des lipoprotines riches en triglycrides lors de la lipolyse et contribuent la synthse des HDL. Les HDL ont t divises en quatre sous classes : HDLp HDL^, HDLg et les lipoprotines de trs hautes densits (VHDL). HDL^ et HDLg sont les plus importantes et correspondent aux principales tapes mtaboliques. Les premires HDL libres dans la circulation sanguine ou HDL naissantes scrtes par les hpatocytes ne contiennent pas de cholestrol estrii. Elles ont une forme de disque. Au fur et mesure, la particule s'enrichit en cholestrol et phospholipides. Aprs l'estrification du cholestrol par la LCAT, le cholestrol estrifi hydrophobe se localisera au centre et transformera les disques en sphres : les HDL^. Ces HDLg sont des HDL de petite taille et de haute densit qui sont capables de recevoir du cholestrol et de continuer l'estrifier avec la LCAT. Elles se transforment en HDL de plus grande taille, les HDL^, de densit plus lgre car plus riches en triglycrides, qui sont des transporteurs de strides vers le foie ou les autres lipoprotines VLDL et LDL. Il y a un cycle permanent de conversion de HDL, en HDL^ avec intervention de la lipase hpatique (reprsent dans la figure 7.3). Les HDL ont plusieurs fonctions : intervenir dans la lipolyse des chylomicrons et VLDL en leur transfrant l'apo Cil activateur de la LPL et rcuprer, aprs la lipolyse, des particules de phospholipides, cholestrol libre et apoprotines ; intervenir dans le transport reverse ou efflux du cholestrol avec quatre tapes : rcuprer l'excs de cholestrol libre des tissus priphriques avec l'intervention d'un rcepteur spcifique HDL. Il s'agit alors de la sous classe : HDL3;
Figure 7.3 Mtabolisme des lipoprotines.

*CETP : cholesteryl ester transfer protein.
- permettre l'estrification du cholestrol libre par la LCAT pour librer les sites priphriques de la lipoprotine. Aprs estrification, tant hydrophobe, il forme le noyau des HDL ; - changer ce stride ainsi form contre des triglycrides des LDL grce une protine permettant cet change, la CETP ( cholesteryl ester transfer protein ) ; - ramener au foie le cholestrol des tissus non chang avec les triglycrides des LDL. HDL^ est donc la vraie lipoprotine antiathrogne puisqu'elle ,2 est donc la vraie lipoprotine pure l'excs de cholestrol (20 30 % des HDL totales). Au niveau du foie le cholestrol libre peut alors tre limin dans la bile ou servir la synthse des acides biliaires. La lipase hpatique, en hydrolysant les triglycrides et les phospholipides des HDLy permettrait leur retour dans la circulation sous forme de HDL^.
2.6.
Lipoparticules
Chaque classe de lipoprotines est elle mme un mlange htrogne de lipoparticules distinctes, de nature et de signification biologique diffrentes. Chaque lipoparticule est dfinie non plus par sa densit mais qualitativement par son contenu en apolipoprotines. Les unes ne comportent qu'une apolipoprotine, exemple : la Lp AI qui ne contient que de l'apo AI. D'autres plus complexes contiennent plusieurs apolipoprotines, exemple : la Lp-B-CIII-E. Les particules contenant l'apo AI (principalement les HDL) comportent deux populations : les Lp AI et les Lp AI-AII. - Les Lp AI sont riches en LCAT et en CETP et ont galement un trs faible taux d'apo AIV. Ces lipoprotines sont responsables de l'efflux de cholestrol des tissus priphriques vers le foie. - Les Lp AI-AII n'ont pas cette proprit. Une autre lipoparticule est diffrente par son apoprotine : la lipoprotine (a) ou Lp (a). C'est une lipoparticule caractrise par une apoprotine (a) (20 %), glycoprotine lie par un pont disulfure une apo B100 (60 %). Elle a longtemps t considre comme une LDL. A l'tat physiologique tous les sujets la possdent. Son analogie avec le plasminogne provoque sa liaison avec les glycosaminoglycannes et protoglycannes. Elle pourrait avoir une fonction rgulatrice de l'quilibre coagulation-fibrinolyse . Elle est trs athrogne et reprsente un facteur de risque indpendant pour une concentration plasmatique suprieure 0,3 g/1.
2.7.
Rgulation hormonale
Elle porte essentiellement sur le mtabolisme des triglycrides dont l'importance nergtique est fondamentale. La lipognse (synthse des TG) et la lipolyse (catabolisme des TG) sont rgules par diffrentes hormones (figure 7-4). On notera dans ce schma simple l'importance de l'insuline et le fait que les facteurs stimulant la lipase hormonodpendante du tissu adipeux sont tous des facteurs hyperglycmiants. Ainsi la production d'nergie partir de glucose ou partir d'acides gras peut-elle tre quilibre.
Insuline
Lipognse
FOIE
TISSU ADIPEUX
Lipolyse
Tissus Priphriques Lipase hormone-dpendante du tissu adipeux
Insuline Catcholamines Glucagon ACTH T3-T4 Cortisol
Figure 7.4 Rgulation hormonale de la lipognse et de la lipolyse.
3.
3.1.
Bilan lipidique
Bilan lipidique systmatique
II faut un bilan de sant ds l'enfance dans les familles risques et vers 18-25 ans chez les autres sujets. Ce bilan de premire intention doit comprendre : l'aspect du srum jeun et les dosages des triglycrides, du cholestrol total et du cholestrol HDL.
ir C
3.2.
Bilan lipidique orient
II est utilis pour une confirmation diagnostique aprs une anomalie dans le bilan systmatique, ou pour une surveillance de traitement ou aprs la dcouverte d'une maladie susceptible d'entraner une hyperlipmie secondaire. Ce bilan comprend en plus du bilan systmatique une lectrophorse des lipoprotines, un dosage de l'apo B et de l'apo Al et ventuellement les dosages de Lp Al et Lp(a).
3.3. ?
Paramtres lipidiques
3.3.1. Aspect du srum Sur un sujet jeun depuis 12 heures, le srum doit tre clair, c'est--dire avec un faible taux de VLDL et sans chylomicron. S'il est opalescent, il y a un excs de VLDL ; s'il est lactescent, des chylomicrons sont prsents. Pour contrler la prsence effective de chylomicrons, le srum est conserv 24 heures + 4 C et les chylomicrons forment alors une crme la surface du srum.
3.3.2. Dosage des triglycrides Des techniques enzymatiques sont utilises par plus de 90 % des laboratoires. Elles reposent sur le dosage enzymatique du glycrol libr aprs action de la lipase. Le glycrol libre prexistant est en quantit trs faible dans le srum. On peut cependant le doser sans faire l'hydrolyse pralable des triglycrides. La premire tape est une phosphorylation du glycrol par la glycrol kinase. Selon les tapes suivantes il s'agit de dosage photomtrique dans le visible ou dans l'U.V. 3.3.2.1. Dosage enzymatique calorimtrique
La lecture colorimtrique est effectue 500 nm. La coloration due au Formazan est proportionnelle la concentration en triglycrides dans le srum. Cette premire technique enzymatique colorimtrique est en voie d'abandon. 3.3.2.2. Dosage enzymatique l'oxydase-peroxydase
La lecture colorimtrique est effectue 540 nm. Cette technique est la plus utilise actuellement (2/3 des laboratoires franais la pratiquent). 3.3.2.3. Dosage enzymatique par spectrorflectomtrie II s'agit d'un dosage utilisant le mme principe de reaction que le dosage enzymatique l'oxydase-peroxydase mais pratiqu sur support solide. Taux normaux homme < 7,5 mmol/l ou < 1,30 g/l Taux normaux femme < 1,3 mmol/l ou < 1,15 g/l Pour tablir un rgime et/ou un traitement le seuil pathologique sera gal ou suprieur 2,3 mmol/l soit 2 g / l . 3.3.3. Dosage du cholestrol Le cholestrol peut tre dos par de trs nombreuses mthodes. Les plus anciennes sont colorimtriques, les plus pratiques sont enzymatiques. La mthode de rfrence est chromatographique. 3.3.3.1. Mthodes enzymatiques Ces mthodes concernent plus de 99 % des laboratoires franais. Elles utilisent toutes une cholestrol estrase et une cholestrol oxydase. Dans une premire tape les esters de cholestrol sont hydrolyses en cholestrol libre par l'estrase puis le cholestrol libre est oxyd en A4-cholestnone avec production d'eau oxygne. Les diverses techniques enzymatiques diffrent entre elles par le dosage de cette eau oxygne. Cholestrol 0,, Cholestrol oxydase CE ;> CL + AG CL y-> cholestne-4, one 3 estrase -- (CE = Cholestrol estrifi) (CL = Cholestrol libre) HÔ^ forme peut tre dose en prsence de catalase ou peroxydase :
Mtabolisme des lipides et des lipoprotines_____________________173 ou 2^0^ + phnol + chromogne (amino 4 phnazone) '> quinone unine +41^0 - Technique avec peroxydase et chromogne phnolique. Elle est pratique par plus de 90 % des laboratoires. La quinone imine obtenue ci-dessus est colore en ros et peut tre dose par colorimtrie 540 nm ou par spectrorflectomtrie. La coloration obtenue est proportionnelle la concentration du cholestrol srique. Les autres techniques sont beaucoup moins utilises.
r^
- Technique avec peroxydase et chromogne non phnolique. Avec de l'iodure, l'eau oxygne oxyde l'iodure en iode dos par photomtrie. - Technique avec catalase et chromogne. - Technique par spectrorflectomtrie avec chromogne phnolique. Toutes ces techniques enzymatiques montrent une bonne spcificit et une bonne exactitude. 3.3.3.2. Techniques chromatographiques
> CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
II s'agit de la technique de rfrence ncessitant un matriel trs spcialis. Aprs dilution isotopique, l'chantillon srique est pass sur chromatographie en phase gazeuse suivie d'une mesure par spectromtrie de masse. Taux normaux < 5,70 mmol/1 ou 2,20 g/1. Pour tablir un rgime et/ou un traitement, c'est le taux de cholestrol LDL qui sera retenu mais le seuil pathologique est diffrent selon le nombre de facteurs de risque prsent par le patient (tableau 7.6). 3.3.4. Dosage des phospholipides Trs peu demand, le dosage des phospholipides (lcithines, phosphatidyl thanolamines, phosphatidyl serines, sphingomylines et lysolcithines) est effectu par des techniques chimiques ou enzymatiques.
> TECHNIQUES CHIMIQUES :
Elles sont pratiques en dosant le phosphore directement ou aprs minralisation par formation d'un complexe phosphomolybdique.
La quinone imine forme est colore en ros et la densit optique 540 nm est proportionnelle la concentration des phospholipides sriques. Taux normaux < 3,20 mmol/l ou 2,50 g/l 3.3.5. Dosage des acides gras libres ^
II s'agit d'un dosage colorimtrique comportant 3 ractions successives :
La lecture colorimtrique est encore effectue 540 nm.

3.3.6. Dosage du cholestrol HDL
II s'effectue aprs prcipitation slective des LDL et VLDL avec un complexe polyanion-cation ou avec l'acide phosphotungstique en prsence de cations bivalents. Le cholestrol HDL est dos par technique enzymatique sur le surnageant rsultant de la centrifugation du prcipit. Les TG interfrent sur cette prcipitation partir de 4 mmol/l. - Des dosages directs du cholestrol HDL sont actuellement proposs, le principe est de bloquer les autres lipoprotines avec des anticorps anti apo B ou des polyanions puis le dosage du cholestrol HDL est effectu par mthode enzymatique. Taux normaux homme > 1,10 mmol/l ou > 0,42 g/l Taux normaux femme > 1,30 mmol/l ou > 0,50 g/l Le rapport cholestrol total/cholestrol HDL est utilis comme facteur de risque cardiovasculaire et doit tre infrieur 4,9 chez l'homme et 4,2 chez la femme.
3.3.7. valuation du cholestrol des LDL
Plus difficile pratiquer, le dosage par prcipitation slective des LDL est peu utilis. Un dosage direct vient d'tre propos en utilisant un dtergent qui
solubilise VLDL et HDL puis les enzymes cholestrol estrase et oxydase oxydent le cholestrol HDL et VLDL en produit inactif incolore. Un deuxime ractif avec dtergent, enzymes et chromogne permettra le dosage direct du cholestrol LDL. Taux normaux < 4,1 mmol/l ou 1,60 g / l Entre 4,1 et 5,7 mmol/l (1,60 2,20 gA) en prvention primaire chez des sujets sans autres facteurs de risque, seuls des conseils hygino-dittiques sont ncessaires. La formule de Friedewald permet de calculer le cholestrol LDL condition que les TG soient infrieurs 4 mmol/l (3,5 g/l). Pour des concentrations exprimes en moJ/1 : Chol. LDL = Chol. total - (Chol. HDL + TG/2,2) Pour des concentrations exprimes en g/l : Chol. LDL = Chol. Total - (Chol. HDL + TG/5,6). Si les triglycrides sont suprieurs 4 mmol/l (3,5 g/l) le cholestrol LDL peut tre calcul par la formule de Planella : Chol. LDL (mmol/l) = 0,41 Chol. total (mmol/l) - 0,32 TG (mmol/l) + 1,7 apo B(g/l) - 0,27. 3.3.8. Dosage des apoprotines AI et B Les deux principales apoprotines peuvent tre doses par diffrentes techniques immunologiques avec antisrums spcifiques et talons purifis. I - Les mthodes automatises utilises sont l'immunonphlmtrie et l 'immunoturbidimtrie. Mais pour les petites sries de dosages, l'immunodiffusion radiale, l'lectroimmunodiffusion et l'immunoenz.ymologie sont aussi pratiques. | - Les autres apoprotines utiles pour un diagnostic, apo Cil et apo E, sont aussi values avec leur anticorps correspondant par techniques immunologiques. Taux normaux apo B = 0,6 1,40 g/l Taux normaux apo AI > 1,10 g / l .
3.3.9 Dosage de la lipoparticule Al
Ce dosage s'effectue par lectroimmunodiffusion avec des anticorps anti AI et anti Ail. Taux normal LpAl > 0,35 g/l.
3.3.10. Dosage de la Lp (a) Ce dosage est galement effectu selon les techniques classiques immunologiques. Il faut viter la conglation des smms pour les techniques utilisant les principes d'immunonphlmtrie et d'immunoturbidimtrie. Taux normaux < 0,3 g/1. 3.3.11. lectrophorse des lipoprotines C'est un examen de deuxime intention qui apporte des informations complmentaires dans les cas de srums troubles avec hypertriglycridmie ou hyperlipmie mixte. Il permet un typage plus prcis de ces hyperlipoprotinmies. Cet examen est pratiqu sur agarose ou sur gel de polyacrylamide.
% LDL VLDL HDL 57.4 17.1 25.5
Normes % 45 - 60 05-18 10-45
Lipidogramme sur agarose
Figure 7.5 Schma d'un lipoprotinogramme.
Aprs migration lectrophortique des lipoprotines et coloration, il permet de visualiser qualitativement : - une surcharge en chylomicrons au point de dpt, - une augmentation des VLDL et/ou des LDL, - la prsence d'IDL ou de Lp(a), - une diminution relative des HDL. Il faut le pratiquer sur srum frais et ne pas l'utiliser pour quantifier le cholestrol HDL.
4.
Principales dyslipoprotinmies
Deux classifications, tablies par Fredrickson et de Germes, peuvent tre utilises pour dfinir les dyslipoprotinmies, (tableau 7.4).
Tableau 7.4 Classifications des hyperiipoprotinmies familiales. Classification internationale (Fredrickson) Frquence Aspect du srum CT TG Classification selon de Gennes Hypercholestrolmies essentielles 1) Forme mineure : expression biologique permanente, manifestations cardiovasculaires occasionnelles 2) Forme majeure : xanthomatose tendineuse hypercholestrolmique familiale (XTHF) 3) Forme monstrueuse de XTHF Hyperlipidmies mixtes 1) Forme mineure : expression biologique permanente, quelques manifestations cardiovasculaires 2) Forme majeure avec ou sans xanthomatose
na
frquent
clair
+++
IIb
frquent
opalescent
++
m i
IV
rare trs rare
opalescent lactescent
++
++ Hypertnglycridmies majeures Formes exognes dpendantes des graisses (activit lipoprotine lipase diminue) Formes endognes indpendantes des graisses soit glucide-dpendantes, soit thanolo-dpendantes, soit association avec d'autres facteurs (plthore, goutte...) activit lipoprotine lipase normale Forme exognes et endognes
N o u + +++
frquent
opalescent
Nou+
++
rare
lactescent
N o u + +++
1.1.
Hyperiipoprotinmies familiales
Trois hyperiipoprotinmies reprsentent 99 % des cas : l'hypercholestrolnie essentielle (type lia de Fredrickson), l'hyperlipmie mixte type IIb et l'hy)ertriglycridmie de type IV.
4.1.1. Hypercholestrolmies essentielles Elles atteignent 0,2 % de la population gnrale. L'anomalie primitive porte principalement sur le gne codant le rcepteur apo B/E des LDL avec plusieurs types de mutations entranant des modifications sur diffrents domaines du rcepteur. Exemples : - rcepteur synthtis mais non fix sur la membrane plasmique ; - pas de fixation possible de LDL ; - fixation de LDL mais pas d'intemalisation ; - il peut aussi y avoir des mutations sur le gne de l'apo B au niveau de son site de fixation sur le rcepteur. Dans tous les cas, les LDL ne sont pas captes par les cellules. Ces sujets type lia n'ont alors pas de rcepteurs ou ont des rcepteurs apo B dficients. Il y a trois degrs d'atteintes : - une forme htrozygote mineure avec un cholestrol total < 4 g/1 ou 10 mmoVl ; - une forme htrozygote avec xanthomes (accumulation de cholestrol au niveau des tendons) le cholestrol total est de 4 6 g/1 ou de 10 15 mmol/1 ; - une forme homozygote avec xanthomes et cholestrol > 6 g/l ou 15 mmol/l. L'aspect du srum est clair. Le cholestrol total, le cholestrol LDL et l'apo B sont augments. Le cholestrol HDL est normal ou diminu. Les triglycrides sont normaux. Le pronostic vasculaire est trs mauvais avec une augmentation des LDL circulantes qui peuvent tre modifies par oxydation ou actylation ce qui augmente les charges ngatives de la lipoprotine. Le catabolisme de ces LDL chez ces sujets se fait par l'intermdiaire des rcepteurs macrophagiques (rcepteurs scavenger ) qui ne sont pas rguls par le taux de cholestrol. Le macrophage pourra absorber un excs de LDL modifies qui le transformera en cellule spumeuse. Le risque athrogne sera donc trs important. Les LDL prsentes des concentrations leves peuvent aussi tre captes par fixation et intemalisation rcepteur indpendante par micropinocytose ; cet autre procd en l'absence de rcepteurs apo B-E permet de fournir du cholestrol aux tissus mais il n'y a plus aucune rgulation de l'intemalisation et du mtabolisme intracellulaire du cholestrol.
4.1.2. Hyperlipmies mixtes
Elles concernent 2 3 % de la population. La nature des anomalies gntiques est encore inconnue. Il y a une augmentation de la synthse de l'apo B et des VLDL, donc une augmentation des LDL. Un vrai type IIb prsente une augmentation du cholestrol et des triglycrides, mais sous l'influence des conditions dittiques on peut observer un cholestrol
lev avec des triglycrides normaux (pseudo type lia) ou un cholestrol normal | avec des triglycrides levs (pseudo type IV). L'aspect du srum est plus ou moins opalescent. Le cholestrol total, le cholestrol des LDL, les triglycrides totaux, les triglycrides des VLDL, l'apo B sont augments. Cholestrol des HDL et apo AI sont gnralement diminus. Le risque athrogne est important. 4.1.3. Hypertriglycridmies familiales
Elles reprsentent 1 % de la population. L'hypertriglycridmie d'origine endogne est due une augmentation de la synthse hpatique des VLDL et un ralentissement de leur catabolisme. L'apo CIII inhibitrice de la LPL peut tre augmente. Le srum est opalescent, le cholestrol est normal ou lgrement augment, les triglycrides sont trs levs et surtout les triglycrides des VLDL. Le cholestrol HDL et l'apo AI sont diminus. Le risque athrogne est important. L'hyperinsulinmie souvent associe suggre la participation d'un phnomne de rsistance l'insuline dans le dveloppement de l'hypertriglycridmie. Cette hypertriglycridmie peut tre intensifie par des facteurs dittiques comme glucides, alcool, obsit. Il faut liminer toutes les causes secondaires d'hypertriglycridmie avant de conclure un type IV familial. 4.1.4. Autres hyperlipoprotinmies familiales
Ces trois autres types (III, 1 et V) de la classification de Fredrickson sont beaucoup plus rares :
| > DYSBTALIPOPROTINMIE DE TYPE III
Les lipoprotines intermdiaires, IDL et les remnants de chylomicrons, ne sont pas purs par la lipase hpatique car les sites rcepteurs hpatiques apo E (gnotypes E2, E3, E4) ne reconnaissent pas le phnotype E2/E2. Les sujets atteints sont soit homozygotes E2/E2 soit htrozygotes E2/E3 mais seulement 1 % des sujets portant l'allle E2 dveloppent un type III ; donc cette anomalie n'est pas suffisante pour le dveloppement systmatique de cette dyslipoprotinmie. Le phnotype E3/E3 est le plus frquent chez l'homme mais chez les sujets atteints par la maladie d'Alzheimer la frquence des phnotypes avec apo E4 atteint 50 %. La prsence d'apo E4 serait un facteur de risque de dveloppement de la maladie alors que l'apo E2 pourrait avoir un effet protecteur. L'accumulation d'IDL et de VLDL se traduit par un catabolisme diffrent
180________________________________Biochimie clinique de ces lipoprotines : la voie macrophagique gnratrice d'athrome comme dans le type lia est utilise. Le risque cardiovasculaire est lev.
> HYPERCHYLOMICRONMIE (TYPE I)
Trs rare, elle est caractrise par une forte hypertriglycridmie d'origine exogne avec accumulation de chylomicrons. Elle est donc dpendante de l'apport en graisses alimentaires. Le dfaut gntique porte soit sur la lipoprotine lipase, soit sur son activateur l'apo Cil. L'enzyme est donc soit absente, soit inactive et les chylomicrons ne sont plus dgrads. Dans certains cas il peut y avoir aussi accumulation de VLDL (type V). La principale complication est la pancratite aigu mais le type 1 n'est pas athrogne.
> HYPERTRIGLYCRIDMIE MIXTE EXOGNE ET ENDOGNE (TYPE V)
C'est une hypertriglycridmie due l'augmentation des chylomicrons et des VLDL c'est--dire une combinaison des types 1 et IV. Le mode de transmission n'est pas dtermin. L'hypertriglycridmie peut tre aggrave par une forte consommation de glucides, alcool et graisses. Des dyslipoprotinmies rares ne sont pas classes selon les types de Fredrickson. On peut cependant en citer quatre.
> HYPERAPOBTALIPOPROTINMIE
Identifie par Sniderman, elle est caractrise par une augmentation de l'apo B avec un cholestrol LDL normal ou lgrement lev. Les LDL sont plus petites, denses et trs athrognes.
> AUGMENTATION DE LA LP(a)
Le taux de Lp(a) est suprieur 0,3 g/1. Cette lipoprotine est alors visible l'lectrophorse sur agarose ou en gel de polyacrylamide. Elle est associe ou non une hyperlipmie. Le risque athrogne est trs lev.
> HYPERALPHALIPOPROTINMIE
Ces sujets prsentent une augmentation du cholestrol HDL avec un cholestrol LDL normal. La transmission gntique est autosomique dominante. Les familles atteintes ont une grande longvit et une bonne protection contre l'athrosclrose.
> HYPOALPHALIPOPROTINMIE FAMILIALE
Le cholestrol HDL est diminu ainsi que l'apo AI. Il existe des analphalipoprotinmies qui relvent d'un dfaut de synthse des apo AI ou des apo AI et apo Cil car les deux gnes sont voisins.
Mtabolisme des lipides et des lipoprotines______________________181 r La maladie de Tangier est une analphalipoprotinmie autosomique rcessive avec mutation sur le gne de l'apo AI. Le transport reverse du cholestrol n'est plus effectu et il se dpose dans diffrents tissus. Des hypolipoprotinmies peuvent tre rencontres au cours de maladies de la nutrition et de la maladie cliaque. 1 Les vgtariens ont un taux de lipoprotines et de cholestrol plus bas que les omnivores.
|
f2.
Dyslipoprotinmies secondaires
Une dyslipoprotinmie secondaire peut tre iatrogne ou bien tre la consquence de nombreuses pathologies et modifications hormonales. Elle est susceptible de rgresser par le seul traitement de l'affection causale. Les plus fr||uentes sont prsentes dans le tableau 7.5. 4.2.1. Pathologies mtaboliques et hyperlipoprotinmies secondaires
> DIABTE SUCR
L'hyperlipoprotinmie de type IV est la plus frquemment associe au diabte mais sont galement trouvs les types IIb et V. L'activit LPL est diminue car l'insuline est diminue. La lipolyse intra-adipocytaire n'est plus freine par l'insuline et entrane une activation de la synthse des VLDL.
^Tableau 7.5 '
Principales dyslipoprotmmies secondaires. Types selon Fredrickson IV ou IIb IV ou IIb IV ou IIb IIb ou IV lia ou IIb CT Nou+ Nou+ Nou+ + ++ TG + + + + NOU++
Pathologie mtabolique Diabte (type 1 ou D) Insuffisance rnale Hyperuricmie Syndrome nphrtique Pathologie Hormonale Hypothyrode Hyperlipoprotinmies iatrognes Usage de contraceptifs strodiens Bta-Bloquants Diurtiques thiazidiques Corticodes
nb,iv
IV
nb
IV ou IIb
Nou+ N + Nou+
+ + + +
182________________________^__________Biochimie clinique
^ OBSIT
Le type IV est le plus frquent, provoqu par une augmentation de la synthse des VLDL. L'association clinicobiologique de l'obsit, hypertension, insulinorsistance avec hyperinsulinisme secondaire est dnomme syndrome X : chez ces sujets il y a une augmentation des VLDL due l'insulinorsistance. Le cholestrol HDL est souvent diminu et le risque cardiovasculaire est trs augment chez ces sujets.
> HYPERURICMIE
Le type IV et le type IIb sont frquemment associs l'hyperuricmie et la goutte.

^- CHOLESTASE INTRA- OU EXTRAHPATIQUE
Les types lia et IIb sont rencontrs. Le foie scrte dans le sang des lipoprotines anormales dites lipoprotines X riches en cholestrol libre, phospholipides et en apo C et E. L'activit LCAT serait diminue par la prsence de sels biliaires dans le sang.
> INSUFFISANCE RNALE CHRONIQUE
Le type IV est surtout prsent avec une augmentation de la synthse des VLDL et un catabolisme frein par une augmentation de l'apo CIII, inhibitrice de la LPL et peut-tre par un dficit en lipase hpatique. Les sujets en hmodialyse prsentent les mmes perturbations alors que les sujets transplants sous corticothrapie voluent vers un type IIb.
^ SYNDROME NPHROTIQUE
Les types IIb et IV sont principalement rencontrs. La fuite de l'albumine au niveau rnal provoque un excs d'acides gras libres par rapport la srum-albumine qui les transporte et entrane une stimulation de la synthse des VLDL et un catabolisme diminu. La synthse de l'apo B est galement augmente. De plus la lipase hpatique serait moins active. 4.2.2. Pathologies hormonales
> HYPOTHYRODIE
Elle est frquemment associe des types lia et IIb. Le mcanisme est mal lucid. Il semble qu'une faible concentration en hormones thyrodiennes entrane une diminution du catabolisme des LDL et du cholestrol.
> HYPERTHYROD
Elle est gnralement associe une hypocholestrolmie.
fc Mtabolisme des lipides et des lipoprotines______________________183
4.2.3.
Hyperlipoprotinmies iatrognes
Diffrents troubles lipidiques peuvent tre provoqus par la prise de mdicaments. Les plus importants sont :
> TRAITEMENT AVEC CONTRACEPTIFS STRODIENS
1 Les strognes diminuent l'activit lipase hpatique donc provoquent une hypertriglycridmie et une augmentation des HDL2. Les progestatifs norstrodes augmentent l'activit lipase hpatique donc diminuent les triglycrides et les HDL2. Les progestatifs non androgniques n'ont pas d'influence.
> AU COURS DU TRAITEMENT DE L'HYPERTENSION ARTRIELLE
Certains (3-bloquants peuvent diminuer l'activit LPL entranant une hypertriglycridmie. Les diurtiques thiazidiques provoquent une augmentation du cholestrol, surtout du cholestrol LDL, et une augmentation des triglycrides.
^ AU COURS DES CORTICOTHRAPIES DE LONGUE DURE.
Elles peuvent provoquer l'installation de types IIb ou IV.
4.3. Notions thrapeutiques

Dans toutes les dyslipoprotinmies athrognes, le rgime est appliqu systmatiquement et constitue la premire mesure thrapeutique. L'indication d'un mdicament sera discute dans un deuxime temps aprs trois six mois de rgime. Les seuils dcisionnels de traitement sont prsents dans le tableau 7.6 I selon les rfrences mdicales opposables (RMO).
4.3.1. Traitement dittique
> EN CAS D'HYPERCHOLESTROLMIE
r D ne faut pas dpasser un apport quotidien en cholestrol de 300 mg. Les graisses d'origine animale sont proscrire : jaune d'uf, beurre, charcuterie... Il faut diminuer la consommation en graisses satures en vitant les graisses d'origine animale mais aussi certaines graisses vgtales, huile de coco, vgtaline, huile de palme, beurre de cacao, margarines dures... Il faut augmenter les graisses insatures : acides gras monoinsaturs (acide olique) et polyinsaturs. Les huiles vgtales (tournesol, mas, colza, soja, noix, ppin de raisin) et les margarines drives de ces huiles sont utiliser ; l'huile d'olive est riche en acide olique mono-insatur. Les poissons, mme les poissons gras comme saumon, sardine... sont une source importante d'acides gras polyinsaturs.
Tableau 7.6 Seuils dcisionnels de traitement. Catgorie de patients ayant une lvation duLDL Cholestrol Prvention primaire des hommes de moins de 45 ans ou femmes non mnopauses n'ayant aucun autre facteur de risque Prvention primaire des hommes de moins de 45 ans ou femmes non mnopauses n'ayant aucun autre facteur de risque aprs chec de la dittique. Prvention primaire des sujets ayant un autre facteur de risque Prvention primaire des sujets ayant au moins deux autres facteurs de risque Prvention secondaire des sujets ayant une maladie coronaire patente. 21,60 (4,1) >1,30 (3,4) <1,60 (4,1) <1,30 (3.4) Valeur d'instauration du traitement dittique >2,20g/l (5,7 mmol/1) ++ Valeur cible Valeur d'instauration du traitement mdicamenteux Pas d'indication en premire intention Valeur cible
<1,60 (4,1)
>2,20 (5,7) malgr une dittique suivie pendant 6 mois 21,90 (4.9) <1,60 (4,1)
<1,60 (4,1)
<1,60 (4,1) <1,30 (3,4)
>1,30 (3,4)
<1,00 (2.6)
>1,30 (3,4) malgr une dittique suivie pendant 3 mois
<1,00 (2,6)
Dans le cadre de la prvention des maladies cardiovasculaires, il faut prfrer les glucides complexes et riches en fibres (pain complet, pain, lgumes verts et secs, fruits, pommes de terre, ptes, riz) aux sucres d'absorption rapide (sucre, confitures, confiseries, jus de fruis sucrs...).
> ENCASD'HYPERTRIGLYCRIDMffi
II faut rduire les glucides et les boissons alcoolises. L'obsit est quelque fois lie une augmentation des triglycrides et du cholestrol associe une diminution du cholestrol HDL. Dans ce cas il faut diminuer l'apport calorique (en particulier les graisses, les sucres d'absorption rapide et l'alcool) et en mme temps augmenter les dpenses nergtiques en pratiquant des exercices physiques.

4.3.2. Traitements mdicamenteux
i 4.3.2.1. Hypocholestrolmiants
> RSINES SQUESTRANT LES ACIDES BILIAIRES
En France, c'est la choiestyramine (Questran) qui est utilise pour le type lia. Le cholestrol est alors consomm par les hpatocytes pour une production accrue d'acides biliaires. Cependant, il y a quelques effets digestifs secondaires.
> FIBRATES
Diffrents drivs des fibrates : fnofibrate, bezafibrate, ciprofibrate sont utiliss dans les hyperlipmies mixtes mais aussi pour les hypercholestrolmies. Leurs actions s'exercent plusieurs niveaux en particulier en activant les oxydations d'acides gras dans les peroxysomes. En effet ces molcules agiraient par l'intermdiaire de rcepteurs d'activation des peroxysomes (PPARs a et "y) qui en leur prsence migreraient vers le noyau entranant la transcription et la traduction de protines enzymatiques du peroxysome. Le PPAR a prsent dans foie, rein, cur et muscle serait un rgulateur essentiel du mtabolisme lipidique en augmentant l'expression du gne de la lipoprotine lipase et en diminuant la synthse de l'apo CIII. De plus une induction de la synthse des apo AI et AU par le PPAR a permet d'augmenter le cholestrol HDL sous traitement par fibrates. La modulation par les PPARs a permet d'expliquer la diminution de la synthse des VLDL et l'augmentation de leur catabolisme sous fibrates. Les fibrates sont particulirement indiqus dans les hyperlipoprotinmies mixtes avec augmentation du LDL cholestrol et des triglycrides, aprs chec du rgime.
> INHIBITEURS DE LA P-HYDROXY, P-MTHYL, GLUTARYL-COA RDUCTASE
Cette enzyme (HMG CoA rductase) rgulatrice de la synthse intracellulaire du cholestrol peut tre inhibe par des statines . La concentration intracellulaire de cholestrol diminue, il y a alors stimulation de la synthse des rcepteurs LDL et captation augmente des LDL. Diffrentes statines sont commercialises : pravastatine, simvastatine, fluvastatine, crivastatine et atorvastatine. Leur effet biologique majeur est d'abaisser le LDL cholestrol. Les statines sont utilises principalement dans les hypercholestrolmies type lia. 4.3.2.2. Autres hypolipmiants
> ACIDE NICOTINIQUE
II est peu utilis en France. Il diminuerait le taux de Lp(a).
> PROBUCOL (LURSELLE)
Ancien hypocholestrolmiant, il diminue le cholestrol LDL mais aussi le cholestrol HDL. Cependant il est efficace dans la rgression des xanthomes. Il est surtout un anti-oxydant ; or la peroxydation des LDL joue un rle important dans l'athrognse. Donc ce mdicament, comme la vitamine E, serait protec' teur de l'athrome par ses proprits anti-oxydantes.
^- ACIDES GRAS POLYINSATURS DE LA SRIE to, (MAXEPA)
Ces extraits d'huile de chair de poisson sont efficaces sur les hypertriglycridmies de type IV et V. Ils diminuent la synthse hpatique des triglycrides et augmentent le catabolisme des VLDL par activation de la lipoprotine lipase. Ils ont galement un effet anti-agrgant plaquettaire.
> HUILES AVEC ACIDES GRAS CHANES COURTES
Elles sont utilises dans les rgimes des hypertriglycridmies exognes car ces acides gras chane courtes sont librs directement par l'entrocyte sans entraner la synthse des chylomicrons.
5.
Conclusion
En pidmiologie, pour diminuer la mortalit cardiovasculaire, deux causes majeures devraient pouvoir tre vites : le tabagisme et l'hypercholestrolmie. Pour celle-ci, il faut un dpistage systmatique des hyperlipmies, associ une modification du rgime alimentaire gnral. Ce dernier devrait comprendre 30 % seulement de la ration sous forme de graisses, elles mmes reprsentes parties gales de graisses satures, mono-insatures et polyinsatures.
Bilan lipidique en pratique mdicale courante. Biologiste et praticien, Mendiboume, Paris, 1990,4. Lipoprotein analysis. C.A. Converse and E.R. Skinner. Oxford University Press, London (1992).
Hyperlipidmies ; G. Turpin et al. Arcol John Libbey. Montrouge, France (1995). -. .. . , .... --, - , _ . Biochimie pour le clinicien. J.P. Borel. Frison Roche, Paris (1999).
8
Gnralits sur le mtabolisme awt
Pierre Valdigui
Les protides (du grec protos, premier) sont les constituants principaux de la cellule sur le plan plastique aussi bien que dynamique. Ils sont forms par l'enchanement d'aminoacides et renferment environ 16 % d'azote, appartenant au radical amin de ces aminoacides. Le mtabolisme azot est donc le plus important de tous les mtabolismes des constituants organiques de la matire vivante et il mrite quelques notions gnrales introductives de physiologie et de biochimie.
1.
Besoins et apports protiques
Les besoins sont la fois quantitatifs et qualitatifs. Ils doivent tre pris en compte dans toute tude nutritionnelle.
1.1.
Besoins quantitatifs
Malheureusement trop souvent objectivs par les mdias lors des reportages sur les pays du tiers monde ou lors des grandes famines, les apports protiques sont, dans ces cas, insuffisants. Pourtant le besoin minimum, chez l'adulte, en protines alimentaires est faible, environ 1 1,1 g par kilo de poids corporel. Facilement couvert dans les pays riches, ce besoin est satisfait par une alimentation mixte et quilibre. Les protines vgtales des crales, telles que les glutlines, et les protines de l'alimentation came et lacte apportent mme souvent un large excdent qui sera perdu sous forme d'ure urinaire.
Les 20 acides amins courants des protines sont ainsi apports. La liste des aminoacides non indispensables comprend glycocolle, alanine, serine, cystine, acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, proline et tyrosine. Les aminoacides indispensables sont prsents ci-aprs.
1.2.
Besoins qualitatifs
Ils sont reprsents par les aminoacides indispensables et les vitamines. 1.2.1. Aminoacides indispensables Ils sont au nombre de : - 8 chez l'adulte : valine, thronine, leucine, isoleucine, mthionine, lysine, phnylalanine et tryptophane ; - 10 pendant la priode de croissance car histidine et arginine s'ajoutent la liste prcdente, n'tant fabriques qu'en quantit insuffisante par nos cellules (arginine) ou par la flore bactrienne intestinale (histidine) d'o nous l'obtenons par symbiose. Ces acides amins sont facilement apports par les protines animales de l'alimentation came ou lacte, alors que les protines de certaines crales renferment peu de tryptophane et de lysine. Ds lors, dans les pays o la ration alimentaire dpend largement des farines de ces crales, et dans la mesure o il n'y a pas de supplmentation par des protines d'origine animale, de graves tats de dficience sont observs, de type kwashiorkor ou marasme, associant un dficit quantitatif une insuffisance en aminoacides indispensables et en vitamines.
1.2.2. Vitamines
Le terme de vitamine dsignait toute substance azote indispensable la vie car non synthtise par nos cellules et devant ds lors tre apporte par l'alimentation. En ralit on sait maintenant que de nombreuses vitamines sont dpourvues d'azote (acide ascorbique ou vitamine C par exemple) et que des substances encore appeles vitamines sont en fait synthtisables par nos cellules, bien que parfois en quantit insuffisante (amide nicotinique ou vitamine PP par exemple, fabrique en ralit partir de mtabolites du tryptophane). Les progrs de la dittique, les connaissances sur nos besoins nutritionnels sont maintenant parvenus bien cerner le besoin vitaminique. Rappelons qu'il ncessite des vitamines dites liposolubles (vitamines A, D, E et K) et des vitamines hydrosolubles trs nombreuses (Bp B^, Bg, H, Bc, B^, etc.).
Gnralits sur le mtabolisme azot
_____
189
2.
2.1.
Digestion et absorption intestinale

