FUNDAMENTOS Y TCNICAS DE ANLISIS BIOQUMICOS

UT 1. MTODOS DE ANLISIS BIOQUMICOS

INTRODUCCIN

(24/09/01)

LABORATORIO DE BIOQUMICA: se aplican mtodos qumicos y bioqumicos en el estudio de la enfermedad. Los estudios bioqumicos constituyen una tercera parte de todas las determinaciones del Laboratorio. UTILIDADES: diagnstico. Valoracin del pronstico y del tratamiento, investigacin, ensayos clnicos de frmacos.

PROCESO ANALTICO
2.1. FASE PREANALTICA Correcta cumplimentacin de la peticin analtica: legible, datos mnimos imprescindibles (edad, sexo, raza, fecha de la solicitud) y datos complementarios (juicio clnico, semanas de embarazo, da del ciclo en caso de hormonas sexuales en mujeres, medicacin, etc.. Preparacin del paciente: (25/09/01) Ayuno: se aconseja de forma generalizada. Se puede beber agua. Alcohol: altera la concentracin de lactato, cido rico, enzimas hepticas... Tabaco: contraindicado si se piden catecolaminas, cortisol, cidos grasos... - Ejercicio fsico: altera los niveles de enzimas musculares como la creatinfosfoquinasa (CPK). - Estrs: puede alterar los resultados de los anlisis. - Dieta: algunos parmetros requieren restricciones o cambios en la dieta previos a la determinacin. Ej. Aclaramiento de creatinina: no tomar exceso de carne. - Supresin de la medicacin: para el aclaramiento de creatinina suprimir por ejemplo antiinflamatorios no esteroideos. Obtencin de la muestra: - Extraccin de sangre: en posicin sentado o tumbado. - Recogida de orina de 24 horas: algunos parmetros requieren condiciones de acidez por lo que habr que aadir un cido al recipiente de recogida (Ej. El 5hidroxiindolactico, aldosterona en orina, etc). - Niveles de frmacos: hay que tener en cuenta la hora de la administracin. Se suelen tomar las muestras 3-4 horas antes de la siguiente dosis. Hay casos particulares. - Ritmo cardaco: hay que tenerlo en cuenta para algunas sustancias como ACTH, cortisol, etc. 2.2. FASE ANALTICA

 TCNICAS ANALTICAS: son los diferentes procedimientos de anlisis basados en el comportamiento de la materia ante la Energa: - Espectrofotometra: autoanalizadores - Cromatografa - Qumica seca - Electroforesis - Electroqumica - Inmunoensayos

(25/09/01) MTODOS ANALTICOS: son aplicaciones de las tcnicas, en casos determinados, con parmetros y protocolos concretos. Su nombre hace referencia a: a) Alguna caracterstica analtica: mtodo del punto final, mtodos cinticos, mtodos colorimtricos, mtodos enzimticos, mtodos de curva de calibracin, etc. b) Alguno de los reactivos usados: mtodo de la glucosa-oxidasa, mtodo del verde bromocresol, etc. c) A la persona que optimiz el mtodo: mtodo de Biuret, mtodo de Jaff, etc. 2.1 FASE POSTANALTICA Es el conjunto de procesos que van desde la obtencin de los resultados analticos hasta que el clnico solicitante tiene el informe de resultados. Es una fase compleja pero decisiva para cumplir una calidad total. Validacin de resultados Valoracin tcnica: es la aceptacin de los resultados obtenidos por las distintas tcnicas. Valoracin clnica: los resultados deben ser coherentes con la clnica.

Informe de resultados Tiempo de respuesta: es el tiempo que transcurre hasta que se entregan los resultados al mdico solicitante. Debe ser lo ms corto posible, sin sacrificar la calidad. Teora de los valores de referencia: son intervalos de normalidad de los resultados, los lmites superior e inferior no son rgidos (se pueden usar los valores anteriores del propio sujeto aunque normalmente no se tienen datos suficientes). Variabilidad de los resultados analticos: Variaciones analticas: toda determinacin analtica est sometida a una variacin que se denomina error analtico Variaciones extraanalticas: pueden ser fisiolgicas, tanto interindividuales como intraindividuales.

