Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Cincias da Sade Departamento de Nutrio Disciplina de Bioqumica dos Alimentos

ESCURECIMENTO ENZIMTICO POR POLIFENOLOXIDASE(PFO)

Discentes: Ana Gabriella Costa Lemos da Silva Hoziana Cunha de Medeiros Ramon Morais Lopes

Docente: Nly Holland

Natal/RN 2010.2

1 INTRODUO

No escurecimento enzimtico, as oxidases (polifenoloxidase, ascorbato oxidase, lipoxidase, etc) so ativas somente nos primeiros passos da reao, na converso de fenol, enediol ou grupos funcionais dienos conjugados para compostos carbonilas ativos. As reaes que seguem as oxidaes enzimticas no so enzimticas.

O escurecimento enzimtico devido PFO de importncia comercial particularmente em tecidos vegetais. Normalmente, os substratos fenlicos naturais (cido cafico, cido protocatechico, cido clorognico, etc) esto separados da PFO em tecidos intactos e o escurecimento no ocorre.

A exposio das superfcies de frutas e vegetais cortados ao ar resultam em rpido escurecimento devido oxidao enzimtica dos compostos fenlicos presentes para ortoquinonas, que por sua vez polimerizam-se rapidamente para formar pigmentos marrons de melaninas. Na reao catalisada PFO, o substrato fenlico oxidado e o oxignio serve como aceptor de hidrognio. Assim, operaes como corte, descascamento e contuso so suficientes para causa escurecimento enzimtico.

A polifenoloxidase contm o cobre como produto prosttico, podendo este ser removido, tornando a enzima inativa.

A fenolase ou a polifenoloxidase catalisa dois tipos de reao: a) Hidroxilao de monofenis para difenis, referido como fenol hidrolase ou cresolase, monofenol ou terosinase. b) Oxidao de difenis para ortoquinona, referida como atividade de catecolase ou polifenoloxidase.

2 OBJETIVOS
Inativar termicamente a polifenoloxidase (mtodo do branqueamento); verificar o efeito do cido ascrbico e do bissulfito de sdio na atividade da polifenoloxidase e verificar o efeito do cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio e cloreto de sdio na atividade da polifenoloxidase da berinjela.

3 METODOLOGIA

3.1- Inativao trmica da PFO tratamento trmico (branqueamento)

No procedimento foram utilizados os seguintes componentes, respectivamente, como amostra: batata, banana, ma e berinjela. Foram adicionadas 30 g de batata em gua fervente por 1 minuto e outras 30 g por 2 minutos. Em seguida cada amostra foi resfriada em gua fria e homogeneizada, em liquidificador com 300 ml de gua destilada. Foram pipetados 4 ml de catecol 0,2% em tampo fosfato 0,05 M pH 6,0 e em seguida adicionados 0,5 ml de gua destilada e 0,5 de amostra obtida anteriormente. Os tubos de ensaio foram encubados em banho-maria termostatizado a 40 c durante 20 minutos, para que em seguida a colorao obtida pudesse ser observada. O processo foi seguido com as trs amostras seguintes.

3.2 - Efeito do cido ascrbico na atividade da polifenoloxidase

Foram adicionados 4 ml de soluo de catecol 0,2% em tampo fosfato 0,05M pH 6,0 em 5 tubos de ensaio. A partir de solues de cido ascrbico 0,5%, foram preparadas solues de cido ascrbico de concentraes de 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02%, as quais foram adicionadas, inclusive a 0,5%, nos 5 tubos de ensaio. Foram adicionados tambm 0,5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos, para que ento pudessem ser observadas as coloraes e a ocorrncia ou no de escurecimento enzimtico em cada concentrao de inibidor.

3.3 - Efeito do bissulfito de sdio na atividade da polifenoloxidase

Foram adicionados 4 ml de soluo de catecol 0,2% em tampo fosfato 0,05M pH 6,0 em 5 tubos de ensaio. A partir de solues de bissulfito de sdio 0,5%, foram preparadas solues de cido ascrbico de concentraes de 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02%, as quais foram adicionadas, inclusive a 0,5%, nos 5 tubos de ensaio. Foram adicionados tambm 0,5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos, para que ento pudessem ser observadas as coloraes e a ocorrncia ou no de escurecimento enzimtico em cada concentrao de inibidor.