Digestion des protines alimentaires
La protolyse digestive est ralise par des enzymes gastrique, pancratiques et intestinales. On distingue des exopeptidases et des endopeptidases. - Les endopeptidases hydrolysent les liaisons peptidiques des protines l'intrieur des chanes. Les principales endopeptidases sont : - la pepsine gastrique ; - la trypsine ; gi - la chymotrypsine pancratiques. Ces enzymes sont scrtes sous forme de proenzymes inactives puis actives dans l'intestin par des mcanismes divers (entrokinase, autocatalyse protolytique, activation par la trypsine). L'activation in situ au niveau du pancras est responsable de lsions graves comme celles de la pancratite aigu hmorragique. Leur spcificit d'action est diffrente. La plus troite est celle de la trypsine qui hydrolyse spcifiquement les liaisons peptidiques dans lesquelles sont engags les COOH de l'arginine et de la lysine. Le rsultat de la protolyse par les endopeptidases est un mlange trs complexe de peptides sur lesquels agiront les exopeptidases. - Les exopeptidases principales sont : - l'aminopeptidase qui libre l'acide amin situ en position N terminale, - la carboxypeptidase qui dtache en revanche l'aminoacide du ct oppos c'est--dire COOH terminal. Ces deux enzymes ont une action rcurrente, permettant l'hydrolyse complte de la plupart des peptides. Ainsi le rsultat final de la protolyse est un mlange des vingt aminoacides courants des protines et de quelques dipeptides non encore totalement hydrolyses.
2.2. Absorption intestinale des acides amins

Le mlange d'aminoacides et de dipeptides subit un transport membranaire actif au niveau de la bordure en brosse, coupl l'absorption du Na"1". Ce dernier sera chass ultrieurement par le canal Na-K avec consommation d'nergie. Les quelques dipeptides absorbs subissent une hydrolyse intracellulaire. Normalement tous les acides amins sont absorbs avant la valvule ilocaecale et les composs azots prsents dans le clon proviennent du mucus, des scrtions, des leucocytes et des cellules pithliales desquames. Leurs transformations sont effectues par la flore bactrienne colique au cours de la putrfaction.
La dgradation incomplte du gluten, principale protine du bl, est responsable, chez certains enfants, de l'absorption puis du passage dans le sang de polypeptides qui entranent l'apparition d'anticorps, crant des lsions de la muqueuse intestinale (atrophie villositaire), des troubles de l'absorption avec une diarrhe particulire (selles bouseuses ), puis des troubles gnraux, un arrt de la croissance pondrale, le tout caractristique de la maladie cliaque. Le traitement est prventif, par la suppression des farines de crales de l'alimentation de l'enfant. La maladie cliaque est aussi observe chez l'adulte. Le syndrome de malabsorption et la diarrhe s'accompagnent volontiers d'ostomalacie ou d'anmie de carence.
3.
Utilisation mtabolique
Aprs leur absorption dans l'intestin grle, les aminoacides gagnent le foie par la voie portale o ils retrouvent une partie des acides amins issus de la destruction physiologique des tissus sous l'action de cathepsines. Leur destine mtabolique est alors variable. Certains servent l'dification de protines nouvelles, d'autres sont utiliss pour faire du glucose et la fonction amine doit tre dtache par dsamination ou transamination. L'ammoniac qui en rsulte aura son mtabolisme propre (cf. chapitre 11 Constituants azots non protiques).
3.1.
Biosynthses protiques
Le foie et tous les autres tissus utilisent le pool des aminoacides pour difier leurs protines. Ce pool est obtenu partir des aminoacides alimentaires, des aminoacides issus du renouvellement permanent des protines tissulaires et aussi des aminoacides non indispensables fabriqus partir de divers matriaux dont le glucose. Ainsi le foie est-il impliqu dans la gense des trs nombreuses protines plasmatiques (toutes l'exception des immunoglobulines). Les oprations de biosynthse obissent aux rgles classiques de la synthse des protines, savoir transcription des gnes de structure de l'ADN sous forme d'ARN messagers, traduction du message nuclotidique en terme d'acides amins grce aux ribosomes et aux ARN de transfert positionnant l'aminoacide voulu la place requise. Cette synthse des squences primaires des protines sera suivie par la glycosylation et la maturation des protines dans l'appareil de Golgi, aboutissant aux structures secondaire puis tertiaire voire quaternaire des protines.
Gnralits sur le mtabolisme awt
191
.1.
Noglucognse
L'utilisation de la chane carbone des aminoacides pour faire du glucose est trs classique et essentielle. Tous les aminoacides sont en effet glucoformateurs, l'exception de la leucine, ctoformatrice stricte. C'est la noglucognse, principalement hpatique, stimule par le cortisol et inhibe par l'insuline.
4.
Catabolisme et limination azote
L'adulte sain soumis un rgime normal est en quilibre azot c'est--dire que les apports d'azote alimentaire, sous forme presque exclusivement de protines alimentaires, (de 60 90 g par jour soit 10 12 g d'azote) et l'excrtion totale d'azote sont identiques. Quelles sont la nature, l'origine et le mcanisme biochimique de l'excrtion
ate?
Ll.
Excrtion azote
Elle est faite de diverses composantes : - l'excrtion fcale est relativement constante mais elle est faible : environ 1 'i 2 g par jour. Elle s'lve lors des syndromes de malabsorption de la maladie , coeliaque ou lors des insuffisances pancratiques chroniques. | Elle s'abaisse au cours du jene. - la dperdition azote est minime par la desquamation cutane, la coupe des cheveux et des ongles et la sueur. - l'limination urinaire est prpondrante. On y trouve en effet l'azote urique qui reprsente 50 % de l'azote total urinaire, des traces de protines, des aminoacides, de la cratinine, des sels ammoniacaux, de l'acide urique. Comprendre l'importance de l'limination de l'ure, terme du mtabolisme du radical NH^ des acides amins est donc fondamental.
4.2.
Origine de l'limination azote sous forme urique
Elle est double, associant le catabolisme des aminoacides alimentaires en x excs et celui des aminoacides issus de la dgradation endogne des protines. Le processus gnral devant respecter l'quilibre entre entres et sorties, deux kthories se sont, un temps, affrontes.
192____________________________________Biochimie clinique 4.2.1. Thorie de l'usure et de la dgradation L'excs d'acides amins alimentaires est immdiatement limin sous forme d'ure et reprsente la part exogne de l'limination. La part endogne correspond la fraction dtruite des protines uses par les cathepsines cellulaires. Cette thorie est reste longtemps classique. Elle n'est plus en fait maintenant applicable que dans un cas bien particulier, celui de l'hmoglobine qui, enferme dans son sac globulaire, chappe au renouvellement permanent et est dtruite au bout d'environ 120 jours lorsque l'rythrocyte arrive au terme de sa vie.
Part Exogne
Urines
Apports
Elimination
Part Endogne
Tissus
Figure 8.1 Reprsentation schmatique du mtabolisme azot dans la thorie de l'usure et de la dgradation . 4.2.2. Thorie du mtabolisme azot permanent Le renouvellement permanent des protines implique qu'il y ait une scission continue des protines plasmatiques ou cellulaires, mme s'il y a un excdent d'apport protique alimentaire.
l, Gnralits sur le mtabolisme azot__________________________193

Apports Urines
Figure 8.2 Thorie du renouvellement permanent.
L'hydrolyse et le renouvellement continus ne correspondent pas, bien entendu, une usure des molcules mais une destruction permanente suivie de reconstruction. Selon ce mcanisme, la fraction limine est issue du pool des aminoacides, fond commun partir duquel s'effectuent aussi bien les synthses que les catabolismes. Toutes les protines de l'organisme rpondent ce schma l'exception de l'hmoglobine, comme dj indiqu ci-dessus. Toutefois ce pool d''aminoacides ne reprsente pas une rserve. Il n'y a pas, chez l'adulte, de mise en rserve d'azote, la diffrence des rserves glucidiques (glycogne) ou surtout lipidiques (triglycrides du tissu adipeux). Un bilan azot positif sera not seulement au cours de la croissance du sujet jeune et chez la femme au cours de la grossesse, alors qu 'un bilan ngatif sera observ quand les pertes dpasseront les apports, en particulier lors du jene, des syndromes de malabsorption, des hypercatabolismes protiques (fivre, infection, traumatismes, brlures tendues).
4.3.
Catabolisme du radical amin des aminoacides
Le mcanisme biochimique de la production d'ure procde de deux lments : - la dsamination des aminoacides, directe ou indirecte au travers de la transamination avec formation d'ammoniac. - l'intgration de cet ammoniac dans la molcule d'ure par les ractions hpatiques de l'urognse (cf. chapitre 11). 4.3.1. Dsamination des acides amins Tous les aminoacides sont concerns, la libration d'ammoniac laissant la chane carbone disponible pour la noglucognse.
> DSAMINATION OXYDATIVE
Elle concerne thoriquement tous les aminoacides grce l'enzyme trs gnrale qu'est la L-aminoacide dshydrognase. En ralit cette enzyme est peu active et la dsamination oxydative s'applique donc essentiellement l'acide glutamique, activement dsamin par sa dshydrognase spcifique (Lglutamodshydrognase) qui le transforme en acide a cto-glutarique. Celui-ci est aussi impliqu dans les ractions de transamination qui permettent tous les autres aminoacides de lui cder leur groupement amin, ce qui le transforme en acide glutamique, alors facilement dsamin. Ds lors directement mais surtout indirectement au travers de la transamination, tous les acides amins peuvent librer leur radical NH^, qui est ensuite transform en NHg, dissimul sous forme de glutamine.
> AUTRES TYPES DE DSAMINATION
II s'agit de processus biochimiques particuliers pour divers aminoacides : - dsamination dshydratante pour les aminoacides hydroxyls serine et thronine ; - dsamination dsulfurante pour cystine et homocystine issue de la mthionine ; - dsamination dsaturante pour l'histidine. Le rsultat est partout identique, car l'ammoniac libr est immdiatement dtoxiqu sous forme de glutamine, agent de transport et d'utilisation de l'ammoniac, ct de son rle plastique de constituant des protines (car c'est un des 20 aminoacides des protines). 4.3.2. Urognse hpatique Le cycle de l'urognse est destin intgrer sous forme d'ure deux molcules d'ammoniac (apportes par la glutamine et libres par la glutaminase) et une molcule de gaz carbonique.
Gnralits sur le mtabolisme azot__________________________195
Le processus mtabolique, reprsent sur la figure 11.1, fixe la premire molcule d'ammoniac et le CO^, sous forme de carbamyl-phosphate qui s'intgrera l'omithine pour produire de la citrulline. Celle-ci recevra une deuxime molcule d'ammoniac, en ralit apporte sous forme d'acide aspartique, pour former l'arginine, alors spcifiquement et trs activement hydrolyse par l'arginase hpatique en ure et ornithine, prte redmarrer le cycle.
15.
Rgulation hormonale
L'ensemble du mtabolisme azot est soumis des facteurs de rgulation soit favorables (anabolisants) soit dfavorables (catabolisants).
5.1.
Facteurs anabolisants
Ils favorisent, comme leur nom l'indique, la biosynthse des protines et tendent entraner un bilan azot positif. Ces facteurs sont trs nombreux et l'on peut distinguer des facteurs hormoinaux et des facteurs de croissance.
5.1.1. Facteurs hormonaux
15.7.7.7. Insuline
Elle freine la noglucognse et favorise la biosynthse protique en augmentant la production nergtique d'origine glucidique, en facilitant aussi l'incorporation directe des aminoacides dans les chanes protiques en cours d'dification sur les ribosomes. 5.1.1.2. Hormone de croissance Elle stimule la biosynthse des protines, la croissance et le dveloppement tissulaires, provoquant ainsi une rtention azote et un bilan azot positif. p.1.1.3. Andrognes Les hormones mles sont trs classiquement de puissants agents anabolisants. Elles entranent une stimulation gnrale de la biosynthse des acides nucliques et des protines, exerant en particulier une action trophique trs nette sur les muscles squelettiques (utilisation sportive lors du dopage) et la matrice protique de l'os (utilisation thrapeutique dans l'ostoporose snile). Comme toutes les hormones andrognes, les produits de synthse ou anabolisants ont toutefois conserv une part de l'action virilisante, ce qui est souvent gnant au cours des utilisations thrapeutiques chez la femme.
5.1.1.4. strognes Leur action isole est difficile mettre en vidence puisque c'est surtout l'association stroprogestative qui est implique dans le dveloppement des cellules de la sphre gnitale. Cependant la survenue de l'ostoporose post-mnopausique montre bien l'influence favorable des strognes sur la trophicit de la trame protique de l'os. 5.2.2. Facteurs de croissance et cytokines De connaissance rcente, ces facteurs, reconnus par des rcepteurs membranaires spcifiques, s'adressent au mtabolisme cellulaire. Ils stimulent (ou parfois dpriment) le mtabolisme protique par le biais d'actions nuclaires dclenchant diverses rponses cellulaires ou diverses productions enzymatiques aboutissant finalement une stimulation gnrale du mtabolisme cellulaire. Leur nombre s'accrot chaque jour grce aux connaissances permises par les progrs du gnie gntique, de mme que leur mcanisme d'action se prcise petit petit. Ainsi par exemple les cytokines du groupe des interleukines sont scrtes par les mastocytes en rponse la fixation d'IgE sur des rcepteurs spcifiques de haute affinit ou bien la suite d'une stimulation non immunologique induite par des ionophores pour le calcium. Les proprits proinflammatoires de certaines de ces cytokines sont lies la production de substances dclenchant l'inflammation, l'induction de molcules d'adhsion la surface des cellules endothliales, au chimiotactisme et peuvent dclencher une raction de type allergique qui pourra, elle-mme, tre autoentretenue.
5.2.
Facteurs catabolisants
5.2.1. Glucocorticodes
Cortisol, cortisone et cortisoniques de synthse (corticodes) acclrent le catabolisme protidique. Ils provoquent une fuite urinaire azote, augmentent la noglucognse et rendent donc la balance azote ngative. De plus ils inhibent l'incorporation des aminoacides dans les chanes en cours de biosynthse. Leur action est particulirement nette au niveau de la peau, trs amincie, au niveau de l'os avec ostoporose grave, ou au niveau des muscles avec atrophie, lors des hypercorticismes ou des syndromes de Cushing iatrognes. 5.2.2. Hormones thyrodiennes
Elles augmentent le catabolisme azot comme elles stimulent tous les mtabolismes. Ainsi l'amaigrissement est-il un des signes cardinaux de l'hyperthyrodie.
9
Protines plasmatiques
Pierre Valdigui
Les protines reprsentent la plus grande partie des matires solides du plasma. En dehors du fibrinogne, protine fibreuse, ce sont toutes des protines globulaires. Seule la srum-albumine est une holoprotine, toutes les autres tant des htroprotines pouvant contenir des lipides (lipoprotines), des mtaux (mtalloprotines) et surtout des glucides, la plupart des protines plasmatiques sont en effet des glycoprotines. Leurs proprits sont trs variables : transporteurs, anticorps, enzymes, agents de pression oncotique, marqueurs de l'inflammation, marqueurs tumoraux, agents de la coagulation, facteurs de croissance, etc... mais il faudra diffrencier les protines toujours prsentes dans le plasma, lments constitutifs de celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant que transitoirement.
Principales protines plasmatiques

A. Srum-albumine
Reprsentant 55 60 % de l'ensemble des protines du plasma, c'est le constituant majeur des protines circulantes. Son poids molculaire est 69 000 Da. C'est une molcule relativement stable, contenant 564 amino-acides, rpartis sur une seule chane peptidique. La fonction thiol libre d'une cystine lui confre une ractivit particulire. Elle est le principal agent de la pression oncotique et joue un rle trs important de transporteur : transport de bilirubine, d'acide gras, de mdicaments, d'hormones thyrodiennes
Elle est facile doser par des mthodes colorimtriques, immunologiques ou par lectrophorse condition de disposer de la protidmie totale. Les taux normaux sont de 40 50 g/l soit 0,5 0,7 mmolll. Ses variations pathologiques seront uniquement des hypoalbuminmies (cf. paragraphe 3) car les hyperalbuminmies ne sont rencontres que dans les syndromes, transitoires, d'hmoconcentration.
1.2.
Glycoprotines
1.2.1. Protines de transport En dehors de la srum-albumine, de nombreuses protines ont dans le plasma un rle de transport. Seront dcrites ou rappeles ici, titre d'exemples, la transferrine, la cruloplasmine, la transcortine. 1.2.1.1. Transferrine Le fer srique est transport par cette p-globuline, (cf. chapitre 4), normalement sature seulement au tiers de ses possibilits d'accueil. Il existe plusieurs types gntiques de transferrine, comme l'a montr l'lectrophorse en gel d'amidon ou de polyacrylamide. Le dosage par immunoprcipitation en milieu liquide ou par immunodiffusion radiale est facile et la transferrine fait le plus souvent partie des profils protiques plasmatiques . Les taux usuels sont de 1,5 3 g / l . En raison de sa taille (poids molculaire 90 000 d), la sidrophiline apparat rapidement dans l'urine, aprs l'albumine, dans les syndromes nphrotiques expliquant l'anmie hypochrome observe souvent dans ces cas. La transferrinmie est galement diminue dans l'intoxication thylique chronique, o l'on trouve classiquement les signes biologiques suivants : lvations de la gamma-GT, du VGM et des Ig A, diminution par contre de la srumalbumine et de la transferrine. Le rapport Ig A/transferrine s'lve au-del de sa valeur normale de 1,2 1,5. L'lvation de la transferrine dficiente en acide sialique (carbohydrate dficient transferrin ou CDT des anglo-saxons) semble tre actuellement le meilleur marqueur de l'alcoolisme chronique.
1.2.1.2. Cruloplasmine
Riche en cuivre, ce qui lui donne et sa couleur bleue et son nom, cette a2 glycoprotine est en fait une oxydase dans laquelle le cuivre est un cofacteur. Elle augmente au cours des tats inflammatoires, de la grossesse, des traitements strogniques. Ces variations, cependant, ne prsentent pas suffisamment d'intrt pour inclure la cruloplasmine dans les profils protiques . La variation la plus spectaculaire s'observe dans la trs rare maladie de Wilson o le taux est trs diminu, expliquant que le cuivre plasmatique soit fix, de manire labile, sur la srum-albumine qu'il pourra quitter pour aller se dposer dans les noyaux gris centraux, le foie, la corne (cf. chapitre 5).
Protines plasmatiques__________________________________199
1.2.1.3. Transcortine C'est une c^-globuline de poids molculaire 56 000 d fixant le cortisol avec une grande affinit. Elle est donc comme la SBP (sex binding protein) fixant les andrognes, la DBP (yitamin D binding protein) ou la retinol binding protein, un transporteur particulier d'hormones lipidiques ou de produits proches. Sa concentration normale est voisine de 70 mg/l. Elle augmente, classiquement, dans la grossesse et les traitements androgniques ou strogniques. Des dficits congnitaux ont t dcrits, lis au chromosome X. 7.2.2. Antiprotases On range dans ce groupe une famille de protines ayant des proprits inhibitrices vis--vis des protases diverses circulant dans le plasma. Celles-ci sont trs nombreuses : la trypsine, la chymotrypsine, la plasmine, la thrombine, l'lastase, la collagnase et d'autres enzymes hydrolytiques libres par les polynuclaires sont en effet susceptibles d'apparatre dans le plasma. 1.2.2.1. Anti-protase ou a^-antitrypsine Elle est en realit capable d'inhiber bien d'autres srine-protases que la trypsine, ce qui explique le nom actuel de cette protine. C'est une glycoprotine de petite taille, ayant une demi-vie brve (5 jours). Elle est un inhibiteur puissant des diverses enzymes protolytiques pouvant tre dverses dans le plasma par des tissus ou par des cellules circulantes comme les polynuclaires. On comprend ainsi son augmentation au cours des tats inflammatoires o de nombreuses enzymes, en particulier lysosomiales, sont relches. Le polymorphisme gntique de l'aj-antiprotase est responsable de plusieurs formes molculaires, individualisables l'lectrophorse en gel d'amidon ou de polyacrylamide. En effet divers gnes allles sont impliqus dans la biosynthse et sont responsables d'un grand nombre de phnotypes. Ainsi l'allle M, le plus frquent, entranera un phnotype MM chez l'homozygote et divers phnotypes htrozygotes. L'allle Z conduit parfois des homozygotes ZZ dont le taux plasmatique est beaucoup plus bas. Par techniques immunologiques, le taux normal est de 2 4 g/l. Il y a cependant des variations lies au phnotype. Des variations pathologiques sont notes : - au cours de l'inflammation o le taux est banalement augment ; - les diminutions, par contre, sont plus intressantes car gntiques ou acquises. Elles intressent la pathologie pulmonaire et hpatique. Au cours de bronchopneumopathies et d'emphysmes, des dficits trs importants en o^-antitrypsine ont t observs. Ils frappent surtout les phnotypes ZZ, SS, 00 et sont particulirement frquents en Sude o un dpistage systmatique a t instaur.
; t
La structure des parois alvolaires est dgrade par les enzymes protolytiques des leucocytes, des macrophages et des plaquettes et remplace par un tissu fibreux non fonctionnel pour les changes gazeux et dont l'lasticit est quasi nulle. Au cours de cirrhoses infantiles, observes chez des homozygotes ZZ, on trouve, la ponction-biopsie hpatique, une accumulation d'o^-antitrypsine dpourvue d'activit antiprotasique, responsable de la destruction des cellules et de leur remplacement par du tissu fibreux, expliquant la cirrhose et l'ictre nonatal. Le pronostic est videmment trs sombre et l'emphysme n'a pas le temps de se dvelopper. Chez l'adulte, une association emphysme, cirrhose et dficit en o^-antiprotase a aussi t observe. Au cours des entropathies exsudatives, la perte digestive de protines peut tre objective par l'tude de l'limination de l'Qq-antiprotase. Son dosage dans les selles et dans le plasma permet de calculer une vritable clairance digestive de cette protine. 1.2.2.2. a^-macrobuline Comme son nom l'indique, c'est une volumineuse glycoprotine de poids molculaire 750 000 Da, forme par plusieurs subunits runies par des ponts disulfure. Elle se combine aux diverses enzymes protolytiques circulantes (plasmine, collagnase, trypsine et a chymotrypsine, protases bactriennes et protases leucocytaires). Elle pourrait ainsi limiter les effets nfastes de la raction inflammatoire en inhibant les enzymes lysosomiales dverses. Le dosage immunologique est facile. Les valeurs de rfrence sont: 2 3,5 g/l. Les variations pathologiques sont surtout en hyper : - augmentation dans les syndromes nphrotiques lie une synthse hpatique accrue et une rtention (partielle) du fait qu'elle ne franchit pas facilement la membrane glomrulaire pathologique. Ainsi se comprend l'augmentation de la fraction lectrophortique o^ dans les syndromes nphrotiques, accompagnant et contre-balanant peut-tre la baisse importante de l'albumine et de nombreuses autres prottines ; - augmentation dans l'inflammation aigu, moins nette toutefois que celle de l'orosomucode, de l'haptoglobine ou de la CRP. 1.2.3. Immunoglobulines Autrefois appeles "y-globulines du fait de leur migration lectrophortiques majoritairement en zone -y, les immunoglobulines sont le support de l'immunit humorale, sous forme d'anticorps. Les cellules qui fabriquent les anticorps sont les plasmocytes et les lympho-
plasmocytes, tous issus des lymphocytes B et pouvant se dvelopper partir d'une seule cellule souche pour former un clone lorsque un antigne a t dtect et phagocyt par les macrophages. Les immunoglobulines sont trs htrognes, pouvant tre classes en 5 classes diffrentes, objectives l'immunolectrophorse et dfinies par la structure de l'une de leurs chanes, la chane lourde (isotypie). On distingue ainsi : les Ig G avec chane lourde Y, lesIgA a lesIgM H lesIgD 8 lesgE e. Les trois premires sont quantitativement les plus importantes. 1.2.3.1. Structure gnrale Toutes les immunoglobulines ont un motif commun constitu de 4 chanes polypeptidiques, identiques deux deux (figure 9.1). Les chanes dites lgres ont un poids molculaire de 22 000 Da, alors que les plus lourdes ont 50 000 d. Ces chanes sont runies entre elles par des ponts disulfure et la coupure qu'elle subissent lors de l'hydrolyse par la papane entrane l'apparition des fragments Fab et Fc bien classiques maintenant. La prsence de glucides aboutit finalement un poids molculaire de 150 000 Da.
^ . - - - - - - J pab l------->. < - - - - - - - - - - - -
pc \-----------^
s S
Glucides S S "2
c,
s S
Figure 9.1 Structure schmatique du motif lmentaire des immunoglobulines.
Les fragments Fab sont capables de fixer l'antigne, ce que ne fait pas le fragment Fc, qui tient cependant sous sa dpendance la fixation du complment. Chaque chane lourde est constitue de deux parties :
- une partie constante (c), dfinissant l'isotypie, dont la squence en aminoacides est identique, pour la mme espce, dans toute molcule d'immunoglobuline de la mme classe (sous reserve de l'existence d'allotypes Gm ou Inv) et - une partie variable (v), responsable de Vidiotypie, dont la squence est adapte chaque antigne, permettant sa reconnaissance spcifique. Les chanes lgres ont seulement deux types de squence appels kappa (K) et lambda ( X ) qui s'associent avec toutes les varits de chanes lourdes. Le type K prdomine. 1.2.3.2. Structures particulires Les immunoglobulines G sont sous forme monomrique (poids molculaire 150 000 Da). Leurs chanes lourdes sont constitues par 4 sous-classes y, 72, y3, et y4. Les immunoglobulines A sont prsentes dans le plasma et dans les liquides de scrtion des cellules pithliales. Dans le plasma, elles sont sous forme monomrique traditionnelle alors que dans les scrtions elles sont gnralement unies (figure 9.2) une glycoprotine appele pice scrtoire de poids molculaire 58 000 Da. De plus, une autre glycoprotine la chane J peut aussi se fixer sur l'Ig A, provoquant alors sa dimrisation. Les Ig M ou macroglobulines sont polymrises, associant gnralement 5 subunits monomriques unies entre elles par une chane J . Leur poids molculaire atteint ainsi 800 000 ou 1 000 000 Da.
Figure 9.2 Structures schmatiques d'une Ig A ( gauche) et d'une Ig M ( droite).
1.2.3.3. Taux normal des immunoglobulines Ils varient selon l'ge, les Ig G chutant rapidement aprs la naissance pour remonter progressivement, comme Ig M et Ig A, partir de la 4e semaine. Des | taux constants sont obtenus environ 4 ans. Chez l'adulte les valeurs de rfrence sont les suivantes (tableau 9.1) :
Tableau 9.1 Concentrations moyennes des immunoglobulines sriques
b |?
' 1.2.4.
IgG 8 12
IgA
IgM 0,6 a i,2
IgD
IgE
0,1 0,5
24
0,1 0,3
Microglobulines
On trouve en zone o^ et (^ de l'lectrophorse des protines de faible poids molculaire dont la p^-microglobuline est, dans le srum, le reprsentant le plus notable. Glycoprotine de 12 000 d, elle est produite par les cellules nucles de l'organisme. Elle fait partie du complexe d'histocompatibilit majeur de la classe I, compos de protines de membrane cellulaire, en particulier au niveau des lymphocytes, en tant que chanes lgres des antignes HLA. Aprs son relargage des membranes, pour des raisons inconnues, la protine est facilement filtre au niveau du glomrule du fait de sa petite taille et elle est ensuite totalement rabsorbe par le tubule rnal. Le taux plasmatique normal est de 1,2 2 mg/l. Le taux urinaire, normalement faible, augmente dans les tubulopathies et son dosage urinaire est aussi utile pour la surveillance des greffes rnales. Dans le plasma l'lvation de son taux est observe dans l'insuffisance rnale et dans divers cancers. Elle augmente, en dehors de toute atteinte rnale, lors de Yactivation lymphocytaire (syndromes lymphoprolifratifs; SIDA). Elle s'accumule dans les tissus lors de l'amylose observe chez les dialyses au long cours dans l'insuffisance rnale chronique.
1.3. Marqueurs d'une pathologie cellulaire