3. CONTROL DE CALIDAD
2.1 Control de calidad interno:

a) Calidad en el Laboratorio: se basa en controlar los resultados que emite el

Laboratorio. Es muy importante porque la calidad de los resultados analticos puede afectar a la salud de las personas y puede traer importantes consecuencias econmicas. Para controlar la calidad del Laboratorio se pone en marcha el programa de control de calidad.

b) Programa de Control de Calidad:

(25/09/01) Objetivos: 1. Asegurar que los datos producidos por un determinado mtodo analtico son cientficamente vlidos, defendibles ante terceras personas y tienen unas conocidas y aceptadas precisin y exactitud. 2. Evaluar de forma real la capacidad funcional habitual de un Laboratorio con respecto a otros. 3. Identificar problemas a medida que surgen. 4. Resolver los problemas. Requisitos: 1. Participacin de todo el personal del Laboratorio. 2. Debe ser coordinado con la mxima eficacia por el responsable de la calidad. 3. Se debe informar peridicamente al personal del Laboratorio. Fundamento: el control de calidad se basa en la manipulacin de datos estadsticos que se obtienen de la repeticin de los ensayos. Se realizan un conjunto de experimentos sistemticos encaminados a asegurar la precisin y la exactitud de los anlisis. Concepto de Exactitud y Precisin: Exactitud: es el acercamiento de un resultado o de la media de un grupo de resultados al valor verdadero o a un valor aceptado como tal. Precisin: es el grado de concordancia entre medidas repetidas de una misma muestra, es decir, est relacionada con la dispersin que tiene varias determinaciones de una misma muestra. El valor numrico que define la precisin es la Desviacin Estndar:

Y tambin se define por otro valor, que es el Coeficiente de Variacin:

Para calcular la SD se deben determinar como mnimo 20 mediciones sucesivas del parmetro en cuestin. El 95% de los resultados deben encontrarse entre los siguientes valores: - X 2 SD - En la prctica X 3 SD

(26/09/01) La SD expresa la amplitud de la variacin de los resultados de tal manera que sta se debe slo a errores aleatorios y los valores se distribuyen como una curva normal o de Gauss:

Tipos de errores experimentales: Errores Sistemticos: son de causa ajena a lo que es el propio mtodo en s. Afectan tanto a la exactitud como a la precisin. Estos errores no deben existir, siempre que se de uno hay que buscar las causas y evitarlo. Errores Aleatorios: rigen la precisin del mtodo y dependen del propio mtodo. No se pueden evitar.

c) Control de calidad interno basado en el empleo de muestras control.

C.1. SELECCIN DE LAS MUESTRAS DE CONTROL DE CALIDAD: se emplean preparados comerciales de referencia que son liofilizados. C.2. GRFICOS CONTROL: hay distintos tipos, el ms extendido en el LDC es el grfico de Levey-Jennings, en el cual los resultados de control son expresados en el eje de ordenadas con respecto al tiempo o a las determinaciones sucesivas en el eje de abcisas.

Se introduce la muestra control una vez al da o una vez por turno de trabajo y se van anotando los resultados del anlisis. Cuando tengamos como mnimo 20 determinaciones se hace la interpretacin del grfico. 5

En la grfica se apunta el valor medio esperado que es el valor que resulta de la media de todos los valores de las muestras de referencia analizadas. El valor medio esperado se utiliza para valorar la precisin del mtodo. En el caso de la exactitud ser el valor medio de referencia que tiene la muestra control cuando es suministrada por el Laboratorio de referencia. El valor medio se representa como una gruesa lnea en el centro de la grfica. Se sealan los lmites de control aceptados, que se representan por una lnea de puntos en el grfico de control. (26/09/01) Modificaciones frecuentes en los grficos de control: Dispersin: cuando los errores aleatorios o la imprecisin aumentan Tendencia: es la desviacin sistemtica de los valores observados cuando el mtodo analtico sufre un problema en desarrollo progresivo. Desviacin: es una modificacin abrupta o brusca con respecto al valor medio establecido.

