多糖的研究方法及其现状

活性多糖的研究 ---- 正 在 形 成 中 的
热点

方积年
中国科学院上海药物研究所
2004.11.
生命的四大物质：

蛋白质
核酸
脂类
多糖
 六十年代以后 , 随着现代
仪器分析方法的飞速发展 , 使 人
们能成功的分离纯化和鉴定生物
体 内 微量活性物质 , 从而对糖
特别是多糖的认识产生了飞跃。
 愈来愈多的研究发现 , 人 的 生 命
过程几乎都与糖链有关 :

如 细胞间通讯 , 识别和相互作用

细胞的运动和粘附
病原与宿主细胞的作用 等等 .

这是因为糖链携带着生物信息 .
它在细胞表面的分子识别过程中起着决
定性作用 .
血型
---- 红血球表面糖链末端糖基的不同

恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同
---- 糖链的不同

1995 年 Hirabayashi 提出 “类似于基因密码

, 可能也存在多糖密码”的论点 .
多糖的研究己愈来愈受到人们的关
注.
—— 国内外正在形成热
点
生物细胞 特征 :
繁殖 ( 复制 ) 凋亡 ---- 平衡
平衡破 : 细胞 过度 增生 --- 组织表
面大体积堆积 ( 肿瘤 )--- 增
生
细胞基因突变 ( 癌 )
 多糖是一种免疫调节剂 ( 激 活 机 体 免 疫
反应 )
但也有少数多糖具直接杀死癌细
胞作用
或两者俱存
---- 治疗机体免疫功能受到严重损伤的
---- 治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌
癌症和爱滋病
, 病毒引起的疾病
---- 多糖还具有明显的抗病毒、抗感染
、降血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我
们实验室发现的刺激神经细胞生长作用
徐 , 冯教授 : 抗心肌缺血作用
多糖作为药物的最大特点是毒副作用
很小
但是
多糖的研究必竟起步较晚

---- 各方面尚须进行深入的研究
---- 大量新的活性多糖有待于研究与开
发
---- 作用机制有待于完善
 多糖的构效关系的研究是寻找高
活性多糖及深入研究多糖作用机制的
基础
最近 作用机理研究 -------
进展快
机体 免疫细胞 多糖 ---- 分子水
平

------- 激 活
-------- 释放出细胞间传导的信息
Cytokine
------- 再作用于免疫细胞
--------- 体内协同作用
最终 抑制肿瘤生长
多糖在机体免疫反应中相当于 抗原
---- 免疫细胞可识别多糖
--- 迅速被多糖诱导激活产生免疫反应

多糖作用机理研究集中于 :
1. 多糖与免疫细胞是否有分子水平接触 ?
2. 怎样接触 ? 免疫细胞表面是否存在识别
多糖的受体 ?
3. 免疫细胞激活后如何协同作用杀死癌细胞 ?
 研究至今 有的已阐明

如 : 发现 β-Glucan 与免疫细胞 ( 单细胞 , 巨

噬细胞 ,
中性粒细胞 , 自然杀伤细胞 )--- 发生特异性结
合 --- 活
化信号传导途径 --- 调节细胞因子释放

1997 发现人体单细胞表面的受体

多糖对机体作用后 细胞因子 (TNF-α, IL-

1,2) 浓度
显著↑
 正在深入研 究中 :
ß-D-(1→3)-Glucan ---- 抗肿瘤

水溶 水不溶
不同立体结构 ( 单螺旋 三螺旋
无规线团 半柔顺链 聚集体 )

不同构 象 ----- 不同活性

---- 由于细胞表面受体蛋白具特定构象 --- 只

识别特殊构象多糖

杂多糖 糖蛋白 α-D-(1→3)-Glucan

------- 显著抗肿瘤
 阐明 多糖 --- 靶细胞上受体
------- 分子水平药 物设计
------- 重要指导意义

多糖 分子内及分子间 较强氢键作用
------- 不溶于水 --- 影响活性

大量实验表明
衍生化 ---- 水溶性提高 ---- 活 性 提 高
—— 近代研究另一热点
 多糖衍生化两种方法

1. 不溶性多糖 水解 醇解 酶 解
如 碱不溶性多糖 (β-Glucan 与甲壳素复
合 物 )--- 甲壳素酶解去甲壳素 --- 水溶

甲酸解
多糖 ---99%HCOOH 降解 ---99%EtOH 沉
淀 --- 溶解 , 透析 --- 冻干 ---formalated
derivatives

Smith 降解
pH3-5 水溶液— 0.1M NaIO4 氧化 ---NaBH4
还原 --- 部分酸水解 ---Polyalcohols
2. 半合成方法
衍生化基团 取代 --- 多糖中羟基
中 H 原 子 --- 改变氢键作用 --- 成盐 —改善溶解
性