3.4 - Efeito do cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio e cloreto de sdio na atividade da polifenoloxidase da berinjela
Foram preparadas 30 ml de soluo de cido ascrbico a 0,5%, cido ctrico a 0,5% e 1,0%, bissulfito de sdio a 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,05% e 0,02% e cloreto de sdio a 1,0% e 0,5%. 30 ml de cada concentrao foram colocadas em placas de Petri numeradas. Uma berinjela foi descascada e cortada em fatias de 0,7 cm de espessura e foi colocada uma fatia sobre cada placa de Petri. As amostras foram trituradas com basto de vidro em suas respectivas placas, para que em seguida fossem observadas suas coloraes diante de cada soluo.

4 RESULTADOS E DISCUSSES

4.1- Inativao trmica da PFO tratamento trmico (branqueamento)

A mudana de cor de acordo com tempo em que as amostras foram imersas em gua fervente pode ser observada na tabela 1.

Tabela 1: Mudana de cor das amostras de acordo com o tempo de imerso em gua fervente
PFO Batata Banana Maa Berinjela 1 minuto ++ ++ 2 minutos +

Legenda: - : incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de intensidade leve

O branqueamento um processo bastante utilizado na indstria de alimentos. Consiste na promoo de um choque trmico no alimento, onde esse exposto gua em temperatura de pr-fervura e em seguida exposto a uma baixa temperatura. Esse processo inativa a enzima polifenoloxidase (PPO), uma vez que a exposio da mesma a altas temperaturas pode causar mudanas na sua forma dimensional (desnaturao) tirando sua capacidade de catalisar reaes de oxidao dos compostos fenlicos, as quais so responsveis pelo escurecimento das frutas.

O resultado mostrou que o a exposio da mistura contendo extrato da batata, catecol e gua destilada ao calor eficiente para inativar a PPO em apenas 1 minuto, concluise isso pela ausncia de cor do lquido. Para inativao do PPO da banana foi necessrio 2 minutos na gua em temperatura de fervura, pois ao fim desse tempo a

mistura contendo catecol, gua destilada e extrato de banana gerou uma soluo incolor. A exposio da mesma mistura durante 1 minuto na gua em temperatura de fervura resultou em um lquido de cor classificada como marrom de intensidade mdia. Isso indica que a enzima no foi inativada e desenvolveu sua atividade cataltica da oxidao dos fenis, gerando escurecimento. Assim como na batata, a exposio da mistura contendo catecol, gua destilada e estrato de ma durante 1 minuto foi o suficiente para inativar a enzima PPO, pois o resultado foi um lquido incolor. A exposio da mistura contendo catecol, gua destilada e extrato de berinjela gua em temperatura fervente durante 1 e 2 minutos no foi suficiente para inativar a enzima PPO, a mistura gerou respectivamente uma colorao classificada como marrom de intensidade mdia e marrom de intensidade leve, indicando que houve atividade enzimtica de escurecimento realizado pela PPO.

4.2 - Efeito do cido ascrbico na atividade da polifenoloxidase

A mudana de cor das amostras de acordo com as diferentes concentraes de cido ascrbico pode ser observada na tabela 2.

Tabela 2: Mudana de cor das amostras de acordo com as concentraes de cido ascrbico
cido ascrbico 0,50% 0,25% 0,10% 0,05% 0,02% + ++ + ++ +++ + ++ + ++ PFO batata PFO banana PFO ma PFO berinjela

Legenda: - : incolor +: marrom de intensidade muito leve

++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermdiria

O cido ascrbico um potente antioxidante que atua de duas formas na manuteno das cores naturais das frutas. A propriedade j citada desse cido, conhecido popularmente por Vitamina C, atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior, impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas, responsveis pela colorao amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados. Outra ao desse cido a sua capacidade de diminuir o pH do meio, essa ao favorece a inibio da atividade da polifenoloxidase, a qual tem mxima atividade por volta de pH 6, sendo assim a reao de hidroxilao dos fenis em orto-difenis no ser iniciada e as frutas permanecero com a cor de colheita por um bom tempo.

Como se pode perceber atravs da anlise da tabela 2, a mnima concentrao do cido ascrbico capaz de no permitir a reao de escurecimento enzimtico igual a 0,10%. Essa mnima concentrao permaneceu para manuteno da cor de colheita da ma e da berinjela. J na banana a concentrao de 0,10% foi responsvel por uma colorao classificada como marrom de intensidade leve, isso indica que essa concentrao no foi capaz de inibir a reao de escurecimento. Para a banana a mnima concentrao foi 0,25%.