1.3.1. Protines de l'inflammation
Un certain nombre de protines plasmatiques voit leur taux augmenter fortement et de manire non spcifique au cours des tats inflammatoires. On les appelle protines de la phase aigu . Leur lvation est due une augmenta;tion de synthse hpatique, mdie par l'interleukine 1, qui n'a pas de retentis-
204__________________________________Biochimie clinique sment sur la protinmie totale. Cette lvation est lie un tropisme particulier de ces protines pour le foyer inflammatoire mais ne peut avoir de valeur en terme de diagnostic tiologique. Cependant elles permettent de suivre l'volution de la maladie inflammatoire. Ainsi le dosage de ces protines peut-il quantifier, voire automatiser la dtermination de la vitesse de sdimentation globulaire, (VS) si utilise en France. La VS est mesure grce un tube d'environ 25 cm de hauteur, rempli de sang citrate et donc incoagulable, maintenu verticalement. Au bout d'une heure, la hauteur de la colonne plasmatique est mesure avec un dcimtre. Elle reprsente la sdimentation des globules rouges sous l'influence de la gravit et elle est normalement < 5 mm. Toute augmentation, en dehors d'une anmie, est habituellement le fait d'une inflammation ou d'un cancer (VS souvent > 100 mm), ce qui lui donne une valeur de dpistage grossier intressante. Elle est cependant non spcifique, peu sensible. Les facteurs diminuant la VS sont la polyglobulie, la macrocytose, l'hypoprotinmie. Au contraire, l'anmie, la microcytose, la prsence de protines monoclonales l'augmentent. Nanmoins, elle est simple raliser et peu coteuse et reste donc trs populaire pour les mdecins franais. 1.3.1.1. Orosomucode C'est une protine a,, de faible poids molculaire (40 000 Da) trs riche en sucres et en acide sialique, ce qui lui a confr aussi le nom de glycoprotine acide a 1. Sa concentration normale varie entre 0,6 et 1,2 g/L Elle s'lve fortement dans les tats inflammatoires, en particulier au cours du rhumatisme articulaire aigu de l'enfant ou maladie de Bouillaud, dans lequel l'volution favorable tait suivie par la baisse progressive du taux d'orosomucode. 1.3.1.2. Haptoglobine Capable de fixer l'hmoglobine, d'o son nom, cette protine a^ (Hp) est une glycoprotine trs riche en sucres, constitue dans sa forme monomre la plus simple de quatre chanes polypeptidiques 2 a et 2 P. Les chanes (3 sont identiques chez tous les individus, alors que les chanes a diffrent car trois gnes distincts peuvent les coder. Ainsi y a-t-il des formes monomres et des formes polymres transmission gntique. La fixation d'hmoglobine entrane la formation d'un complexe Hb-Hp qui a la particularit d'avoir une action enzymatique, de type peroxydasique, mise profit pour le dpistage du sang sur les bandelettes urinaires ou dans les matires fcales.
Protines plasmatiques___________________________________205
Par dosage immunologique, (immunoprcipitation en milieu liquide avec mesure de la dispersion d'un faisceau laser), le taux varie entre 0,5 et 1,5 g/l. Les variations pathologiques observes sont : - abaissement, voire effondrement dans les hmolyses, particulirement utile lors des hmolyses discrtes ; - lvation dans les tats inflammatoires, frquente et banale car l'haptoglobine est un marqueur trs sensible de l'inflammation non spcifique. Le taux d'haptoglobine peut s'lever jusqu' 10 g/l mais n'a ni valeur diagnostique ni pronostique. Ici encore l'intrt est essentiellement li la surveillance de l'voi lution du syndrome inflammatoire. r
1.3.1.3. Protine C ractive (CRP)
Glycoprotine de poids molculaire 120 000 Da, forme par l'union de 5 sub| units identiques, cette protine porte son nom en raison de sa proprit de prcipiter au contact du polysaccharide C du pneumocoque. C'est un marqueur trs prcoce de l'inflammation (tableau 9.2), s'levant |dans les 2 4 heures aprs le dbut du processus inflammatoire.
Tableau 9.2 Principales protines de la phase aigu Poids molculaire Valeurs usuelles Dlai d'apparition (Da) (/l) (heure) CRP______________120 000______< 0,006________24 SAA_______________12000_______<0,01________46 OROSO_____________40000______0,6 1,2_______24 48 HAPTO_____________86000______0,5 1,5________id_ FIBRINOGENE _ _ 3 4 0 000 2,5 3.5 ____id CRILO 132000 0,2 0,4 id al A N T I P R O T A S E 5 4 0 0 0 2 4 i c T
Elle a, par ailleurs, un rle d'activation du complment, de facilitation de la phagocytose des bactries et de modulation de la multiplication des lymphocytes T. Du fait de sa demi-vie trs courte (24 heures), la CRP est aussi un tmoin prcoce de l'efficacit thrapeutique, lors d'une antibiothrapie par exemple. Le taux normal varie de 0 6 mg/l. Les lvations de la protine C ractive sont observes : - dans tous les tats inflammatoires o l'augmentation prcde celles de l'orosomucode et de l'haptoglobine (2 3 jours) et du fibrinogne (aprs 13 jours);
- dans les infections bactriennes nonatales, renseignant sur l'efficacit de l'antibiothrapie ; - dans la surveillance post-opratoire o la CRP s'lve systmatiquement aprs l'intervention chirurgicale et atteint son pic en 2 3 jours. Si sa concentration srique continue s'lever au 4e jour, il faut craindre une complication infectieuse. 1.3.1.4. Fibrinogne Destin essentiellement se transformer en fibrine et former le caillot au cours de la coagulation, le fibrinogne est aussi une protine de la phase aigu dont le taux augmente au cours des syndromes inflammatoires. C'est une glycoprotine constitue de 6 chanes peptidiques 2 2 identiques, de poids molculaire 330 000 Da. Il est synthtis dans le foie essentiellement et aussi, faiblement, par les mgacary ocytes. Le dosage est effectu soit par mthode immunologique (immunodiffusion radiale ou immunoprcipitation) soit par mthode de mesure de sa transformation en fibrine sous l'influence de la thrombine. Le temps de coagulation d'un plasma dilu est en effet proportionnel la concentration en fibrinogne, pour une zone donne de concentration. La calibration de ce dosage est cependant dlicate. Les valeurs de rfrence chez l'adulte sont 2,5 3,5 g / l . L'intrt du dosage du fibrinogne sera donc mixte, dans tout processus inflammatoire, o son lvation accompagnera celle de la VS et des autres marqueurs protiques et en hmostase, o le temps de thrombine explore plus particulirement la fibrinoformation. 1.3.1.5. Srum amylode A protine La srum amylode A protine ou SAA est la plus petite des protines de la phase aigu (poids molculaire 12 000 Da). Elle apparat prcocement dans toute inflammation aigu. 1.3.2. Marqueurs tumoraux Les marqueurs biologiques des cancers sont des molcules fabriques par les cellules tumorales et prsentes dans la circulation sanguine. La transformation maligne de nombreuses cellules s'accompagne de l'activation d'oncognes ou de proto-oncognes dclenchant la biosynthse de protines dites transformantes , enzymes de type protine-kinases, facteurs de croissance pouvant alors expliquer leur tour le dveloppement anarchique du cancer. C'est le cas de l'oncogne V-erb-B codant le rcepteur membranaire de l'EGF (epidermal growth factor), ou du gne p53 codant une protine s'accumulant dans les cellules tumorales et dtectable par immuno-histochimie.
Protines plasmatiques__________________________________207 Ailleurs la multiplication cancreuse entrane une production hormonale susceptible d'tre reconnue comme moyen de diagnostic : forte lvation de la gonadotrophine chorionique HCG dans les choriocarcinomes, de la srotonine dans les tumeurs carcinodes du grle, de l'hormone anti-diurtique ADH dans les cancers bronchiques petites cellules, responsable du syndrome de Schwartz-Bartter. Enfin parfois la transformation noplasique est associe la ractivation de gnes codant pour des protines qui sont normalement absentes ou prsentes de trs faibles taux l'tat normal. C'est le cas, par exemple, de l'antigne carcinoembryonnaire ACE, de l'a-ftoprotine AFP, appels ds lors antignes oncoftaux . Tous ces marqueurs permettent au laboratoire qui les dose de participer au diagnostic ou surtout la surveillance de l'volution des cancers en cause. Bien sr le marqueur tumoral idal n'existe pas car cette substance devrait avoir les proprits suivantes : fabrique par la tumeur elle-mme, elle devrait permettre le diagnostic, l'apprciation de la masse tumorale, son extension mtastatique ventuelle, et aussi l'apport de substances thrapeutiques localement (immunothrapie par anticorps monoclonaux dirigs contre cette substance). Nous dcrirons quelques marqueurs d'utilisation courante (tableau 9.3). Tableau 9.3 Intrt clinique de quelques marqueurs tumoraux. Marqueur AGE AFP PSA A 15-3 A 125 CA19-9 hCG Normalit < 7 ug/1 < 10 ug/1 < 4 (lg/1 25 U/ml < 35 U/ml < 35 U/ml < 0,4 ug/1 Cancer Clon Foie Prostate Sein Ovaire Pancras Testicule Diagnostic 0 + +/0 0 0
++
Pronostic + ++ + + + +++ ++
Suivi ++ +++ +++ ++ ++ +++
1.3.2.1.
Antigne carcinoembryonnaire
L'antigne carcinoembryonnaire (ACE) est une glycoprotine prsente dans le foie, l'intestin et le pancras ftal au cours des premiers mois de la grossesse. Cet antigne oncoftal a t mis en vidence d'abord dans les cancers du clon, grce des anticorps monoclonaux, puis dans d'autres tissus normaux o son taux reste cependant trs faible. Le dosage est possible par mthode immunologique, avec marqueur isotopique aussi bien qu'avec marqueur froid, enzymatique par exemple. Les taux normaux varient avec la technique utilise.
Ils sont habituellement <7 pg/l. L'intrt clinique n'est pas le diagnostic des cancers du clon ou du sein mais la surveillance thrapeutique et pronostique chez un patient dtermin. Dans le cancer du clon, le taux propratoire de l'ACE une valeur pronostique, des taux levs laissent souponner une rcidive aprs la rsection chirurgicale, d'autant plus rapidement que le taux est plus lev. L'ACE n'a aucun intrt en dpistage de masse.
1.3.2.2. a-ftoprotine
L'alpha-ftoprotine (AFP) est une glycoprotine du srum ftal disparaissant dans les semaines qui suivent la naissance. Les mthodes de dosage immunologique sont nombreuses par prcipitation, technique radio-isotopique ou par marqueur non isotopique. La limite suprieure de la normale est comprise entre 10 et 20 / J / l . L'intrt de l'AFP vient de son lvation dans un grand nombre de carcinomes hpatocellulaires pour lesquels, associe l'chographie, elle sera un bon lment de diagnostic, confirm bien sr par l'histologie aprs ponction biopsie. Ce n'est pas toutefois un marqueur prcoce et son rle dans le suivi de l'volution aprs exrse est donc encore plus important. Il faut noter cependant que l'hpatocarcinome est rare en Europe, mais frquent en Afrique de l'Est, et que dans notre pays les cas de cancers primitifs du foie sont rares, limits aux adnocancers sur cirrhose. L'AFP est aussi un marqueur intressant des tumeurs testiculaires o il est augment, avec hCG et p hCG, dans 70 % des tumeurs germinales en dehors des sminomes. Dans ces cas, les marqueurs ont un grand rle diagnostique car dpistes prcocement, ces tumeurs ont un pronostic favorable. Enfin en pathologie obsttricale, l'AFP est utilise comme marqueur d'anomalies du dveloppement du tube neural du ftus (spina bifida, anencphalie par exemple). 1.3.2.3. Antigne spcifique de la prostate (PSA) Produite dans les cellules pithliales de la prostate, cette protine ou prostate spcifie antigen ou PSA, de poids molculaire 33 kDa appartient au groupe des kallicrines. Elle est abondante dans le liquide sminal. C'est une protase, exerant des fonctions enzymatiques de type trypsine et chymotrypsine-like. Elle n'offre aucune parent ni physiologique ni biochimique avec les phosphatases acides prostatiques qui ne sont plus utilises en pratique courante. Le PSA circule dans le sang sous plusieurs formes : libre, complex l'a,antichymotrypsine, complex l'a^-macroglobuline, inaccessible dans ce cas aux dosages immunologiques. Le dosage classique concerne PSA total < 4 mg/1
Protines plasmatiques_______________________________
209
r1.3.2.4. ^
'
Il doit tre effectu avant tout toucher rectal qui libre des quantits massives de PSA. La fraction libre est maintenant accessible au dosage, permettant d'tudier le rapport PSA libre/ PSA total. Son intrt clinique est li la pathologie prostatique et en particulier au cancer de la prostate, le plus frquent des cancers masculins. Il est alors souvent considr comme un marqueur ayant une petite valeur diagnostique permettant, pour des taux entre 4 et 10 mg/1 de diffrencier adnome ou hypertrophie bnigne de la prostate et cancer. Cependant le PSA s'lve avec l'ge, avec l'hypertrophie bnigne et il faut alors tudier le rapport PSA libre / PSA total, accompagn du toucher rectal, de l'chographie pour dcider de faire une biopsie. Plus le rapport baisse, plus le risque de cancer est lev, car la fraction de PSA libre est significativement plus faible chez les sujets porteurs d'un cancer, et en dessous de 15 pour ce rapport, la biopsie est indique. Le dosage de PSA total est aussi utile pour la surveillance post-thrapeutique, BBU'elle soit hormonale, chirurgicale ou radiothrapique. Hormone chorionique gonadotrophique
L'hormone chorionique gonadotrope (hCG) est une hormone glycoprotique, faite de 145 aminoacides et synthtise par le placenta (syncytiotrophoblaste). Deux sous-units sont prsentes. La chane a est identique celle de LH, FSH et TSH. La chane (3 en revanche est spcifique et est d'ailleurs souvent dose isolment sous le nom de p hCG. Les valeurs usuelles, en dehors de la grossesse, sont < 0,4 i^g/l ou 8 Vil. hCG ou p hCG est utilise pour le diagnostic prcoce de la grossesse, car elle est dtectable dans les urines partir du 8e jour aprs la fcondation. Les nombreuses trousses disponibles en pharmacie assurent plus ou moins bien ce rle diagnostique. En pathologie, hCG et p hCG reprsentent des marqueurs des tumeurs d'origine trophoblastique : - tumeurs testiculaires en dehors des sminomes, bien que certains de ceux-ci aient des taux levs d'hCG ; - grossesse molaire ou choriocarcinome en pathologie obsttricale. Dans ces divers cas hCG a une valeur majeure pour le diagnostic et pour la surveillance de ces tumeurs. 1.3.2.5. A 15-3
II s'agit du cancer antigen 15-3, glycoprotine identifie dans le plasma au cours des tumeurs mammaires humaines. Il est dfini et dos grce deux anticorps monoclonaux obtenus par hybridation de cellules de mylome murin avec des cellules de souris immunises par des lipoprotines du lait humain et j par des cellules de tumeurs mammaires.
Ce marqueur peut tre utilis pour le bilan d'extension et la surveillance des cancers du sein car il s'lve trs prcocement lors de la survenue de mtastases, souvent mme avant la traduction clinique de celles-ci. 1.3.2.6. CA-125 Le CA-125 reprsente en ralit un ensemble d'antignes ayant en commun un pitope reconnu par l'anticorps monoclonal OC 125. Cet anticorps est obtenu partir de souris immunises contre des cellules de carcinome ovarien humain. Il s'agit donc d'un marqueur du cancer de l'ovaire, quel qu'en soit le type histologique, utilis encore pour le suivi des malades et non pour le diagnostic. 1.3.2.7. A 19-9 Le A 19-9 a t isol grce un anticorps monoclonal de souris dirig contre des cellules d'adnocarcinome du clon humain. Des taux levs de cet antigne sont observs dans les cancers pancratiques et les cancers du clon. Sa spcificit pour les cancers du tractus digestif est bonne, en particulier pour les adnocarcinomes du pancras, ce qui lui permet de participer en partie au diagnostic, difficile, de ce cancer profond. Il permet en effet de faire la diffrence entre une pancratite chronique et un cancer. Comme pour les autres marqueurs, toutefois, l'intrt est surtout dans le suivi de l'volution. 1.3.3. Marqueurs non enzymatiques de la souffrance myocardique Les marqueurs biologiques d'un infarctus du myocarde (IDM) ont beaucoup volu depuis quelques annes. Les enzymes localises dans le cytoplasme, telles que transaminases, cratine kinase, lacticodshydrognase ont t devances par des protines impliques dans des fonctions mtaboliques (myoglobine) soit par des protines structurales (myosine et troponine). 1.3.3.1. Myoglobine La myoglobine est prsente dans tous les types de myocyte ; elle a un faible poids molculaire et elle est localise prfrentiellement dans le cytoplasme. Elle passe trs rapidement dans le srum ce qui en fait un excellent marqueur prcoce. Elle a une faible spcificit d'organe puisqu'elle augmente aussi bien dans les pathologies cardiaques (infarctus, chirurgie cardiaque) que musculaires (exercice intense, traumatisme, chirurgie, rhabdomyolyse). Son mtabolisme est essentiellement rnal. Le diagnostic de ncrose cardiaque ne peut donc pas tre bas uniquement sur ce test chez des patients en insuffisance rnale. Pour affirmer la prsence d'une ncrose l'lvation de myoglobine doit toujours tre
confirme par un test beaucoup plus slectif comme la CK^g massique ou la ^troponine 1 cardiaque ou troponine T cardiaque (Tnic, TnTc). Valeurs usuelles de la myoglobine < 80 f i g / l (Stratus SCS Dade Behring) ^.3.3.2. CK^g massique La CK^g massique associe au dosage de la myoglobine peut permettre un bon classement des malades prsentant ou non un infarctus du myocarde. La CK^g massique a une spcificit infrieure la troponine le surtout en bas de pathologie musculaire associe, bien que ces deux paramtres gardent Ties caractristiques cintiques post IDM semblables. 1.3.3.3. Troponines Le filament fin du myocyte, rgulateur de la contraction myocardique, est compos principalement de l'actine, de la tropomyosine et du complexe des troponines. Le complexe des troponines se compose de trois protines I, C et T. La troponine C (TnC) fixe le calcium. Son dosage n'a aucun intrt dans le diagnostic des pathologies cardiaques puisque les formes exprimes par le myocarde ne sont pas diffrentes de celles du muscle squelettique. La troponine 1 (Tnl) fixe le filament d'actine la TnC et empche la contraction en l'absence de calcium. La troponine T (TnT) lie le complexe troponine la tropomyosine. Les troponines T et 1 possdent des isoformes cardiaques diffrentes des isoformes musculaires ce qui permet un dosage par mthode immunologique. Les isoformes cardiaques de la Tnic et de la TnTc sont des marqueurs spcifiques du myocarde et leur dosage est d'un grand intrt clinique.
> INTRTS CLINIQUES DU DOSAGE DE LA TROPONINE
Une lvation mme modre des marqueurs dfinit un patient risque. L'importance de ce risque est proportionnelle l'lvation de la concentration en troponine 1 ou T. Il existe pour les marqueurs cardiaques deux seuils diagnostiques. , Le premier seuil correspond la valeur obtenue dans une population indemne |de pathologie cardiaque (valeur seuil de la population de rfrence). Le deuxime est le seuil dcisionnel de l'infarctus du myocarde. Tout patient prisentant une valeur intermdiaire entre les deux seuils doit tre suivi et est considr comme prsentant des dommages myocardiques .
Valeurs usuelles de la troponine le < 0,10 [Lgtl (Stratus SCS Dade Behring)
Dans les cas classiques d'infarctus du myocarde, le diagnostic peut tre affirm par l'association des signes cliniques et lectrocardiographiques qui suf-
fit dans un cas sur deux : le dosage des marqueurs cardiaques n'est alors pas ncessaire. Les protines sont relargues dans la circulation en fonction de leur poids molculaire et de leur localisation cellulaire. Les protines de faible poids molculaire et prsentes dans le cytosol sont les premires apparatre. L'intrt de la Tnic rside dans sa cardiospcificit. Aprs une priode initiale de 2 3 heures au cours de laquelle les taux plasmatiques restent normaux, on assiste l'lvation successive de la myoglobine (2-3 h) puis de la CK^g, de la troponine et des CK totales. Les taux reviennent la normale selon des dlais diffrents suivant les marqueurs, mais dans un ordre identique celui de leur lvation. La myoglobine a un retour la normale en 48 h. Le diagnostic d'exclusion d'IDM ne devrait jamais se baser sur les rsultats d'un prlvement unique. En cas de suspicion d'IDM, un seul test ngatif ne saurait en rien liminer le diagnostic. La probabilit de positiver les tests s'accrot avec le temps. la 9e heure, la probabilit est maximale. En pratique, le dlai entre le dbut des symptmes et l'arrive aux urgences tant variable d'un patient l'autre, deux marqueurs biochimiques doivent tre utiliss pour le diagnostic d'IDM : un marqueur prcoce (positif dans les 6 premires heures aprs la douleur) et un marqueur de certitude (positif dans les 6 12 heures mais hautement sensible et spcifique d'une lsion myocardique). L'arbre dcisionnel qui utilise le couple myoglobine-troponine est d'un grand secours puisqu'il allie la rapidit, grce la myoglobine, la spcificit de la troponine (figure 9.3).
CONFIRMATION
EXCLUSION
Confirmation < en accord avec le tableau clinique
(^-"""^ '*~^ Seuils de positivit
> Exclusion en accord avec le tableau clinique Tn le 1,5 ng/ml
Myo 85 ng/ml
Figure 9.3 Proposition d'un arbre dcisionnel pour confirmer ou exclure un infarctus du myocarde.
> REMARQUE
A dfaut de pouvoir dater prcisment le dbut des pisodes douloureux, tous les prlvements doivent se rfrer l'heure d'admission. Il est important de suivre la cintique des marqueurs cardiaques au cours de l'infarctus du myocarde (figure 9.4).
Cintique au cours de l'IDM
12
18
24
32
48
72
Temps aprs le dbut de la douleur
Figure 9.4 Cintique des marqueurs cardiaques au cours de l'infarctus du myocarde.
Comme les concentrations leves en Tnic peuvent tre dtectes dans le srum jusqu' 10 jours aprs l'infarctus, ce marqueur prsente un intrt dans le diagnostic rtrospectif des infarctus du myocarde, un rle jusque l tenu par la dtermination des LDH. La reperfusion est l'objectif thrapeutique essentiel en cas d'infarctus du myocarde ; elle doit tre ralise le plus rapidement possible, au mieux entre 6 et 12 heures aprs le dbut des douleurs. Cet objectif peut tre atteint par un traitement chimique (agent thromboly tique) ou physique (angioplastie). En permettant la recirculation coronaire, elle limite l'importance de la ncrose et diminue la mortalit de l'infarctus du myocarde. La Tnic joue aussi un rle important dans l'angor instable. Chez les patients admis aux urgences pour angor instable, la valeur de la TnIC permettrait un classement prcoce des malades. Une valeur seuil de 0,40 |Jig/l de Tnic est associe une prvalence de mortalit plus importante 42 jours (3,7 % contre 1,0 %). La mortalit est proportionnelle la valeur de la Tnic l'admission. L'augmentation de la Tnic au cours du suivi du malade est proportionnelle au risque de mortalit.
Dans les atteintes musculaires, alors que beaucoup de marqueurs cardiaques sont augments la troponine le reste le marqueur le plus spcifique. C'est aussi le cas de rhabdomyolyse d'origine septique, chez les polytraumatiss et chez les insuffisants rnaux. Le dosage de la Tnic a aussi t prconis : - dans le suivi de la cardiotoxicit chimio-induite par les anticancreux, - dans le diagnostic des contusions cardiaques, - dans l'ischmie myocardique observe au cours des tats septiques graves, - dans la slection des greffons prlevs en vue de la transplantation cardiaque, - dans l'hypothyrodie o la CK^ est frquemment augmente, la Tnic reste toujours infrieure la normale, - dans l'intoxication par le monoxyde de carbone, la valeur de la Tnic serait corrle l'augmentation de la carboxyhmoglobine. 1.3.3.4. Myosine La myosine est une protine myofibrillaire interagissant rversiblement avec l'actine durant la contraction musculaire. Elle est constitue de deux chanes lourdes et de deux chanes lgres. Les chanes lgres sont de deux types 1 et II et possdent plusieurs isoformes de structure molculaire diffrente. Cependant on ne connat pas d'isoformes du muscle cardiaque. La dtermination des chanes lourdes se fait par radioimmunologie, mthode longue et rserve des laboratoires spcialiss.. Il existe galement des mthodes immunologiques froides utilisant des anticorps anti-chanes lourdes et anti-chanes lgres.
2.
Exploration
L'exploration des protines plasmatiques est ralise par le dosage individuel de telle ou telle protine, par le regroupement de quelques dosages, sous le terme de profil protique, par l'lectrophorse qui peut tre faite sur des supports diffrents et enfin par l'tude ventuelle d'une protinurie.
2.1.
Dosages protiques
Ils concernent, soit la protinmie totale, soit des dosages individuels de protines plasmatiques.
2.1.1. Protidmie totale
Le dosage des protines ou protides totaux est extrmement classique. Il est effectu par la traditionnelle raction du biuret, plus ou moins modifie
pour s'adapter aux analyseurs biochimiques multiparamtriques ou par la simple rfractomtrie. Le taux normal est de 65 75 g/l. 2.1.2. Dosage de protines particulires .2.1.2.1. Dosages isols
1
Toutes les protines dont nous avons parl ci-dessus peuvent, bien sr, tre doses individuellement, par des mthodes immunomtriques maintenant automatises. Leur dosage est habituellement demand l'occasion d'un syndrome ou d'une maladie particulire. Ainsi, par exemple, la concentration de la srumalbumine, associe aux facteurs de l'hmostase, est-elle trs utile dans une insuffisance cellulaire hpatique. Sur le plan technique, diverses mthodes sont utilisables : - dosages turbidimtrique ou nphlmtrique laser aprs immunoprcipitation, - dosage radio-immunologique avec marqueur isotopique, - dosage avec marqueur froid : enzyme, compos fluorescent, compos chimiluminescent. 2.1.2.2. Profil protique C'est la reprsentation graphique des dosages de plusieurs protines, exprims en g/l ou mieux en pourcentage de la normale en fonction de l'ge et du sexe du sujet. Deux types de profils peuvent tre envisags : - Un profil largi, 8 ou 10 protines, dit d'orientation, comportant (figure 9.5) une srie de protines trs diffrentes en ce qui concerne leur origine, leur demivie, leurs fonctions ou leur rgulation. Ce type de bilan est destin mettre en vidence un maximum d'information biologique utile au diagnostic ou au dpistage de complications. Il sera toujours accompagn d'une lectrophorse. Les indications les plus frquentes sont relies aux situations suivantes : - dbrouiller des hypothses diagnostiques suggres par une VS acclre, une fivre prolonge, une altration inexplique de l'tat gnral, des algies diffuses avec ou sans syndrome inflammatoire clinique ; - caractriser la nature et l'tiologie d'une anmie ; - prciser la fuite protique en cas d'entropathie exsudative ; - mettre en vidence un dficit immunitaire au cours d'infections chroniques ou rcidivantes ; - Un profil minimum ou cibl, de 2 3 protines, destin essentiellement au suivi volutif d'un syndrome inflammatoire, d'une intervention chirurgicale, d'un tat de dnutrition profonde ou d'une hmolyse chronique.
Figure 9.5 Exemple d'un profil protique dans un tat inflammatoire intense.
(D'aprs P. Giraudet.) (3 = fraction C, du complment, a.G = Ot) glycoprotine acide ou orosomucode, Hap = haptoglobine, Trf = transferrine, Alb = albumine.
p2
Electrophorse des protines plasmatiques
2.2.2. Protinogramme L'lectrophorse consiste faire migrer et fractionner grce un champ lectrique, au sein d'un milieu variable et dans un tampon de pH dtermin, les protines spares par leur charge lectrique. A ct de la charge lectrique, interviennent aussi : - le courant liquidien, allant d'un bac l'autre pour compenser la perte de liquide par vaporation du fait de la chaleur provoque par le courant lectrique (effet Joule) ; | - la diffusion, les particules incluses dans le gel ayant tendance diffuser ' des rgions les plus concentres vers les moins concentres, ce qui gne la , bonne sparation des zones ; t - la taille des particules car charge gale, une molcule plus petite migrera plus vite. Cet effet de tamisage molculaire est surtout important pour les gels de polycrylamide. Le choix du support est maintenant essentiel. Aprs Tiselius et l'lectrophorse en veine liquide, le support a t trs longtemps le papier, remplac ensuite par la membrane d'actate de cellulose, puis le gel d'agarose qui permet une meilleure sparation et la dtection de protines monoclonales de faible concentration. Le gel d'amidon est d'un maniement dlicat ; par contre le gel de polyacrylamide a un trs fort pouvoir sparateur utile pour les lipoprotines et les apoprotines. La technique consiste dposer quelques microlitres de srum sur le support, choisir un tampon, qui est gnralement pH 8,6 auquel les protines s'ionisent comme des anions, migrant donc vers l'anode, laisser migrer durant un temps fonction du support : 15 25 minutes pour l'actate, 30 60 minutes pour le gel de polyacrylamide. Fixation et coloration sont, dans le temps suivant, habituellement faites avec le mme ractif. Cependant le colorant varie avec la nature des composants rvler. Pour le protinogramme standard les colorants les plus utiliss sont l'amidoschwarz, le vert de lissamine, le rouge Ponceau ou le bleu de Coomassie. Aprs transparisation du support, la lecture photodensitomtrique de la coloration de chaque bande donne le trac classique (figure 9.6) o apparaissent les 5 pics : Albumine, a? a^, p et y-globulines. L'intgration de la surface de chaque pic conduit enfin un pourcentage de chaque fraction, traduit aussi en gramme/litre si le taux des protines totales a t donn l'appareil.
Figure 9.6 Courbe lectrophortique normale avec les pourcentages des fractions et leur taux en g/1. 2.2.2. Immunolectrophorse et immunofxation L'analyse immunolectrophortique combine les principes de l'lectrophorse en glose des protines et de l'immunodiffusion. Aprs sparation des protines par le champ lectrique, on dpose les anticorps (immunsrum anti-protines plasmatiques humaines, ou immunsrums spcifiques de telle ou telle protine) dans une gouttire parallle l'axe de migration. La rencontre Ag-Ac se traduit, aprs la diffusion, par un arc de prcipitation. L'immunoHxation, (figure 9.7) plus rapide, plus performante et d'interprtation plus aise tend de plus en plus remplacer l'immunolectrophorse. L'lectrophorse des protines en gel d'agarose est suivie par une immunoprcipitation in situ des immunoglobulines avec des antisrums spcifiques de chaque isotype incubs la surface du gel. Cette technique est particulirement utile pour le typage des protines monoclonales : sur un mme gel six pistes du mme chantillon subissent l'lectrophorse puis cinq pistes sont recouvertes chacune d'un immusrum monospcifique (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-K, anti-\), la dernire piste tant mise en contact avec un ractif fixateur des protines pour servir de rfrence.
Figure 9.7 Exemple de trac en lectrophorse et en immunofixation.
2.3.
Etude de la protinurie
Au-del de la protinurie physiologique, infrieure 150 mg/24 h, la protinurie est pathologique et elle constitue un marqueur sensible et prcoce de toute affection rnale. Son tude apporte un complment non ngligeable au dossier clinique et biologique. En effet, d'une part la quantit de protines limines dpend de l'tiologie et de la gravit des lsions et d'autre part la nature de ces protines urinaires ainsi que leurs proportions renseigne sur la localisation de l'atteinte rnale, glomruiaire, tabulaire ou mixte. De plus, la recherche d'une protine de Bence Jones (PBJ) est importante pour le diagnostic ou la confirmation du diagnostic d'une dysglobulinmie monoclonale. Le dosage des protines urinaires, dtectes par la positivit de la bandelette spcifique, est toujours assez difficile car les mthodes sont nombreuses mais peu exactes ; les techniques rcentes au rouge de pyrogallol ou au bleu de Coomassie sont actuellement les plus recommandables. L'lectrophorse des urines est donc une mthode de choix car elle permet de visualiser toutes les protines prsentes mais elle ncessite parfois une concentration pralable, source d'erreurs non ngligeables. Aussi la mthode recommande est-elle l'lectrophorse haute rsolution (HR) qui permet, grce sa haute sensibilit, de fractionner les protines dans l'urine pure. Cependant en cas de protinurie modre, < 1 g/1, mme cette technique risque de laisser chapper une PBJ et il faut recourir alors l'immunofixation.
220____________________________________Biochimie clinique - L'tude qualitative de la protinurie permet de la dfinir, de la classer en fonction de son origine (tableau 9.4) : - Protinurie tabulaire, comportant peu d'albumine mais toutes les globulines du srum, dp a^, (3, y- Le marqueur tubulaire le plus classique est la ^^-microglobuline mais son augmentation peut rsulter d'une surcharge des rcepteurs tubulaires par accroissement de sa concentration srique et l'inverse une diminution de son taux urinaire peut tre simplement lie son instabilit pH acide. C'est la raison pour laquelle le dosage de la retinol binding protein ou RBP parat tre actuellement le meilleur reflet de l'atteinte tubulaire. - Protinurie glomrulaire slective faite de protines de bas poids molculaire, albumine surtout, dpassant 80 % mais aussi transferrine dans un net pic
P.
L'tude prcise de la slectivit de la protinurie, qui tait prcdemment complexe raliser par comparaison des clairances de la transferrine et de l'Ig G, est maintenant simple grce l'apparition de nouvelles trousses d'immunofixation renfermant des immunsrums dirigs contre les protines habituellement d'origine glomrulaire ou contre les protines d'origine tubulaire. De plus la dtection de faibles quantits d'albumine (microalbuminurie) peut tre ralise par l'emploi de bandelettes spcifiques associant de manire originale chromatographie et immunoenzymologie. Cela est particulirement intressant chez le diabtique dont la si frquente microangiopathie rnale s'exprimera rapidement par une microalbuminurie de l'ordre de 300 mg/24 h. C'est un marqueur de nphropathie dbutante dans le DID et un marqueur de risque vasculaire athrosclreux chez les DNID. Tableau 9.4 Classification d'une protinurie. Albumine Transferrine Ig G PM=69000 PM=77000 PM=150000 Protinurie physiologique Atteinte glomrulaire slective Atteinte glomrulaire non slective Atteinte tubulaire Atteinte mixte glomrulaire et tubulaire grces + + Traces + 0 + + 0 + Traces Traces ++ Traces + Microprotines 0 0 0 + +
Electrophorse des protines sriques
Protinogramme normal
re 9.8 Stratgie d'tude d'une protinurie.
Protinurie glomrulaire non slective, dans laquelle toutes les protines du plasma sanguin peuvent tre reprsentes. En pratique tous les types intermdiaires de protinurie peuvent s'observer et il n'y a d'ailleurs pas de paralllisme strict entre la slectivit de la protinurie et l'importance des lsions glomrulaires. La dtection d'une protine de Bence-Jones (PBJ) en lectrophorse simple (figure 9.8) ou en lectrophorse haute rsolution doit tre confirme par l'immunofixation en utilisant 3 immunsrums : anti Ig total (G, A, M, D et E), anti-K et anti-..
3.
Des hypo- et des hyperprotinmies peuvent tre rencontres. Les premires portent surtout sur la srumalbumine et les immunoglobulines. Les secondes atteignent exclusivement les globulines car l'hyperalbuminmie n'est que relative dans les tats d'hmoconcentration.
3.1
Hypoprotinmies
3.1.1. Hypoalbuminmies Elles sont provoques par des dfauts de synthse ou par des dperditions d'origine diverse. 3.1.1.1. Dfauts de synthse Ils sont nots au cours : - Des carences nutritionnelles par dfaut d'apport protique : kwashiorkor et marasme ; malabsorptions et maldigestions ; cachexie cancreuse. - Des atteintes hpatocellulaires graves : cirrhoses, ictres graves. - Des syndromes inflammatoires. - Des synthses anormalement leves d'autres protines, par mcanisme de comptition, au cours par exemple des dysglobulinmies monoclonales.
3.1.1.2. Dperditions
Ce sont, dans notre pays, les causes les plus frquentes. Perte rnale. Elle est trs importante lors des syndromes nphrtiques, (figure 9.9) associant :
Protines plasmatiques__________________________________223 - une fuite rnale d'albumine, d'orosomucode, de transferrine du fait de leurs faibles poids molculaires, produisant une protinurie parfois massive ; I - une hypoprotinmie avec hypoalbuminmie, responsable d'une chute de la pression oncotique, elle-mme cause des : - dmes blancs, mous, prenant le godet et donc typiquement rnaux. ' La glomrulite membraneuse responsable de ces dsordres entrane, suivant l'ge, deux types de syndrome : le syndrome nphrtique de l'adulte se compliquant volontiers d'insuffisance rnale et la nphrose de l'enfant classiquement de meilleur pronostic. Les tracs lectrophortiques sont trs vocateurs avec un effondrement du pic de l'albumine, une baisse gnralise de toutes les protines l'exception de l'o^-macroglobuline, responsable du pic en zone o^ et d'un pic en zone ? li la prsence de P-lipoprotines en excs. Perte digestive au cours des entropathies exsudatives dans lesquelles la fuite protique peut tre considrable mais difficile apprcier en raison de la protolyse par la flore bactrienne intestinale. Perte cutane dans les brlures tendues. 3.1.2. Hypogammaglobulinmies
Elles peuvent tre acquises ou congnitales.
PROTIDES TOTAUX : 54.0 G/L

A/G : 0.52 NOM ALBUMINE ALPHA 1 ALPHA 2 BTA GAMMA % 34.4 3.0 42.7 14.1 5.8 G/L 18.6 1.6 23.0 7.6 3.2
Sens de la migration
| Figure 9.9 Trac d'un protinogramme de syndrome nphrotique.
224__________________________________Biochimie clinique 3.1.2.1. Hypo- ou agammaglobulinmies acquises Les causes de diminution sont, comme ci-dessus pour l'albumine, les dperditions rnales ou digestives. Quant aux dfauts de synthse on peut les voir lors des syndromes d'puisement du systme immunoformateur ou lors des thrapeutiques immunosuppressives (corticodes, ciclosporine). 3.1.2.2. Hypo- ou agammaglobulinmies primitives D s'agit de dficits immunitaires spcifiques, touchant soit l'immunit cellulaire mdie par les lymphocytes T, soit l'immunit humorale et les lymphocytes B. On dcrit ainsi des dficits immunitaires combins svres, d'origine gntique souvent lis au sexe, et ne pas confondre avec les hypogammaglobulinmies transitoires de l'enfance. Dans ce dernier cas, trs frquent, caractris par des infections ORL et trachobronchiques rptition, il s'agit d'un simple retard de la synthse des immunoglobulines qui se corrigera aprs quelques injections de gammaglobulines ou spontanment, vers l'ge de 4 ou 5 ans. Le diagnostic sera fait, non sur l'lectrophorse ou l'immunolectrophorise, trop grossires, mais sur le dosage spcifique des Ig G, Ig A et Ig M dont on apprciera le taux en fonction de l'ge.
3.2.
Hyperprotinmies hyperglobulinmies
Les hyperprotinmies sont toujours des hyperglobulinmies. Celles-ci atteignent souvent plusieurs familles de globulines simultanment, et sont donc plus diffuses que les dysglobulinmies monoclonales trs localises aux immunoglobulines et un clone particulier de celles-ci. Nous distinguerons donc ces deux chapitres trs diffrents de la pathologie. 3.2.1. Hyperglobulinmies diffuses et polyclonales Elles s'observent trs frquemment dans des affections diverses et l'augmentation des globulines l'lectrophorse affecte soit plusieurs zones, soit la zone gamma exclusivement : - dans les infections aigus ou chroniques, dans les infestations parasitaires, on note une lvation concomitante des o^ et des "/-globulines. L'intensit de l'augmentation n'est pas proportionnelle l'intensit de l'infection ni la gravit de la maladie ; - dans les cirrhoses, l'lvation des (S- et -y-globulines en dos de chameau est trs caractristique. Elle est due l'augmentation des Ig A et Ig
Protines plasmatiques
________________________________225
M, qui dpasse celle des Ig G et qui se positionne l'lectrophorse entre les P- et les v-globulines ; b - l'augmentation isole des 'y-globulines se prsente l'lectrophorse comme ' une courbe arrondie et tale. Elle s'observe frquemment dans les infections, les maladies auto-immunes. les maladies allergiques et particulirement dans l'asthme o les Ig E sont augmentes slectivement. Outre les Ig E totales, des Ig E spcifiques d'un grand nombre d'allergnes peuvent tre doses. ' 3.2.2. Dysglobulinmies monoclonales Une dysglobulinmie monoclonale ou gammapathie monoclonale correspond la synthse d'une seule immunoglobuline par un clone cellulaire, d'origine lymphocytaire B ou plasmocytaire, en voie de multiplication anarchique. Elle correspond sur le trac lectrophortique une bande mince, troite et trs homogne, se traduisant sur la courbe densitomtrique par un pic aigu et troit, dit monoclonal, facile dceler. Plusieurs entits cliniques et biologiques sont bien dfinies : mylome plasmocytaire, macroglobulinmie, leucmies lymphodes chroniques, maladies des chanes lourdes et gammapathies bnignes enfin. 3.2.2.1. Mylome plasmocytaire ou maladie de Kahler Encore appel mylome multiple des os, c'est une plasmocytose mdullaire maligne d'une frquence non ngligeable. - La traduction clinique est souvent pauvre au dbut, avec des douleurs osseuses, une altration de l'tat gnral. - La radiologie montre classiquement des godes osseuses ou simplement parfois une dminralisation diffuse. - Les signes biologiques sont, par contre, trs vite vocateurs avec des signes sanguins, des signes urinaires et des anomalies de la moelle osseuse. Dans le sang, la vitesse de sdimentation est trs leve dpassant 100 ou 120 mm, la protinmie est augmente, parfois 100 ou 120 g/1, la calcmie galement par processus d'ostolyse. L'lectrophorse objective (figure 9.10) un pic monoclonal en zone gamma, l'immunofixation identifie une Ig G le plus souvent, parfois une Ig A ou D ou E. La protine anormale peut tre dose et ses chanes lgres identifies. Dans les urines, la prsence d'une protine de Bence-Jones dite thermosoluble, car elle prcipite aux alentours de 55 C et se redissout lorsque la temprature continue augmenter, est un bon lment en faveur de ce diagnostic. Elle est faite de dimres de chanes lgres K ou \ dont la synthse est excdentaire par rapport aux chanes lourdes. Son dpistage ncessite une lectrophorse des urines, concentres si ncessaire et un typage immunologique. Dans la moelle osseuse, la dcouverte de foyers mylomateux avec nappe plasmocytaire et cellules jeunes, de type plasmocytoblastes, signe le diagnostic.
PROTIDES TOTAUX : 113.0 G/L A/G : 0.46 NOM ALBUMINE ALPHA 1 ALPHA 2 BTA GAMMA 31.5 1.8 4.0 4.7 58.0 G/L 35.6 1.6 4.5 5.3 65.5 NORMES : % 61-69 1-4 6-10 7-13 11-18 33.5-52 0.5-3 3.3-7.5 3.8-9.8 6-13.5
Sens de la migration
Figure 9.10 Trac lectrophortique d'un srum de mylome avec pic monoclonal.
Le pronostic de la maladie n'est pas bon, la destruction osseuse tant rgulire et invalidante malgr la chimiothrapie. 5.2.2.2. Macroglobulinmie de Waldenstrm C'est une hmopathie maligne, comme le mylome, mais la protine monoclonale est une Ig M, expliquant le nom donn cette affection. Les signes cliniques sont voisins de ceux voquant la maladie de Kahler, si ce n'est l'ge, habituellement plus avanc, la prsence de ganglions, de troubles de la coagulation et d'une anmie. Les godes osseuses, l'emporte-pice, typiques du mylome, sont ici rares ou absentes. Les signes biologiques sont moins riches : Dans le sang, la protidmie leve est due la macroglobuline monoclonale, identifie par le dosage de cette fraction, par le pic en zone (3 de l'lectrophorse, par l'immunofixation. Dans les urines, la PBJ est beaucoup moins frquente. Dans la moelle osseuse, une infiltration lymphoplasmocytaire, ou rticulolymphode caractrise la maladie. 3.2.2.3. Maladies des chanes lourdes Ce sont des dysglobulinmies rares, dans lesquelles les plasmocytes monoclonaux ont perdu la facult d'associer normalement les chanes lourdes et lgres. Les chanes lourdes, compltes ou incompltes, circulent l'tat libre sous forme dimrise ou polymrise.
Il s'agit de chane a le plus souvent, rarement de chanes -y, exceptionnellement de chanes p.. La prsence de chanes lourdes a est volontiers note dans les lymphomes mditerranens observs chez des sujets jeunes du pourtour de la Mditerrane prsentant une diarrhe continue avec, l'lectrophorse du srum, une bande large anormale en zone 0(3 ou (3. l'immunolectrophorse l'arc Ig A est dform et paissi. 3.2.2.4. Gammapathies monoclonales bnignes Un pic monoclonal de type mylomateux est assez souvent dcouvert l'lectrophorse du srum de sujets gs. Le diagnostic de mylome est alors envisag mais la symptomatologie n'est pas complte et l'volution ne la voit se complter que dans 10 20 % des cas vers le mylome ou la maladie de Waldenstrm. Ces cas trs particuliers, qui ont reu le nom de dysglobulinmies bnignes, ncessitent cependant une surveillance rgulire de 3 mois en 3 mois pour apprcier la variation du taux de la protine anormale, Ig G le plus souvent. Une dysglobulinmie de ce type est parfois note l'occasion d'infections ou de parasitoses chroniques.
E
Aperu technologique sur les immunodosages
La raction immunologique, base sur la reconnaissance slective d'un antigne par son anticorps, a donn naissance, depuis quelques annes, un trs grand nombre de mthodes nouvelles. Celles-ci peuvent tre classes simplement en trois rubriques selon la manire dont on observe la raction antigne-anticorps.
|t.l.
|UU.
tude directe des effets de la raction antigne-anticorps