羧甲基化 硫酸化 磷酸化

羧甲基化 (1) 多糖 (0.15M NaOH,

95oC, 2h)— 残渣水洗至中性 --- 悬浮于
0.06%NaCl--- 醋酸调 pH 至 4.5(50oC 6h)---
悬浮液 pH 调至碱性 --- 氯乙酸反应 --- 羧甲基
化多糖钠盐 .
(2) 多糖均匀分散异丙醇中 --- 加粉状
NaOH---
搅拌 --- 氯乙酸进行非均相反应 ---- 产物

硫酸化
在质子惰性溶液 (DMSO, DMF)
中进行 --- 加入一定比例 氯 磺酸吡 啶盐 ---
控制温度及时间 --- 获得不同取代度的硫
酸酯化多糖
可以上述两种 方法结 合

如 : 分枝的 α-(1→3)-Glucan
先去侧链 , 再羧甲基化 --- 获得线
状羧甲基葡聚糖 ( 显著免疫及抗肿瘤活性 )
---- 美国专利报导

--- 己应用于灵芝 灰树花 巨大口蘑

水溶性好 抗癌活性高的衍生物
目前研究得较为深入
：

高等真菌 ( 主要是蘑菇类 ) 产
生的

β- 葡聚糖
某些植物产生的具抗补体作用
的

果胶类多糖
影响构效关系研
究:

1) 多糖的化学平面结构测定比较困难
, 特别是含有几种糖残基的杂多糖 , 至
于决定多糖活性的高级结构 ( 三维结构 )
测定更难 . 因为多糖是水溶性胶状物质
不能结晶 , 这样限制了用通常 X- 衍 射 方
法去测定立体结构 .
2) 多糖的体内药物代谢动力学研究
困难

3) 多糖在分子水平下与蛋白质 , 核
酸等其他分子相互作用的认识还不清楚
. 由于目前有关多糖的药理研究主要
局限于观察多糖在体外或体内的生物效
应 , 要达到分子水平 , 细胞水平还需
大量研 究 .
 己有的实验证明影响多糖生物活性的
主要因素：
分子量 , 分枝度 , 高级结构 , 溶解度 ,
粘度 等
多糖 -- 大分子 --- 分子内的 糖苷键 有
较强的旋转性
------- 决定了多糖的二级结构

氢键 , 范德华力 , 色散力和 疏水性等

非共价作用
-------- 决定了多糖的三级结构
蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多
糖:
分子量 10 万至 100 万

分枝度为 2:3 至 1:5

三股螺旋立体结构的 β- 葡聚
糖
香菇多糖 , 云芝糖肽 , 裂褶菌
多糖
------- 正式在临床上应
用 证明在提高机体免疫功能上特
别是肿瘤辅助治疗中具有显著作
用 --- 受到临床医生的青睐

但是 , 人 们 期 待 更 有 效 的 活 性
多糖的问世
 特别是具有抗炎作用 , 抗病毒作
用 , 降血糖作用 , 刺激神经细胞作用的
多糖问世
目前主要可从二方面着手 :

一是 继续 从 高等真菌 ( 如灵 芝 ,
猪苓 , 猴头菇 , 冬虫夏草 , 姬松茸 ) 中
寻找活性多糖 .
同时重点从动植物特别是从传统
的中草药及海洋生物（如海藻）中寻找
高效的活性多糖 .
实验证明 :
许多属去邪扶正的中药
---- 发挥主要作用的大多是多糖成
份
---- 从中草药及海洋生物中寻找有
效的活性多糖
---- 方向
 最新报道

藻类中主要存在的硫酸酯多糖

—— 可以抑制 HIV-I 表面糖蛋白 gp120 与免

疫细胞表面 CD4 ＋受体的结合
—— 抑制合胞体 的形成

特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止
Aids 通过性交途径的感染

—— 具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良
 我们认为影响发现活性多糖的关
键:
分离纯 化方法及检测 手段 , 多糖是水溶
性大分子物质 , 它的分离纯化方法不同于一般
小 分 子 物 质 , 而且常用的检测 手段又不灵 敏 , 所
以常会将微量高活性成份的多糖作为杂质而丢
弃.

结构改造及结构修饰
--- 结构改造或结构修饰可以提高或改
变多糖的活性 .
如 具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒
作用的香菇多糖 , 如分子中引入 硫酸
基 后 , 则几乎不再具抗肿瘤作用 ,
却具显著抗爱滋病毒作用 .