TCNICA MULTIRREGLA DE WESTGARD 1: 3 SD una observacin supera la media el lmite de 3SD 2: 2 SD dos observaciones consecutivas superan la misma media 2SD R:4 SD dos observaciones consecutivas se diferencian ms de 4SD 4: 1 SD cuatro observaciones superan la media 1SD 10:MEDIA diez observaciones caen a un mismo lado de la media. Las reglas 1:3SD y R: 4SD generalmente sugieren un error aleatorio. Las reglas 2:2SD, 4:1SD y 10:MEDIA suele ser un error sistemtico.

3.2. Control de calidad externo 6

Tiene como objetivo principal conocer la comparacin de los resultados analticos de diferentes Laboratorios. En la actualidad existen 2 tipos de programas:

a) Programas de vigilancia o pruebas de eficacia, en las que gran

nmero de laboratorios analizan las mismas muestras varias veces al ao. b) Programas de control de calidad regional, en los que un grupo de laboratorios de una Regin emplea los mismos lotes de muestras control para su programa de calidad interno. Se analizan durante un perodo de aproximadamente un ao y, los resultados son enviados semanal o mensualmente al suministrador de programa. ste compara el valor medio y la SD con los otros laboratorios. (27/09/01)

UT. 2 MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS I

1. NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA
La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define: a) Longitud de onda ( ): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0 = 10-9 m.

b) Frecuencia ( ): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda.

Su frmula es: = c/ , y se mide en ciclos por segundo o hertzios. c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x = h x c/ (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa. d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes para nosotros son: Regin Ultravioleta: = 10-380 nm Regin Visible: = 380-780 nm Regin Infrarroja: = 780-30.000 nm En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENMENO DE ABSORCIN Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado 7

excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h. ). La partcula en estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.

(27/09/01) Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de absorcin.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia). B. FENMENO DE EMISIN Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.

3. LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia.

Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida: T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100. Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene 8

todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco. La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

(28/09/01) La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente: - Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0 - Si el %T = 0 A = 2-log 0 = En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia. 3.1. LEY DE BEER La absorbancia de una solucin es directamente proporcional ala concentracin y a la longitud del paso de la luz. A = . b. c Siendo: A: absorbancia. No tiene unidades. : el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm). b: es la longitud de paso de la luz, en cm. c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L. La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de dos formas: 1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas: 2. A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la curva de calibracin. Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin. Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin 9

falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad. Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

(03/10/01) 4. ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos: Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.

Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difraccin. Monocromador de Prisma

2.2. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible. Tipos de lmparas: Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante entre 360-950 nm. Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad. 10

Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm. Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y cromatografa HPLC. Precauciones: - Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios en las lecturas de la Absorbancia. - La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato. (03/10/01) 2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda. 3. Monocromadores. Pueden ser: - Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano. - Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeo prisma. 4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01) 5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico. 6. Detector. Puede ser de dos tipos: Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:

Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre. A sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que seala el paso de corriente. Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra. 11

Fototubos multiplicadores:

(04/10/01) Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces. Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y son muy sensibles. 7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin. (05/10/01) 4.2 TIPOS DE APARATOS ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripcin dada para el espectrofotmetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para determinar bilirrubina directa en capilar). ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes estn duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz y de absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: utilizan los mismos componentes que el espectrofotmetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un Chopper consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de una cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la variacin de energa radiante.