Mthodes de prcipitation
H.l.1.1. En solution II s'agit des mthodes trs classiques d'immunoturbidimtrie et d'immunonphlmtrie qui reposent sur les phnomnes de diffusion de la lumire dans un milieu trouble, du fait de la prcipitation antigne-anticorps. - La turbidimtrie est identique la photomtrie d'absorption car on value la diminution d'intensit de la lumire incidente lorsqu'elle traverse le milieu trouble, la lumire transmise tant mesure dans la mme direction que la lumire incidente.
La plupart des automates de biochimie sont donc capables d'effectuer ces mesures. - La nphlmtrie value la diffusion de la lumire sur les particules du milieu trouble, qui dpend de la taille des particules, de leur indice de rfraction, de la longueur d'onde de la radiation incidente, mise ou non par un laser. La lumire diffuse est mesure dans une direction diffrente de celle de la lumire incidente, avec un angle variable suivant les appareils du commerce. 4.1.1.2. Diffusion en gel L'immunodiffusion simple peut tre linaire (Oudin) ou radiale (Mancini). Dans l'immunodiffusion radiale, le diamtre de l'anneau de prcipitation est proportionnel la concentration de l'antigne et cette technique a t trs populaire. Immunodiffusion en gel aprs lectrophorse. U s'agit des techniques d'immunolectrophorse, simple ou bidimensionnelle, de l'lectro-immunodiffusion selon Laurell ou encore de l'immunofixation. Toutes ces techniques associent un temps lectrophortique une prcipitation immunologique secondaire par diffusion ou simultane dans la mthode de Laurell. Celle-ci, en effet, ralise la migration lectrophortique dans une glose imprgne d'anticorps, entranant la formation de pics ou rockets dont la hauteur, est proportionnelle la concentration de l'antigne soumis l'lectrophorse. 4.1.2. Mthodes d'agglutination Ces mthodes sont souvent anciennes et sont trs varies. Elles consistent revtir une particule (hmatie, grain de latex, micro-organismes) d'un antigne unique ou d'un complexe antignique ou d'un anticorps et observer l'agglutination produite par un ractif agglutinant lui-mme trs variable : anticorps, anticorps associ au complment, complment, antigne. L'observation de l'agglutination peut tre visuelle, photomtrique ou par comptage de particules. Un exemple typique de ces ractions est donn par les techniques de dtermination des groupes sanguins.
K Protines plasmatiques____________________________________229
L2. 1
tude de la raction antigne-anticorps grce au signal mis par un ractif marqu
HLU. Dosages en phase htrogne. Mesure de la distribution du ractif marqu ~ Les molcules de ractif marqu sont rparties en deux compartiments selon qu'elles sont ou non engages dans une raction antigne-anticorps. Il sera donc ncessaire d'avoir une tape de sparation physique pour ne conserver que les molcules marques lies, suivie d'une deuxime tape de mesure du signal. C'est donc bien la distribution du ractif marqu qui est tudie. Suivant la nature du marquage, on distingue : 4.2.1.1. Marquage isotopique La radio-immunologie combine la sensibilit des mesures radioactives la spcificit de la reaction immunologique. Dcrite pour la premire fois par Berson et Yallow en 1962 propos du dosage de l'insuline plasmatique, cette mthode (radio-immuno assay ou RIA) permet divers schmas ractionnels. ct du schma historique par comptition, on dcrit en effet des mthodes sandwich par double ou simple capture. Les techniques par comptition restent trs classiques. Leur principe est le \ suivant : Les antignes marqus et non marqus entrent en comptition vis--vis des sites anticorps. Aprs incubation de dure variable, l'antigne radioactif qui ne s'est pas fix sur les sites anticorps est spar des complexes antignes marqus -anticorps et limin. La mesure de la radioactivit de la fraction lie est faite dans un compteur adapt, gnralement y (cas de l'iode 125). L'isotope le plus utilis pour marquer antignes ou anticorps est en effet l'iode 125, metteur "y et de priode 60 jours. L'iodation des rsidus de tyrosine des peptides et protines est en effet relativement facile. Permettant de mesurer des concentrations de l'ordre du picogramme par ml, cette technique a permis d'innombrables progrs en physiologie et mdecine humaines. En France, cependant, elle n'est utilisable que par de rares laboratoires agrs, ce qui a considrablement limit son dveloppement. Le processus est reprsent simplifi dans la figure 9.11.
F
4.2.1.2. Marquage emymatique | Les mthodes immunoenzymologiques ou EIA pour enzymo-immuno 1 assay ont t les premires remplacer les RIA pour certains dosages. Ouvrant ainsi les techniques d'immunodosages en phase htrogne (ELISA ou enzyme-linked immunosorbent assay tous les laboratoires de biologie j clinique, l'immunoenzymologie a donc aussi un intrt historique.
Antigne + Anticorps + Antigne-125!
Complexe antigne-Anticorps Complexe antigne ^l-Anticorps
Sparation (forme libre-lie)
Mesure de la radioactivit lie dans un compteur y
Figure 9.11 Principe du dosage par comptition.
Comme pour la radioimmunologie en phase htrogne, une tape de sparation de l'Ag li l'Ac de l'Ag libre est obligatoire. La mthode sandwich, utilisable si l'Ag doser possde au moins deux sites antigniques est souvent employe. Les Ac en excs sont fixs sur une phase solide (comme la paroi du tube ractionnel) et ils fixent tous les Ag doser dans l'chantillon. Aprs lavage on incube en prsence d'un deuxime Ac marqu par une enzyme (conjugu) qui se fixe sur le deuxime site antignique. Un deuxime lavage limine le conjugu non li et l'on ajoute le substrat pour dvelopper la raction enzymatique, elle-mme observe par une raction colore facile mesurer. Les enzymes les plus utilises sont : - La peroxydase du raifort. Son substrat est l'ortho-phnylne diamine ou la trimthyl benzidine, en prsence d'eau oxygne. - La galactosidase d'E. coll. - La phosphatase alcaline d'intestin de veau ou d'E. coli. Le principe ractionnel est reprsent sur la figure 9.12. 4.2.1.3. Marquage par fluorescence Les techniques d'immunofluorescence (FIA ou fluorescence immunoassay ) sont bases sur la mesure de la fluorescence mise par le marqueur et permettent d'atteindre des seuils de dtection voisins de ceux de la radioimmunologie.
limination du srum
Raction colorimtrique Substrat Produit color
A8>.___ Chromogne j^(?"^ (ABTS)
-<
Figure 9.72 Schma ractionnel d'une technique enzymoimmunologique selon le principe sandwich (note d'information scientifique. Roche-Boehringer).
En phase htrogne, les mthodes sont identiques aux prcdentes. Les diffrents marqueurs fluorescents ou fluorochromes sont : - l'isothiocyanate de fluorescine ; - les rhodamines ; - les complexes base de lanthanides (europium ou terbium) qui ont une bande d'mission troite, un indice de Stokes (diffrence entre la longueur d'onde d'excitation et celle d'mission) lev et enfin une dure de vie d'mission longue de l'ordre de 50 1 000 [is, ce qui permet d'viter les interfrences dues au milieu biologique ; - les substrats enzymatiques fluorescents o la fluorescence n'est rvle qu'aprs hydrolyse enzymatique du compos marqu.
4.2.1.4. Marquage par luminescence La dtection consiste ici en la mesure de l'intensit du rayonnement lumineux mis par chimiluminescence, partir de molcules de synthse, ce qui le diffrencie du phnomne de bioluminescence intervenant chez certains organismes vivants. La lumire mise est issue d'une raction chimique exergonique, lorsque le produit final de la raction, oxyd, revient son tat fondamental. Les traceurs peuvent tre de deux types : - les traceurs directement luminescents sont des conjugus d'aminobutylisoluminol (ABEI) ou d'esters d'acridinium ; - les traceurs enzymatiques sont constitus par des drivs de couplage d'Ac ou d'analytes avec une enzyme implique dans une raction de chimi- ou de bioluminescence. Il s'agit d'une production de lumire due l'action d'une peroxydase sur le luminol ou grce au systme lucifrase-lucifrine de luciole, ATP dpendant et pouvant maintenant tre fourni par gnie gntique, en ce qui concerne la lucifrase, et par synthse chimique pour la lucifrine. 4.2.2. Dosages en phase homogne. Mesure par modulation de l'activit du ractif marqu Le ractif marqu va ici mettre un signal diffrent selon qu'il est engag ou non dans une raction antigne-anticorps. On observe donc une modulation du signal lie la raction Ag-Ac, qui peut s'apprcier sans qu'une sparation soit ncessaire, ce qui explique le nom de phase homogne. On peut donc thoriquement esprer de ces mthodes une meilleure adaptation aux appareils avec automatisation plus aise, ventuellement au prix d'interfrences plus gnantes et d'une sensibilit de dtection moins performante. 4.2.2.1. Marque enzymatique Dans ces techniques, o il n'y a pas d'tape sparative, l'anticorps, en se fixant sur l'Ag ou l'haptne marqu agit en mme temps sur l'activit de l'enzyme marqueur provoquant une augmentation ou une diminution d'activit. Chaque molcule d'Ag marqu rest libre aprs la formation des complexes Ag-Ac, catalyse la transformation de nombreuses molcules de substrat et il y a amplification de la raction. Cette technique est appele EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique). Les enzymes utilises ici sont : - le lysozyme du blanc d'uf ; - la glucose 6 phosphate dshydrognase ; - la malate dshydrognase.
' Protines plasmatiques__________________________________233
' 4.2.2.2. Marque fluorescente Les mthodes les plus classiques sont : - la mthode utilisant la protection de fluorescence avec deux Ac : l'un dirig contre l'Ag doser et l'autre dirig contre l'Ag marqu non li permettant sa neutralisation. - la polarisation de fluorescence (FPIA ou fluorescence polarization immuno assay ). Si l'on excite des molcules fluorescentes par une lumire polarise et si l'on mesure l'intensit de lumire fluorescente dans les directions parallle et perpendiculaire la lumire incidente, on dfinit un taux de polarisation de la lumire de fluorescence. Une dcroissance de la polarisation de fluorescence est observe lorsqu'il y a comptition entre l'Ag marqu et l'Ag non marqu pour les sites de liaison sur l'Ac et cela se prte aisment la mesure. 4.2.3. Techniques de localisation microscopique II s'agit de techniques trs particulires (immunoenzymologie cellulaire, immunofluorescence l'examen microscopique, analyse et comptage de particules fluorescentes par cytofluorimtrie de flux) rentrant dans le cadre des tudes microscopiques en anatomie pathologique ou parasitologie par exemple. Ces techniques ne seront pas abordes ici.
^
î
4.3.
Observation d'un effet biologique de la raction immunitaire
II peut s'agir de lyse cellulaire observe sur des hmaties, sur des lymphocytes, sur des micro-organismes ou sur des liposomes. Il peut aussi tre question de mobilit cellulaire tudie par exemple lors des tests d'immobilisation des spermatozodes ou du test d'inhibition de la migration des macrophages. Parfois ce sont des tudes de diffrenciation ou de modification cellulaires comme le test de transformation blastique des lymphocytes ou le test de dgranulation des polynuclaires basophiles. Le grand nombre de ces tests, leur dfaut de spcificit expliquent le manque d'engouement actuel pour ces analyses.
ASSIM (Association des Enseignants d'Immunologie des universits de langue franaise), Immunologie gnrale, Medsi/ Mcgraw-Hill, Pparis, 1991. J.P. Borel et Al., Comment prescrire et interprter un examen de biochimie, Maloine, Paris, 1984. M. Charrel, Smiologie biochimique. Ellipses, dition Marketing, Paris, 1991. Laboratoire Cerba, Les marqueurs tumoraux, Collection Quid Novi n 1, Cergy-Pontoise, 1988. R. Masseyeff, Propositions pour une classification et une terminologie de l'immunoanalyse. Instrumentation en biochimie clinique, commission Instrumentation de la SFBC, Expansion Scientifique Franaise, Paris, 1989. Professeurs et enseignants de biochimie, Ouvrage destin aux internes du DES de Biologie mdicale, tome 2, Toulouse, 1991. L. Stryer, Biochemistry, 4th dition, W.H. Freeman and Company, New York, 1995. G. Lefevre, H. Graine. Les nouveaux marqueurs de la ncrose cardiaque : aspects analytiques et diagnostiques. Option Bio, 24 juillet 1998. supplment au numro 211.212. G. Lefevre. Les troponines : aspects biologiques et cliniques. Annales de Biologie Clinique, 2000 ; 5 : 39-48.
10
Enzymes plasmatiques
France de La Farge
La mesure de l'activit des diffrentes enzymes du srum humain a pris depuis quelques annes une grande importance. Ces enzymes se trouvent normalement dans le srum en faible quantit et des taux bien dtermins. Ds qu'un organe ou un tissu est ls, il libre dans la circulation gnrale des enzymes qui lui sont propres. Par exemple, pour dterminer l'organe ls au lieu de faire une biopsie d'organe il est beaucoup plus facile et confortable pour le malade d'effectuer une prise de sang.
Origine musculaire
Origine prostatique
Figure 10.1 Origine des diffrentes enzymes prsentes dans le srum humain.
Les enzymes que l'on retrouve dans le srum proviennent du foie, du cur, du pancras, de la prostate et des muscles. L'intrt de la dtermination des enzymes est multiple : - il permet de dceler une maladie avant mme qu'elle ne soit cliniquement percevable ; - il permet de prciser l'organe ls ; - et enfin pour certaines enzymes leur taux est un bon marqueur de l'volution de la maladie. Les maladies molculaires font galement appel l'enzymologie. Ainsi, les dficits enzymatiques d'origine gntique peuvent-ils, bien entendu, tre dcels ou confirms grce aux mthodes gnrales de l'enzymologie. On exprime les activits enzymatiques en Units Internationales UI ou U/l. Une unit internationale correspond la quantit d'enzyme qui transforme dans des conditions optimales bien dfinies (temprature, pH, quantit de substrat), une micromole de substrat par minute.
1.
Classification des enzymes plasmattques
Le nom donn une enzyme est bas sur la spcificit d'action et de substrat. Il existe des rgles strictes de nomenclature. Dans un premier temps des noms proches de l'organe dans lequel on les trouvait, ont t utiliss. Ainsi la pepsine (enzyme du suc gastrique) vient de peptique, relatif la digestion. Ensuite on a ajout le suffixe ase au substrat qu'elles dgradaient : l'urase dgrade l'ure et l'uricase l'acide urique. Pour commencer rationaliser le nom des enzymes, on a tenu compte du nom du substrat et du type de raction auquel on ajoutait le suffixe ase . C'est le cas de : - la phosphofructo-kinase ; - la pyruvate-kinase ; - et de la L-lactate-dshydrognase par exemple. L'Union internationale de biochimie a un registre de toutes les enzymes, une numrotation et une classification officielle. Cette numrotation comprend 4 chiffres. Le premier dsigne la classe de l'enzyme qui dpend du type de raction catalyse : 1. Oxydo-rductases (transfrent des lectrons). 2. Transfrases (transfrent des atomes ou des groupes d'atomes). 3. Hydrolases (coupent des liaisons en ajoutant une molcule d'eau). 4. Lyases (coupent des liaisons : carbone - carbone ; carbone - oxygne par d'autres moyens que l'oxydation ou l'hydrolyse). 5. Isomrases (catalysent l'isomrisation).
pEnzymes plasmatiques_______________ _______
_____
237
6. Ligases (forment des liaisons entre un carbone et un mtallode en utilisant l'nergie fournie par l'hydrolyse d'une molcule d'ATP). Le second chiffre dsigne la sous-classe de l'enzyme, qui est dfinie selon le mcanisme de la raction. Ainsi par exemple, les dshydrognases transfrent des atomes d'hydrogne. Le troisime chiffre dsigne la nature de la molcule servant d'accepteur. Le quatrime enfin, reprsente le numro d'ordre de l'enzyme dans le sous groupe. Exemple : la L-lactate dshydrognase a pour numrotation : EC 1.1.1.27.
1.1. Enzymes spcifiquement plasmatiques

Les enzymes spcifiquement plasmatiques sont des composants habituels et fonctionnels du plasma. Elles sont prsentes un taux constant maintenu par la production active d'un ou plusieurs organes. Quelques exemples peuvent tre donns : 1.1.1. Cruloplasmine
La cruloplasmine est une enzyme d'oxydation portant du cuivre. Le cuivre y est fortement li et il est impossible de le sparer sans dnaturer la protine. Il y a 8 atomes de cuivre sur chaque molcule de cruloplasmine, ce qui lui confre la couleur bleue des sels de cuivre lorsqu'elle est purifie. Au cours de l'inflammation, l'interleukine 1 stimulerait de faon spcifique la transcription et la traduction de gnes codant principalement les protines plasmatiques de la phase aigu, donc de la cruloplasmine. Le taux sanguin de la cruloplasmine augmente rapidement dans l'inflammation. 1.1.2. Lipoprotine lipase Elle est produite, la surface de l'endothlium capillaire, par les cellules endothliales. Elle hydrolyse les trigycrides des chylomicrons et des VLDL, librant leurs acides gras. C'est le facteur clarifiant du plasma. 1.1.3. Enzymes de la coagulation et de lafbrinotyse Elles sont galement spcifiques du plasma o elles exercent leur fonction particulire dans la cascade ractionnelle de l'hmostase ou de la Hbrinolyse. Elles sont synthtises par le foie expliquant que, lorsque la capacit de syn; thse de l'hpatocyte diminue, l'activit plasmatique de ces enzymes diminue ssi. Leur dtermination fera partie de l'exploration fonctionnelle hpatique.
1.2.
Enzymes non spcifiquement plasmatiques
Ce sont des enzymes simplement vhicules dans le sang, n'ayant pas de fonction plasmatique vidente, et prsentes normalement un taux faible. On peut distinguer : 1.2.1. Enzymes d'excrtion Ces enzymes sont synthtises par des glandes exocrines. Citons par exemple les enzymes suivantes : - Phosphatase acide de la prostate ; - Phosphatase alcaline du foie ; - Amylase du pancras ; - Lipase du pancras. 1.2.2. Enzymes cellulaires Les enzymes cellulaires appartiennent tous les mtabolismes et leur nombre est considrable. Certaines ont une localisation trs particulire dans certains tissus. On peut ainsi identifier l'organe d'o proviennent les enzymes dont les taux sriques sont modifis. En comparant les rsultats obtenus pour les enzymes qui passent rapidement dans le plasma et qui ont une dure de vie courte (CK, TGO) et pour les enzymes qui ont une longue dure de vie et qui passent moins rapidement dans le srum (TGP et a HBDH), on peut dterminer la phase d'une affection aigu.
2.
2.1.
Problmes rencontrs en enzymologie clinique

Spcificit d'organe
L'idal serait de rencontrer pour chaque organe, une enzyme spcifique produite uniquement par cet organe. Ainsi l'omithine carbamyl transfrase (OCT) a une origine hpatique stricte et elle est donc un marqueur trs spcifique de l'atteinte de l'hpatocyte. Ce n'est malheureusement pas souvent le cas. Toutefois l'tude de la rpartition des isoenzymes dans diffrents organes permet de retrouver une meilleure spcificit d'organe. Ainsi, la L-lactate dshydrognase qui peut provenir du foie, du cur, des reins, des globules rouges, a une isoenzyme spcifique du cur, LDH 1 ou aHBDH. Son dosage prsente donc un grand intrt. De mme, la cratine kinase (CK), enzyme musculaire, possde une isoenzyme, la CK^g d'origine myocardique. Les enzymes libres dans le plasma sont ensuite catabolises ou limines.
Enzymes plasmatiques__________________________________239 La concentration srique d'une enzyme un moment donn dpend de l'quilibre entre deux facteurs : la libration cellulaire et le catabolisme de la protine. On peut donc dfinir une demi-vie dans le srum qui est variable d'une enzyme l'autre. Ainsi, aprs un infarctus du myocarde, le taux de la CK^g (demi-vie 12 15 h) se normalise plus vite que celui de l'oHBDH (demi-vie 50 120 h). Tableau 10.1 Demi-vie de quelques enzymes plasmatiques. TGO TGP LDH1(a HBDH) LDH5 CK Phosphatase alcaline ^GT Amylase Lipase 17 47 113 10 3 3 3 3 + + 5 heures 10 heures 60 heures j; 2 heures env. 15 heures 7 jours 4 jours 6 jours 6 heures
2.2.
Expression des rsultats
La vitesse d'une raction catalyse par une enzyme dpend de nombreuses conditions exprimentales : concentration en enzyme, nature et concentration du ou des substrats, temprature, pH, prsence d'activateurs. Les conditions idales pour la mesure d'une activit enzymatique ne devraient dpendre que de la concentration en enzyme. La mthode est alors dite optimise. Selon les mthodes conventionnelles utilises depuis des annes, avec des conditions ractionnelles non optimales, la comparaison des rsultats d'un laboratoire l'autre n'est gure possible. La modification des concentrations des substrats et des coenzymes, du tampon, du pH, de la temprature, ainsi que l'utilisation d'activateurs permettent d'obtenir des activits plus leves ; en mme temps on se rapproche de la condition requise dans la dfinition de l'unit internationale, en vue d'obtenir la meilleure standardisation possible. 2.2.1. Unit internationale Une unit internationale correspond la quantit d'enzyme qui catalyse la transformation d'une micromole de substrat par minute, dans des conditions optimales de concentration en substrat, de pH et une temprature dfinie. Dans les liquides biologiques, les rsultats sont exprims en units internationales (UI) ou en units par litre (U/l). Une nouvelle unit doit remplacer l'unit internationale, le katal.
240____________________________________Biochimie clinique Un katal dfinit l'activit catalytque permettant la conversion d'une mole de substrat par seconde dans les conditions opratoires dfinies ci-dessus. En pratique dans les liquides biologiques, on est amen retenir le nanoKatal. (1 U/l = 16,67 nKat/1). L'unit internationale, malgr son nom, ne rsout malheureusement pas tous les problmes. 2.2.1.1. Problmes de temprature En ce qui concerne la temprature, la Socit allemande de chimie clinique conseille 25 C, la Socit franaise de biologie clinique (SFBC) propose des normes 30 C et les tats-Unis 37 C. Il est important de noter les diffrences de valeurs usuelles obtenues en fonction de la temprature. Il existe toutefois des facteurs de conversion pour passer d'une temprature l'autre. Le tableau 10.2 montre les grandes diffrences obtenues en fonction des diffrentes tempratures. Tableau 10.2 Valeurs usuelles sriques obtenues pour quelques enzymes (en U/l) par des mthodes optimises diffrentes tempratures. Amylase Cratine Kinase 25 C 6-30 10-80 10-70 6-24 100-240 55-145 <3 30 C 7-37 15-130 15-110 8-33 140 - 330 70 - 190 <;5 =7 145-950 80-220 37 C 10-55 25-195 25-170 11-43 200-480 80 - 220
2=9
Homme Femme
^GT LDH ccHBDH 5' Nuclotidase Phosphatases acides Phosphatases alcalines Enfant Adulte 2.2.1.2. Problmes de substrat
S 10 180-1 200 100-290
110-720 60-170
Nous prendrons comme exemple les phosphatases alcalines pour montrer que l'activit enzymatique d'une mme enzyme est trs diffrente d'un substrat l'autre. De nombreuses mthodes, utilisant diffrents substrats, ont ainsi vu le jour et donn des rsultats exprims en units suivies du nom de l'auteur qui avait propos la technique (exemple : mthode de Bodansky, exprime en units Bodansky).
Enzymes plasmatiques__________________________________241
La technique de Bodansky utilise le p-glycrophosphate comme substrat. Aprs coupure du glycrol et du phosphate par la phosphatase alcaline, on termine par un dosage du phosphate 37. Les valeurs usuelles sont alors 1 4 units Bodansky, ce qui correspond 18 et 27 U/l. La technique de King et Armstrong utilise le phnylphosphate 37 comme substrat et dose le phnol form. Les valeurs usuelles, selon King et Armstrong, sont de 4 12 U K.A., dont la correspondance avec les U/l est donne dans le tableau 10.3.
Tableau 10.3 Correspondance des units Bodansky, King Armstrong et Bessey Lowry en U/l. Mthodes utilises Mthodes optimises Bodansky King Armstrong Bessey Lowry Valeurs usuelles 30-126 U/l 1-4UB 4-12 UKA 1,2-UBL Valeurs usuelles transformes en U/l 30-126 U/l 18-27 U/l 10-46 U/l 30-100 U/l
La mthode de Bessey Lowry a pour substrat du paranitrophnylphosphate qui sera transform par la phosphatase en paranitrophnol dont on dosera la coloration jaune au spectrophotomtre. Le tableau 10.3 montre bien que l'expression des rsultats en U/l n'apporte aucune standardisation si la technique utilise n'est pas mentionne. 2.2.2. Principe gnral de la mesure d'une activit Pour dterminer l'activit enzymatique d'une enzyme on utilise la raction catalyse par l'enzyme et l'on dose la quantit de produit form ou la quantit de substrat dtruite au cours d'un temps dtermin (la minute). Nous pouvons pour cela utiliser des mthodes colorimtriques en point final comme c'est le cas dans la mthode Bodansky ou bien utiliser la cintique d'apparition du produit comme dans la mthode de Bessey Lowry. Enfin bien souvent, on essaie d'introduire un coenzyme nicotinique, soit dans une raction directe, comme c'est le cas pour la dtermination de la lacticodshydrognase (LDH), soit en utilisant une cascade de ractions afin de terminer par une raction utilisant le couple NAD"1", NADH.H4' ce qui est le cas de la dtermination de l'aspartate amino-transfrase (AS AT), ou le couple NADP4", NADPH,H'1' pour la dtermination de l'activit catalytique de la cratine kinase (CK).
242__________________________________Biochimie clinique 2.2.2.1. Mthode calorimtrique en point final Exemple : phosphatases alcalines dtermines par la mthode de Bodansky. Les phosphatases alcalines agissent sur le (3 glycrophosphate pour le transformer en glycrol et acide phosphorique. Le dosage en point final des phosphates produit une coloration proportionnelle la quantit de phosphatases alcalines dans le srum. 2.2.2.2. Mthode calorimtrique en cintique Exemple : phosphatases alcalines dtermines par la mthode de Bessey Lowry. Cette mthode peut tre ralise aussi bien en point final qu'en cintique. Elle utilise la raction suivante, en milieu alcalin : Paranitrophny phosphate + HÔ os^ a> paranitrophnol + acide phosphorique La vitesse de formation du paranitrophnol est proportionnelle la quantit d'enzyme dans le srum. 2.2.2.3. Dtermination de l'activit aspartate 2 oxoglutarate aminotransfrase TGO ou ASAT (aspartate aminotransfrase) selon les recommandations de la SFBC Les deux ractions suivantes sont couples :
T/~^/~\
1) L-aspartate + a-ctoglutarate <> oxaloactate + L-glutamate 2) Oxalaoactate + NADH^ <

MDH
> L-malate + NAD-^
MDH = Malate dshydrognase. a-ctoglutarate = 2 oxoglutarate Deux temps peuvent tre distingus : - mise en temprature des ractifs et limination des ractions parasites (ici consommation de l'oxaloactate prsent dans l'chantillon) ; - dclenchement de la raction par addition de 2 oxoglutarate et mesure de la vitesse de diminution de l'absorbance 340 nm (cintique dcroissante) aprs que l'quilibre entre les deux ractions ait t atteint. Les mthodes cintiques utilisant le couple NAD"1', NADH, H"1" sont aujourd'hui trs employes en chimie clinique pour dterminer des activits enzymatiques. 2.2.3. Standardisation des mthodes de mesure d'activit enzymatique L'utilisation des mthodes recommandes par la Socit franaise de biologie clinique (SFBC) pour mesurer la concentration catalytique des diffrentes
Enzymes plasmatiques____________________________________243
enzymes dans le srum doit contribuer l'amlioration des rsultats en permettant une meilleure prcision et conduire une apprciation standardise de la concentration catalytique de ces enzymes dans les laboratoires de biochimie clinique. L'idal serait que tous les laboratoires utilisent le mme substrat, les mmes activateurs de reaction, le mme pH et la mme temprature. ce moment-l seulement les rsultats pourront tre compars.
p.
3.1.
Principales enzymes d'intrt clinique

Phosphatases
Les phosphatases sont des phosphomonestrases qui coupent la liaison ester phosphorique par hydrolyse en librant de l'acide phosphorique. Ainsi par exemple : <"n f - i- * TT -r-> , ., Glucose 6-Phosphate + PLO <"> Glucose r6 phosphatase glucose + acide I phosphorique |i r Le pH optimum de ces phosphatases varie selon l'origine organique de l'enzyme. Il existe dans le srum deux types de phosphatases. Les phosphatases qui agissent pH acide et les phosphatases qui agissent pH alcalin. Cela explique leur dnomination. 3.1.1. Phosphatases alcalines 3.1.1.1. Rle Les phosphatases alcalines sont des enzymes dimriques de type mtalloglycoprotique. Ce sont des phosphomonoestrases de type I, leur activit optimale est comprise entre pH 7,5 et pH 9,6. Ces enzymes se trouvent dans de nombreuses cellules en particulier dans les zones de croissance des os, la muqueuse intestinale, le rein, le foie, le cerveau, les leucocytes. Leur limination se fait par la bile. ! 3.1.1.2. Valeurs usuelles L - Adultes: 30 125 V f l . r - Enfants : 110 400 U/l (technique au paranitrophnylphosphate, cintique 37).
244____________________________________Biochimie clinique 3.1.1.3. Variations pathologiques Des augmentations des phosphatases alcalines sont observes dans les affections hpatiques et les affections osseuses.
> AFFECTIONS HPATIQUES
L'augmentation des phosphatases alcalines est un signe de cholestase. Tout ictre avec un taux de phosphatases alcalines normal doit faire penser une cirrhose, une hpatite ou une hmolyse. L'volution du taux de bilirubine est diffrente de celle des phosphatases alcalines. La dissociation phosphatases alcalines leves et bilirubine normale est un signe de cancer secondaire du foie. En revanche, lorsqu'un ictre se traduit par une forte augmentation des phosphatases alcalines et une augmentation modre du taux des transaminases, il faut penser un ictre par rtention. Les phosphatases alcalines sont augmentes dans les cancers primitifs du foie et lors des calculs des voies biliaires.
^- AFFECTIONS OSSEUSES
Les phosphatases alcalines sont augmentes dans les affections suivantes : - La maladie de Paget. Les taux de phosphatases alcalines peuvent tre 20 30 fois plus levs que la normale. Cette indication est importante au dbut de la maladie lorsque les signes radiologiques ne sont pas encore visibles. - Les ostomalacies et le rachitisme. - Les tumeurs osseuses. - Les leucoses et la maladie de Hodgkin. On note par contre une hypophosphatasmie dans les maladies suivantes : - Les hypophosphatasmies congnitales. - L'hypoparathyrodie. - L'ictre hmolytique. 3.1.1.4. Dtermination de l'activit enzymatique des phosphatases alcalines Les phosphatases alcalines catalysent l'hydrolyse du paranitrophnylphosphate (PNPP) en paranitrophnol et acide phosphorique. Le paranitrophnol (PNP) de coloration jaune est libr proportionnellement l'activit de la phosphatase et est mesur par photomtrie en milieu alcalin.
La diffrenciation des activits d'origine osseuse et d'origine hpatique peut se faire en utilisant la thermosensibilit de la fraction osseuse 56 C pendant 10 minutes.
Enzymes plasmatiques__________________
245
3.1.2. Isoenzymes des phosphatases alcalines La sparation des isoenzymes des phosphatases alcalines est particulirement difficile. Elle se fait habituellement par lectrophorse qui diffrencie difficilement les fractions hpatiques des fractions osseuses. Seul le support IsoPAL permet de les sparer selon le schma de la figure 10.2.
H1
Os
Figure 10.2 lectrophorse des isoenzymes des phosphatases alcalines

A = diverses fractions thoriques. B = trac l'tat normal.
La rpartition physiologique des isoenzymes chez. un individu sain est la suivante : - fraction osseuse 50 70 % ; - fraction hpatique 30 50 %. Ces deux fractions sont les plus importantes ; - fraction intestinale 0 20 %. Cette fraction est inconstante. L'enfant a, jusqu' l'adolescence, une prdominance de l'isoenzyme osseuse qui peut atteindre 90 % et qui va, bien entendu, de pair avec l'lvation physiologique du taux des phosphatases alcalines sriques. Les diffrentes formes retrouves dans le srum sont codes par trois gnes diffrents. 3.1.2.1. Isoenzymes normalement prsentes dans le plasma humain Ces isoenzymes sont constitues essentiellement de la forme hpatique H, et de la forme osseuse, codes par un gne aspcifique que l'on retrouve dans l'os et dans le foie. Une troisime forme macromolculaire (appele encore fraction hpatique rapide, biliaire, extra-hpatique ou H^) correspondrait des molcules de phosphatases alcalines, associes des fragments de membrane hpatique. Cette isoforme a des mobilits lectrophortiques variables, selon le support : elle peut tre trs rapide sur actate de cellulose, et beaucoup plus lente sur agarose (d'o sa terminologie diffrente). Sa prsence est significative d'une pathologie qui
246__________________________________Biochimie clinique peut tre non cancreuse (cholestase) ou cancreuse avec ou sans mtastase hpatique. 3.1.2.2. Isoenzyme d'origine intestinale L'isoenzyme intestinale est code par un gne s'exprimant dans l'pithlium intestinal. Cette forme est exempte d'acides sialiques, et prsente chez 15 20 % des individus, plus particulirement ceux dits scrteurs des groupes sanguins 0 et B. On peut trouver jusqu' trois fractions sur support d'agarose. 3.1.2.3. Isoenzyme d'origine placentaire Habituellement absente chez les sujets normaux, cette isoenzyme placentaire est trouve dans le placenta de la femme enceinte partir du 4e mois de la grossesse et jusqu'au terme. On peut retrouver une forme placentaire associe (dite placenta], like PALP) dans le srum de certains patients cancreux (cancers de l'ovaire, du col de l'utrus, du poumon). Elle est appele isoenzyme de Regan. Une autre forme associe ou isoenzyme de Nagao a t trouve dans certaines tumeurs (testicule, thymus). Ces deux dernires formes pathologiques se diffrencient de la fraction placentaire par leurs proprits immunologiques. Il existe enfin une autre forme dite intestinale ftale. C'est une enzyme htromre qui s'exprime au niveau de l'intestin du ftus jusqu' 25 et mme 32 semaines de gestation (et peut-tre dose dans le liquide amniotique). Elle est compose de deux isoformes d'origine intestinale et placentaire. Elle possde donc les proprits biochimiques la fois des isoenzymes intestinale et placentaire. 3.1.3. 5' nuclotidase
La 5' nuclotidase a une localisation hpatique prpondrante bien qu'on puisse la retrouver dans beaucoup d'autres tissus. Dans l'hpatocyte, elle se trouve au niveau des membranes, fonctionne pH alcalin et a pour substrat les nuclotides phosphoryls en position 5' du pentose. Les valeurs usuelles sont infrieures 9 Vil. Cette enzyme est spcifique de la pathologie hpatobiliaire. Elle augmente au cours des cholestases intra ou extra-hpatiques. Une dissociation entre les phosphatases alcalines leves et un taux normal de 5' nuclotidase oriente vers une affection d'origine osseuse. Dans ce cas la sparation lectrophortique des isoenzymes de la phosphatase alcaline permet de lever l'ambigut.
Enzymes plasmatiques_______________________________247
3.1.4. Phosphatases acides 3.1.4.1. Rle Les phosphatases acides sont des phosphomonoestrases de type II, leur activit optimale se trouve comprise entre pH 4,5 et pH 6. Les phosphatases acides se trouvent dans les tissus suivants : prostate, foie, rein, rate, globules rouges. Le taux srique des phosphatases acides totales n'est gure diffrent chez l'homme et chez la femme, ce qui prouve qu' l'tat normal la phosphatase acide d'origine prostatique passe peu dans le srum. L'activit phosphatasique acide du srum provient surtout des rythrocytes ou des os. 3.1.4.2. Valeurs usuelles Phosphatases acides totales : 2 10 VU. Phosphatase acide prostatique : < 3,5 VU (Technique au p. nitrophnylphosphate, cintique 37 C). Elle est dtermine de faon indirecte aprs inhibition de son activit par le tartrate pH 5 ou par dosage spcifique immunologique. 3.1.4.3. Variations pathologiques Les phosphatases acides augmentent fortement dans les cancers de la prostate en particulier avec mtastases osseuses. Cependant leur manque de spcificit leur fait prfrer d'autres marqueurs : ainsi actuellement le marqueur PSA (antigne spcifique de la prostate) est plus intressant ; il permet parfois de dceler une pathologie tumorale avant que la clinique ne puisse le faire (cf. Marqueurs tumoraux, chapitre 9).
3.2
Transaminases
Les transaminases permettent le transfert du groupement amin d'un acide amin sur un acide a ctonique. L'acide amin est alors transform en acide a ctonique correspondant et l'acide a ctonique en acide amin. Les deux principales ractions de transamination sont catalyses par les transaminases TGO ou ASAT et TGP ou ALAT. 3.2.1. Transaminase glutamo oxaloactique ou L-aspartate : 2 oxoglutarate aminotransfrase 3.2.1.1. Rle i La transaminase glutamo-oxaloactique ou TGO ou ASAT (aspartate aminotransfrase) catalyse la raction suivante :
La TGO est essentiellement prsente dans le cur, mais on la trouve aussi dans le foie, le rein et les muscles. 3.2.1.2. Valeurs usuelles 5 40 U/l (Cintique UV 37 C). 3.2.1.3. Dtermination de l'activit enzymatique de la TGO Les mesures sont effectues l'aide de ractions couples pour permettre l'utilisation du coenzyme NADH,H"1", dont on mesure la diminution d'absorbance. La TGO catalyse la reaction :
T'/"1/"^
L-aspartate + 2 oxoglutarate > oxalo actate + L-glutamate cette raction est couple avec la raction suivante : Oxalo actate + NADH + H+ MDH) L-malate + NAD-^. La vitesse d'oxydation du NADH est proportionnelle l'activit catalytique de la TGO. Elle est dtermine par mesure de la diminution de l'absorbance 340 nm. 3.2.2. Transaminase glutamo-pyruvique ou alanine amino-transfrase 3.2.2.1. Rle La transaminase glutamo-pyruvique (TGP) est encore appele alanine amino transfrase (ALAT). Elle est essentiellement prsente dans le foie mais on la trouve aussi dans le cur, le rein. La TGP catalyse la raction suivante : TGP Acide glutamique + acide pymvique > acide a ctoglutarique + alanine. 3.2.2.2. Valeurs usuelles 5 55 U/l (Cintique UV 37 C). 3.2.2.3. Dtermination de l'activit enzymatique de la TGP l'exception de la temprature, les diffrentes socits scientifiques, SFBC (Socit franaise de biologie clinique), IFCC (International fdration of clini-
Enzymes plasmatiques________________________________249
cal chemistry societies) et SSCC (Socit suisse de chimie clinique) recommandent les mmes conditions de ractions. Les ractions sont toujours couples afin de permettre l'utilisation du NADH:
La vitesse d'oxydation du NADH est proportionnelle l'activit catalytique de la TGP. Elle est dtermine par mesure de la diminution d'absorbance 340 nm.
3.2.3. 3.2.3.1. Variations pathologiques des transaminases Affections cardiaques
La mesure de l'activit des transaminases est trs utile pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde. L'valuation de la TGO y est la plus importante. Mais, bien que la TGP ait un rle moins grand puisque d'origine principalement hpatique, une augmentation de la TGP et de la TGO donne une indication du degr de l'atteinte hpatique ventuelle, pouvant tre conscutive une insuffisance cardiaque post-infarctus. Lors d'un infarctus du myocarde, l'augmentation de la TGO commence la e 6 heure, se poursuit jusqu' la 36e heure et retourne la normale au bout de 5 6 jours. On trouve galement une augmentation des TGO dans les embolies pulmonaires et les infarctus rnaux.
f 3.2.3.2. Affections hpatiques
Dans les affections hpatiques, la demande d'analyse n'est pas limite une transaminase mais aux deux, TGO et TGP. Dans les hpatites aigus, l'augmentation des TGO mais surtout des TGP commence avant mme que l'ictre ne soit dclar. L'augmentation du taux des TGP signe en e f f e t une cytolyse hpatique qui permet de suivre l'volution de la maladie et une rechute ventuelle. Jl' L'augmentation des transaminases est le seul signe biologique des hpatites anictriques. Dans les hpatites chroniques, l'augmentation des transaminases est modre, elle traduit l'atteinte parenchymateuse par ncrose cellulaire. Les obstructions des voies biliaires provoquent une augmentation modre des transaminases. Le retour la normale est rapide.
33.
Lactate dshydrognase
3.3.1. Rle La lactate dshydrognase (LDH) est prsente dans de nombreux organes, cur, foie, muscle, rein. Elle catalyse la raction suivante : Acide pyruvique + NADH,H'1' <> acide lactique + NAD'1'. 3.3.1.1. Valeurs usuelles 200 600 VU (cintique UV 37 C par la mthode des plaques LDH Vitros, lecture 340 nm). De trs nombreuses mthodes donnent des valeurs physiologiques des LDH infrieures 250 U/l, tout en utilisant aussi des cintiques 37 C avec lecture 340 nm. Nous retrouvons ici toute l'importance de la standardisation de la mesure des activits enzymatiques. 3.3.2. Variations pathologiques 3.3.2.1. Affections cardiaques Lors d'un infarctus du myocarde, l'augmentation du taux de LDH dbute la 10 heure, atteint son maximum de la 48e heure la 72e heure, le retour la normale s'effectuant en 15 jours.
e
T DT-T
3.3.2.2. Affections hpatiques
Les valeurs des LDH augmentent beaucoup au cours des hpatites. Le taux est galement trs lev dans les ictres prhpatiques. L'augmentation est importante dans les ictres hmolytiques. Dans les mtastases hpatiques des cancers on constate une forte augmentation du taux des LDH. Les LDH augmentent galement dans les intoxications aigus graves avec hpatonphrite, dans les tumeurs en gnral.
3.3.2.3. Anmies
L'anmie pernicieuse prsente des valeurs extrmement leves de LDH pouvant atteindre 8 000 10 000 U/l. Les anmies hmolytiques prsentent des taux de LDH moins levs de 1 000 2 000 U/l. Lors des derniers mois de la grossesse et au moment de l'accouchement, on peut remarquer une augmentation du taux des LDH qui revient rapidement la normale.
3.3.3. Dtermination de l'activit enzymatique de la lactate dshydrognase Nous avons dj vu plusieurs fois cette raction qui est souvent couple d'autres pour dterminer les activits d'autres enzymes. Ici la raction est directe : Pyruvate + NADH.H-^ <> L-lactate + NAD+ La vitesse initiale d'oxydation du NADH est proportionnelle l'activit catalytique de la LDH. Elle est dtermine par mesure de la diminution d'absorbance 340 nm.
T DH
3.4.
Isoenzymes des LDH
La lactate dshydrognase srique possde cinq varits d'isoenzymes diffrentes qui peuvent tre spares par lectrophorse du srum sur actate de cellulose. Ces isoenzymes rsultent de l'association quatre par quatre de deux types de protomres (A et B). LDH, = 84 LDH^ = A^ LDH3 = A^ LDH4=3Bi LDHg = A4. Chaque isoenzyme a un poids molculaire voisin de 140 000 Da et chaque monomre un poids molculaire de 35 000 Da. 3.4.1. tude lectrophortique globale l'lectrophorse les 5 isoenzymes sont spares suivant leur vitesse de migration en LDH,, LDH^, LDHg, LD^ et LDH:5. La LDH, est la plus rapide. La rpartition de ces isoenzymes varie selon les tissus. La LDH, prdomine dans le cur alors que la LDHc prdomine dans le foie et dans les muscles squelettiques. L'valuation quantitative de chaque varit d'isoenzymes est intressante en clinique, car l'atteinte d'un organe entranera le passage dans le srum du type d'isoenzyme qu'il contient. Les pourcentages de chacun des isoenzymes de LDH observs dans le srum humain sont les suivants : LDH, = 20 % LDH;, = 40 % LDH3 = 20 % LDH4 = 10 % LDHs = 10 %.
^^__________________________________Biochimie clinique
Lors d'un infarctus du myocarde on trouve surtout dans le srum de la LDH^ d'origine cardiaque, qui reprsente alors environ 50 % (figure 10.3). Lors d'une hpatite infectieuse on constate une augmentation de la LDHc, pouvant atteindre 50 %. Dans les myopathies la LDHg n'est pas prsente car la biosynthse ne se fait pas, cause d'un dficit gntique. 3.4.2. a-hydroxybutyrate dshydrognase a HBDH L'a-hydroxybutyrate dshydrognase est l'isoenzyme rapide de la LDH, LDH), ou B4, spcifique du myocarde. Elle catalyse la dshydrognation de l'a-hydroxybutyrate, utilisant directement les coenzymes nicotiniques. a hydroxybutyrate + NAD"*" <> a ctobutyrate + NADH, H"1". L'a-HBDH prsente dans l'infarctus du myocarde une augmentation qui dbute la 12e heure et son maximum est compris entre la 30e et la 72e heure.
Figure 10.3 Courbe lectrophoretique des isoenzymes des LDH, avec les pourcentages de chaque isoenzyme, d'un srum de malade prsentant un infarctus du myocarde.
3.5.
15.2.
Cratine kinase
Rle
La cratine kinase ou CK est une enzyme d'origine musculaire, myocardique et crbrale qui catalyse le transfert d'un phosphate de l'ATP sur la cratine, permettant ainsi le stockage d'nergie en vue de la contraction musculaire. Cratine+ATP <> Cratine Phosphate + ADP. Rappelons que ce phosphagne ou cratine phosphate participe activement la contraction musculaire en tant que fournisseur de deuxime rang pour l'ATP ncessaire. Le premier rang est l'ATP prsent sur les fibres de myosine en contact avec l'actine et le troisime rang est l'ATP fabriqu par la glycognolyse et la glycolyse.
3.5.2. Valeurs usuelles CK
40 290 Vil (Cintique UV 37 C).