4.3 - Efeito do bissulfito de sdio na atividade da polifenoloxidase

A mudana de cor das amostras de acordo com as diferentes concentraes de bissulfito de sdio pode ser observada na tabela 3.

Tabela 3: Mudana de cor das amostras de acordo com as concentraes de bissulfito de sdio
Bissulfito sdio 0,5% 0,25% 0,10% 0,05% 0,02% ++ + +++ ++ ++ de PFO batata PFO banana PFO ma PFO berinjela

Legenda: - : incolor +: marrom de intensidade muito leve ++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermdiria

Comparando a ao do bissulfito sobre a conservao da colorao natural dos frutos com a ao do acdo ascrbico, podemos perceber, pela anlise da tabela 3, que aquele mais eficaz. Essa alta eficcia garantida pela capacidade que esse composto de frmula NaHSO3 tem de se complexar ao grupo prosttico da enzima polifenoloxidase, o cobre. Quando isso ocorre essa enzima perde sua capacidade de hidroxilao dos fenois, no ocorrendo o escurecimento enzimtico. Ela tambm atua revertendo a reao de hidroxilao dos fenis em orto-difenois e reao de oxidao dos orto-difenois em orto-quinonas. Ou seja, mesmo se o escurecimento tiver sido iniciado e estiver nas fazes citadas, o bissulfito tem a capacidade de reverter.

menor

concentrao

desse

composto

responsvel

pela

inativao

da

polifenoloxidase foi igual a 0,02% para batata, ma e berinjela. Essa mesma concentrao usada na banana gerou uma colorao classificada como marrom de intensidade leve. Isso demonstra que ela no foi inativada. Para que a inativao ocorrese foi necessrio uma mnima concentrao de 0,10%.

Apesar dos resultados bastante efetivos na inativao da polifenoloxidase, o bissulfito de sdio tem seu uso limitado pela legislao por ser txico e seu resduo causar vrios problemas ambientais (Oga, 1996).

4.4 - Efeito do cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio e cloreto de sdio na atividade da polifenoloxidase da berinjela
A mudana de cor das amostras de acordo das diferentes concentraes de cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio e cloreto de sdio pode ser observada na tabela 4.

Tabela 4: Mudana de cor das amostras de acordo das diferentes concentraes de cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio e cloreto de sdio
PLACAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AMOSTRA Berinjela + 30 mL gua Berinjela + 30 mL c. ascrbico 0,5% Berinjela + 30 mL c. ctrico 1,0% Berinjela + 30 mL c. ctrico 0,5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,25% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,1% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,05% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0,02% Berinjela + 30 mL NaCl 1,0% Berinjela + 30 mL NaCl 0,5% RESULTADO ++++++ ++ +++ ++++ + + ++ +++++ ++++

Legenda:
-: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de iIntensidade leve +++: marrom de intensidade intermediria

++++: marrom de intensidade forte +++++: marrom de intensidade muito forte ++++++: marrom super intenso

Agentes acidulantes so freqentemente usados para manter o pH do meio mais baixo que o pH timo para a ao cataltica das enzimas em alimentos. Exemplos de acidulantes que podem inibir o escurecimento enzimtico so os cidos ctrico, mlico e fosfrico (ZEMEL et all. 1990). Na prtica experimental foi utilizado o cido ctrico que age de duas formas para o cancelamento do escurecimento enzimtico. Ele pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase. Segundo Macedo (2005) as polifenoiloxidases so enzimas que possuem os ons Cu2+. A remoo desses ons do stio ativo por quelao inativa a enzima. No entanto, para a prtica experimental, o cido ctrico no foi um bom inibidor do escurecimento enzimtico nas concentraes 0,5% e 1,0%, os mesmos apresentaram respectivamente uma colorao classificada como marrom de intensidade forte e marrom de intensidade intermediria, com isso pode se concluir que o aumento da concentrao desse cido provoca diminuio da atuao da polifenoloxidase da berinjela.