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(05/10/01)

UT. 3 MEDIDAS FOTOMTRICAS II

1. FLUORIMETRA 1.1 CONCEPTOS GENERALES A. Luminiscencia B. Fluorescencia 1.2 INSTRUMENTACIN FLUOROMTRICA A. Fluormetro B. Espectrofluormetro 1.3 1.4 CARACTERSTICAS DE LA FLUORIMETRA APLICACIONES

2. FOTOMETRA DE LLAMA 2.1 CONCEPTOS GENERALES A. Generalidades B. Fundamento C. Interpretacin 2.2 INSTRUMENTAL 3. ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA 3.1 PRINCIPIOS 3.2 INSTRUMENTAL A. Lmpara de ctodo hueco B. Quemador C. Componentes fotomtricos 3.3 ABSORCIN ATMICA 4. NEFELOMETRA Y TURBIDIMETRA 4.1 PRINCIPIOS. LEY DE RAYLEIGH 4.2 DETECCIN DE LA LUZ DISPERSADA 13

A. Turbidimetra B. Nefelometra

(09/10/01)

1. FLUORIMETRA (FLUOROMETRA)
1.1 CONCEPTOS GENERALES
A. LUMINISCENCIA: es un fenmeno resultante de la interaccin de la luz con la materia que tiene como resultado la emisin de energa radiante. Dentro de la luminiscencia se incluyen la fluorescencia, fosforescencia y la quimioluminiscencia. B. FLUORESCENCIA: se produce cuando una molcula absorbe luz de una determinada longitud de onda y emite luz de una longitud de onda superior y, por lo tanto, de menor energa. Es un fenmeno ms lento que el de la absorcin. As, entre la absorcin de energa y la liberacin en forma de fluorescencia se produce un retraso de 10-8 10-4 segundos, mientras que en la absorcin, el retraso es de 10-15 segundos. Si el tiempo transcurrido es inferior a 10-4 segundos se habla de fosforescencia. La relacin entre la concentracin de la sustancia y la intensidad de emisin fluorescente se deduce a partir de la Ley de Beer segn la siguiente expresin: I = Intensidad transmitida I / I0 = 10- bc I0 = Intensidad de la luz incidente = coeficiente de extincin molar b = longitud de paso de la luz c = concentracin Se llama rendimiento cuntico de la fluorescencia a la relacin entre los fotones emitidos y los absorbidos: = I / I0 Puede ir desde 0, para sustancias no fluorescentes; hasta 1 cuando la fluorescencia es ptima. Realizando operaciones matemticas, se llega a la conclusin de que la intensidad de la radiacin fluorescente es proporcional a la concentracin de la sustancia. La fluorimetra combina la simplicidad de la fotometra con la alta sensibilidad y especificidad del fenmeno fluorescente.

1.2 INTRUMENTACIN FLUOROMTRICA

Se utilizan dos tipos de aparatos: A. FLUORMETRO: emplea filtros de vidrio o filtros interferenciales para seleccionar la longitud de onda de excitacin y de emisin. 14

B. ESPECTROFLUORMETRO: emplea prismas o redes de difraccin para seleccionar las longitudes de onda. Ambos aparatos tienen como componentes bsicos: Fuente de energa radiante: son dos lmparas de arco de Xenn o lmparas de Mercurio. Emiten energa radiante de intensidad elevada. Rendijas de entrada y salida (= que en el espectrofotmetro) Monocromadores: pueden ser filtros o prismas o redes de difraccin. Hay dos monocromadores: Monocromadores de excitacin o primario, que selecciona las longitudes de onda de excitacin. Monocromadores de emisin o secundario, que selecciona la longitud de onda de emisin antes que la luz llegue al detector.

Cubetas: son de slice o cuarzo. No todas las de plstico valen porque pueden originar fluorescencia adicional. Detectores: son fototubos multiplicadores. Amplan la pequea seal fluorescente pudindola cuantificar. Son muy sensibles. El monocromador secundario y el detector estn situados en ngulo recto en relacin al haz de luz incidente para impedir que la luz procedente de la lmpara llegue al detector. Los espectros de absorcin y emisin varan de un compuesto a otro, por lo que al hacer una determinacin, hay que seleccionar la longitud de onda de excitacin ms adecuada, que es la de mxima absorcin; y hay que seleccionar la longitud de onda de emisin ms adecuada, que es la del mximo de fluorescencia.