同样结构修饰或改造也可以改
变给药途径 , 如高等真 菌产 生的具提高
兔疫功能的 β- 葡聚糖 , 一般注射有效
, 口服无效 . 但如果连 接有少量 肽 成
为多糖肽 , 或连接一些其他糖残基成
为杂多糖 , 则口服有效 .
 这是制作真菌来源的保健品中值得
注 意 的 问题 . 却被许多人疏忽 . 譬如说市
场上已有的香菇多糖保健品 , 实质上香菇
多糖 (Lentinan) 口服是无效的 , 那么为
什么这些保健品确实还是对人体有良好作
用呢 ? 这是因为香菇提取物中不仅存在
香菇多糖 , 还存在其他对人体有效的活
性物质 , 而真正起作用的就是这些活性物
质 , 可以这么说保健品中香菇多糖含量越
高 , 其效果越差 . 所 以 如 果 将 香 菇 提 取 物
命名为香菇多糖保健品是不恰当的 .
目前对于多糖进行结构改造或修饰常用的
方法 :
过碘酸盐氧化 Smith 降解 部分水解

衍生化
—— 硫酸化 , 羧甲基化 , 羧乙基化 , 磷酸化 , 棕
榈酰化
 多糖的羧甲基化可以提高多糖的
水溶性 , 一般水溶性提高其抗 肿 瘤活性
也提高

多糖中引入硫酸基一般均可 显 著
提高其抗 爱 滋病毒的活性 , 且 其 活 性 随
主链中的氨基糖及分枝度的增加而增
加 , 但随 主链 中去 氧
已糖及分枝度的增加
而减少
 从高等真菌中获得的 β- 葡聚糖大多
具明显的免疫活性 , 但它们 在消化道内难
以被肠 道壁直接吸收而进 入血液 , 所 以 必 须
通过注射才能发挥作用 . 如果进 行结构 修
饰 , 使 其 能 被 消 化 道 吸 收 , 变注射为口服
, 则将大大简化给药途径 .
从植物及海藻中获得的活性多糖一
般是杂多糖
----- 它们大多口服也
有效 . 植物及海藻来源的活性多糖
-----
可以作为保健品的优越之处
 多糖是亲水性大分子 , 难以透过
由脂质构成的细胞膜 , 所 以 口 服 有 效 常
受到质疑 . 有人认为多糖主要与肠道细
胞表面的相应受体分子起作用 , 或者通
过胞饮内吞作用 (pinocytosis) 由消
化道进入血液 , 然后刺激人体免疫细胞
的成熟 , 分化和繁殖 , 诱导专一性细胞
因子的产生与激活 ( 所 谓 多 糖 是 多 细 胞
因子诱导剂 ), 结果由这些免疫细胞去
吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌 , 病毒
的吸附或繁殖 .
 有人认为 β- 葡聚糖是一种融
合诱导剂 , 它能诱导免疫细胞与肿
瘤细胞的融合 , 从而使肿瘤细胞消
失 . 上述这些作用机制的理论有的
虽被初步实验证实 , 有的却是推测
, 有待人们去进一步完善 .

由此可见 , 至 今 活 性 多 糖 的
研究尚属初级阶段 .
 多糖的应用可分为两个方面
一 类 是利用多糖的独特理化性 质
，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度
和吸水性，制备医药材料、药物缓
释剂、血浆代用品等
另一类利用多糖的抗原性、抗
肿瘤、降血糖、促进免疫功能等生
物功能或活性制备疫苗或新药。至
今 从 多 糖 中 寻找 具 有 抗 爱 滋 病 的 新
药已引起人们很大的兴趣。
美国学者 M.Yalpani 认
为:
“ 至 今 多 糖 在 生 物 技 术领 域 仍 是
一个沉睡的巨人 , 有待于大家去
唤醒 .”
可以预言 :
活性多糖的研究与开发将成为
生命科学中的重要课题 .
 多糖
多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键
形式结 合起来 的聚糖

（ Polysaccharide 或 glycan ）
可用 (C6H10O5)n 表示，其中 n>10
自然界很少存在 n 为 10-30 的多糖

匀多糖——只 有 一 种类 型 的 单 糖 组 成 的 多 糖

杂多糖——几种类型的单糖组成的多糖
 直线 型
取代线状型
多糖结构
分枝型
环状型

表 1 记录了来自天然界的一些重要多糖。
天然界存在的单糖种类很多 , 但组成多糖的单糖大
致 由 表 2 所示的一些单糖组成。
 表 1. 几种天然存在的多糖

微生物 海洋生 物 陆生 植物 动物
( 包括高 等真菌
葡聚糖
） 琼脂 淀粉 糖原
（ Dextran ） （ Agar ） （ Starch ） （ Glycogen ）
果聚糖 藻酸 纤维素 硫酸软骨素
（ Levan ） （ Cellulose ） （ Chondroitin
（ Alginic
黄源胶 sulfate ）
acid ） 木聚糖
（ Xanthan ） 肝素
卡拉胶 （ Xylan ）
甘露聚糖 （ Heparin ）
（ Carrageenin 果胶
（ Mannan ） 透明质酸
） （ Pectin ）
黑曲霉多糖 （ Hyaluronic
（ Nigeran ） 海带多糖 阿拉伯胶（ Gum
arabic ） acid ）
细胞壁多糖 （ Laminaran
壳聚糖
（ Cell wall ）   卡胶
（ Chitin ）
（ Mucilage ）
polysaccharide  
）
香菇多糖
（ Lentinan ）
 表 2. 构成 多糖的 通常 的
单糖