3.5.3. Variations pathologiques
Dans l'infarctus du myocarde l'lvation du taux de CK est trs prcoce (ds la 3e heure) pour atteindre son maximum entre la 24e et la 36e heure et revenir la normale en 3 ou 4 jours. Dans les myopathies, l'augmentation est importante ds le dbut de la maladie. Le dosage de la CK est intressant pour dpister les jeunes filles htrozygotes (porteuses du gne), qui sont susceptibles de transmettre la tare hrdi; taire. Leur taux de CK est en effet toujours suprieur celui d'une population fminine du mme ge. On peut observer une lgre augmentation de la CK en fin de grossesse et au moment de l'accouchement. Les taux redeviennent rapidement normaux. 3.5.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la cratine kinase L'ensemble des ractions suivantes permet de dterminer l'activit de la cratine kinase : Cratine phosphate + ADP <> cratine + ATP. ._,, , hexokinase . _ _ - , , ATP + D glucose <> ADP + glucose 6 phosphate. G.PDH Glucose 6 phosphate + NADP1" <"> gluconate 6 phosphate + NADPH, H"*". GgPDH = Glucose 6 phosphate dshydrognase.
CK
La vitesse de formation du NADPH est proportionnelle l'activit catalytique de la CK. Elle est dtermine par mesure de l'augmentation d'absorbance 340 nm.
3.6.
Isoenzymes de la CK
La CK est une enzyme dimrique compose de deux sous-units polypeptidiques : M (muscle) et B (brain = cerveau) qui forment en s'associant trois isoenzymes : CKgg ou CKp CK^g ou CK^ et CK,^ ou CKg. Ces isoenzymes sont trouves chez le sujet normal dans des proportions diffrentes selon les tissus : le cerveau renferme pratiquement 100 % de CKgg, les muscles squelettiques environ 96 % de CK^[ et 4 % de CK^g, le myocarde 60 % de CK^M et 40 % de CK^g. De petites quantits de ces isoenzymes sont galement observes dans d'autres tissus, comme le tractus gastro-intestinal ou dans divers organes parenchymateux : utrus, prostate, rein, foie. 3.6.1. CK^g Le principal intrt de cette tude rside dans le dosage de la CK^g ou CKy trs utile pour aider au diagnostic d'un infarctus du myocarde, pour distinguer un infarctus d'une embolie pulmonaire (dans le cas de l'embolie pulmonaire, la CK totale est leve mais l'isoenzyme MB est normale), pour surveiller l'volution d'une ncrose myocardique ou enfin l'tat du myocarde aprs chirurgie cur ouvert. 3.6.1.1. Valeurs usuelles 6 16 U/l (cintique UV 37 C). 3.6.1.2. Dtermination de la CK^y La CK>.g se compose des sous-units CK^[ et CKg. L'utilisation d'anticorps spcifiques permet l'inhibition immunologique des sous-units CK^. L'activit restante ou activit CKg qui correspond la moiti de l'activit CK^g est alors dtermine selon la mthode optimise traditionnelle. Cette mesure n'est valable que dans le cas o il n'y a pas de traumatisme crnien ou de tumeur crbrale, car normalement le srum humain ne possde pas de CKgg et toute augmentation de la CKg provient bien de la CK^g. 3.6.1.3. Dtermination de la CK^g massique La CK,g massique fait partie des nouveaux marqueurs de la souffrance cardiaque, elle possde une activit enzymatique mais elle est dtermine de faon
pondrale et non cintique grce l'utilisation d'anticorps monoclonaux. Les rsultats sont alors exprims en ug/1. Ces tests ont augment les performances de la CK^g et sont prfrables la dtermination de la CK^g activit. Valeurs usuelles : infrieures 7 fig/l.
3.7.
Isoformes de la CK
Les isoenzymes MM et MB de la CK sont elles mmes htrognes et prsentent des isoformes rsultant de la dgradation dans le plasma de la forme tissulaire des isoenzymes aprs leur passage dans la circulation. Les CK^^[ possdent trois isoformes et les CK^g n'en possdent que deux. Il existe des possibilits de sparation par lectrofocalisation, les rsultats sont alors donns en pourcentage, mais il existe galement des mthodes immunologiques pour les dterminer.
3.8.
Macro-CK
Les CK, comme de nombreuses enzymes peuvent exister sous une forme particulire appele macroenzyme qui correspond une forme circulante d'enzyme associe le plus souvent des immunoglobulines, parfois des lipoprotines. On distingue deux types de macro-CK : - macro-CK de type 1 qui correspond une CK^-IgG ou, rarement, une CK^-IgA. Cette macroenzyme existerait principalement chez 2 5 % des femmes ges et serait associe des maladies intestinales de type colite ulcrative ou des infections des voies respiratoires suprieures ; - macro-CK de type 2 ou CK mitochondriale qui est une CK auto-agrge. Elle serait surtout prsente chez le nouveau-n atteint d'affection noplasique avec mtastases hpatiques. En fait, la signification physiopathologique de ces macroenzymes reste mal comprise (drglement immunitaire, reflet d'un processus tumoral ?) mais leur prsence interfre avec les techniques classiques d'tude des isoenzymes. Il est donc important que le biologiste puisse les dtecter. Le signe d'appel biologique est une valeur anormalement leve de CK^g (parfois suprieure la CK totale), surtout avec les techniques d'immuno-inhibition.
3.9.
Amylase
3.9.1. Rle
L'a-amylase existe dans les glandes salivaires et le pancras. Elle dgrade l'amidon du contenu intestinal pour le transformer en dextrines et en maltose. 3.9.2. Valeurs usuelles 30 110 Vil (cintique UV 37 C).
3.9.3. Variations pathologiques
On note une augmentation de l'amylasmie dans les affections suivantes : 3.9.3.1. Pancratite aigu hmorragique L'amylasmie augmente au cours de la pancratite aigu hmorragique, pouvant atteindre 30 40 fois la valeur normale. Cette augmentation se manifeste entre la 3e et 6 heure aprs le dbut de l'affection, atteint son maximum entre la 20 et la 30e heure et se normalise entre 2 8 jours. L'amylasmie doit toujours tre complte par l'amylasurie car l'amylase est limine par les urines. Le dcalage des signes urinaires est de 6 12 heures. 3.9.3.2. Pancratites chroniques et cancers du pancras L'augmentation de l'amylase n'est pas aussi importante que dans les pancratites aigus. 3.9.3.3. Parotidites L'amylasmie est augmente dans les parotidites virales telles que les oreillons, et le dpistage prcoce des enfants contagieux a t propos pour permettre une viction scolaire rapide. Une lvation marque au cours de l'volution de la maladie doit d'ailleurs faire penser une raction pancratique secondaire. 3.9.3.4. Autres affections entranant une augmentation de l'amylasmie - perforation d'ulcres gastro-intestinaux ; - occlusions intestinales hautes ; - lithiase biliaire ; - rupture de grossesse extra utrine. Une augmentation de l'amylasmie peut aussi traduire un dfaut d'limination rnale par diminution de la filtration glomrulaire. L'amylase peut se combiner avec des glycoprotines sanguines (immunoglo-
bulines IgG ou IgA) pour former des macro-amylases qui dans ce cas ne seront plus filtres par le glomrule. On observe alors une hyperamylasmie sans hyperamylasurie. 3.9.4. Dtermination de l'activit enzymatique de Pamylase L'activit de l'amylase peut-tre mesure par une mthode UV en cintique utilisant le maltottraose comme substrat. <x arnylase Maltottraose + FLO -> 2 maltoses. hydrolase Maltose + phosphate > glucose + (3 D glucose-1 phosphate. -_ , , , phosphoglucomutase , ^ , , p D glucose 1 phosphate --> glucose 6 phosphate. G/PDH Glucose 6 phosphate + NAD'4" -> 6 phospho-gluconate + NADH + H"1". G^PDH = glucose phosphate dshydrognase. La vitesse de formation du NADH est proportionnelle l'activit catalytique de l'a amylase. Elle est dtermine par mesure de l'augmentation d'absorbance 340 nm. On peut sparer deux isoenzymes de l'amylase : les isoenzymes d'origine pancratique et les isoenzymes d'origine salivaire.
3.10. Lipase
3.10.1. Rle
La lipase pancratique, la plus importante, fonctionne en prsence d'un cofacteur d'origine protidique, la colipase. Elle dgrade les triglycrides du contenu intestinal en diglycrides puis en monoglycrides. Seule une partie des monoglycrides sera transforme en glycrol et acides gras. 170.2. Valeurs usuelles 20 210 U/l 37 C (cintique 400 nm). 3.10.3. Variations pathologiques On rencontre une hyperlipasmie : - dans les pancratites aigus ; - dans les pancratites chroniques ; - dans les cancers de la tte du pancras ; - dans les atteintes hpatiques.
On note une hypolipasmie : - dans les premiers mois de la grossesse ; - dans les maladies infectieuses (tuberculose) ; - dans l'volution du diabte. 3.10.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la lipase La dtermination de l'activit lipasique se fait par turbidimtrie. lioase Triglycrides + FLO "> glycrol + acides gras (mono et diglycrides solubles). La lecture se fait 400 nm.
3.11.
'Y-glutamyltransfrase
3.11.1. Rle La y-glutamyltransfrase ou gamma glutamyl transpeptidase ou 'yGT ou GGT exerce son activit catalytique dans des ractions de transfert et d'hydrolyse : 'vGT yGlutamylpeptide + acide amin -> y glutamyl acide amin + peptide. La 'y-glutamyltranspeptidase sert au transport membranaire du radical glutamyl mais aussi d'autres aminoacides. 3.11.2. Valeurs usuelles 5 80 VU 37 C (cintique 405 nm). 3.11.3. Variations pathologiques On note une augmentation des 'yGT dans les affections suivantes : 3.11.3.1. thylisme chronique Les ^GT augmentent chez tout individu qui absorbe de l'alcool en quantit. La prise d'alcool peut entraner une hpatite toxique anictrique avec augmentation de la 7GT. Dans les cirrhoses d'origine thylique, l'augmentation des ^GT est trs importante. Le retour la normale est assez rapide ds l'arrt de la prise d'alcool chez un sujet non statosique, alors que chez le cirrhotique les valeurs baissent mais ne reviennent pas tout fait la normale.
3.11.3.2. Cancers du foie
Dans les cancers primitifs du foie et dans les cancers avec mtastases hpatiques, on constate une augmentation importante et rapide de la ^GT. L'augmentation de la ^GT est souvent le premier signe de la prsence de mtastase hpatique. 3.11.3.3. Cholestase On constate une augmentation rapide de la ^GT dans tout ictre par obstruction, comme d'ailleurs dans toute cholestase. 3.11.3.4. Intoxications mdicamenteuses De nombreux mdicaments augmentent les taux de la ^GT tels que les anticoagulants, les antipileptiques, les neuroleptiques et certains contraceptifs oraux.
3.11.3.5. Affections pancratiques et hpatiques
On constate une augmentation de la ^GT dans les pancratites aigus et dans le cancer de la tte du pancras. Dans les hpatites virales, la 'yGT ne prsente pas d'intrt diagnostique. Elle peut nanmoins tre utilise pour confirmer la gurison.
1
3.11.4. Dtermination de l'activit enzymatique de la y-glutamyltransfrase
La dtermination de la ^GT est faite par une mthode cintique colorimtrique utilisant le L y-glutamyl-4 nitranilide. Glutamyl-4-nitranilide + glycylgiycine > glu-glycylgiycine + 4 nitraniline. La vitesse de formation de la 4 nitraniline, qui correspond l'activit de la yGT, est dtermine en mesurant l'augmentation d'absorbance 405 nm.
vGT
1
3.12. Aldolase
3.72.7. Rle
L'aldolase est d'origine musculaire ou hpatique. Elle scinde le fructuose 1-6 diphosphate en 3 phosphoglycraldhyde et phosphodihydroxyactone au niveau de toutes les cellules dans la glycolyse, et le fructose 1 phosphate en phospho-dihydroxyactone et glycraldhyde au niveau du foie.
3.12.2. Valeurs usuelles 0,5 7,6 U/l 37 C (cintique UV 340 nm). 3.12.3. Variations pathologiques 3.12.3.1. Au niveau musculaire On note une augmentation considrable de l'aldolase dans les myopathies. L'aldolase est avec la CK une enzyme de la pathologie musculaire. On peut dceler chez des femmes porteuses de tare myopathique htrozygote une augmentation du taux de l'aldolase. 3.12.3.2. Au niveau hpatique On observe une augmentation trs importante au cours des hpatites virales, mais en gnral cette enzyme n'est utilise ni pour dpister ni pour suivre l'volution d'une hpatite virale. 3.12.4. Dtermination de l'activit enzymatique de l'aldolase
A 1r1(^1 ic^
Fructose 1-6 diphosphate <> 3-phospho-glycraldhyde + phospho-dihydroxy actone. Si on bloque la voie glycolytique du 3-phospho-glycraldhyde, on peut mesurer l'activit de l'aldolase en utilisant la transformation de la dihydroxy actone : , Triose phosphate isomrase 3-Phospho-glyceraldehyde <--> phospho-dihydoxy actone. _, , ,., . . Glycrophosphate dshydrognase - - , Phospho-dihydroxy actone <--> 3 phospho+ NADH.H+ glycrol + NAD-*et l encore, on mesure la dcroissance d'absorption 340 nm.
4.
4.1.
Synthse clinique
Intrt des enzymes et des autres marqueurs en cardiologie
Dans l'infarctus du myocarde il est ncessaire pour tre efficace d'instaurer un traitement le plus rapidement possible. Le passage de la CK au niveau srique ne se produit pas immdiatement mais au bout de trois ou quatre heures. Afin d'tre le plus efficace possible, il est souhaitable d'ajouter au bilan enzymatique le dosage de la myoglobine (Mb). La myoglobine n'est pas une enzyme
Enzymes plasmatiques__________________________________261 mais, cause de son faible poids molculaire, elle passe plus rapidement dans le srum. Son origine est musculaire, cardiaque et squelettique. Elle est limine rapidement par les urines sous forme de myoglobinurie. Son dosage peut tre effectu actuellement en urgence d'une faon fiable et prcise par immunoturbidimtrie. La mthode de rfrence est une mthode radio-immunologique mais moins rapide, elle ne peut pas tre effectue en urgence. En chirurgie cardiovasculaire, il n'est pas possible d'utiliser le dosage de la myoglobine car sa valeur augmente par le simple fait de l'intervention. 4.1.1. Enzymes du bilan cardiaque Les enzymes du bilan cardiaque sont les suivantes, donnes par ordre chronologique : CK et CK^B, TGO et TGP, LDH et a HBDH. Seules la CK^g et l'a HBDH sont spcifiques du tissu cardiaque, les autres se retrouvent aussi bien dans le foie que dans le cur. L'augmentation de l'activit de ces enzymes et leur volution en fonction du temps sont reprsentes dans la figure 10.4 :
Figure 10.4 Reprsentation graphique de l'volution des marqueurs biochimiques au cours de l'infarctus.
La diffusion plus ou moins rapide de ces enzymes est en partie fonction de leur poids molculaire. Ces activits enzymatiques apparaissent, passent par un maximum et disparaissent peu prs dans le mme ordre : 1 CK^g et CK totales.
2 TGO.
3 CtHBDHetLDH. 4.1.2. Autres marqueurs Actuellement de nouveaux marqueurs protiques tels que la myoglobine et les troponines cardiaques Tnic et TnTc jouent un rle primordial. La myoglobine passe rapidement dans le sang et permet une rponse dans les trois heures qui suivent l'atteinte cardiaque, alors que la troponine plus tardive (6e heure) est plus slective. Le couple myoglobine et troponine est pour le clinicien une aide considrable (cf chapitre 9 Protines plasmatiques. Marqueurs non enzymatiques de la souffrance cardiaque, paragraphe 1.3.3).
4.2.
Intrt des enzymes en hpatologie
Le foie est l'organe qui renferme le plus grand nombre d'enzymes. Certaines enzymes sont spcifiques du foie, c'est le cas de l'OCT ; d'autres enzymes se retrouvent galement dans d'autres organes mais la concentration hpatique reste chez l'homme la plus importante. Les enzymes de l'exploration biologique du foie sont les suivantes : 1 TGO-TGP. 2 Phosphatases alcalines et 5'nuclotidase.
3 -yGT.
4 LDH. Ces enzymes augmentent diffremment suivant qu'il s'agit d'un syndrome de cytolyse ou de cholestase. 4.2.1. Cytolyse Le syndrome de cytolyse est commun toute hpatite quelle qu'en soit l'origine. Les transaminases sont les seules enzymes utilises en pratique pour dpister une hpatite. La figure 10.5 montre bien que l'augmentation des TGP avant mme le dbut de l'ictre, a un rle prpondrant dans le diagnostic de l'hpatite aigu. Bien que l'importance de l'augmentation soit proportionnelle la gravit des lsions, elle n'a pas de valeur pronostique. Son taux doit revenir la normale en 4 5 semaines.
Enzymes plasmatiques________________________________263 Il y a galement une augmentation des LDH, de l'aldolase hpatique et de l'OCT, mais ces dterminations n'apportent rien au diagnostic. Les phosphatases alcalines et les "yGT ne sont que trs modrment augmentes. Vhyperbilirubinmie conjugue se manifeste quelques jours aprs l'augmentation des transaminases. L'hpatite virale aigu reprsente le cas le plus facile diagnostiquer. Son origine sera dtermine par la recherche des marqueurs immunologiques. Ceci permettra de dtecter soit le virus A, soit le B, plus rarement le C. Certaines hpatites peuvent se prolonger et passer la chronicit, pouvant se transformer en cirrhose. La plupart des cirrhoses non thyliques ont effectivement pour origine une hpatite virale. Il existe aussi des hpatites anictriques qui ne peuvent tre mises en vidence que par la dtermination des transaminases (viction des donneurs de sang par exemple). Dans l'hpatite thylique, on constate une augmentation rapide et importante des 7GT. On note souvent une augmentation des TGO suprieure celle des TGP, comme le montre la figure 10.6. L'introduction du dosage systmatique des transaminases dans les examens de sant amne parfois rencontrer des valeurs leves, isoles, qui ont le plus souvent une origine mdicamenteuse.
Temps en semaines
Figure 10.5 Reprsentation graphique de l'volution des enzymes au cours d'une hpatite virale ictnque.
Temps en semaines
Figure 10.6 Reprsentation graphique de l'volution de l'activit des enzymes lors d'une hpatite thylique aigu.
4.2.2. Rtention biliaire Au cours de l'ictre obstructif, deux enzymes prsentent un grand intrt, comme le montre la figure 10.7, ce sont les ^GT et les phosphatases alcalines. Les transaminases sont galement augmentes mais de faon bien moins importante que dans les hpatites, avec un retour la normale trs rapide. On notera galement une augmentation isole des phosphatases alcalines la suite de prises prolonges de certains mdicaments tels que les antipileptiques et les anticoagulants. Lorsque l'on observe une augmentation des phosphatases alcalines sans signe clinique, il est conseill de dterminer les isoenzymes des phosphatases alcalines. L'augmentation isole de la ^GT doit faire penser un alcoolisme chronique. Mais cette augmentation peut aussi se produire lors de la prise prolonge de certains mdicaments tels que les antidpresseurs ou les anticonvulsivants. Parfois aucune tiologie ne pourra tre dcele (cf. chapitre 12 Exploration fonctionnelle hpatique).
Figure 10.7 Reprsentation graphique de l'volution de l'activit des enzymes au cours d'un ictre obstructif d'origine calculeuse.
4.3.
Enzymes musculaires
Les enzymes intressantes sont la cratine kinase et l'aldolase. L'augmentation de l'isoenzyme musculaire MM de la CK existe dans diverses myopathies mais aussi lors d'une rhabdomyolyse d'origine traumatique ou toxique. L'aldolase possde deux isoenzymes, l'une hpatique l'autre musculaire. L'isoenzyme hpatique n'est pas intressante car d'autres enzymes existent pour apprcier l'atteinte hpatique. L'isoenzyme musculaire est, par contre, beaucoup plus utile mesurer, en utilisant un substrat spcifique, le fructose 1-6 diphosphate, mtabolite de la glycolyse musculaire. Des constituants non enzymatiques sont aussi intressants dterminer au cours de la pathologie musculaire ; ce sont la myoglobine et la myosine dont l'augmentation va de pair avec la destruction musculaire, et la cratine qui augmente aussi bien dans le sang que dans l'urine lors des myopathies.
S. Bernard, Biochimie clinique, Maloine, Paris 1984. J.-P. Borel, Biochimie dynamique, Maloine, Paris,1987. M. Charrel, Smiologie biochimique, Ellipses, ditions Marketing, Paris, 1991. E. et F.W. Schmidt, Manuel d'enzymologie clinique, Boehringer Mannheim, 1973. G. Lefevre, H. Graine. Les nouveaux marqueurs de la ncrose cardiaque : aspects analytiques et diagnostiques. Option Bio, 24 juillet 1998. supplment au numro 211.212. G. Lefevre. Les troponines : aspects biologiques et cliniques. Annales de Biologie Clinique, 2000 ; 5 : 39-48.
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11
Constituants azots non protiques
France de La Farge Pierre Valdigui
On dsigne sous ce nom une foule de substances diverses issues du mtabolisme protique dont l'intrt est d'tre frquemment doses ou explores car touchant de multiples aspects de la pathologie mdicale. Nous limiterons notre tude aux composs suivants directement impliqus, pour la plupart dans les diagnostics ou la surveillance quotidienne : - ure ; - cratinine ; - ammoniac ; - bilirubine ; - acide urique. Pour chacun de ces composs, nous dcrirons successivement les notions biochimiques ou physiologiques fondamentales, les moyens d'exploration, les applications cliniques et les principales techniques de dosage.
1.
Ure
L'ure est le terme ultime principal du catabolisme protique chez l'homme. Atoxique, trs soluble, elle s'limine 90 % dans les urines, un peu dans la sueur et la salive, trs peu dans les matires fcales. Le dosage de l'ure dans le sang ou azotmie et dans l'urine est le paramtre le plus ancien de la biochimie clinique ; associ aux dosages du glucose et des lments de l'iogramme, il reste aujourd'hui l'un des plus demands. En nphrologie pure, le dosage de l'ure plasmatique et urinaire est dpass par celui de la cratinine, mais il reste un prcieux lment d'appoint.
1.1.
Rappels physiologiques
L'ure se forme dans le foie (figure 11.1) essentiellement aux dpens du groupement NtL des aminoacides. L'ure diffuse librement travers les membranes cellulaires. Son limination se fait par le rein par filtration glomrulaire et sa rabsorption tubulaire partielle est passive : elle dpend donc du flux du liquide urinaire dans le nphron. Une partie trs importante de l'ammoniac issu de la dsamination des acides amins est combine avec des radicaux carbons pour former l'ure. Les ractions conduisant la formation de l'ure constituent la voie mtabolique dite de l'urognse, exclusivement hpatique. L'ure n'est pas dgrade dans les tissus de l'organisme, elle est l'lment terminal du catabolisme protique, permettant l'limination d'un CO^ et de deux NHg dans sa formule simple : OCCNH^)^. Son limination urinaire, variable en fonction de la diurse, rend la clairance difficile interprter, alors que la confrontation simple du taux de l'ure urinaire au taux de l'ure plasmatique conserve tout son intrt. Le dosage de l'ure sanguine permet, avec celui de la cratinine, de dtecter l'insuffisance rnale.
Ac. aspartique
Acide a-cto- Acide glutarique/^ amin
argino- Ac-malic'ue succjnique | Ac. oxaloactique
c \
Microsomes
^. Ac. Tum; MC. fumarique
Acide \^ Acide glutamique ^^. nique
Figure 11.1 Cycle de l'ure.
Constituants azots non protiques___________________________269
1.2.
Mthodes d'exploration
1.2.1. Dtermination de l'ure sanguine et urinaire La dtermination du taux de l'ure sanguine est un moyen grossier d'valuation de la fonction rnale. Ce taux d'ure sanguine, reflet de la valeur de la fonction rnale, est aussi influenc par les apports azots alimentaires et le volume urinaire des 24 heures. L'ure urinaire est donc trs variable, dpendant du rgime alimentaire et de la diurse. Elle peut fluctuer entre 200 et 500 mmol par 24 heures. 1.2.2. Interprtation du taux de l'ure sanguine et urinaire II est ncessaire de comparer les trois valeurs suivantes : - ure sanguine ; - ure urinaire ; - dbit urique journalier. Le dbit urique journalier renseigne sur la ration alimentaire. Il permet d'interprter le taux d'ure sanguine. Un taux d'ure sanguine la limite suprieure de la normale avec une excrtion urique leve, reflet d'apports azots importants, peut tre compatible avec une fonction rnale normale. Ce mme taux d'ure (8 9 mmol/1) avec excrtion urique faible qui correspond aussi un apport azot faible, doit faire penser une insuffisance rnale. La comparaison de la concentration urique urinaire, du volume de la diurse des 24 heures et du taux de l'ure plasmatique permet une apprciation du pouvoir de concentration du rein. L'ure sanguine se situe aux alentours de 5 mmol/l chez l'adulte sain disposant d'une ration protique normale en climat tempr. Les variations physiologiques de la diurse, les carts de la ration protique alimentaire combinent leurs actions pour largir la fourchette de normalit (2,5 7,5 mmol/l). 1.2.3. Clairance de l'ure La clairance de l'ure reflte le pouvoir d'puration du plasma par le rein vis-vis de l'ure. Elle est donne par la formule gnrale : C ure = -u- x V. P U = concentration urinaire de l'ure en mmol/l. P = concentration plastique de l'ure en mmol/l. V = dbit urinaire en ml/mn ou en ml/s. La valeur de la clairance de l'ure crot avec le volume de la diurse car l'ure est filtre par le glomrule et rabsorbe en partie par le tubule. Cette rabsorption est passive, elle s'accrot au faible dbit urinaire et diminue au fort dbit.
270____________________________________Biochimie clinique L'influence du rgime alimentaire et du volume de la diurse sur le taux plasmatique de l'ure a fait abandonner la clairance de l'ure au profit de la clairance de la cratinine.
1.3.
Une chute du taux d'ure sanguine au dessous de 2 mmol/1 chez l'adulte avec une chute du taux de l'ure urinaire s'observe au stade terminal des grandes insuffisances hpatiques, tmoignant d'une dchance profonde et irrversible de la fonction urognique du foie, en mme temps que s'installent l'hyperammonimie et le coma hpatique. Beaucoup plus frquent est le syndrome de rtention awte qui associe une hyperazotmie des taux d'ure variables, dans le cadre des insuffisances rnales aigus et chroniques. L'ure sanguine reste un paramtre de dpistage grossier des maladies rnales. En pathologie nphrologique, elle est toujours associe au dosage de la cratinine, voire la clairance de la cratinine. Les deux paramtres ure et cratinine se compltent sans s'exclure. L'lvation de l'ure sanguine (ou hyperazotmie) a donn son nom au syndrome clinique observ dans l'insuffisance rnale chronique : l'urmie. 1.3.1. Azotmies rnales 1.3.1.1. Nphrites chroniques Lors des nphrites chroniques l'ure sanguine augmente progressivement. Son taux permet d'apprcier l'volution de la maladie. Le taux sanguin peut alors atteindre 30, 50 et mme 60 mmol/1. L'augmentation de l'ure est lie un trouble de l'excrtion rnale. Les atteintes rnales globales et chroniques entranent non seulement un dfaut d'limination de l'ure, mais aussi des sulfates, des phosphates, des ions H"1". Lorsque l'azotmie est svre la dtermination de l'ionogramme, de la rserve alcaline, du pH sont indispensables. La prsence d'une acidose mtabolique lie la rtention des acides organiques, des sulfates et des phosphates est souvent observe et n'amliore pas le pronostic. 1.3.1.2. Nphropathies aigus - Glomrulonphrites aigus (glomrulonphrites post-angineuses par exemple). Dans les formes communes, la rtention urique y est souvent modre. Nphropathies tubulaires (intoxication mercurielle par exemple). Au cours de la priode anurique l'ure s'lve progressivement jusqu'au 5e jour pour atteindre 30 50 mmol/1. Lorsque la diurse se rtablit, la baisse de
Constituants azots non protiques___________________________271 l'azotmie s'amorce lentement d'abord et rapidement ensuite, alors que l'ure urinaire remonte progressivement. 1.3.2. Azotmies d'autres origines Avant d'affirmer le diagnostic de nphropathie chronique il est indispensable d'liminer d'autres causes d'hyperazotmie. Dans les azotmies, que l'on appelle tort extrarnales, des tiologies multiples peuvent intervenir : Simple oligurie, exagration de l'urognse lors des grands catabolismes, hyperazotmie par manque de sel, obstacle mcanique sur les voies excrtrices, rgime hyperprotidique. 1.3.3. Diagnostic tiologique d'une hyperazotmie chronique 1.3.3.1. Nphropathies interstitielles Elles reprsentent 20 % des cas d'insuffisance rnale chronique et se traduisent par une hyperazotmie pure ou associe une hypertension artrielle. Elles s'observent : - lors des syndromes de rtention vsicale (adnome prostatique, cancer de la prostate, prostatite chronique, tumeur du col) ; - lors de la polykystose, de la lithiase, de la tuberculose uro-gnitale, d'une tumeur vsicale, des compressions urtrales (cancer du col utrin). 1.3.3.2. Nphropathies glomrulaires Elles reprsentent 30 % des cas et sont caractrises par : - une tendance aux dmes ; - une volution avec hypertension accompagne de rtinopathie et de souffrance ventriculaire gauche ; - une protinurie ; - une hmaturie microscopique nette ; - une cylindrurie inconstante. t.3.3.3. Nphroangiosclrose Elle reprsente 15 % des cas et constitue une atteinte secondaire du rein, possible lors de l'volution de toute hypertension. On constate alors : - l'absence d'dme ; - une protinurie discrte ; - une hmaturie peu importante.
1.3.3.4. Nphropathies diverses Elles reprsentent 35 % des nphropathies ce sont : - la maladie polykystique ; - les atteintes rnales des connectivits telles que par exemple, lupus rythmateux, priartrite noueuse ; - les atteintes rnales au cours de maladies mtaboliques, goutte, dysglobulinmies (mylomes, maladie de Waldenstrm).
1.4.
Dosages de l'ure plasmatique et urinaire
Le prlvement sanguin est effectu sur tube sec ou sur tube hparine. 1.4.1. Mthode l'hypobromite L'ure est traite par une solution alcaline d'hypobromite de sodium, ce qui donne un dgagement d'azote qui est mesur dans l'uromtre et compar l'azote dgag, dans les mmes conditions, par une solution d'ure de titre connu. La dfcation du srum est effectue par une solution d'acide trichloractique. L'appareillage tait reprsent par l'uromtre d'Yvon et une cuve mercure. Cette technique, applicable aussi bien au srum qu' l'urine n'est plus utilise depuis longtemps, mais c'est elle qui a donn le nom d'azotmie au taux d'ure dans le sang. 1.4.2. Mthode la diactylmonoxime La diactylmonoxime en milieu acide et chaud donne en prsence d'ure une coloration jaune utilise pour le dosage colorimtrique. Cette mthode est souvent utilise aprs dprotinisation, mais elle peut aussi tre utilise directement. La parfaite proportionnalit entre l'absorbance et le taux de l'ure autorise l'emploi de 2 ou 3 talons seulement. 1.4.3. Mthodes enzymatiques 1.4.3.1. Dosage enzymatique l'urase couple une raction colore L'urase hydrolyse l'ure en produisant de l'ammonium. Les ions ammonium ragissent en milieu alcalin avec du phnol et de l'hypochlorite pour former un indophnol color en bleu. La raction est catalyse par le nitroprussiate, et l'intensit de la coloration forme est proportionnelle la concentration d'ure dans l'chantillon. La lecture est effectue 630 nm.
Constituants azots non protiques___________________________273 1.4.3.2. Dosage enzymatique l'urase. Dtermination UV Ure + HÔ
urease
) 2 NH3 + CO^
1 1 . 1 XTTT glutamo dshydrognase ^TAT^+ alpha-cetoglutarate + NHg ---> glutamate + NAD"1" + + + NADH, H HÔ Dans les conditions opratoires choisies, la vitesse de disparition du NADH est proportionnelle la concentration d'ure dans l'chantillon. La lecture est effectue 340 nm. Cette technique peut tre effectue en cintique ou en point final. 1.4.3.3. Dosage enzymatique l'urase. Appareils lectrode L'urase dgrade l'ure en NH^ qui fait varier la conductivit. On mesure la cintique de la variation de la conductivit avec une lectrode slective de conductivit. 1.4.3.4. Dosage enzymatique utilisant la chimie sur support solide Les plaques sont constitues de plusieurs couches ractionnelles sur un support en polyester. La mthode analytique est base sur l'hydrolyse de l'ure en prsence d'urase pour donner de l'ammoniac et du gaz carbonique. Une raction colorimtrique permet de dterminer par rflectomtrie la concentration en ammoniac produit. Cette mthode analytique l'avantage d'tre spcifique, rapide et d'viter l'utilisation de produits corrosifs ainsi que la dprotinisation.
1.5.
Rpartition des techniques. Contrle de qualit national
Les techniques enzymatiques reprsentent 83 % de toutes les mthodes utilises, dont 2,6 % avec lecture colorimtrique, 80,4 % avec lecture en UV et 10,6 % avec lecture rflectomtrique.
2.
Cratinine
La cratinine plasmatique et urinaire est le reflet de la masse musculaire globale. Pour un sujet donn, le taux plasmatique et la quantit de cratinine limine quotidiennement dans les urines constituent des paramtres biologiques remarquablement fixes. Pour ces raisons, la valeur de la clairance de la cratinine revt une signification smiologique fondamentale lors de l'tude d'une
274____________________________________Biochimie clinique insuffisance rnale. La clairance de la cratinine est indpendante de la diurse, elle mesure directement la Hitration glomrulaire. Le taux plasmatique est indpendant de l'apport protique alimentaire ; il reflte la masse musculaire du sujet et son mtabolisme propre. L'limination est exclusivement urinaire, et donc toute variation de la clairance renseigne directement sur l'tat fonctionnel du rein.
2.1.
Rappels physiologiques
2.1.1. Origine mtabolique La cratinine provient (figure 11.2) de la dshydratation de la cratine, ellemme prsente dans le muscle stri o elle permet le stockage d'ATP sous forme de cratine phosphate ou phosphagne par une raction catalyse par la cratine kinase (CK). 2.7.2. Comportement de la cratinine au niveau du nphron La cratinine subit la filtration glomrulaire ; elle n'est par la suite ni rabsorbe ni excrte au niveau du tubule. Sa clairance mesure le volume du Hitrat glomrulaire form par seconde. Clairance = 2 ml/setonde pour 1,73 m2 de surface corporelle (voir tables des Dubois).
Glycocolle Argimne
(Cratinine) -
K,0
Ornithine
Cratine-Ph l
^^^ Cratine ) Ac. guanidoactique
ADP
ATP
Figure 11.2 Mtabolisme de la cratinine.
2.2.
Mthodes d'exploration
2.2.7. Dtermination de la cratinine sanguine Le sang total renferme de la cratine et de la cratinine. La cratine se trouve surtout dans les globules rouges des taux faibles, alors que la cratinine est galement rpartie entre les globules et le plasma. La concentration en cratinine totale du sang est remarquablement constante chez un sujet donn, en fonction de sa masse musculaire. Elle ne dpend ni du rgime, ni de l'exercice physique, ni mme d'autres influences biologiques. C'est le constituant sanguin dont le taux est le plus fixe. La cratinine sanguine ne varie pratiquement que dans les lsions rnales. Son taux varie, chez l'adulte, de 50 105 pmol/l. 2.2.2. Clairance Elle tablit le rapport entre la quantit de cette substance apporte par le plasma au niveau du rein et la quantit de cette substance limine par le rein. C'est le coefficient d'puration plasmatique ou nombre de ml de plasma totalement purs par le rein dans l'unit de temps. Ce volume thorique s'exprime dans le cadre des units SI en ml/seconde. Il est utile, pour manipuler simplement les clairances, de retenir que 24 h correspondent 1 440 minutes et 86 400 secondes.
C=
uv
p
C = clairance = volume de plasma totalement pur. U = concentration urinaire par litre. P = concentration plasmatique par litre. V = volume d'urines mises en une seconde (ou une minute). Il suffit donc de doser la cratinine dans le plasma et dans l'urine, d'exprimer les rsultats dans la mme unit, de connatre la diurse (dbit urinaire) par seconde, pour calculer sa clairance. Il est essentiel au cours de l'preuve (3 h ou mieux 24 h) de mesurer exactement la diurse et de faire boire abondamment le sujet, afin d'avoir une diurse suprieure 1,5 1/24 h. La valeur normale est de 2 ml/s. UV De plus la formule C = est valable pour le sujet adulte normal dont la surface corporelle est voisine de 1,73 m2. Chez l'enfant et le nourrisson il faut tenir compte de la surface corrige Se : 1 73 Ce = C x Se
La Se est obtenue grce aux tables de Dubois (figure 11.3) qui permettent, en joignant par une droite la taille et le poids, d'obtenir la surface corporelle recherche l'intersection avec la ligne des surface corporelles. 2.3. Signification des variations pathologiques
La cratinine plasmatique et urinaire, sa clairance, l'ure sanguine et urinaire et l'ionogramme plasmatique et urinaire sont les paramtres biochimiques fondamentaux de la pathologie nphrologique lors des insuffisances rnales. Ils sont difficiles interprter les uns sans les autres.
r- 200
- 190 - 180 - 170 - 160 - 150 .- 220 .215 -210 - 205 -200 - 195 -190 - 185 r3'00 - 2aa -2.80 -2.70 - 2.60 -2.50 -240 -030 -220 ' 140 ' -130 - 120 _.B -110 -100 f95 -90
:
F3 -2 '
- -? :
-2
-75
-;65 -160 - ^5 . 148 -140 -135
150
-^
: t . : 1| .^ c S :l " S ~ -^ E Lijo g ^ ^ 6
^
^ -80 75 -70 -85 -e0 -55 -50
-
-^ -75 -70 -65 -eo -55 F 5
-.6
-5
'4 " E S - 3 g ; : " " ^ ^ 0-
- 125
.115
- 13Q -120
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3 (0
I
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- 25 - .20 .^ " ' -1-00 .95 . g,, .85 80 75
1-35 3
(o
o
.45
-50
- 4 5I -4
. 0
t 3
3 B
t= S
. 105 -100 95
-40 w
.4 . 3 5 - 3 5
-90 -B5
- 3 0 - 3 0
'
-^
1 75
-25
L., 2
.65
- .60 -2(1 .50

L1
1-20
-15
Table de Dubois (grand enfant et adulte)
Table de Dubois (nourrisson et enfant)
Figure 11.3 Table de Dubois.