1.3 CARACTERSTICAS DE LA FLUOROMETRA

(10/10/01)

Tiene una muy alta sensibilidad. Es de 100 a 1000 veces ms sensible que las tcnicas colorimtricas normales. Las medidas de fluorescencia se expresan en unidades de intensidad relativa, se emplea lo que se llama Rendimiento de Fluorescencia Relativo. La seal electrnica variar para la misma concentracin de una sustancia de un instrumento a otro y, por lo tanto, no se podrn comparar.

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 Las medidas de fluorescencia se deben hacer siempre en soluciones diluidas. La absorcin debe ser como mximo del 2% de la radiacin incidente. Por encima de esta absorbancia no se ilumina por igual todas las partes de la solucin y, por lo tanto, se emitir distinta fluorescencia en las distintas capas de la solucin. Las cubetas no deben tener ralladuras porque aumentan la dispersin de la luz; ni se deben tocar con los dedos las caras pticas de las cubetas, porque se produce fluorescencia contaminante.

1.4 APLICACIONES

(10/10/01)

FLUOROINMUNOANLISIS: son anticuerpos marcados con una sustancia fluorescente, especficos de la sustancia que se va a estudiar. etc. DETERMINACIN de vitaminas, frmacos, algunas enzimas,

2. FOTOMETRA DE LLAMA
2.1 CONCEPTOS GENERALES
A. GENERALIDADES: La fotometra de llama se basa en el fenmeno de emisin de luz. Se utiliza para la determinacin de Sodio, Litio y Potasio (Na, Li, k) en lquidos biolgicos. B. FUNDAMENTO: un tomo en estado fundamental sometido a la energa calorfica de una llama excita sus electrones pasando stos a niveles superiores de energa. Como all son inestables, vuelven a su estado inicial emitiendo el exceso de energa en forma de luz. La luz desprendida puede tener distintas longitudes de onda. Se debe seleccionar para un elemento aquella longitud de onda en la que emite con mayor intensidad y hay menos posibilidades de tener longitudes de onda cercanas que interfieran.

C. INTERPRETACIN: la intensidad luminosa es directamente proporcional al nmero de tomos que emiten energa, que a su vez es directamente proporcional a la concentracin del in de la muestra. Los metales alcalinos (Li, Na, y K) son los ms fciles de excitar con una llama. Al ponerse en contacto con la llama, cada metal tiene un color caracterstico que es: Litio-rojo; Na-amarillo y K-violeta. Y las longitudes de onda correspondientes a estos colores son las que se usan para determinar los iones correspondientes.

2.2 INSTRUMENTAL
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Se usan aparatos iguales al espectrofotmetro pero sustituyendo la lmpara por una llama.

GASES: suele usarse gas natural, acetileno o propano con aire u oxgeno. La eleccin del gas depende de la temperatura que se desee. Normalmente se utiliza propano-aire para Na y K. El flujo de gas debe ser constante, para ello se necesitan reguladores. ATOMIZADOR: tiene como funcin disgregar la solucin problema en pequeas gotas para que los tomos absorban la energa trmica de la llama y se exciten. Se debe aspirar previamente agua y soluciones estndar, adems de un calentamiento previo para que la llama mantenga la temperatura constante. Se introducen comprobaciones con estndares de concentracin conocida entre las determinaciones.

3. ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICA

Se utiliza para la determinacin de Calcio, Magnesio, Cobre, Zinc, Plomo y otros metales

3.1 PRINCIPIOS
La tcnica de basa en la absorcin de la luz por parte de los tomos vaporizados en estado de reposo. El espectro de absorcin de un tomo es muy estrecho (corto), recibe el nombre de espectro de lneas y va de 0,001 a 0,01 nm. Se basa en medir la cantidad de luz a la longitud de onda seleccionada que es absorbida cuando la luz pasa a travs de una nube atmica. Los tomos de corresponden al metal que se va a medir y se cumple que a mayor concentracin del metal, mayor absorcin.