O bissulfito de sdio pode agir diretamente nas enzimas pela diminuio do nmero de pontes dissulfeto no centro cataltico (SAYAVEDRA-SOTO e MONTGOMERY, 1988; WALKER e FERRAR, 1998), ou nos compostos de reao, formando sulfonatos sem colorao, ou reduzindo-os aos fenis precursores (WONG, 1995; ARAJO, 1999). Na prtica experimental a melhor concentrao para inativao da polifenoloxidase foi 0,1% e 0,05%, pois o resultado foi um lquido classificado como incolor. As concentraes 0,25% e 0,5% garantiram uma colorao para o lquido que circundava a berinjela classificado como marrom de intensidade muito leve e a concentrao 0,02 uma cor marrom de iIntensidade leve. As concentraes 0,05% e 0,1% geraram uma lquido incolor, indicando a inativao da enzima. No entanto na literatura os resultados para essa prtica no so coerentes com esse resultado, normalmente com o aumento da concentrao do bissulfito de sdio ocorre diminuio da atividade da polifenoloxidase, que resulta em um lquido incolor.

A imerso do tecido vegetal em gua aps injria mecnica ou corte faz com que a reao de escurecimento enzimtico no seja realizada, pois para ela ocorrer necessrio, alm da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato, os compostos fenis, preciso o oxignio. Na gua a concentrao do O2 muito limitada quando comparada com a concentrao do ar, por esse motivo na gua a reao de escurecimento enzimtica mais lenta, no entanto ela ainda se processa e na prtica experimental a imerso da berinjela em gua destilada resultou na colorao mais intensa do estudo, a qual foi classificada como marrom super intenso.

O cido ascrbico, ou vitamina C, alm de atribuir valor nutricional aos alimentos, tambm apresenta ao redutora. Juntamente com seus sais neutros compe um dos principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reaes oxidativas de duas maneiras: (1) agindo diretamente na enzima, complexando o cobre do grupo prosttico da PPO, causando sua inibio; (2) reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenis, impedindo a formao dos pigmentos escuros (SAPERS e MILLER, 1998). O cido ascrbico foi usado na presente prtica experimental para inativao da polifenoloxidase da berinjela em dois momentos, no primeiro a concentrao de 0,5% resultou em um lquido incolor, no segundo a mesma concentrao promoveu uma colorao classificada como marrom de iIntensidade leve. Esse fato pode ser explicado por duas causas; no primeiro experimento contendo cido ascrbico e berinjela, a enzima foi obtida atravs do extrato de berinjela, isso pode ter resultado em uma melhor extrao da polifenoloxidase, que ficou em maior concentrao, podendo agir com maior eficcia, quando comparado com o segundo experimento, onde as nicas enzimas que estavam agindo eram provenientes da superfcie do tecido vegetal que tinha sido cortado da berinjela. Outro motivo pode ter sido advindo de erros na legenda, j que grupos diferentes realizaram os experimentos.

O NaCl no apresentou um bom resultado para o bloqueio da reao de escurecimento enzimtico. A concentrao de 0,05% foi responsvel pela colorao do lquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentrao 0,1% gerou uma colorao marrom de intensidade muito forte. Isso indica a fraca ao do NaCl para o bloqueio dessa reao.

REFERNCIAS
1 - ARAJO, J. M. A. Qumica de alimentos: teoria e prtica. 2. ed. Viosa: UFV, 1999. p. 319-329. 2 CARNEIRO, Cristine et al. Estudo das atividades de peroxidades e polifenoloxidase de guariroba (Syagrus oleracea Becc) sob a ao de diferentes inibidores. Gois: Acta Scientiarum: Biological Sciences, 2003. 3- LUPETTI, Karina et al. Anlise da imagem em qumica analtica: empregando metodologias simples e didticas para entender e prevenir o escurecimento de tecidos vegetais. So Paulo: Qumica Nova, 2005. 4 - OGA, S. Aditivos alimentares, In: Fundamentos de toxicologia. So Paulo: Atheneu, 1996. parte 5, p. 405-440. 5 - SAPERS, G. M.; MILLER, R. L. Browning inhibition in fresh-cut pears. J. Food Sci., v. 63, n. 2, p. 342-346,1998. 6 - SAYAVEDRA-SOTO, L. A.; MONTGOMERY, M. W. Response contour diagrams to describe effects of moisture, storage, temperature, and sulfur dioxide on color of dried apples. J. Food Sci., v. 53, n. 2, p. 643-644, 1988. 7 - WONG, D. W. S. Qumica de los alimentos: mecanismos e teoria. Zaragoza: Acrbia, 1995. p. 233-236, 365, 372.