2.3.1. Valeur diagnostique dans le cadre du syndrome biologique de rtention azote
Un taux d'ure sanguine entre 8 et 12 mmol/1 associ une cratinine 88 u.mol/1 permet d'affirmer le caractre extra-rnal de cette azotmie. Par contre une ure 17 mmol associe une cratinine 220 (J.mol/1 signifie une insuffisance rnale modre. Une azotmie 33 mmol/1 et une cratinine 600 u,mol/l tmoignent d'une insuffisance rnale avance. 2.3.2. Valeur pronostique et surveillance de la thrapeutique Tout au long de l'volution d'une nphropathie, la valeur de la cratininmie et la clairance de la cratinine mesurent le degr d'insuffisance rnale et motivent de ce fait les attitudes thrapeutiques, alors que le taux d'ure sanguine et urinaire mesurent surtout le catabolisme azot.
2.4. Mthodes de dosage

Le srum ou le plasma sanguin peuvent tre utiliss indiffremment. Les chantillons de srum ou de plasma ou d'urines peuvent tre conservs plusieurs jours l'abri de l'vaporation.
2.4.1. Raction de Jaff. Coloration picrique
Aprs dfcation l'acide trichloractique, on utilise la raction de Jaff. La cratinine au contact d'un picrate alcalin donne une coloration orange. La cratine ne donnant pas cette raction, la cratinine prforme est dose seule. La lecture est effectue 510 nm. On opre directement sur les urines, mais pour le srum ou le plasma, sur un dfcat trichloractique en mthode manuelle. Les analyseurs modernes peuvent mesurer partir du srum, plasma ou urines la cintique d'obtention de la coloration. On reproche cette raction de Jaff son manque de spcificit. Les protines, le glucose, l'acide ascorbique, les corps ctoniques peuvent en effet interfrer sur la coloration. Malgr ces rserves, le dosage colorimtrique de la cratinine est encore aujourd'hui trs utilis et satisfait les exigences de la clinique nphrologique.
2.4.2. Mthodes enzymatiques 2.4.2.1. Mthode enzymatique lecture UV
_ , . . cratininase Lreatimne -> bactenenne
, . , CK , . . , creatine + ATP > creatine phosphate + .y^ , , . , ADP + phosphoenoipyruvate
La cintique dcroissante de disparition du NADH suivie 340 nm est proportionnelle la quantit de cratinine initiale prsente. 2.4.2.2. Action d'une oxydase spcifique
2.4.2.3. Spectrorflectomtrie C'est le cas des appareillages de chimie sur support solide. Exemple : plaque Vitras de dosage enzymatique de la cratinine sur une seule plaque. La plaque contient une srie de couches afin de raliser une cascade de ractions enzymatiques. La cratinine est tout d'abord hydrolyse en cratine :
La cratine est alors hydrolyse en sarcosine, elle-mme oxyde pour produire du peroxyde d'hydrogne (eau oxygne). L'eau oxygne, en prsence de peroxydase, oxyde un leucodriv qui se colore, et la vitesse de coloration est alors mesure en cintique par rflectomtrie. La vitesse de raction est proportionnelle la concentration de cratinine prsente dans le srum.
2.5.
2.5.7.
Contrle de qualit national

Techniques cintiques directes
Les techniques directes de dosage de la cratinine en cintique reprsentent 85 % des participants. 2.5.2. Technique enzymatiques Elle concernent essentiellement la rflectomtrie (10,5 % des laboratoires).
3.
3.1.
Ammoniac
Origines biochimiques et destines
L'ammoniac NH^ est issu des ractions de dsamination des aminoacides ou d'autres composs amins. Il est donc d'origine endogne et exogne. On distingue les origines : - intestinale lie l'activit mtabolique de la flore bactrienne intestinale richement quipe en dsaminases spcifiques ; - cellulaire (principalement hpatique et rnale) o seule la dsamination oxydative du glutamate par la L-glutamo-dshydrognase est efficace, couvrant nanmoins l'ensemble du mtabolisme des aminoacides grce la transamination sur l'oxo-glutarate qui fournit du glutamate qui sera donc lui-mme secondairement dsamin. Le NH^ form lors de la dsamination est aussitt dissimul, dtoxiqu, sous forme de glutamine, acide amin de transport et d'utilisation de l'ammoniac ; - rnale o s'effectue une hydrolyse enzymatique de la glutamine faisant rapparatre le N^ (ammoniophanrse) limin ensuite dans les urines sous forme de cation NH^ (sels ammoniacaux urinaires). Les destines biochimiques, outre l'limination urinaire, sont : - l'urognse hpatique arrtant normalement tout ammoniac issu de la dsamination intestinale. L'ure limine ainsi, comme nous l'avons vu prcdemment, deux molcules d'ammoniac dans sa structure chimique de diamide carbonique ; - l'utilisation anabolique permet d'intgrer NHg dans des structures (biosynthse des nuclotides puriques et pyrimidiques, biosynthse de la glutamine, aminoacide commun des protines).
3.2.
Exploration
3.2.1. Prlvement sanguin
II doit thoriquement tre artriel, l'ammonimie veineuse tant moins leve en raison : - de la fixation tissulaire priphrique d'ammoniac sous forme de glutamine ; - de l'limination rnale de sels ammoniacaux. Toutefois, pour des raisons de commodit, le prlvement veineux est le plus souvent utilis. Le sang doit tre recueilli sur tube hparine et conserv dans la glace jusqu'au moment o il sera trait au laboratoire dans les dlais les plus brefs (risque d'apparition de NHg de novo par dsamination). Ainsi on considre que le temps coul entre le prlvement et la centrifugation au laboratoire ne doit pas excder 30 minutes. La centrifugation devra tre ralise dans des conditions normales. Trop lente elle fournira un plasma riche en plaquettes et l'ammonimie augmentera ; trop rapide, elle chauffera le plasma et le risque de dsamination in situ s'lvera. Le dosage enfin devra tre effectu dans les minutes suivant la centrifugation. Les plasmas trop hmolyses devront tre rejets.
3.2.2. Valeurs physiologiques de l'ammonimie
Le taux normal de l'ammoniac libre du plasma est trs faible : 10 50 yanoVI. 3.2.3. Ammoniurie Aprs recueil des urines de 24 heures sur HC1 pour viter la fermentation ammoniacale lie aux urases bactriennes, les sels ammoniacaux peuvent tre doss grce la raction colore de Berthelot directement sur l'urine dilue. Les valeurs physiologiques sont : 20 70 mmol/24 h. Des valeurs leves sont observes lors des acidoses, en particulier rnales. D'autre part, le dosage des sels ammoniacaux est indispensable pour la mesure, lors d'explorations fonctionnelles rnales, du dbit des ions H'1".
3.3.
Variations pathologiques de l'ammonimie
3.3.1. Chez le nouveau-n L'lvation de l'ammonimie signe habituellement une anomalie congnitale portant sur l'une des enzymes impliques dans le cycle de l'urognse. Les dficits congnitaux en carbamyl-phosphate synthtase et omithine-carbamyl transfrase sont les plus svres, conduisant le plus souvent le nouveau-n au dcs dans un tableau clinique fait de coma, mouvement anormaux et troubles du tonus.

3.3.2. Chez l'adulte
Au cours des cirrhoses, les hyperammonimies s'observent surtout lorsque l'hypertension portale ouvre des anastomoses portocaves. Ds lors l'absence ou F insuffisance d'puration hpatique de l'ammoniac (devant tre normalement incorpor dans l'ure), associe au shunt portocave explique son lvation dans le sang artriel. l'occasion des hmorragies digestives frquentes chez ces malades (varices sophagiennes), la dsamination bactrienne intense des acides amins de l'hmoglobine produit de grandes quantits d'ammoniac qui atteindront le cerveau et seront responsables de troubles neurologiques variables, de la simple obnubilation jusqu'au coma, rversibles lorsque l'ammonimie s'abaissera. C'est la classique encphalopathie portocave (figure 11.4).
Figure 11.4 Physiopathologie de F encphalopathie portocave.
Dans la gense des troubles de la conscience, interviennent, non seulement la toxicit propre de NFL mais aussi la dficience nergtique provoque par le dtournement de l'a-ctoglutarate du cycle citrique pour dtoxiquer tout prix l'ammoniac sous forme de glutamine non toxique, selon la raction Acide ct-ctoglutarique + 2 NHg glutamine.
Au cours des comas hpatiques, marquant souvent la fin des hpatites graves et des cirrhoses, l'hyperammonimie accompagne le dficit en facteurs de l'hmostase et contribue l'odeur particulire de l'haleine de ces patients. Elle participe par son taux trs lev au pronostic extrmement fcheux. En effet, hormis la greffe hpatique dans les hpatites aigus fulminantes, il n'y a aucun traitement vraiment efficace actuellement.
3.4.
Mthodes de dosage
3.4.1. Dtermination calorimtrique Elle peut tre ralise, en fonction des appareillages de deux manires diffrentes : - sur plaque de chimie sche dans les appareils Vitros , la diffusion de l'ammoniac au travers d'un film de polypropylne dans une couche contenant un colorant (bleu de bromocrsol ou bleu de bromophnol) provoque une coloration dont l'intensit, mesure par rflectomtrie, est proportionnelle la quantit d'ammoniac plasmatique ; - la dtermination colorimtrique traditionnelle, utilisable dans de nombreux automates multiparamtriques, repose sur la classique raction de Berthelot, dans laquelle l'ammoniac dveloppe, en milieu alcalin, une coloration bleue en prsence de phnol et d'hypochlorite de sodium.
3.4.2. Dosage enzymatique
Le plus rpandu il utilise la glutamo-dshydrognase qui, en prsence de NADH^ transporte l'ammoniac sur l'a-ctoglutarate pour le transformer en glutamate, selon la raction : NH3 + NADH + H++ a-ctoglutarate
GLDH
) NAD + + glutamate.
La dcroissance de la densit optique 340 nm, lie la disparition du NADH, est proportionnelle la quantit d'ammoniac prsent.
4.
Bilirubine
La dgradation du pigment porphyrinique de l'hmoglobine conduit aux pigments biliaires prsents dans le plasma en petite quantit, l'tat normal, sous forme de bilirubine. Son augmentation pathologique produit une coloration de la peau et des muqueuses, l'ictre. De multiples classifications des ictres ont t proposes, les plus rcentes s'appuyant sur le sige et la nature du trouble mtabolique responsable de l'hyperbilirubinmie.
4.1.
Rappels biochimiques
4.1.1. Transfert hpatique Au bout d'environ 120 jours, les globules rouges snescents sont capts et hmolyses par les macrophages du systme rticulo-endothlial. La globine subit une protolyse, le fer est rcupr. Issue de la dgradation de la porphyrine de l'hmoglobine, la biliverdine se transforme en bilirubine. La molcule de ce pigment rouge brun qui apparat dans le sang de la veine splnique est la bilirubine libre, non conjugue, insoluble dans l'eau et donc prise en charge par le transporteur non spcifique du plasma, la srum-albumine. La bilirubine ne dans la rate parvient au foie par la veine porte ; celle qui est issue de la moelle osseuse, c'est--dire du territoire cave, rend compte de la fraction dosable dans le sang prlev au pli du coude et parvient au foie, toujours fixe sur la srum-albumine, par l'artre hpatique. Une fraction mineure est issue du catabolisme hpatique de l'hme non rythropotique prsent dans les cytochromes, catalase et peroxydases. 4.1.2. Mtabolisme hpatique Trois oprations se produisent (figure 11.5) dans l'hpatocyte pour traiter les 50 mmol de bilirubine libre, non conjugue, formes chaque jour par un adulte sain : - captation au ple vasculaire ; - conjugaison glycuronique, au niveau du reticulum endoplasmique, fixant soit une molcule de glycuronate (mono-glycuronide de bilirubine), soit surtout deux molcules (di-glycuronide). La conjugaison est le fait d'une glycuronyltransfrase. Elle entrane une solubilit dans l'eau de la bilirubine conjugue ; - scrtion dans les canalicules biliaires. La bilirubine conjugue est alors devenue un pigment biliaire qui sera dvers dans l'intestin grle, comme tous les lments de la bile. 4.1.3. Sort intestinal L'hydrolyse de la liaison de conjugaison affecte une partie mineure de la bilirubine conjugue intestinale et libre de la bilirubine libre qui est rabsorbe et rejete dans la circulation porte, ralisant un cycle entro-hpatique. La majeure partie de la bilirubine est transforme par la flore bactrienne intestinale en stercobilinogne et urobilinogne qui, oxyds en stercobiline et urobiline, donnent aux matires fcales leur coloration. Une petite partie est reabsorbe, passe ensuite dans les veines sus-hpatiques pour tre finalement limine par le rein sous forme d'urobilinogne et d'urobiline, qui participent la coloration normale des urines.
Conjugaison ICTRE NOUVEAU-N CRIGLER-NAJAR
GILBERT
Captation
Scrtion
DUBIN-JOHNSON, 'BILIRUBINE
Hb
[Bilirubine [Conjugue, Directe

RTENTION
(Bilirubine \ \ Libre, Indirecte )
[Urobiline \Stercobiline Figure 11.5 Mtabolisme de la bilirubine et physiopathologie des ictres.
4.2.
Exploration
L'exploration est simple. Elle s'effectue par le dosage srique de la bilirubine et de ses diverses fractions. Le dosage sanguin des sels biliaires (cholmie), ou leur recherche dans les urines, n'est en effet plus gure utilis. Le taux normal de bilirubine totale varie entre : 1,7et 20 fJlinol/l. Il n'y a pratiquement l'tat normal, que de la bilirubine indirecte dans un prlvement de sang veineux au pli du coude, issue de la dgradation de l'hmoglobine dans la moelle osseuse.
43.
Elles concernent la pathologie en excs c'est--dire les ictres. Ils sont trs divers et leur diagnostic tiologique est parfois difficile, s'appuyant sur une dmarche toujours systmatique (figure 11.6).
Figure 11.6 La dmarche diagnostique dans les ictres.
4.3.1. Ictres bilirubine libre, non conjugue ou indirecte II s'agit le plus souvent d'une hyper-production, c'est--dire d'une hmolyse. Parfois, l'ictre sera li un dficit en glycuronyl-transfrase. 4.3.1.1. Ictres hmolytiques L'ictre s'associe une splnomgalie et une anmie dans le cadre classique des anmies hmolytiques. L'ictre est gnralement discret, sans dcoloration des selles, mais parfois plus intense et la lithiase pigmentaire de la voie biliaire principale est rechercher. Les signes biologiques sont : - lvation de la bilirubine libre au-dessus de 25 |J.mol/l : - anmie normocytaire, avec diminution de la rsistance osmotique ; - hyper-rticulocytose traduisant le caractre rgnratif ; - effondrement de l'haptoglobine plasmatique. Les tiologies sont reprsentes par : - Les anmies hmolytiques chroniques constitutionnelles avec : La maladie de Minkowski-Chauffard ou microsphrocytose hrditaire o l'anmie et l'ictre s'accentuent lors de pousses fbriles et o le traitement est la splnectomie. Les maladies gntiques de l'hmoglobine, P-thalassmie homozygote, drpanocytose homozygote.
Les dficits enzymatiques rythrocytaires dont le plus frquent est le dficit en glucose 6 phosphate dshydrognase (GgPDH). - Les anmies hmolytiques acquises peuvent tre d'origine immunologique, toxique, infectieuse ou mcanique par fragmentation rythrocytaire. Les hmolyses all ou iso-immunes s'observent essentiellement la suite d'une transfusion sanguine incompatible et lors d'une grossesse complique d'une immunisation fto-matemelle. Le diagnostic repose sur la mise en vidence d'une agglutinine irrgulire (anti D) chez la mre. Le risque majeur est la maladie hmolytique du nouveau-n chez lequel le risque d'ictre nuclaire, vit par exsanguinotransfusion, existe ds que la bilirubine srique atteint 300 urnol/1. Les anmies hmolytiques peuvent aussi tre d'origine toxique (mdicaments, toxiques industriels, mtaux lourds, venins), infectieuse et parasitaire. Ce dernier groupe est domin par le paludisme en particulier lors de l'accs pernicieux. Les hmolyses par fragmentation rythrocytaire rpondent plusieurs causes : mcanique lors des prothses valvulaires, traumatique aprs gros effort (hmoglobinurie), lors de microangiopathies chez l'enfant. 4.3.1.2. Dficit en glycuronyl-tranfrase L'ictre est isol, sans splnomgalie ; les urines sont claires et les selles colores. Au plan biologique, le dfaut de conjugaison hpatique se caractrise uniquement par l'hyper-bilirubinmie indirecte. Les tiologies sont, suivant l'ge, trs diffrentes (cf. figure 11.5) : - L'ictre du nouveau-n et du prmatur. Il survient souvent vers le 2e ou le 3e jour, dure une semaine environ, est isol et sans signification fcheuse en dehors d'autre pathologie associe surtout chez le prmatur. - Les dficits congnitaux en glycuronyl-transfrase. La maladie de Gilbert, dficit partiel en glycuronyl-transfrase hpatique, est une affection frquente transmission autosomique dominante. Elle est souvent dcouverte l'occasion d'un subictre conjonctival associ une bilirubine indirecte leve. Les tests d'exploration fonctionnelle hpatique sont normaux ainsi que l'hmogramme. Le pronostic long terme est bon, il n'y a pas de traitement. La maladie de Crigler-Najar est un dficit profond en enzyme de conjugaison, soit total (type I), soit incomplet (type II). Dans les deux cas il s'agit d'une affection svre, domine par le risque de complications neurologiques, particulirement dans le type 1 o la bilirubine libre peut atteindre 700 ou 800 umol/1. 4.3.2. Ictres bilirubine directe. Ictres par rtention Ils sont tous lis un syndrome de rtention biliaire, ou cholestase. Cliniquement, l'ictre est trs sombre, parfois vert bouteille , les urines
sont trs fonces, presque noires, les selles sont blanchtres, graisseuses, mastic . Il y a une bradycardie et surtout un prurit, parfois froce, avec lsions cutanes de grattage, d l'lvation concomitante des sels biliaires dans le sang. Il y a un gros foie de cholestase. Biologiquement, l'hyperbilirubinmie porte presque exclusivement sur la fraction conjugue ou directe qui peut atteindre des valeurs suprieures 500 p-mol/l. Les enzymes de cholestase, 7-GT, phosphatases alcalines, 5'nuclotidase, sont bien videmment trs augmentes. Il n'y a pas au dbut de raction parenchymateuse d'insuffisance hpatique ni de cytolyse mais rapidement, du fait de la cholestase, les transaminases vont s'lever discrtement. Les tiologies sont domines par deux causes : - la lithiase biliaire (ictre douloureux, fbrile, variable) ; - le cancer de la tte du pancras ou des voies biliaires (ictre classiquement indolore, apyrtique, constamment progressif) ; - les hpatites et les cirrhoses ont aussi dans leur tableau biologique une lvation de la bilirubine conjugue, lie la cholestase intrahpatique, au niveau des canalicules biliaires, par l'dme et l'inflammation. Cependant, il y a aussi paralllement une lvation de la bilirubine libre.
4,3.3. Ictres bilirubine mixte
Par leur frquence, les hpatites aigus, quelle que soit leur tiologie, et les cirrhoses d'origine thylique, post-hpatitique, hmochromatosique ou biliaire primitive, constituent un groupe important o les deux fractions de la bilirubine srique sont leves. La maladie de Dubin-Johnson est une affection congnitale rare de l'excrtion biliaire hpatocytaire o la bilirubinmie est mixte (environ 60 % de bilirubine conjugue) avec des pousses d'ictre franc sur fond de subictre chronique, l'ensemble totalement sans gravit.
4.4.
Mthodes de dosage
Prlvement. Le prlvement peut tre du srum ou du plasma aprs recueil sur hparinate de lithium. Il doit tre conserv l'abri de la lumire en raison de la sensibilit de la bilirubine la photooxydation et le dosage pratiqu dans les 8 heures. Principes gnraux. Deux techniques diffrentes peuvent tre en fait utilises pour doser la bilirubine totale : - Spectrophotomtrie directe. Le srum est dilu dans une solution de ttraborate de potassium de pH 9,3 puis l'absorbance est mesure 466 (correspondant la bilirubine conjugue et non conjugue) et 522 nm pour liminer l'interfrence ventuelle de l'hmoglobine et des carotnodes.
288__________________________________Biochimie clinique - Colorimtrie aprs diai.ota.tion. Le diazo-ractif, l'acide sulfanilique diazot, coupe la molcule de bilirubine en deux fragments dipyrroliques. Dans la technique de Jendrassik et Grof, la coloration obtenue est bleue pH alcalin et rouge pH neutre ou acide. La raction est instantane avec la bilirubine soluble dans l'eau, conjugue et dite directe . Une solubilisation est ncessaire pour la bilirubine libre, grce au mthanol ou des agents tels que cafine, benzoate de sodium, produits tensioactifs (Brij). Deux dosages, avec et sans adjuvant de solubilisation, permettent ainsi d'apprhender les deux formes principales directe et indirecte. - Bilirubine libre non lie l'albumine. En cas d'hmolyse majeure (incompatibilit fto-matemelle par exemple), la bilirubine libre peut dpasser les possibilits de fixation de la srum-albumine. Le risque de dpt au niveau des noyaux gris centraux est alors rel et l'exsanguinotransfusion doit tre ralise avant. La mesure de cette varit de bilirubine libre ncessite une chromatographie sur Sphadex G25 qui retient le pigment non li l'albumine. - Delta-Bilirubine. C'est une bilirubine libre lie covalentiellement la srum-albumine qui donne donc une raction directe. La bilirubine directe est donc la somme suivante : Bilirubine directe = bilirubine Delta + bilirubine conjugue (c'est--dire l'ensemble des di-glycuronoconjugus et des mono-glycuronoconjugus). Le dosage de la bilirubine Delta est ralis trs facilement par les techniques de chimie sche des automates Ortho (Vitros). Donc la bilirubine totale est la somme des fractions suivantes : Bilirubine totale = bilirubine Delta + bilirubine conjugue + bilirubine non conjugue.
5.
Acide urique
L'acide urique est chez l'homme, qui a perdu l'uricase au fil de l'volution, le terme du catabolisme des purines. Sa faible solubilit dans l'eau explique la pathologie de surcharge, observe au cours des trs frquentes hyperuricmies.
5.1.
Rappels biochimiques et physiologiques
5.7.7. Origines endognes et exognes de l'acide urique L'acide urique (figure 11.7) provient des purines : - exognes, issues de l'alimentation came (viandes jeunes, abats, ris de veau); - endognes. Pour celles-ci, on peut ainsi envisager : Une origine immdiate, proche, partir des deux bases puriques des acides nucliques, adnine et guanine, qui sont dsamines respectivement en
Constituants azots non protiques___________________________289 hypoxanthine et xanthine puis oxydes par la xanthine-oxydase en acide urique ou trioxypurine. Une origine plus lointaine, dans laquelle la biosynthse complte de novo des purines est concerne. Elle utilise des prcurseurs non puriniques (aminoacides essentiellement) et s'appuie sur du ribose-phosphate ce qui explique la formation directe d'un nuclotide, l'inosine 5'phosphate, (IMP) en bout de voie mtabolique. La rgulation s'effectue sur l'enzyme amidotransfrase intervenant ds le dbut de la biosynthse.
A Acides nucliques | Nuclotides pynmidiques AMP Adnine /' Freinage
f ^-' ,,,-,,, Amidotransfrase PRPP _ - PRA "v Glu
/ /
APRT
IMP J-lypoxanthine Xanthine oxydase/. Allopurinol
Glu-NK
Freinage GMP
HGPRT
*' Xanthine A. urique
\Acides nucliques t
Figure 11.7 Biosynthse de l'acide urique (PRA = phosphoribosylamine).
La conversion de l'IMP en AMP et GMP procurera les nuclotides puriques intgrer, sous forme de nuclotides triphosphates, dans les acides nucliques de toutes nos cellules. IMP, AMP et GMP exercent une action inhibitrice sur l'enzyme amidotransfrase. Ils peuvent aussi tre synthtiss directement partir des bases libres, grce aux enzymes APRT (adnine-phosphoribosyl transfrase) et HGPRT (hypoxanthine, guanine-phosphoribosyl transfrase). 5.1.2. tat de l'acide urique Dans le sang, l'acide urique se trouve sous forme libre, non nuclotidique, d'urate monosodique. Il est galement prsent dans les espaces interstitiels et l'ensemble de l'acide urique changeable (avec de l'acide urique marqu par un isotope) ou pool miscible est d'environ 1,2 g (figure 11.8).
290____________________________________Biochimie clinique Mme en cas de trs forte hyperuricmie, la solubilit de l'acide urique est maintenue par la prsence des protines plasmatiques.
Urines
*~
AllantoTne
Figure 11.8 Schma mtabolique de l'acide urique.

5.1.3. limination
En raison de l'absence d'uricase dans nos cellules, qui, chez tous les mammifres (sauf le singe et le chien de Dalmatie), ouvre le cycle de la trioxypurine et donne de l'allantone, l'acide urique est chez nous limin tel que, essentiellement par voie urinaire. Aprs une filtration glomrulaire complte, une rabsorption galement complte dans le tubule proximal, l'limination n'est malheureusement que trs partielle dans le tube distal. L'acide urique a donc une clairance basse, de l'ordre de 6 10 ml/mn, soit 0,10 0,16 mVs. Le problme majeur est celui de sa solubilit dans l'urine car en milieu acide les urates repassent sous une forme non salifie, encore moins soluble. Les hyperuricmiques ayant gnralement une acidit urinaire leve, on comprend ainsi la frquence des prcipitations d'acide urique responsables de calculs des voies urinaires (lithiase urique). L'allantone est prsente, trs faible taux, dans nos urines mais elle n'est que le rsultat de l'action uricasique de la flore bactrienne intestinale.
5.2.
Exploration
Elle est trs simple, associant dosages sanguin et urinaire.

5.2.2. L'uricmie
Elle est plus leve chez l'homme o les taux normaux vont de : 200 420 pmol/l. L'uricmie de la femme est gnralement comprise entre 150 et 360 pmol/l.
Constituants ostes non protiques___________________________291
5.2.2. L'uricurie ou uraturie Les taux des urines de 24 heures sont environ 10 fois les taux sanguins soit 7,5 4,5 mmol/24 h. 5.2.3. Clairance Elle est basse : 60 10 ml/mn soit : 0,1 0,16 ml/s.
5.3.
Applications pathologiques Hyperuricmies
L'augmentation du pool miscible et donc celle du taux srique de l'acide urique sont extrmement frquentes chez l'homme (de 5 18 % dans les populations masculines des pays dvelopps suivant les enqutes). 5.3.7. tiologies des hyperuricmies Secondaires. Elles s'observent au cours des affections suivantes : - insuffisance rnale chronique ; - grands catabolismes cellulaires ; - tubulopathies. Primitives. Elle sont trs frquentes, parfois aggraves par des excs alimentaires et ce sont elles souvent qui sont rvles par des complications de surcharge. 5.3.2. Manifestations cliniques Les complications des hyperuricmies sont lies au dpt ou la prcipitation d'acide urique. On dcrit des complications rhumatologiques, urologiques et nphrologiques. La goutte se manifeste d'abord par des crises aigus au niveau du pied et en particulier au niveau de la base du gros orteil. La crise inflammatoire est lie la prcipitation de cristaux d'acide urique dans la synoviale (arthropathie microcristalline). Elle volue ensuite parfois vers un stade subaigu o les crises inflammatoires peuvent toucher toutes les grosses articulations. La goutte chronique enfin se caractrise par le tophus, concrtion sous cutane d'acide urique amorphe, au niveau des tendons extenseurs, du pavillon de l'oreille, qui peut aussi se former dans les os au voisinage des articulations et la goutte devient alors une poly arthropathie chronique inflammatoire. La lithiase rnale, due la prsence de calculs uriques dans les voies excrtrices rnales se traduit invitablement par des coliques nphrtiques, itratives, sans tendance l'infection ni la stase. Les calculs uriques sont radio-invisibles, mais l'uraturie forte ou normale a la particularit d'tre accompagne
292___________ ___ ____________________Biochimie clinique
d'une acidit urinaire importante qu'il convient d'attnuer par la prise de boissons alcalines (eaux bicarbonates). La nphropathie urique est due des dpts d'acide urique au niveau des pyramides des reins. Elle est lie directement l'hyperuricmie et toute apparition d'hmaturie microscopique au culot, toute lvation de la tension artrielle doivent entraner la prescription de freinateurs de la synthse urique, abaissant l'uricmie au-dessus d'un seuil de scurit (400 (J.mol/1) avant que ne s'installe une insuffisance rnale chronique.
5.4.
Mthodes de dosage
5.4.1. Mthodes enzymatiques Elles reposent toutes sur la destruction spcifique de l'acide urique par l'uricase, selon la raction suivante : Acide urique + 2I-LO > allantone + CO^ + HÔ^. 5.4.1.1. Dosage de H ^0^ forme II peut tre ralis avec une catalase ou avec une peroxydase : Avec une catalase et en prsence d'thanol, il y a formation d'actaldhyde que l'on peut doser l'aide : - d'une aldhyde dshydrognase avec formation de NADH et d'actate (technique de Haeckel avec lecture 340 nm) ; - d'une alcool dshydrognase en prsence de NADH. Il y a formation d'thanol et de NAD'1' et la diminution d'absorbance est encore lue 340 nm (technique de Trivedi). Ces techniques, utilisant le couple uricase-catalase, sont employes par 10,8 % des laboratoires. Avec une peroxydase, selon la technique de Trinder, avec oxydation d'un chromogne incolore en produit color. Malgr les interfrences, cette technique est la plus populaire avec 84 % d'utilisateurs. 5.4.1.2. Mthodes spectrophotomtriques On dtermine avant et aprs action de l'uricase l'extinction 293 nm. L'acide urique prsente un pic d'absorption maximale cette longueur d'onde et pas l'allantone. La technique est encore employe par 3,6 % des laboratoires.
Annales du contrle de qualit national, Agence du Mdicament, 1998 et AFSSAPS, 1999. S. Bernard, Rvisions acclres en biochimie clinique, Maloine, Paris, 1982. J.P. Borel et al, Biochimie pour le clinicien. Mcanismes molculaires et chimiques l'origine des maladies, Prison-Roche, Paris, 1999. J. Frexinos, Hpato-gastm-entrologie clinique, Simep, Villeurbanne, 4" d., 1992. P. Mtais et al., Biochimie clinique, tome 1, 2e d., Simep, Paris, 1990. P. Mtais et al., Biochimie clinique, tome 3, Simep, Paris, 1988. G. Siest et al.. Rfrences en biologie clinique, Eisevier, Paris, 1990.
12
Exploration fonctionnelle hpatique
Pierre Valdigui
L'importance physiologique et mtabolique du foie, la frquence des atteintes hpatiques ou hpatobiliaires expliquent le caractre fondamental et l'intrt de l'exploration biologique de cet organe. Le choix et la slection de tests sensibles et spcifiques peut paratre difficile au milieu de la foule de tests hpatiques disponibles mais la simplification est facile. Elle s'impose d'autant plus que la demande de prescription biologique des patients vis--vis de leur mdecin est abusive, le foie tant considr en France comme un organe particulirement fragile et sensible, responsable d'un grand nombre de malaises.
1.
1.1.
Rappel des grandes fonctions hpatiques