3.2 INSTRUMENTAL
Los espectrofotmetros de absorcin atmica constan de: LMPARA DE CTODO HUECO: Es la fuente de luz. Est constituida por un ctodo hueco del metal que se va a medir, que emite el espectro de lneas caracterstico de este metal. El nodo y el ctodo se encuentran en un cilindro de vidrio sellado y relleno de un gas inerte (Ej. Ne, Ar). En el cilindro hay una ventana de vidrio o de cuarzo que permite la transmisin de la luz.

CHOPPER 17

QUEMADOR: tiene como funcin colocar al metal en estudio en un estado en el que se produzca la absorcin de la luz. Para ello tienen lugar 2 procesos: Nebulizacin de la muestra, es decir, transformar la solucin en un fino aerosol antes de ser introducida en la llama. Atomizacin: consiste en la evaporacin del solvente dentro de la llama dando lugar a la formacin de tomos. El combustible utilizado es el acetileno, usndose llamas aireacetileno. RENDIJA DE ENTRADA; MONOCROMADOR; RENDIJA DE SALIDA; DETECTOR; MEDIDOR.

4. NEFELOMETRA Y TURBIDIMETRA
4.1 PRINCIPIOS

(15/10/01)

Cuando un haz de luz choca contra una partcula en suspensin sufre una serie de fenmenos: DISPERSIN de la luz REFLEXIN ABSORCIN TRANSMISIN La DISPERSIN de la luz depende de varios factores, que son: Tamao y peso molecular de las partculas Longitud de onda de la luz incidente Distancia del detector a la cubeta Concentracin de partculas Todos estos factores se relacionan mediante complejas frmulas matemticas, por la Ley de Rayleigh.

4.2 DETECCIN DE LUZ DISPERSADA

Se utilizan dos mtodos para detectar la dispersin: A. TURBIDIMETRA: Es la medida de la intensidad de un haz de luz incidente cuando ste pasa a travs de una suspensin de partculas. La turbidimetra se mide a 0 grados del haz incidente, es decir, en su misma direccin. La disminucin de la intensidad se puede medir como %T o como A en cualquier espectrofotmetro o autoanalizador. B. NEFELOMETRA: Es la medida de la luz dispersada en ngulos distintos al de incidencia. Lo ms frecuente es que sea entre los 15-19. La medida se realiza en aparatos diseados con el sistema de deteccin situado a ngulos predeterminados.

4.3 INSTRUMENTAL

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FUENTE DE LUZ: es una fuente de energa radiante. Puede ser cualquier tipo de lmpara (tungsteno, halgeno, etc), pero la mejor es el lser porque produce haces de luz estables de intensidad adecuada a la tcnica y bien colimados, es decir, paralelos. COLIMADOR: es una lente o espejo, que tiene como misin hacer paralelos los haces de luz. Si la fuente es lser no ser necesario. MONOCROMADOR: filtros, prismas, redes de difraccin...No es necesario si la fuente es lser. CUBETA: = espectrofotometra. SISTEMA DE DETECCIN: si est colocado a 0 la tcnica se denomina Turbidimetra, pero si el ngulo es distinto de 0, la tcnica se denomina Nefelometra.

(16/10/01)

UT. 4 MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS III

1. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE METABOLITOS POR ANLISIS FOTOMTRICOS Se usan reacciones qumicas de las sustancias que se valoran. Para ellos se utilizan los reactivos adecuados y se detectan los productos de estas reacciones por tcnicas espectrofotomtricas. La determinacin de la concentracin de un compuesto se puede medir de tres formas: Midiendo la absorbancia del compuesto directamente si ste absorbe luz. Hacindolo reaccionar con reactivos adecuados, transformando la sustancia inicial en un producto que absorbe luz. Haciendo que el compuesto forme parte de una reaccin en la que otra sustancia experimente un cambio en sus propiedades de la absorcin de la luz.