类型 单糖
五碳糖 D- 木糖， L- 阿拉伯糖
六碳糖 D- 葡萄糖， D- 甘露糖， D- 半乳糖，
L- 半乳糖， D- 果糖
己糖胺 N- 乙酰葡萄糖胺， N- 乙酰半乳糖胺
糖醛酸 D- 葡萄糖酸， D- 半乳糖酸， D- 甘露糖
酸
去氧己糖 L- 鼠李糖， L- 岩藻糖， 6- 去氧 - 塔罗
糖
多糖研究与开发的关键
—— 多糖均一组分
—— 深入研究结
构分析、构效关系

多糖的纯度标准：
不能用通常小分子化合物的纯 度标 准来 衡量
多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同
一种多糖的相似链长的平均配布  
通常符合下列标准即可肯定为均一多
糖：
1. 在重复 的纯 化过 程中其单 糖的组 成及摩尔 比
恒定或其它理化性质不变化。如分步沉淀
（如 30%,50% 乙醇沉淀）得到的两组分
其比旋度或单 糖摩尔 比不变 。
2. 超 离 心 后 ， 具 有 相 同 沉 降 速 率 ， 即 具 有 一
个对称峰。
3. 高效凝 析（ HPGPC ）得到的一个对称峰
。 
 HPGPC
—— 目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一
种方法

—— 多糖 专 用柱 （不是通常的反相柱及氨基柱）
—— 检测仪（示差检测器或激光光散射仪）

过去常用常压凝胶层析 / 分步收集 / 硫酸 -- 苯
酚法检测 ——误差很大。
一 . 多糖的分离提取方法
通过分离纯化不使原有的多糖性质改
变（如结构改变、降解等）。
存在于动 植物细 胞壁外——胞外多糖
存在于细 胞壁内 ——胞内 多糖（大多数 多糖）
第一步——动植物体的粉碎
超声波气流粉碎技术
将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高
了多糖的提取效率
动 植物的细 胞大多由脂质 包围 ，用机械粉碎后还
必须脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）
—— 脱脂后就可以进行提取
多糖的提取常用四种方法：

A. 热水提取法：
根据大多数多糖在热水中溶解度较大且
稳定的性质进行提取 ——这种方法提取多
糖的破坏最小。
即经过上述方法处理过的植物用沸水提取 2-6 小时。
提取液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，
对于粘度大的提取液则必须采用离心法去残渣，即
得到多糖提取液或上清液。有时可在热水中加入 2-
10% 尿素，使多糖的构型改变（这种改变是可逆
的），粘度降低，增加其在 热 水中的溶解度。
B. 稀碱水溶液提取法：
酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中
溶解度不大，所以常用 5-15% NaOH 或
Na2CO3 水溶液提取。
不过 用稀碱 溶液提取时 ，温 度必须 保持在 10℃ 以
下，否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却
的条件下（ 4℃ ），放置 6-8 小 时 ， 然 后 过滤
或离心，滤液用稀盐酸调节 pH 至中性即得碱
性多糖提取液。
我们实验室 ——

通常先用热水法提取，然后残渣再用
稀碱溶液提取， 这样 可将大部分多 种类
型的多糖提取出来 。
用稀碱提取，其提取液中存在大量的无机盐，在下
一步过程中必须设法除去。
C. 酶解法：
粉碎的植物悬浮于水中
调节至最适温度（通常是 38-50℃ ）
最适 pH 范围（通常是 pH3.8-4.5 ）
加入 5-25% 复合酶，反应 4 小时
过滤去残渣
—— 滤液即为多糖提取液

该法已在多糖保健品（如香菇多糖保健品）的制备中
采用。但大多采用热水提取法及酶法相结合的办法，
即先用热水提取，然后残渣再用酶法提取，这样多糖
收率可提高许多。
D. 其它方法：
对质子惰性的溶剂如二甲亚砜作
溶剂 提取多糖
碱金属盐的有机溶剂如氯化锂 -
二甲氧基乙醇提取多糖
酸性水溶液提取多糖
—— 以上这些方法现在大多数不采用
了，理由是成本高、收率低
 二．多糖提取液中杂质的去除：

多糖提取液
—— 都含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、
低 分 子 量 的 非 极 性 物 质 及 高 分 子 量 的 有 机 杂质 （ 如
蛋白质、木质素）

透析法
—— 使用透析袋除去无机盐、单糖、寡糖和低分子量
的非极性物质