Fonction excrtrice
7.7.7. Fonction biliaire Elle s'apprcie par le dosage des : - pigments biliaires. Bilirubine essentiellement dans le sang, urobilinogne et urobiline dans les urines ; - sels biliaires, pouvant tre recherchs facilement dans les urines grce leur action tensio-active (reaction de Hay la fleur de soufre) ou doss dans le sang sous le nom de cholmie ; - enzymes de cholestase. Ce sont essentiellement les phosphatases alcalines, la "/-glutamytransfrase et la 5' nuclotidase.
1.1.2. Fonction d'puration plasmatique Elle peut tre tudie par : - l'ammonimie qui reprsente aussi la fonction mtabolique d'urognse ; - l'preuve la BSP (bromosulfone-phtaline) qui est encore parfois pratique. Elle consiste mesurer dans le plasma la disparition du colorant (par photomtrie aprs alcalinisation) inject par voie veineuse sous forme d'une solution 30 mg/ml, la dose de 150 mg/m2 de surface corporelle. Les prlvements sanguins sont raliss 15 mn et 45 mn aprs l'injection (protocole de Rosenthal) ou aprs 8, 15, 45, 90 et 120 mn (clairance de la BSP, normalement de 0,12O,18mVmn). Dans l'preuve simple les taux de colorants ne doivent pas dpasser 25 % 15 mn et 5 % 45 mn, ce dernier chiffre tant parfois seul pris en compte. 1.1.3. Fonction de dtoxication et de conjugaison Diverses fonctions chimiques sont utilises par l'hpatocyte pour assurer ces fonctions fondamentales, rarement explores maintenant. Citons par exemple les fonctions suivantes : - fonction NH^ du glycocolle dtoxicant l'acide benzoque sous forme d'acide hippurique ; - fonction acide du sulfate se combinant divers hormones ; - fonction aldhyde du glycuronate conjuguant des hormones strodes ou la bilirubine.
1.2.
Fonctions mtaboliques. Recherche de l'insuffisance cellulaire
1.2.1. Mtabolisme glucidique La glycmie seule appartient ce chapitre. Toutefois sa baisse profonde ne s'observera qu'au cours des grandes destructions du foie. 7.2.2. Mtabolisme protique Le dosage des protines totales et mieux celui de la srum-albumine apprcie les possibilits de biosynthse hpatique. Les "y-globulines sont leves dans la plupart des cas de cirrhose alcoolique, d'hpatite chronique active et de cirrhose biliaire primitive. Les globulines c^ et o^ sont augmentes en cas de tumeurs malignes. Ainsi s'explique l'intrt de l'lectrophorse des protines sriques si l'on souponne une hpatopathie chronique. L'tude des facteurs de la coagulation et du complexe prothrombinique en particulier est un temps important dans la recherche d'une insuffisance cellulaire hpatique.
Exploration fonctionnelle hpatique___________________________297
Le temps de Quick ou taux de prothrombine est allong en cas de cholestase et d'insuffisance hpatocellulaire. Le dosage des facteurs II, V (proacclrine), VII (proconvertine) ou X (Stuart) peut aussi tre demand.
1.3.
Recherche d'une cytolyse
L'apparition dans le plasma d'enzymes comme les transaminases. la TGP ou ALAT ou alanine-aminotransfrase en particulier, comme l'OCT ou omithinecarbamyl transfrase, comme la choline-estrase ou encore la LDH, signe la destruction des hpatocytes ou tout au moins d'importants troubles de la permabilit cellulaire. Le fer srique lev tmoigne aussi d'une cytolyse hpatique.
1.4.
Tests divers
Selon l'tat clinique des patients, d'autres examens sont souvent ncessaires, en particulier immunologiques. Ainsi la recherche des antignes du virus de l'hpatite B et l'tude des anticorps anti-Hbs, anti-Hbe ou anti-Hbc sont-elles fondamentales au cours de l'volution de ce type d'hpatite, alors que pour l'hpatite C, ce seront les anticorps anti-VHC. Ailleurs ce sera le dosage de l'a-ftoprotine qui sera important, accompagnant une chographie hpatique. Enfin dans certains cas seule l'histologie donnera des renseignements valables aprs ponction-biopsie du foie.
2.
Choix des tests hpatiques indispensables
Nous venons de voir que de nombreux examens biologiques d'exploration hpatique ont t proposs. Cependant un petit nombre peut tre retenu, comportant des tests suffisants et ncessaires qui doivent donc tre systmatiquement effectus chez tout malade suspect d'une maladie du foie ou de la voie biliaire principale.
2.1.
Dosage de la bilirubine srique
Cet examen (cf. chapitre 11, Constituants azots non protiques) permet de reconnatre une hyperbilirubinmie modre car le subictre n'est cliniquement perceptible, la lumire du jour, qu' partir de 25 ou 30 |J,mol/l de bilirubine (valeurs usuelles de 1,5 20 pmol/l).
298__________________________________Biochimie clinique Le dpistage portera surtout sur la fraction libre, non conjugue ou indirecte tmoignant alors d'une hyperhmolyse ou d'une maladie de Gilbert.
2.2.
Dtermination de l'activit des transaminases
Ces enzymes (cf. chapitre 10, Enzymes plasmatiques), (valeurs usuelles de 5 50 Vil 37 C), n'ont pas de spcificit hpatique particulire. Toutefois une lvation de la TGP ou ALAT (alanine aminotransfrase) signe une cytolyse hpatique. Cela s'observera donc dans toutes les hpatites aigus, virale, toxique, mdicamenteuse, au cours de la ncrose ischmique du foie ou de l'insuffisance cardiaque svre, de l'hpatite chronique active. Dans l'hpatopathie alcoolique subaigu, la TGO ou AS AT (aspartate aminotransfrase) est gnralement plus leve que la TGP.
2.3.
Mesure de l'activit de la "/-GT
La "y-GT ou "y-glutamyl transfrase (valeurs usuelles de 5 80 VU 37 C) est augmente dans tous les cas d'hpatite aigu ou chronique (avec les transaminases), dans la cholestase (avec les phosphatases alcalines), dans l'alcoolisme chronique, dans les mtastases o elle constitue classiquement un marqueur prcoce. Son lvation modre est aussi observe l'occasion de la prise de nombreux mdicaments et enfin parfois aussi chez des sujets parfaitement normaux, ds lors longtemps accuss d'intemprance !
2.4.
Dtermination de l'activit des phosphatases alcalines
Leur lvation (valeurs usuelles de 30 125 Vil 37 C) est un bon signe de cholestase (avec la 'y-GT). L'origine osseuse, ostoblastique, doit parfois tre recherche chez certains patients atteints d' ostomalacie ou de maladie de Paget ou parfois mme d'hyperparathyrodie. La sparation des activits hpatique et osseuse peut tre ralise par inactivation thermique 56 C des enzymes d'origines osseuse ou par lectrophorse des isoenzymes.
2.5.
lectrophorse des protines sriques
Elle est utile dans les hpatopathies chroniques o les v-globulines sont leves : bloc (3-^ des cirrhoses, augmentation dans les hpatites chroniques actives, les cirrhoses biliaires primitives.
Exploration fonctionnelle hpatique________________________
299
L'albumine, les c^ et o^ sont considrer lors du diagnostic des mtastases en particulier aprs des cancers digestifs.
2.6.
Autres analyses
Elles n'ont qu'un intrt limit honnis quelques cas particuliers comme l'tude des facteurs de l'hmostase ou du temps de Quick dans la grande insuffisance hpatique prcdant le coma. De mme l'tude de l'limination de la BSP est un bon test gnral d'intgrit hpatique mais il est redondant avec l'une ou l'autre des analyses prcdemment cites. Enfin n'oublions pas que l'intrt des tests biologiques s'efface souvent devant d'autres examens paracliniques tels qu'chographie (pour le dpistage des mtastases) ou examen histologique aprs ponction-biopsie (pour prciser le caractre agressif d'une hpatite chronique par exemple). La conduite tenir est donc simple. En effet si les 4 ou 5 tests ci-dessus sont normaux, il n'y a alors pas de lsion du foie. Si deux au moins sont perturbs, il y a vraisemblablement une maladie du foie ou de la voie biliaire principale et une deuxime srie d'analyses plus spcifiques devra tre alors entreprise. Quelques exemples de pathologie courante serviront illustrer ces propos.
^3.
3.1.
Quelques applications cliniques

Crise de foie
Parfaitement connue de tous cette manifestation bien banale associe des cphales, des nauses ou vomissements, une haleine nausabonde et une langue blanche. Le foie est, dans notre pays, responsable de ces maux alors qu'il ne l'est pas en Belgique ou en Suisse francophones. L'exploration biologique, si elle est ralise, est toujours normale et il faut donc rechercher une autre tiologie, sous rserve d'avoir cependant limin toute pathologie lithiasique de la vsicule biliaire : | - les migraines avec ou sans manifestations digestives associes sont souvent responsables de cette smiologie. Il s'y associe volontiers des signes neurologiques hmilatraliss et une photophobie ; - les gastrites aigus, avec ou sans stase, s'accompagnent souvent de crises dyspeptiques analogues ; l'allergie alimentaire ou toxique est aussi souvent en cause pour les ali-
300__________________________________Biochimie clinique ments trs divers (ufs, chocolat, lait, etc.). L'alcool thylique doit pouvoir tre rang dans cette catgorie et dans la prcdente (gastrite associe). - les colopathies fonctionnelles peuvent donner une smiologie voisine.
3.2.
Ictre
Dans tout ictre, quelle qu'en soit sa cause, l'exploration fonctionnelle hpatique sera perturbe. Les examens prescrire seront : - bilirubine directe et indirecte ; - transaminases (TGP surtout). L'lvation de la TGP traduira en effet trs rapidement l'intensit de la souffrance hpatique devant la cholestase ; - les enzymes de cholestase seront trs levs bien videmment. La dmarche tiologique pourra s'appliquer, selon l'algorithme ci-contre (cf. aussi figure 11.6). Dans cet ensemble, les tiologies sont domines , au plan de la frquence, par les ictres par rtention, d'origine calculeuse ou noplasique et par les hpatites d'origine virale. Ds lors des analyses spcifiques doivent tre demandes en particulier pour les hpatites B, qui permettront de guider diagnostic et pronostic : Ag Hbs > Infection en cours (ou porteur sain). Ac Anti-Hbs > Gurison. Sujet protg. Ag Hbc > Non dcelable dans le sang. Ac Anti-Hbc > IGM infection en cours. IGG infection ancienne. Ag Hb e> Infection trs intense. Ac Anti-Hbe > Pronostic ??? Pour les hpatites C la recherche d'anticorps anti-VHC doit conduire, si elle est positive, une tude de la virmie par biologie molculaire.
33.
Gros foie
Les signes biologiques utiliser en premire intention sont ceux de la cholestase ou de la cytolyse. Les mesures d'activit des phosphatases alcalines, de la "y-GT et de la TGP seront donc ncessaires. Les tiologies devront tre recherches parmi les causes suivantes : cirrhoses, cancer secondaire du foie, insuffisance cardiaque congestive, infestations parasitaires ou maladies du sang.
Exploration fonctionnelle hpatique________
391
Figure 12.1 Schma algorithmique pour le diagnostic des ictres.
3.4.
Ascite
Devant cet panchement pritonal, l'analyse fondamentale est l'examen chimique et histologique du liquide d'ascite. Ainsi un exsudt (taux de protines > 25 g/1) traduit une irritation pritonale directe et le diagnostic est malheureusement le plus souvent un cancer de l'ovaire ou un cancer du pritoine. Un transudat (taux de protines < 25 g/1) s'observera lors de l'hypertension portale : - d'origine pr-hpatique : compression ou phlbite de la veine porte ; - d'origine hpatique : cirrhoses essentiellement ; - d'origine post-hpatique : insuffisance cardiaque ou pricardite constructive.
3.5
lvation isole de la 'y-glutami-transfrase
II faut rechercher avant tout : - une intoxication alcoolique (examen clinique, VGM, C.D. transferrine, test de sevrage devant entraner trs rapidement une chute du taux de la "y-GT) ; - des troubles nutritionnels ou mtaboliques tels que dyslipidmies, diabte, etc.; - une hpatotoxicit mdicamenteuse (contraceptifs strodiens, antipileptiques, etc.). Sinon envisager en deuxime lieu : - une affection hpatobiliaire jusque-l latente sans oublier l'chographie la recherche d'une mtastase ; - une parasitose, une dysthyrodie, une cirrhose biliaire primitive doivent aussi tre voques ; - dans 1 5 % des cas enfin il faut savoir qu'aucune tiologie ne peut tre retenue. Malgr l'inquitude des patients, le diagnostic de normalit peut tre maintenu sous rserve d'une surveillance biologique rgulire, 2 fois par an, comportant y-GT, phosphatases alcalines et transaminases.
J.P. Benhamou et S. Erlinger, Maladies du foie et des voies biliaires, Flammarion Mdecin Sciences, Paris, 4e d., 2000. . Frexinos, Hpato-gastro-entrologie clinique, 4 d., Masson, 1992. P. Mtais et Al., Biochimie clinique, tome 2, Simep, 1980. , . . ., ., . , . ,. G. Siest et Al., Rfrences en Biologie clinique, Eisevier, Paris, 1990.
13
Exploration fonctionnelle rnale
France de La Farge
1.
Introduction
L'urine dfinitive resuite des deux mcanismes suivants : - Infiltration glomrulaire ; - la rabsorption et la scrtion tabulaires. Mais avant d'envisager une exploration fonctionnelle rnale fine, il faut parler d'une exploration fonctionnelle rnale globale et courante. Tout examen clinique comporte un interrogatoire, un examen physique et enfin un examen des urines au cabinet mme du mdecin.
1.1.
Examen des urines au cabinet du mdecin
1.1.1. Examen macroscopique Normalement les urines sont parfaitement limpides. Des urines anormalement colores doivent faire penser une hmaturie, une hmoglobinurie, une myoglobinurie ou bien la prise d'aliments ou de mdicaments colorant anormalement les urines. 1.1.2. Examen par les bandelettes II remplace la recherche de glucose par la liqueur de Fehiing ou d'une protinurie par la chaleur en prsence d'acide actique. Les bandelettes sont constitues par un support plastique rigide sur lequel sont fixes des plages ractives distinctes. Ces zones ractives sont stables et prtes l'emploi.
304________________________________Biochimie clinique Les diffrents paramtres que l'on peut apprcier actuellement sont les suivants : pH, densit, sang, protines, glucose, corps ctoniques, bilirubine, urobiUnogne, nitrites et leucocytes pour dpister une infection urinaire. Pour obtenir des rsultats optimaux, il convient d'utiliser une urine frache, en recueillant les urines aprs la toilette gnitale et au milieu du jet. Le temps de lecture varie entre 0 et 60 secondes. Un examen ngatif permet de ne pas poursuivre l'exploration. Toute anomalie impose une confirmation par des examens de laboratoire.
1.2.
Examens biochimiques de routine
1.2.1. Urines
Tous les examens doivent tre effectus sur des urines de 24 heures. 1.2.1.1. Protinurie Son dpistage repose sur l'usage des bandelettes reactives et son dosage est effectu l'aide d'acide sulfosalicylique, d'acide perchlorique ou de colorants sur des urines de 24 heures. Les rsultats sont exprims en grammes/24 heures. (Cf. chapitre 9). Les protinuries sont gnralement permanentes. Elles peuvent tre intermittentes, c'est le cas des protinuries d'effort et surtout de la protinurie orthostatique frquente au cours de l'adolescence. L'tude qualitative est ralise par lectrophorse ou bien par immuno-fixadon, parfois aprs concentration des urines. On distingue : - la protinurie physiologique infrieure 150 mg/24 h, contenant 2/3 de globulines et peu d'albumine ; - les protinuries tabulaires : rares, avec peu d'albumine ; - les protinuries glomrulaires ; elles peuvent tre slectives, faites de 80 % d'albumine ou non slectives, avec toutes les fractions protiques du plasma ; - les protinuries monoclonales tmoignant de la prsence d'une globuline anormale dans les urines migrant en position a ou p. La plus frquente est la protinurie de Bence Jones. 1.2.1.2. Electrolytes Les variations sont considrables d'un jour l'autre en fonction des apports. Les dosages les plus frquents sont Na4' et K'1'. Normalement Na/K > 1. Si Na/K < 1, il faut penser une raction d'hyperaldostronisme.
Exploration fonctionnelle rnale____________________________305
1.2.1.3.
> URE-
Constituants azots (cf. chapitre 11).
sa concentration par litre interprte par rapport au taux d'ure plasmatique renseigne sur le pouvoir de concentration du rein. Le rapport Ure urinaire/Ure plasmatique est habituellement suprieur 20. Le dbit urique par 24 heures renseigne sur la ration azote alimentaire.
> CRATININE:
son taux d'excrtion par 24 heures est constant d'un jour l'autre, il reflte le catabolisme musculaire. Sa mesure est ncessaire la dtermination de la clairance de la cratinine.
> ACIDE URIQUE:
le dosage est justifi en cas de goutte et de lithiase urique. 1.2.1.4. lments cytobactriologiques
^- HMATIES:
dans une urine normale, on doit trouver moins de 5 hmaties par mm3 ou 5 000/ml.
^ LEUCOCYTES-
l'urine normale ne doit pas contenir de leucocytes ou tout au moins ne doit pas dpasser 10 000 leucocytes/ml.
l^- CYLINDRES:
ils sont constitus d'une protine d'origine tabulaire. Les cylindres protiques ou acellulaires ont peu de signification pathologique. Au contraire les cylindres hmatiques indiquent que l'hmaturie vient du parenchyme rnal, en particulier des glomrules. Les cylindres leucocytaires reprsentent un tat inflammatoire du parenchyme rnal. ^- LES CRISTAUX n'ont pas de signification pathologique. ^- LES CELLULES PITHLIALES n'ont qu'une valeur smiologique mal dfinie.
? ^ LA PRSENCE DE GERMES l'examen direct ncessite une uroculture.
1.2.2. Sang, plasma, srum
1.2.2.1. Dchets azots - La cratinine plasmatique : ce dosage est celui qui permet d'apprcier le plus facilement la valeur de la fonction rnale. Le taux plasmatique est
306__________________________________Biochimie clinique remarquablement fixe pour un individu donn car il dpend uniquement de l'importance de la masse musculaire et de la fonction rnale. Le taux est indpendant du volume des urines et du rgime alimentaire. - L'ure sanguine ; son taux dpend certes de la fonction rnale mais aussi du volume de la diurse et de la teneur en protines du rgime alimentaire. Ce dosage doit tre remplac par celui de la cratinine plasmatique pour apprcier la fonction rnale. - L'acide urique : valeurs normales de 250 420 u,mol/l. Son taux s'lve chez le goutteux et aussi en cas d'insuffisance rnale. 1.2.2.2. lonogramme sanguin : Na'1", K4', Cl", bicarbonates. Leur tude est indispensable pour tout dsordre hydrolectrolytique avec ou sans insuffisance rnale. Le K^ s'lve beaucoup en cas d'insuffisance rnale et plus particulirement en cas d'anurie. 1.2.2.3. quilibre phosphocalcique (cf. chapitre 3) : - examens sanguins : calcium, phosphore, phosphatases alcalines ; - examens urinaires : calcium, phosphore ; - rein, os et intestin participent au mtabolisme phosphocalcique. 1.2.2.4. quilibre lipidoprotidique (cf. chapitre 7) Au cours des syndromes nphrotiques, si la protinurie est suprieure 4 g/24 h, on note : - une baisse des protides totaux infrieure 60 g/1 avec baisse de l'albumine < 30 g/1 ; - une lvation des cc^-p globulines et une baisse des y globulines ; - une hyperlipmie mixte avec un cholestrol 10 mmol/1 et des triglycrides 4 mmol/1.
2.
Notions de clairance
La clairance d'une substance limine par le rein se dfinit comme le volume de plasma pur totalement de cette substance dans l'unit de temps. Plus la clairance est leve plus le pouvoir d'puration du rein pour la substance considre, est grand. La clairance rnale est tablie facilement pour toute substance prsente dans le sang et les urines au moyen de la formule suivant : r-UxV """"P"
Exploration fonctionnelle rnale_____________________________3Q7
U = concentration urinaire de la substance en mmol/1. P = concentration plasmatique de la substance en mmol/1. V = dbit urinaire en ml/s.
3.
Exploration fonctionnelle du glomrule
Elle peut tre ralise grce la dtermination de la clairance d'une substance excrte par la seule filtration glomrulaire (figure 13.1), telle que l'inuline, une perfusion veineuse de la substance tudie permettant d'obtenir une concentration plasmatique constante. Avec l'inuline, on obtient dans ces conditions, chez le sujet normal, des valeurs de 2 ml/s pour 1,73 m2 de surface corporelle. Cette clairance correspond au volume de filtrat glomrulaire ou de l'urine primitive labor en 1 seconde. Les rgles respecter pour une valuation correcte de la clairance sont les suivantes : - repos pendant toute l'preuve ; - recueil des urines rigoureux et suffisant ; - la mesure de la clairance doit tre rapporte la surface corporelle de rfrence (1,73 m2) chez l'enfant.
3.1.
Mesure de la filtration glomrulaire
Principe : si une substance filtre travers le glomrule n'est ni rabsorbe, ni scrte par le tubule, elle est intgralement retrouve dans l'urine dfinitive. Sa clairance mesure le volume de l'ultra-filtrat plasmatique. Les substances utilises pour la mesure de la filtration glomrulaire doivent runir les conditions suivantes : - ne pas se fixer sur les protines plasmatiques (non ultrafiltrables) : - ne pas tre mtabolises dans l'organisme ; - ne pas avoir d'action pharmacodynamique ; - tre d'un dosage facile. 3.1.1. Clairance de l'inuline L'inuline est limine de manire stricte par le glomrule. La mesure de sa clairance est la mthode de rfrence dans l'valuation de la filtration glomrulaire. Cette mesure est exclusivement rserve la recherche, o elle est trs utilise pour des mesures prcises et pour apprcier la valeur de nouvelles techniques.
Rabsorption nulle
Rabsorption +++
(1)TypeP.A.H. Scrtion +++ Rabsorption nulle C# 10ml/s2
- Scrtion faible
(3) Rabsorption +++ Scrtion faible Ac.unque, C # 0,16 m l / s 0,01
(2) Inuline, Cratinine C#2ml/s0,3
FiguivIS.l m
(1) Dtermination du flux sanguin rnal par la clairance (C) du PAH. A faible concentration plasmatique, le PAH est presque totalement scrt dans la lumire tabulaire. (2) Mesure de la filtration glomrulaire par la clairance de la cratinine endogne. La cratinine ne prsente pas de rabsorption ni de scrtion tabulaire. (3) L'acide urique prsente une forte rabsorption et une faible scrtion.
La clairance est de 2 ml/s. L'inuline est un polysaccharide du fructose dos colorimtriquement par la mthode de Selivanoff car par hydrolyse pralable on obtient du fructose (coloration rouge chaud avec du rsorcinol). Elle peut tre galement dose par mthode fluorimtrique ou enzymatique. On injecte de l'inuline 10 % en perfusion veineuse continue, la solution doit tre apyrogne. On dtermine la clairance sur 2 ou 3 priodes d' 1/4 heure. la fin de chaque priode on effectue :
Exploration fonctionnelle rnale_____________________________309
- un recueil d'urines par sondage ; - un lavage de vessie : avec les eaux de lavages ajoutes aux urines ; - un chantillon de sang recueilli sur hparine. Ce protocole lourd ne permet pas d'utiliser cette mthode en pratique clinique courante, mais cette clairance reste la mthode de rfrence. 3.2.2. Clairance de la cratinine endogne En pratique courante, la clairance de la cratinine est donc la seule utilise. La cratinine dont le taux est constant dans le plasma, est limine uniquement par filtration au niveau du glomrule. Cette mesure ncessite une prise de sang et le recueil des urines avec dosage de la cratinine. La priode de recueil est le plus souvent de 24 heures. La valeur de la clairance de la cratinine est 2 ml/s 0,3. Sa mesure est l'examen de base de l'exploration fonctionnelle rnale. Elle permet d'affirmer l'intgrit de la fonction rnale ou de mesurer le degr du dficit fonctionnel au cours de l'insuffisance rnale. 3.1.3. Cystatine C plasmatique Les cystatines sont des inhibiteurs d'enzymes protiques. La concentration srique en Cystatine C est fortement augmente en cas d'insuffisance rnale grave. En raison de son limination exclusive par filtration glomrulaire et de sa production constante dans l'organisme, la Cystatine C a une concentration plasmatique qui dpend directement du taux de filtration glomrulaire. Le dosage fait appel des mthodes immunoenzymatiques, radioimmunologiques ou fluoroimmunologiques. Le cot de ces techniques limite considrablement leur utilisation.
4.
Mesure du flux plasmatique rnal
L'acide para-amino-hippurique (PAH) perfus faible concentration est limin par le rein, la fois par filtration glomrulaire et scrtion tubulaire. A faible concentration, tout le PAH est limin par le rein l'occasion d'un seul passage. La valeur de la clairance du PAH devient alors la valeur du flux plasmatique rnal qui est de 10 ml/s (600 ml/mn), ce qui correspond un flux sanguin rnal de 16,6 ml/s (1 000 ml/mn), c'est--dire 1/5 du dbit cardiaque. Le rapport entre le taux de filtration glomrulaire et le flux plasmatique rnal dfinit la fraction de filtration qui normalement est gale 20 %. On peut galement mesurer le flux sanguin rnal l'aide de molcules marques par un traceur isotopique. Les plus souvent utilises sont celles mar-
310__________________________________Biochimie clinique ques l'Iode 131 ou au Techntium 99, par des gaz radioactifs tels que le Xnon 133 et le Krypton 85, ce qui ncessite un cathtrisme artriel et reste du domaine de la recherche applique.
5.
Exploration fonctionnelle du tubule
Elle consiste tudier les deux fonctions fondamentales du tubule, rabsorption et scrtion. - Rabsorption : elle est mesure en faisant appel des substances dont la clairance (C) est infrieure la clairance glomrulaire, donc C < 2 ml/s. L'exemple de telles substances, rabsorbes par le tubule, est l'acide urique : C= 0,15-0,16 ml/s. - Scrtion : elle est mesure en faisant appel des substances dont la clairance est suprieure la clairance glomrulaire. De telles substances, scrtes par le tubule, sont en gnral des substances trangres l'organisme, comme la phnoisulfonephtaline (PSP), le diodrast ou le PAH, seul le TmPAH est actuellement utilis.
5.1.
Fonction de scrtion tabulaire
5.1.1. tude de la {3^-microglobuline La p^-microglobuline est une protine de faible poids molculaire. Son catabolisme est surtout rnal. C'est classiquement un des marqueurs de la fonction tubulaire bien que son faible poids molculaire entrane une filtration glomrulaire aise. Son intrt est tout de mme limit car sa concentration srique est augmente dans de nombreuses affections extrarnales, telles que mylome, polyarthrite rhumatode... De plus son dosage est onreux.
5.2.
Fonction de rabsorption tubulaire
5.2.2. Clairance de l'ure L'ure est limine par filtration glomrulaire et elle subit au niveau du tube une rabsorption partielle. La clairance de l'ure n'est plus utilise en pratique courante pour explorer la fonction rnale car elle est trop dpendante du dbit urinaire et du rgime alimentaire.
Exploration fonctionnelle rnale____________________________3H
5.2.2. Cas de la rabsorption du glucose Le mcanisme de reabsorption du glucose illustre les caractristiques d'un systme actif capacit de transport limite. Normalement, pour des taux plasmatiques infrieurs 10 mmol/1, le glucose n'est pas excrt dans les urines ; la quantit filtre est reabsorbe. La clairance est donc nulle. Chez un individu normal, le glucose filtr est rabsorb en totalit par le tube proximal. Cette reabsorption est limite par un taux maximal de rabsorption (Tmg) de l'ordre de 350 mg/mn (soit 32 mmol/s). Chaque individu une valeur du Tmg constante. Si la glycmie s'lve et devient suprieure 10 mmol/1, il apparat une glycosurie, la clairance devient alors positive et leve. En prsence d'une glycosurie, il est important de savoir si la glycmie est normale ou pas. - Si la glycmie est normale, il faut penser un diabte rnal ou glycosurie normoglycmique qui est une affection secondaire un abaissement du seuil de rabsorption rnal du glucose. Mais seule l'hyperglycmie provoque permet d'liminer un diabte sucr. - Si la glycmie est suprieure 10 mmol/1, il y a tout lieu de penser un diabte sucr.
5.3.
Fonction de concentration - dilution
L'osmolalit plasmatique est fixe, voisine de 300 mOsm/kg. L'osmolalit des urines est variable de 50 1 200 mOsm/kg. Elle est fonction de la boisson et de l'alimentation, gnralement comprise entre 500 et 800 mOsm/kg (cf. chapitre 1). 5.3.7. Pouvoir de dilution, preuve de charge hydrique Le sujet en tat d'hydratation normale ingre en 30 60 minutes, une charge aqueuse de 20 ml/kg. Les urines sont recueillies toutes les heures pendant 5 heures. L'osmolalit d'un des chantillons doit tre voisine de 100 mOsm/kg. Normalement 50 % de la charge aqueuse sont limins en 2 heures et 80 % en 5 heures. 5.3.2. Pouvoir de concentration, restriction hydrique Le sujet qui reoit un rgime riche en protines et en sel, pauvre en boisson, est soumis un jene hydrique complet de 20 h 8 h le lendemain. La vessie est vide 24 h. L'osmolalit de 8 h du matin doit tre normalement suprieure 800 mOsm/kg.
5.3.3. Eau libre L'eau libre est la quantit d'eau qui devrait tre ajoute (en cas d'urines concentres) ou retranche (en cas d'urines dilues) l'urine pour obtenir une urine iso-osmolaire. 5.3.4. Clairance osmolaire La clairance osmolaire est gale au volume du plasma en ml pur par le rein de ses substances osmotiquement actives, par seconde. Elle est fournie par la formule gnrale :
CosmoL^081"01-^
P osmol. C osmol. : clairance osmolaire. U osmol. : osmolalit urinaire. P osmol. : osmolalit sanguine. V : dbit urinaire en ml/s. Si la charge osmolaire est limine de faon isotomique au plasma : U osmol. = P osmol. 5.3.5. Clairance de l'eau libre
La clairance de l'eau libre (C^ o) est la diffrence entre le dbit urinaire V et la clairance osmolaire C osmol (cf. chapitre 1). C^ y = V - C osmol. Si C^ o est ngative, on dit que les urines sont concentres ; c'est le cas normal. La rabsorption de l'eau libre est augmente sous l'effet de la scrtion accrue de l'hormone antidiuretique. Si C^Q est positive, les urines sont dilues. La rabsorption de l'eau libre est diminue sous l'effet d'une scrtion insuffisante d'hormone antidiurtique.
d.
Physiopathologie des variations de la diurse
La diurse est sous la dpendance d'un mcanisme neurohypophysaire qui intervient par le mcanisme de la soif, de la scrtion de l'hormone antidiurtique et d'un mcanisme rnal. La rabsorption de l'eau et des osmoles dpend de la quantit filtre et des effets sur la fonction tubulaire de facteurs hmodynamiques et hormonaux.
Exploration fonctionnelle rnale____________________________313
partir de l'ultra-filtrat, le rein va pouvoir mettre une urine concentre ou dilue par rapport au plasma dont l'osmolalit est constante et de 300 mOsmol/kg. Les urines peuvent aller jusqu' 1 200 mOsmol/kg ou dilues avec des valeurs pouvant atteindre 50 mOsmol/kg.
6.1.
Pouvoir de concentration
II est altr de manire prcoce au cours de l'volution de toute insuffisance rnale chronique. Les nphrons fonctionnels restants assurent l'excrtion de la charge aqueuse et de la charge osmotique. La charge osmotique accrue par nphron induit une polyurie osmotique par nphron rsiduel. Une charge osmotique identique administre un sujet sain et un sujet insuffisant rnal sera limine avec un volume d'urines plus lev chez l'insuffisant rnal que chez le sujet sain. Le volume d'eau requis, pour l'limination de la charge osmotique, sera d'autant plus lev que la fonction rnale sera rduite.
6.2.
Pouvoir de dilution
II est touch plus tardivement. Dans ce cas, sous l'effet de la charge osmotique par nphron, le mcanisme de dilution fonctionne mal.
7.
Lithiases
La lithiase rnale est une affection frquente. Le traitement des calculs par lithotriptie, c'est--dire par onde de choc, permet d'viter souvent la chirurgie et rend les rcidives moins frquentes.
7.1.
Lithiases calciques
Lors d'une lithiase calcique, il est ncessaire de pratiquer les analyses suivantes : calcium sanguin, calcium urinaire, acide urique des 24 heures. On retrouve des lithiases calciques dans plusieurs ventualits : - lors d'une hypercalcmie : c'est souvent le cas d'un hyperparathyrodisme primaire ; - lors d'une hypercalciurie sans hypercalcmie : c'est le cas d'une acidose tabulaire rnale distale, d'une hypercalciurie idiopathique, d'une hypercalciurie d'absorption (ce dernier cas tant le plus frquent) ; - lors d'une hyperuricurie : les cristaux d'urate de calcium pourraient entraner la nuclation htrogne de l'oxalate de calcium ;
314____________________________________Biochimie clinique - lors d'une hyperoxalurie : il faut toujours penser une hyperoxalurie quand la lithiase d'oxalate de calcium apparat avant 20 ans. Il existe une hyperoxalurie primitive transmise selon un mode autosomique rcessif et une hyperoxalurie d'origine intestinale (maladie de Crohn, rsection intestinale).
7.2.
Lithiase de phosphates ammoniaco-magnsiens
Les calculs de phosphates ammoniaco-magnsiens se forment habituellement dans le rein ou la vessie. Ils sont souvent d'origine infectieuse.
7.3.
Lithiase urique
L'acide urique est librement filtre par le glomrule et presque totalement rabsorb dans la partie initiale du tube contourn proximal. L'acide urique excrt provient surtout d'une scrtion par le tube proximal. L'hyperuricurie peut provenir de l'augmentation de l'apport alimentaire et du catabolisme tissulaire, de l'lvation de la scrtion tabulaire ou d'une diminution de la rabsorption (cf. chapitre 11). Il peut y avoir : - des lithiases d'acide urique sans hyperuricurie : c'est le cas de la rduction du volume urinaire et la diminution du pH urinaire. Pour diminuer le risque, on doit proposer au malade d'abondantes boissons alcalines ; - des lithiases d'acide urique avec hyperuricurie : on les retrouve dans la goutte primitive, dans les tats hypercataboliques, la glycognose de type 1 ; - des lithiases d'acide urique sans hyperuricmie avec hyperuricurie : c'est le cas des rgimes riches en purines.
7.4.
Lithiase cystinique
Cette lithiase se manifeste dans l'adolescence. Elle est hrditaire selon un mode autosomique rcessif.
8.
Exploration du systme rnine angiotensine, au cours de l'hypertension artrielle
Le rein intervient dans le contrle de la pression artrielle grce au systme rnine angiotensine qui libre la rnine, capable d'hydrolyser l'angiotensinogne et de librer l'angiotensine 1 qui sera transforme en angiotensine II grce
Exploration fonctionnelle rnale_____________________________315
l'enzyme de conversion. L'angiotensine stimule la scrtion" d'aldostrone, ainsi que le systme neuroadrnergique.
8.1.
Mthodologie
8.1.1. Activit rnine plasmatique (ARP) Elle est explore par des techniques radio-immunologiques en mesurant la quantit d'angiotensine II forme en excs de substrat par l'action de la rnine. Dans les conditions de base, rgime normosod, repos depuis 12 heures, l'ARP est comprise entre 7,5 et 2 ng/ml/h. 8.1.2. Aldostrone sanguine et urinaire Ces dosages sont utiles au cours des preuves dynamiques. Ils sont effectus par mthode radio-isotopique.
8.2.
Intrt clinique
8.2.1. Hyperaldostronisme primaire Au cours de l'hyperaldostronisme primaire, il existe une augmentation du taux d'aldostrone plasmatique et urinaire et une activit rnine angiotensine basse et non stimulable. 8.2.2. Stnose de l'artre rnale Une stnose importante de l'artre rnale entrane, dans la majorit des cas, une lvation de l'ARP priphrique. La mesure de l'ARP dans les deux veines rnales reprsente un argument important dans la dcision thrapeutique : un gradient suprieur 1,5 laisse prvoir une gurison de l'HTA dans les 2/3 des cas aprs traitement chirurgical de la stnose.
Conclusion
Pour que l'exploration fonctionnelle rnale soit interprtable il faut qu'elle ait t effectue avec rigueur (recueil des urines). Les mthodes d'exploration ncessitent souvent un sondage vsical ou un cathtrisme urtral d'o risque d'infection. Elles sont pourtant indispensables. L'exploration fonctionnelle rnale fait appel de nombreux examens de routine ou spcialiss qu'il faut choisir en fonction de chaque cas clinique.
Ces rsultats doivent tre confronts ceux fournis par les diverses techniques d'imagerie : - l'urographie intraveineuse qui utilise des produits de contraste iods, injects par voie intraveineuse puis limins par voie urinaire ; - l'urtropylographie rtrograde ; - l'angiographie rnale qui permet d'opacifier le systme artriel ; - l'chograhie ; - la scintigraphie ; - la tomographie informatise (scanner) et la rsonance magntique nuclaire enfin. Ds qu'un problme d'quilibre hmodynamique, phosphocalcique, acidobasique ou un trouble du mtabolisme de l'eau se prsente il est souhaitable de faire appel un service d'exploration fonctionnelle rnale qui sera le plus apte rpondre l'attente du malade et de son mdecin traitant.
P. Barjon, Nphrologie, Ellipses, Paris, 1991. M. Legrain, J.M. Suc, Abrg de Nphrologie, Masson, 3e d., Paris, 1985. R.F. Pitts, Physiologie du rein et du milieu intrieur, Masson, Paris, 1973. M. Polonovski, Biochimie mdicale, fascicule III, 8e d., Masson, Paris, 1968. La vie mdicale. Les nouvelles questions : Nphro-urologie 1, octobre 1/1988. 0. Tenstad, A.B. Roald, A. Grubb et K. Aukland. Rnal handiing of radiolabelled human cystatin C in th rat. Scand. J . Clin. Lab. Invest., 1996, 56 : 409-411.
14
Pierre Valdigui Jacques De Graeve
1.
Introduction
L'examen biologique n'est pas seulement une analyse, mais reprsente un ensemble complexe d'tapes qui, du prlvement au compte rendu final, ncessite une surveillance permanente. Les rsultats devront en effet tre aussi exacts que les techniques modernes le permettent. Cette production de rsultats est issue de trois tapes successives : La premire, pranalytique, s'effectue d'abord au contact du patient et correspond au prlvement ; elle se continue par le transport et la rception du prlvement par le laboratoire. La deuxime, analytique, est l'tape technique proprement dite avec tous les lments du traitement de l'chantillon. La troisime tape, post-analytique, consiste valider les rsultats bruts, les analyser dans leur cohrence et les prsenter dans une forme permettant une bonne interprtation par le prescripteur. Chaque tape de ce processus analytique est l'objet de contrles qui contribuent une assurance de qualit.
2.
Prlvement
La procdure de recueil du prlvement devra tenir compte de trois types de paramtres (tableau 14.1).
Tableau 14.1 Facteurs de variabilit des prlvements. Sujet tat physiologique ge, sexe, taille, poids jene, stress, activit physique, rgime, tabac grossesse, lactation, mnopause - position debout couche - rythmes circadien hebdomadaire mensuel Constituant - mtabolisme in vitro, dgradation sensibilit aux agents extrieurs - effecteurs analogues structuraux mdicaments Spcimen - plasma/srum - urines liquide cphalorachidien ponction veineuse / artrielle ponction avec ou sans garrot lumire variations de temprature
2.1.
Paramtres lis au sujet
Si un jene de 12 heures est impratif pour un bilan lipidique, la glycmie et la phosphatmie, un jene de 3 heures est suffisant pour la majorit des autres paramtres.
2.2.
Paramtres lis au constituant dos
II faut viter une dgradation du constituant doser soit en utilisant un agent conservateur, soit en respectant la chane du froid. Un point particulier doit tre not pour les prlvement sanguins : l'hmolyse. Gnralement l'hmolyse est lie un mauvais prlvement, elle pose des problmes pour la majorit des analyses (tableau 14.2)
2.3.
Paramtres lis au spcimen
Ils varient avec la nature du spcimen et du lieu de ponction (tableau 14.3).
lments d'organisation du laboratoire_________________________319
Tableau 14.2 Rapports des concentrations de quelques constituants de Vrythrocyte par rapport au srum. Cratinine............................................... 1,60 Potassium................................................ 25 Magnsium............................................. 2,7 LDH......................................................... 160 Phosphatases acides............................... 57 TGO........................................................ 3
TGP.........................................................
20
Tableau 14.3 Exemples d'utilisation des tubes en biochimie (les couleurs sont celles de la socit Becton Dickinson . Tube hparine (bouchon vert) Tube fluor (bouchon gris) Tube sec avec gel sparateur (bouchon rouge marbr) Tube EDTA (bouchon violet) lonogramme. Ammonium, Cortisol Glucose, Lactate Enzymes, Mdicaments, lonogramme. Substrats Hmoglobine glyque. Bilan lipidique
Dans tous les cas, si le prlvement n'est pas effectu par le laboratoire, il est conseill de noter le maximum d'information, concernant les paramtres prcdents, sur le bon de demande et de l'identifier soigneusement (ces erreurs tant malheureusement les plus courantes et les plus difficiles rectifier). Paradoxalement le prlvement le plus difficile pratiquer, mme en dehors du cas du nourrisson, est celui des urines (tableau 14.4). Pour une ralisation correcte des analyses sur un chantillon urinaire de 24 heures, il est fondamental qu'un recueil complet et prcis des urines soit effectu.
Tableau 14.4 Procdure de recueil des urines de 24 heures 1. Vider la vessie le matin au lever. 2. Jeter ces urines et noter la date et l'heure. 3. partir de ce moment-l, dans un rcipient propre fourni par le laboratoire, collecter les urines de chaque miction, tout au long de la journe. 4. Faites le dernier recueil, le jour suivant, au lever, la mme heure que la veille. 5. Apporter le rcipient au laboratoire le plus vite possible.
Globalement une analyse sanguine ncessite 50 200 |JLI d'chantillon, il suffit donc de recueillir autant de fois ce volume que de paramtres doser plus 1 ml pour tenir compte des contrles et des volumes morts avant centrifugation. La dure de conservation doit tre rduite au maximum. Aprs dcantation, les temps de conservation sont variables en fonction de la dure et de la temprature de conservation (tableau 14.5).
Tableau 14.5 Principales dures de conservation (selon les recommandations de la SFBC). CONSERVATION DES SUBSTRATS (Sriques et/cau plasmatiques) Substrat Bilirubine * Cholestrol Cratinine Fer Albumine Glucose Urates Ure Triglycrides Phosphates +4C oui < 6 jours 24 h < 7 jours < 6 jours < 7 jours 5 jours < 3 jours < 3 jours < 7 jours 20-25 C oui < 6 jours 24 h < 4 jours < 6 jours <24h 5 jours <24h non < 2 jours -20C oui au moins 6 mois au moins 6 mois ? au moins 6 mois + au moins 6 mois au moins 6 mois -
* A la condition que le tube soit toujours conserv l'abri de la lumire. CONSERVATION DES ENZYMES (en tube ferm) Dlai pendant lequel la perte d'activit des enzymes est < 10 % Enzymes Aldolase a-amylase Cholinestrase CK (NAC active) CK-MB (NAC) TGO (ASAT) TGP (ALAT) yGT LDH Lipase Phosphatases alcalines +4C < 5 jours < 5 jours < 7 jours < 7 jours <24h < 3 jours < 3 jours 7 jours 3 jours 5 jours < 7 jours 20-25 C < 3 jours < 5 jours < 7 jours < 2 jours <lh < 3 jours < 3 jours 7 jours 3 jours 24 h < 2-3 jours -20C 1 semaine 1 mois 1 mois non, instable 1 mois instable 1 mois
3.
Traitement du prlvement *
Pour chaque analyse, il existe une procdure analytique bien dfinie, associant les lments suivants, runis dans un manuel interne au laboratoire : 1) Logistique : localisation, nom du responsable (numro de tlphone, de tlcopie), disponibilit, dlai de rponse, possibilit de rponse en urgence, cotation. 2) Spcimen : nature, volume, type de tube, identification, tiquetage, prtraitement ventuel du prlvement, conditions de stabilit, conditions de transport en cas de sous-traitance.
* Reproduit avec l'aimable autorisation de A. Vassault(2).
___________________321
3) Facteurs de variations biologiques ( prendre en compte pour le prlvement), renseignements cliniques indispensables. 4) Principe de dosage. 5) Matriels - mthodes : appareil, ractifs (qualit, contrles, stabilit), talons primaires (nature, nombre, stabilit), spcimens de contrle (nature, nombre, mode d'utilisation, stabilit...), calibrateurs (nombre, nature, prcautions...). 6) Mode opratoire : prparation des spcimens, des ractifs, des calibrateurs, conditions opratoires du dosage (programmation des instruments, temprature, rapport de dilution, dure et nombre de mesures, nature du blanc ractif, mode, frquence et contrle du calibrage...), calculs (mode d'expression, conversions du systme SI versus systme conventionnel). 7) Contrle : valeurs cibles, limites d'acceptabilit en fonction du type de spcimen de contrle, limites de rejet, limites d'alerte. 8) Performances analytiques : domaine de mesure (limite de dtection, limites de linarit), prcision pour diffrents niveaux de concentration (dans la srie, de srie srie), exactitude, interfrences (endognes : bilirubine, trouble, hmolyse-exognes : mdicaments). 9) Valeurs usuelles : en fonction de l'ge, du sexe, des conditions physiologiques. 10) Prcautions - causes d'erreur : nature du liquide de dilution pour les ranalyses, limites de stabilit de l'analyse, procdures suivre pour les spcimens hmolyses, troubles ou ictriques, prcautions pour acheminer les spcimens adresss d'autres laboratoires. 11) Valeur smiologique et interprtation : application au diagnostic ou la surveillance des maladies, limites et informations utiles. 12) Rfrences bibliographiques. 13) Remarques ventuelles : technique de dpannage en cas d'indisponibilit d'appareil ou de reactif. 14) Cahier de bord : changement de lot de calibrateur, changements de lot de ractifs. 15) Srothque.
4.
Rsultat Interprtation
4.1. Erreurs analytiques