2. MTODOS PARA MEDIR LA CONCENTRACIN DE UNA SUSTANCIA POR ESPECTROFOTOMETRA. 2.1 MTODOS DE PUNTO FINAL ( de equilibrio): Se incuba la muestra y el reactivo durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada para que se complete totalmente la reaccin, de tal forma que la sustancia que buscamos debe consumirse totalmente. Si no fuera as y quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el producto, estaramos midiendo menos cantidad de la que realmente hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo de incubacin. La concentracin de un sustancia es igual a la absorbancia por un factor llamado Factor de Calibracin (K), que coincide con la pendiente de la recta de calibracin: Y = a + bX a: punto donde la recta corta al eje Y (ordenada en el origen) b: pendiente de la recta 19

Si a = 0, entonces Y = bX ------------------------------ C = K . A 2.2 REACCIONES ACOPLADAS: Cuando se va a determinar una sustancia que se transforma en una reaccin que no provoca cambios medibles por espectrofotometra, se utiliza otra reaccin ligada a la anterior para medir el compuesto. Se llama Reaccin Auxiliar a la que se utiliza para transformar la sustancia a determinar. Se llama Reaccin Indicadora a la que se utiliza para la medida fotomtrica o colorimtrica. Ambas reacciones se llevan a cabo en la misma mezcla de ensayo y se dice que estn acopladas. Las REACCIONES COLORIMTRICAS pueden ser de dos tipos: Precedentes y Subsiguientes. (16/10/01) R. Colorimtricas Precedentes (muy poco habituales): van antes que la reaccin auxiliar. Se obtiene un producto que reacciona con la sustancia que vamos a determinar (A) dando un producto medible. U + Y X +Y A + Y B + C (Reaccin precedente) (Reaccin auxiliar)

R. Colorimtricas Subsiguientes: van despus de la reaccin auxiliar. Medimos un producto de la reaccin auxiliar (D). A +B C + D (Reaccin auxiliar) D + P Q + R (Reaccin indicadora)

2.3 MTODOS CINTICOS: En ellos se mide la velocidad de la reaccin mediante la medida de la variacin de la Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona con la concentracin. Es una medicin continua, a diferencia de la del punto final, se mide en tiempos regulares. Se puede medir la cantidad de sustrato no transformado la cantidad de producto formado. Mtodos cinticos enzimticos (Reacciones enzimticas): El caso ms sencillo es el de una reaccin irreversible como Sustrato Producto Lo ms frecuente es que se utilicen reacciones de primer orden que se caracterizan por presentar curvas de concentracin frente al tiempo exponenciales. Se produce una variacin de la Absorbancia en el intervalo de tiempo que es directamente proporcional a la concentracin inicial de sustrato si se mantienen constantes los tiempos de medida.

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Mtodos cinticos enzimticos (Reacciones enzimticas): Las reacciones enzimticas estn basadas en la Ley de Accin de Masas o Equilibrio de las Reacciones, que sigue el siguiente esquema:

Los enzimas (E) reaccionan ofreciendo su sitio activo al sustrato (S) con el cual se acoplan y forman un complejo (ES), donde el enzima acta con gran rapidez hasta liberar el producto transformado (P). El enzima no se altera, quedando libre para volver a fijar otra molcula de sustrato. Si mantenemos constantes las condiciones de la reaccin (pH; temperatura; cofactores y la concentracin de la enzima) la velocidad aumentar a medida que aumente la concentracin del sustrato, hasta que lleguemos a un punto en el cual se (16/10/01) alcanza la Velocidad Mxima (Vmax) y a partir del cual la velocidad es constante. Aunque sigamos aumentando la concentracin del sustrato, como la enzima est saturada, la velocidad deja de aumentar.