Elles sont de deux types. 4.1.1. Erreurs alatoires Elles affectent la PRECISION du processus analytique.
La prcision est : l'accord, la similitude entre des mesures rptes sur un mme chantillon. L'imprcision caractrise la dispersion des valeurs obtenues lors des mesures rptes de ce mme chantillon. L'imprcision peut tre quantifie par l'CART-TYPE ou par le COEFFICIENT de VARIATION.
135
136
137 138 139 140 141 142 143 -^^. Dispersion
Figure 14.1 Schma d'une distribution montrant l'imprcision des rsultats (ion
Sodium).
Lorsque l'imprcision est calcule sur des mesures rptes dans les mmes conditions (mme srie, sans rtalonnage), on utilise le terme de RPTABILIT. Le terme de REPRODUCTIBILIT correspond des mesures rptes dans des conditions diffrentes (jour jour, laboratoire laboratoire, technicien technicien...). Les erreurs alatoires affectent tous les chantillons en plus ou en moins, avec une amplitude variable d'un chantillon l'autre. On peut distinguer : - les erreurs alatoires relatives : l'amplitude maximale de l'erreur est fonction de l'analyse. Exemples : - incertitude sur la mesure des volumes de l'chantillon ou du ractif ; - instabilit du systme photomtrique ; - instabilit du systme de thermostatisation... - les erreurs alatoires constantes : l'amplitude maximale de l'erreur est constante quelle que soit l'analyse. Exemple : incertitude sur la dtermination du point d'quivalence lors de mesures titrimtriques.
lments d'organisation du laboratoire 4.1.2. Erreurs systmatiques
___323
Elles affectent l'EXACTITUDE du processus analytique. L'exactitude est l'accord entre la meilleure valeur estime de la quantit mesure et la valeur vraie. - La meilleure valeur estime peut tre la moyenne des rsultats de mesures reptes. - La valeur vraie est la valeur obtenue avec une technique de rfrence.
135
136 137 138 139 140 -<> Inexactitude
141
142
143
Figure 14.2 Exemple d'une distribution rvlant une erreur d'exactitude (ion Sodium).
En prsence d'erreurs systmatiques, tous les rsultats sont affects d'un biais dans le mme sens. On peut aussi, pour ce type d'erreur, diffrencier : - les erreurs systmatiques relatives : le biais est fonction de l'analyse effectue et dpend de diverses variables. Exemples : - erreur sur la concentration de l'talon ; - erreur sur les mesures de volume (ractif ou chantillon) pour les techniques utilisant un coefficient et non un talon : - dcalage de la longueur d'onde du spectrophotomtre ou thermostatisation inexacte pour les mesures d'activits enzymatiques. - Rcupration imparfaite lors d'extraction : - les erreurs systmatiques constantes : le biais est indpendant de l'analyse en cause. Exemples : - existence d'un trouble non compens par la soustraction d'un blanc srum ou d'un blanc ractif ; - volution du blanc reactif lors de mesures d'activit enzymatique. Ces erreurs s'ajoutent et contribuent une erreur totale, cette somme pouvant tre favorable (erreurs qui se compensent) ou dfavorables (erreurs qui se cumulent). Ces erreurs doivent rester dans des limites d'acceptabilit spcifiques
324__________________________________Biochimie clinique (tableau 14.6). Les critres retenus par la Socit franaise de biologie clinique (SFBC) sont maintenant accepts par la plupart des laboratoires. Tableau 14.6 Critres de performance acceptable. TEST Enzymes Alanine aminotransfrase Amylase Aspartate aminotransfrase Cratine kinase (CK) Lactate dshydrognase (LDH) Phosphatase alcaline Substrats Acide urique Albumine Bilirubine totale Calcium Cholestrol Cratinine Glucose Fer Protines totales Triglycrides Ure Electrolytes Chlorures Magnsium Potassium Sodium SFBC 20% 20% 20% 20% 20% 20% 12% 10% 15% 4,6% 16% 15% 10% 10% 15% 14% 12% 4% 10% 6,8% 3%
4.2
Mode d'expression des rsultats
Une trs grande rigueur doit tre utilise pour exprimer ces rsultats. La valeur numrique doit comporter au maximum deux chiffres aprs la virgule. Les units et leurs sous-multiples rsultent de cette rgle. De mme, un rsultat ne doit pas comporter plus de trois chiffres, dans le cas contraire le multiple suprieur de l'unit doit tre utilis. Les lments ncessaires pour dcrire la valeur d'un constituant biologique d'un sujet l'aide d'une quantit sont repris dans les tableaux 14.7 et 14.8.
Tableau 14.7 lments ncessaires pour dcrire une valeur biologique. lment de la description Systme (dont est issu le constituant) Constituant Type de quantit Valeur numrique Unit Exemple Srum du patient X un moment donn Ion sodium Concentration de substance 141 Millimoles par litre
Tableau 14.8 Exemple pratique de compte rendu, tenant compte des recommandations internationales. Systmes * S (JPt)S Constituant Albumine Bilirubine Calcium Ure Ure Cholestrol Cratinine Fer Glucose Hmoglobine Protines Phosphatases alcalines Urate Urate Valeur Type de quantit ** numrique masc. substc. substc. substc. substc. qs. substc. substc. substc. substc substc. masc. catc. substc. qs. 42,3 613 48 2,5 4.2 142 6.2 73 23,6 5,6 9,6 71 1,73 0,28 2,42 Unit* Intervalle de rfrence
s s
dU S S (JPt)S (jPt)S Sg
s s
(JPt)S dU
41,3 4,0 g/1 u.mol/1 600 58 u.mol/1 12 6 mmol/1 2,5 0,25 mmol/1 4,2 2,3 mmol/1 260 80 mmol/1 5,6 0,9 iimol/1 80 40 u.mol/1 21,5 5,5 mmol/1 5,0 0,5 mmoVl 9,1 1,2 68,7 2,4 g/1 uKat/1 0,5 ,025 mmol/1 0,33 0,10 mmol/1 2,40 0,8
* Systme : dU : Urine de 24 h, j : jeun, P : plasma, Pt : patient, S : Srum, Sg : Sang. ** Types de quantit : masc. : concentration de masse, substc. : concentration de substance ( concentration molaire ), qs. : quantit de substance, qs. rel. : quantit de substance relative, catc. : concentration catalytique (concentration d'enzyme).
Tous les lments doivent contribuer une interprtation correcte des rsultats. Cependant, dans tous les cas, un bon dialogue entre le prescripteur et le biologiste permettra de supprimer les ventuelles anomalies rsiduelles et d'optimiser l'interprtation et les ventuelles prescriptions complmentaires.
5.
Assurance de qualit
En principe, le contrle de qualit repose sur un contrle national obligatoire instaur par la loi de juillet 1975 (art. L.761.14 du code de la sant publique), pour lequel est prleve une taxe quivalence 1 140 fois la valeur de la lettre-cl B ( 1,70 F). Ce contrle est actuellement organis en biochimie par l'AFSSAPS (Agence franaise de scurit sanitaire des produits de sant) (Ministre de la Sant). Le contrle est ponctuel ; il comporte plusieurs envois annuels de 2 chantillons lyophiliss (gnralement un taux levs et un taux bas (tableau 14.9) sur chacun desquels est dtermin un nombre limit de paramtres (environ 8).
Tableau 14.9 Rgles de reconstitution des chantillons de contrle. La reconstitution des srums de contrle lyophiliss doit tre conduite avec un soin particulier par un responsable particulier du laboratoire. Il faut videmment : - viter les pertes l'ouverture du flacon ; - utiliser pour la reconstitution de l'eau trs pure ; - utiliser des pipettes de prcision deux traits ; - mlanger par retournements lents puis laisser reposer jusqu' dissolution complte (environ une demi-heure), puis homogniser par agitation doue sans faire apparatre
de mousse.
Sous couvert d'un numro d'anonymat, ces rsultats sont retourns l'organisme centralisateur qui en fait le traitement statistique ; celui-ci est renvoy sous forme de bordereaux individuels et plus long terme sous forme de compte rendu dtaill en fonction des codages des techniques et des automates (tableau 14.10). Ce contrle ne porte que sur les paramtres les plus usuels et seulement une fois par an pour chacun d'entre eux. C'est pourquoi ce contrle doit tre renforc par d'autres contrles : chantillons titrs du commerce mais aussi changes inter-laboratoires organiss par des associations rgionales habilites cet effet. Ainsi par exemple, le centre toulousain pour le contrle de qualit en biologie clinique (CTCB) organise un contrle plus toff puisqu'il comprend : - un contrle de reproductibilit sur un chantillon lyophilis du commerce analys tous les jours sur tous les paramtres, ceci permettant d'valuer le CV % de chaque paramtre pour le laboratoire et de le confronter celui obtenu par les autres laboratoires effectuant ce mme contrle (tableau 14.11). - un contrle en aveugle hebdomadaire (tableau 14.12 et figure 14.3) dont les rsultats peuvent tre interprts de faon quasi immdiate l'aide d'un serveur Internet.
328____________________________________Biochimie cliniqae
____
329
M = MOYENNE GNRALE ZONE A M 0 , 5 x s ZONEB M s ZONE C M 2 x s S = CART TYPE
ZONED ZONEE ZONE F + ZONE F-
M 2,5 X s M 3 x s > M +3 X s < M-3 X s
limites de l'intervalle de fluctuation 95% et donc une exactitude correcte.
Les zones A, B, C correspondent aux
Figure 14.3 Exemple de compte rendu hebdomadaire du contrle d'exactitude du CTCB avec ses critres d'interprtation.
ct de ce type de contrle rgional, il existe aussi des contrles internationaux qui ont pour avantage de noter et classer les participants. Le but de l'ensemble de ces contrles est la matrise de la reproductibilit des techniques et l'uniformisation des rsultats. On connat en effet les problmes de standardisation que rencontre, par exemple, l'enzymologie clinique (cf. chapitre 10).
6.
6.1.
GBEA, certification, accrditation

Guide de bonne excution des analyses
Pouss par les dmarches des pays anglo-saxons, le gouvernement franais a publi en 1994 un Guide de bonne excution des analyses (GBEA) destin crer des conditions de fonctionnement des laboratoires d'analyses mdicales telles que la qualit est dfinie, tudie et assure. Ce guide, rendant obligatoire la mise en place d'un systme Qualit, a t remis jour en dcembre 1999. Voici les diffrents chapitres de ce document fondamental qui rgit l'ensemble du fonctionnement des laboratoires de biologie clinique publics ou privs : - 1 Introduction, Objet, Dfinition des termes, - II Rgles de fonctionnement
Organisation, Installation, Instrumentation, Matriels et ractifs. Informatique, Elimination des dchets. - III Excution des analyses. Rgles gnrales Procdures et modes opratoires, Prlvements, identification, conservation et limination des chantillons. Validation des rsultats. Expression des rsultats et comptes rendus d'analyses. Transmission des rsultats. - IV Cas particuliers des examens de laboratoire destins aux recherches biomdicales (protocoles d'essais cliniques de mdicaments nouveaux) et des examens utilisant les techniques de biologie molculaire. - V L'assurance de Qualit Responsabilit de la personne charge de l'assurance qualit, l'valuation externe de la qualit, Contrle de qualit interne. - VI Stockage et Conservation des archives. - Annexe A : Rgles d'organisation et de fonctionnement pour les laboratoires de statut priv : Forme d'exploitation et autorisation d'ouverture, Locaux, Signalisation, Equipement, Personnel, Transmission des prlvements aux fins d'analyse, Tarifs applicables. - Annexe B : Fiche de suivi mdical. - Annexe C : Dure et temprature de conservation des chantillons biologiques.
6.2.
Certification
C'est l'existence d'un systme d'assurance qualit, rpondant aux normes internationales ISO 9000. Ces normes, datant de 1994 sont en cours de rvision, les nouvelles tant prvues pour fin 2000. La certification, reconnaissance d'une conformit, est dlivre par des organismes habilits, leur habilitation tant reconnue par le COFRAC qui est capable de les accrditer.
6.3.
Accrditation
Lorsque, la suite d'audits, la dmonstration de la comptence et de la matrise du processus qualit mis en place est faite, l'accrditation peut tre alors dlivre. Elle impliquera une reconnaissance de comptence en matire d'organisation du laboratoire ainsi qu'en matire de qualit technique. L'organisme habilit par les instances europennes est en France le COFRAC, Comit franais d'Accrditation, qui s'appuie sur les normes europennes EN 45001, et qui a mis en place une commission spcialise pour la
Biologie mdicale. Les auditeurs qualiticiens sont accompagns d'auditeurs techniques, comptents en matire de laboratoire d'analyses mdicales. Alors que le GBEA est obligatoire, certification et/ou accrditation sont des dmarches volontaires.
Annales du contrle de qualit national. Guide pour l'utilisation des rsultats du contrle de qualit en Biochimie. Laboratoire National de la Sant (Ministre de la Sant), Paris, 1980. A. Vassault, Procdures d'assurance de qualit dans le traitement des analyses : critres d'valuation. L'Assurance de Qualit en Biologie, XXXI' Dimanches Biologiques de Lariboisire, Paris, 1991. R. Dybkaer et P. Metais, Nomenclature en chimie clinique. Recommandations internationales concernant les quantits, units et les rsultats de laboratoire, Ann. biol. clin., 1972,30,99. Protocole de validation de techniques. Commission Validation de techniques de la Socit Franaise de Biologie Clinique. Information scientif. Biologiste, 1985, 11, 31. GBEA, Journal officiel de la Rpublique franaise, 11 dcembre 1999. Accrditation par le COFRAC, www.cofrac.fr
Index
l-a hydroxylase : 76. la, 25-dihydroxyvitamine D3 : 76. a-ftoprotine : 208, 297. a-hydroxybutyrate dshydrognase : 252. o^-antitrypsine : 199. o^-macrobuline : 200. Absorption du fer : 102. Accident vasculaire crbral : 54. Accrditation : 331. Accrtion : 68. Actazolamide : 55. Acide : actoactique : 51. amins glucofbrmateurs : 135. ascorbique : 102. P-hydroxybutyrique : 51. carbonique : 32. gras chanes courtes : 186. gras polyinsaturs de la srie (3 : 186. lactique : 51. nicotinique : 185. para-amino-hippurique : 309. pyruvique : 51. urique : 288, 305, 306. Acidit titrable : 41. Acidoctose : 51. Acidose : 313. lactique : 51.
mtabolique : 50, 51. rnale : 52. respiratoire : 50, 54. Acromgalie : 90. Action biochimique de l'insuline : 138. Acyl cholestrol acyltransfrase : 166. Adnocarcinome du pancras : 210. Adnome prostatique : 271. Alanine aminotransfrase : 248. Alcalose : mtabolique : 50, 56. respiratoire : 50, 57. Alcoolisme : 264, 298. Aldolase : 259, 265. Aldostrone : 40, 315. Allaitement : 123, 130. Allergie alimentaire : 299. Aminoacides indispensables : 188. Ammoniac : 41, 190, 279. AMP cyclique : 73, 80. nphrognique : 73, 84. Amylase : 256. Anarobiose : 42. Andrognes : 195. Anmie : hmolytique : 250, 285. inflammatoire : 111. microcy taire hypochrome : 110. pernicieuse : 250.
334__________________________________Biochimie clinique Anencphalie : 208. Angor instable : 213. Anhydrase carbonique : 32,40. Anticoagulants : 259. Anticorps : 200. Antipileptiques : 259. Antigne carcino-embryonnaire : 207. spcifique de la prostate (PSA) : 208. Apo CIII : 163. Apoferritine : 104. Apolipoprotine : 163 Al : 163. B : 163. E : 163. Arginine : 188. Arthropathie : 291. Ascite : 302. Aspect du srum : 171. Assurance de qualit : 326. Asthme : 225. Atorvastatine : 185. Atransferrinmie : 115. Atteintes musculaires : 214. Azote urique : 191. Azotmie : 267. CA 15-3 :209. CA 19-9 : 210. CA-125 : 210. Cachexie cancreuse : 222. Calcmie : 64, 79, 80. Calcitonine : 74, 80, 84. Calcitriol : 76, 80. Calcium : 62. binding protein : 63. complex : 65. ionis : 65, 80, 81, 95. li l'albumine : 65. plasmatique : 64. sanguin : 64. urinaire : 96. Calciurie : 79, 80. Cancer : 87, 206. de la prostate : 247, 271. de l'ovaire : 210. du col utrin : 271. du foie : 259. du pancras : 257, 259, 287. du sein : 210. Cancer antigen 15-3 : 209 Capacit de fixation : 107. Carbamate : 36. Carbohydrate dficient transferrin : 109. Carences martiales : 108, 110. Catcholamines : 137. Cellule spumeuse : 167. Crivastatine : 185. Certification : 331. Cruloplasmine : 105, 125, 126, 198,
237.
P hydroxy (3 mthylgiutaryl CoA rductase : 166. P-bloquants : 183. P-thalassmie : 285. P^-microglobuline : 220, 310. Bandelettes : 303. reactives : 144. Bases tampons : 48. Basic Multicellular Unit (BMU) : 69. Besoins enfer : 101. Bicarbonate :14, 41, 27,36. de sodium : 32. standard : 48. Bilan lectrolytique : 13. urinaire : 15. Bilan lipidique : 170. Bilirubine : 282, 297, 300. Bromosulfone-phtaline : 296. Bronchopneumopathies : 54, 199. Brlures : 123, 127,223.
Chimiluminescence : 232. Chlorure : 14, 25. Choc: 51. Cholcalcifrol : 76. Cholmie : 284. Cholestase : 244, 259, 182. Cholestrol : 164,172. HDL : 174. LDL : 175. libre : 161. Cholstyramine : 185. Choriocarcinome : 209. Chylomicrons : 162, 165. Ciclosporine : 224. Cirrhose : 18, 113, 127, 200, 222, 224, 244,258,281,287,298,302. bronze : 113. thylique : 287.
Index CK^:254. massique : 211. Clairance : 274, 306. osmolaire : 312. de l'eau libre : 12. CO;, : 33. total : 41,48. Coefficient de saturation de la transferline : 107. COFRAC:331. Coliques nphrtiques : 291. Colopathies fonctionnelles : 300. Coloration de Pris : 105. Comas : 282. Compartiments liquidions : 5. Compensation physiologique : 52. Composition en glucides des principaux aliments : 157. Contraceptifs : 126,183, 259. Corps ctoniques : 51, 152. Corticodes : 196, 224. Corticothrapies : 183. Cortisol : 79, 138. Couple myoglobine-troponine : 212. Cratine : 265. Cratine kinase : 253, 265. Cratinine : 14, 273, 305, 305. Crise de foie : 299. Critres de diagnostic du diabte sucr : 147. Cuivre : 124, 237. Cupremie : 126. Cylindres : 305. Cystatines : 309. Cytokines : 196. Cytolyse : 262, 297.
335 Dialyses: 110. Diurse: 312. Diurtiques : 56, 183. Dopamine (i-hydroxylase : 126, 129. Dosage : des triglycrides : 171. du cholestrol : 172. du lithium : 129. du magnsium : 121. Drpanocytose : 285. Dysbtalipoprotinmie de type in : 179. Dysglobulinmies monoclonales : 222, 225. Dyslipoprotinmies : 177.
Dsamination des acides amins : 194. Dshydratation : extracellulaire : 18. intracellulaire : 20. Dsoxypyridinoline : 71. Diabte : 90, 258. insipide : 130. insulinodpendant : 154, 155. non insulinodpendant : 154, 155. phosphoglucoamin : 91. sucr : 152,153,181. Diactylmonoxine : 272. Diagramme de Davenport : 49.
Eau: 1. libre: 312. lie : 312. changes gazeux : 38. Effet Bohr: 36. Hamburger : 38. Efflux du cholestrol : 167. lectrode de : Clark : 44. Severinghaus : 46. de rfrence : 42. de verre : 42. slective : 23. Electrolytes : 304. lectrophorse des lipoprotines : 170. des protines : 217. ELISA : 229. Embolies pulmonaires : 249. EMIT : 232. Emphysmes : 199. Encphalopathie portocave : 281. Endopeptidases : 189. Entropathies exsudatives : 223. Enzymes du bilan cardiaque : 261. en hpatologie : 262. musculaires : 265. Epreuve de charge hydrique : 311. d'hypoglycmie : 148. quation : d'Henderson-Hasselbakh : 32, 33.
336____________________________________Biochimie clinique Erreurs : alatoires : 321. analytiques : 321. systmatiques : 323. rythrobastes : 103. Esters de cholestrol : 161. thylisme chronique : 258. Exactitude : 323. Excs de base : 49. Excitabilit neuromusculaire : 120. Exopeptidases : 189. Glycoprotines : 198. Glycosaminoglycannes : 69. Glycosurie : 142. Goutte : 291. Gros foie : 300. Grossesse : 110, 126, 130, 209, 246,
258.
extra-utrine : 256.
Facteurs de croissance : 196. de risque cardiovasculaire : 161. Fer : 99. hminique : 99. non hminique : 99. plasmatique : 115. Ferritine : 99, 101, 104. plasmatique : 105, 108,116. Perritinmie : 108. Pibrates : 185. Fibrinogne : 206. Fibrinolyse : 237. Fluorescence immunoassay : 230. Fluvastatine : 185. Flux plasmatique rnal : 309. Foie : 262. Formule de Waugh : 24. Fructosamines : 152.
y-globulines : 200, 225, 296. 'y-glutamyltransfrase : 258. Y-GT : 264, 300.
Gammapathies monoclonales bnignes

227.
Gastrites : 299. Gazomtrie : 59. GBEA : 330. ^ Globules rouges : 38. Glomrule : 307. Glomrulonphrites : 270. Glucagon : 138, 149. Glucocortodes : 196. Glucose: 190,303,311. Glutlines : 187. Glycmie : 133, 143. Glycogne : 134.
Haptoglobine : 103, 204. HbAlc: 151. hCG : 209. HDL : 162, 167. Hmaties : 305. Hmatocrite : 15, 29. Hmatose : 42. Hmochromatose : 103,112,127. Hmoconcentration : 15. Hmodialyses : 114. Hmodilution : 15. Hmoglobine : 35, 99, 192. glyque : 151. Hmoglobinopathie : 114. Hmolyse : 244. Hmosidrine : 99, 101, 105. Hmostase : 237. Hparine : 42. Hpatite : 244, 250, 259, 262, 287. aigu : 249, 287 anictrique : 263. chronique : 249. thylique : 263. virale : 263. Hpatosidrose dysmtabolique : 114. Histidine : 188. Hormone : chorionique gonadotrophique : 209. de croissance : 138, 195. thyrodienne : 196, Hydroxyapatite : 68. Hydroxyproline : 71. Hydroxyprolinurie : 80, 82. Hyperaldostronisme : 17, 315. Hypercalcmies : 83, 86. Hypercalciurie : 85. Hypercapnie : 54. Hypercholestrolmie : 161, 178. Hypercorticismes : 196. Hyperfrritinmie : 108. Hyperglobulinmies diffuses : 224.
Index______________________________ Hyperglycmies : 153. provoque : 146. Hyperhydratation extraceUulaire : 16. Hyperkalimie : 41 Hypertriglycridmies familiales : 179. Hyperlipmies mixtes : 178. Hyperlipoprotinmies familiales : 177. Hypermagnsimies : 121. Hypematrmie : 20. Hyperostodose : 91. Hyperoxalurie : 314. Hyperparathyrodie : 87, 90, 298. Hyperphosphormie : 89, 90. Hypertension artrielle : 314. Hyperthyrodie : 87, 182, 196. Hyperuricmie : 182, 291. Hyperventilation : 57. Hypo-ostoidose : 92. Hypoalbuminmies : 222. Hypobromite : 272. Hypocalcmies : 88. Hypocholestrolmiants : 185. Hypoferritinmie : 108. Hypogammaglobulinmies : 223. Hypoglycmies : 153. Hypokalimie : 41. Hypomagnsimies : 122. Hypoparathyrodie : 89, 90, 244. Hypophosphatasmie : 244. Hypophosphatsmies congnitales : 244. Hypophosphormies : 90. Hypothyrodie : 182.
337
Infections : 225. Inflammation : 108, 200. Inflation hydrosode : 16. Inhibiteur de la glycolyse : 144. Insuffisance : cardiaque : 17, 302. rnale : 88, 89, 114, 122, 130, 182, 223,270,291. hpatique : 270. Insuline : 138, 195. Insulinmie : 148. Interleukines : 196. Intoxication lithie : 130. lonogramme : 13. Ions H+ : 40. Isoenzymes de la CK : 254. desLDH:251. des phosphatases alcalines : 245. Isoleucine : 188.
Jene: 51.
Kalimie : 16. Katal : 239. Kwashiorkor : 18,127,222.
Ictre : 222, 244, 250, 300. du nouveau-n et du prmatur : 200,

286.
hmolytique : 244, 250, 285. obstructif : 264. IDL : 165. Immunodiffusion : 228. Immunodosages : 227. Immunoenzymologie : 229. Immunofixation : 218. Immunofluorescence : 230. Immunoglobulines : 200. Indice de Nordin : 80. Infarctus : du myocarde : 210, 211, 249, 250,
253, 260.
rnal : 249.
Lactate : 152. Lactate dshydrognase : 250. LDL : 162. Leucine : 188. Leucocytes : 305. Leucoses : 244. Lipase : 257. pancratique : 165. Lipognse : 169. Lipolyse : 169. Lipoparticules : 169. Lipoprotine : 161. (a): 169. lipase : 165, 237. Lithiase : 271, 287 biliaire : 256. calcique : 313. cystinique : 314.
338__________________________________Biochimie clinique de phosphates ammoniaco-magnsiens : 314. urique : 314. Lithium : 128. Lupus rythmateux : 272. Lysine : 188. Microsphrocytose hrditaire : 285. Migraines : 299. Milliquivalent : 5. Millimole : 5. Milliosmole : 5. Mucoviscidose : 54. Mylome:86,272,310. multiple des os : 225. plasmocytaire : 225. Myoglobine : 210, 262, 265. Myopathies : 253. Myosine : 214, 265.
Macro-CK : 255. Macroenzyme : 255. Macroglobulinmie de Waldenstrm :

226.
Macrophages : 101, 105. Magnsium : 119. intrarythrocy taire : 121. ionis : 120. li aux protines : 120. osseux : 119. Mal des montagnes : 58. Malabsorptions : 222. Maladie : allergique : 225. auto-immunes : 225. cliaque: 127, 181. de Crigler-Najar : 286. deCrohn:314. de Dubin-Johnson : 287. de Gilbert : 286, 298. de Hodgkin : 244. de Kahler : 225. deMenks: 127. de Minkowski-Chauffard : 285. de Paget: 82,244,298. des chanes lourdes : 226. deTangier: 181. de Waldenstrm : 227, 272. de Wilson : 105, 127, 198. des buveurs de lait : 87. Maldigestions : 222. Marasme : 127, 222. Marqueurs , du remodelage osseux : 70., tumoraux : 206. Mlanodermie : 113. Mtabolisme azot : 192. du fer : 99. phosphocalcique : 67,79. Mtastases : 299. Mthionine : 188. Microglobulines : 203.
NaCl: 16. Natriurie : 16. Noglucognse : 135, 191. Nphlmtrie : 228. Nphrites : 270. Nphroangiosclrose : 271. Nphropathie : aigu : 270. glomrulaire : 18, 271. interstitielle : 271. tabulaire : 270. urique : 292. Nphrose : 223. Neuroleptiques : 259. Noradrnaline : 129. Nourrisson : 42.
Obsit : 182. Occlusions intestinales : 256. dmes : 16. strognes : 79, 126, 183,196. Oncognes : 206. Oreillons : 256. Origine du glucose sanguin : 133. du magnsium : 120. Orosomucode : 204. Orthocrsoiphtaline : 94. Os : 91. Osmolalit : 13. Ostoblastes : 69. Ostocalcine : 68, 69, 80, 82. Ostoclastes : 69. Ostocytes : 69. Ostodystrophie rnale : 89.
Index____________________________________________339 Ostomalacie : 70, 82, 85, 88, 91, 244,

298.
Ostonectine : 68, 69. Ostoporose : 70, 85, 92. Oxyde de carbone : 46, 58. Oxy hmoglobine : 35, 36.
Pancratites : 256, 257. Parasitoses : 227. Parathormone : 64, 73, 80, 83. Parotidites : 256. pCO;, : 42. PeptideC: 138, 139, 149. Pricardite : 302. pH:31,42. Rgulation : 37. Phnylalanine : 188. Phlbite : 302. Phosphatases : acides : 247. alcalines : 69, 80, 82, 242, 243, 264,
300.
C ractive (CRP) : 205. de Bence Jones : 219, 225. de la phase aigu : 203. de l'inflammation : 203. de transport : 198. glyque : 150. Protinogramme : 217. Protinurie : 219, 304. glomrulaire : 220. physiologique : 219. tubulaire : 220. Protidmie totale : 214. Proto-oncognes : 206. PSA : 247. Pseudohypoparathyrodies : 89. Psychoses maniacodpressives : 128. Pyridinolines : 71, 80, 83. Pyruvate : 152.
Phosphatmie : 67, 80. Phosphates : 66. inorganiques : 35, 67. Phosphaturie : 80. Phosphomolydbate : 96. Phosphore : 66. Phosphormie : 67, 79. Phosphovanadomolybdate : 96. Photomtrie d'mission de flamme : 95. de flamme : 21. PICP : 70. pO;, : 42,44. Polarisation de fluorescence : 233. Polyarthrite rhumatode : 310. Polykystose : 271. Porphyrie cutane : 115. Potassium : 16. Potentiomtrie : 23. Pravastatine : 185. Prlvement: 317. Pro-insuline : 138. Probucol : 186. Profil protique : 215. Progestatifs : 183. Propeptide C-terminal du procollagne 1 : 80,82. Protines : 14,35.
Rachitisme : 88, 91, 244. Radio-immunologie : 229. Rapport PSA libre/PSA total : 209. Raction : de Hay : 295. de Jaff : 279. Rcepteur apo B/E : 165. de la transferrine : 103. membranaire de l'insuline : 140. scavenger : 167. soluble de la transferrine : 103. tyrosine kinase : 140. Rglisse : 56. Rgulation de la glycmie : 136. Rein: 72, 314. Remuants : 165. Remodelage osseux : 69. Rnine-angiotensime : 314. Rptabilit : 322. Reproductibilit : 322. Rsorption : 68. Respiration de Kussmaul : 52. Restriction hydrique : 311. Rtention biliaire : 264. Retinol binding protein : 220. Rophocytose : 101.
Sarcodose : 87. Saturation en 0,2
340_________f4./-^t-^ \î__________Biochimie clinique Sels ^./Ttanie : 122. biliaires : 165. ^/TGP : 300, 300. minraux : 1. _ Thalassmie: 114. Srum-albumine : 197, 283. Thronine : 188. SIDA : 203. Tissu ostode : 68. Sidrmie : 106. Transaminase : 262, 297, 300. Sidroblastes : 114. glutamo-oxaloactique : 247. Simvastatine : 185. glutamo-pyruvique : 248. Sodium : 15. Transcortine : 199. Spasmophilie : 122. Transferrine : 101, 102, 107, 116, 198. dsialyse : 109. Spectrophotomtrie d'absorption atomique : 94, 121. Triglycride lipase hpatique : 166. Triglycrides : 161, 164. Spina bifida : 208. Sprue : 127. Troponines: 211,262. Statines : 185. Trou anionique : 51. Stries de Looser Milkman : 91. Tryptophane : 188. Superoxyde dismutase : 126. Tuberculose : 258, 271. Surcharges en fer : 112. Tubule : 310. Syndrome : 127. Tubulopathies : 291. Tumeur : 86, 244 de Cushing : 196. de Franconi : 91. du col: 271. lymphoprolifratif : 203. testiculaire : 209. nphrtique : 17, 182, 200, 223 Turbidimtrie : 227. X.-182. Synthse des protines : 190. Systme rnine-angiotensine : 314. Ulcres : 256.^ rticulohistiocytaire : 101. Unit internationale : 236, 239. Ure : 14, 15, 267, 305. tampon : 32, 35, 36. Urognse hpatique : 194. Tabagisme : 161. Taux de prothrombine : 297. maximum de rabsorption du glucose : 143. Tlopeptides : 70, 80, 83. Temps de Quick : 297, 299. Test de PAK : 85.
Valine : 188. Vitamines : 188. C : 102. D : 75, 87, 90. D3 : 63, 84, 88. VLDL : 162, 165.
Achev d'imprimer par Corlet, Imprimeur, S.A. -14110 Cond-sur-Noireau (France) N 415 - LK 80 - N d'Imprimeur : 51134 - Dpt lgal : novembre 2000 - Imprim en U.E.

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Immunologie N. Genetet, coord., 3e dition, 1997

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Chapitre 3 Mtabolisme phosphocalcique

Table des matires

Mtabolisme du magnsium, du cuivre et du lithium Sous-chapitre 1 : Magnsium...............................................................................

Mtabolisme des glucides

Table des matires

Mtabolisme des lipides et des lipoprotines 161

Gnralits sur le mtabolisme azot

Table des matires

Chapitre 9 Protines plasmatiques

Constituants azots non protiques

Exploration fonctionnelle hpatique

Chapitre 13 Exploration fonctionnelle rnale

lments d'organisation du laboratoire

Rappels physiologiques et physicochimiques

Rpartition de l'eau et des sels Grands compartiments liquidions

Figure 1.1 Les grands compartiments liquidiens de l'organisme.

changes d'eau et d'lectrolytes

Figure 1.2 Exemple de diffusion selon l'quilibre de Donnan

Exploration de l'quilibre hydrominral

Osmolalit plasmatique approche mOsm/1 Osmolalit urinaire approche mOsm/1

Mesure des lectrolytes

Applications pathologiques. Grands syndromes de perturbation de V quilibre hydrominral

Hyperhydratation extracellulaire dmes

(Chute de la pression oncotique)

DMES \ Volume plasmatique

|i. Rtention de Na"1" et eau

Rtentfon d'eau et de sels

Figure 1.3 Exemples de mcanisme d'apparition des dmes

DSHYDRATATION EXTRACELLULAIRE PURE

DSHYDRATATION EXTRACELLULAIRE AVEC HYPERHYDRATATION INTRACELLULAIRE

Approche technologique Principales mthodes de dosage

Cations plasmatiques sodium et potassium

Systme de traitement des mesures

nm Chambre de prmlange Affichage des rsultats Impression Connexion informatique

l'vier Spcimen prdilu

Figure 1.6 Schma de principe d'un photomtre de flamme.

Dosage de l'anion chlorure

> MTHODE DE SCHALES

> MTHODE AU TPTZ (TRIPYRIDYL-TRIAZINE)

AgCI -> Temps (s)

quilibre hydrolectrolytique_______________________________29 - lectromtrie : 16,3 % ; - catharomtrie : 4,6 % ; - rflectomtrie : 12,1 %.

-4.4. Dtermination de l'hmatocrite

Plasma Hmatocrite =1L

Marie-Laure Solera, Michel Lagente

Systmes tampons et quation d'Henderson-HasselbaIch

quation d'Henderson Hasselbaich

Formes de transport du CO^ sanguin

Rgulation de l'quilibre acidobasique

pK 6,1 7,83 6,60 variable 6,8

Figure 2.1 Effet Bohr.

Figure 2.2 Schma des changes respiratoires. 2.2.2. Rgulation rnale

AC = Anhydrase carbonique | Tube proximal Tube distal

Figure 2.3 Rle du rein dans l'quilibre acidobasique

Figure 2.4 changes cellulaires au cours des perturbations de l'quilibre acidobasique.

^ DOSAGE PLASMATIQUE OU SRIQUE SUR SANG VEINEUX