Ecuacin de Michaelis-Menten: V: velocidad de la reaccin

V = K . [S]

K KM: constante de Michaelis-Menten. Es la concentracin de un sustrato en moles/L con la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Es caracterstica de cada enzima con su sustrato y nos da informacin de la afinidad que tiene el enzima por su sustrato. Cintica de primer orden: se habla de cintica de primer orden cuando las concentraciones de sustrato son bajas y, por lo tanto, la velocidad es una funcin lineal de la cantidad de sustrato. Cintica de orden cero: se habla de cintica de orden cero cuando la concentracin de sustrato es muy alta y, por lo tanto, la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato. Para una KM alta, la mitad de la Vmax se alcanzar con una concentracin de sustrato alta, y la velocidad de la reaccin es lenta. Para una KM baja, la velocidad de la reaccin es rpida porque con una concentracin baja se llega rpido a la velocidad mxima. Por lo tanto, las determinaciones cinticas de las concentraciones de sustancias requieren enzimas con constantes de Michaelis altas para que la velocidad de la reaccin sea lenta, se tarde ms en llegar a la velocidad mxima y podamos medir mayor cantidad de sustrato.

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(18/10/01)

UT. 5 MEDICIN DEL PH EN LQUIDOS BIOLGICOS. TCNICAS ELECTROQUMICAS.

1. BASES DE ELECTROQUMICA
1.1 CONCEPTO DE ELECTROQUMICA: son un conjunto de mtodos analticos cuantitativos, basados en las propiedades elctricas de la disolucin de un analito cuando forma parte de una clula elctrica.. 1.2 FUNDAMENTO: A. SEMICLULA DEL NODO: un metal sumergido en una disolucin produce una diferencia de potencial por la tendencia de los tomos del metal a pasar a la disolucin en forma de iones, liberando electrones en el proceso. La reaccin que se produce es la siguiente: (M0 es el tomo metlico neutro y M+ es el in positivo) M0 M+ + eLa lmina de metal introducida en la disolucin recibe el nombre de electrodo. El sistema completo (electrodo + disolucin) recibe el nombre de semiclula. La reaccin que se produce recibe el nombre de oxidacin, ya que el tomo neutro pasa al estado positivo y se pierden electrones.

B. SEMICLULA DEL CTODO: con algunos metales ocurre el proceso contrario, es decir, los iones metlicos de la disolucin toman electrones y pasan a tomos neutros que se depositan en el electrodo. sta es una reaccin de reduccin del in metlico y, el electrodo, recibe el nombre de ctodo. 22

1.3 ECUACIN DE NERNST La relacin entre el potencial generado en la semiclula y la concentracin de la disolucin implicada viene dada por la Ec. de Nernst. E: Potencial de la semiclula E0: Potencial de la semiclula en condiciones estndar, que est calculado experimentalmente para las distintas semiclulas. R: Constante general de los gases T: temperatura absoluta (K) n: n de electrones que se intercambian en el proceso F: Constante de Faraday (18/10/01)

2. LA CLULA ELECTROQUMICA
La clula electroqumica se constituye por la unin de dos semiclulas de forma que los potenciales generados en cada una de ellas se combinan formando una clula electroqumica con una diferencia de potencial que se manifiesta por un flujo de corriente elctrica medible con un voltmetro. El ejemplo ms tpico es la clula de Zn/Cu. El Zn va a formar parte de la semiclula del nodo y el Cu la del ctodo. Las dos semiclulas estn unidad por un puente salino formado por Cl- y K+, que es el que establece la conexin elctrica. El circuito se completa con un potencimetro. El nodo(Zn) tiene un exceso de electrones, mientras que el ctodo (Cu) tiene un dficit de electrones, por lo tanto, el exceso de electrones va desde el nodo hasta el ctodo, y esto constituye la corriente elctrica.

3. ELECTRODOS DE REFERENCIA
Para medir el potencial E de una disolucin necesitamos un electrodo indicador y un electrodo de referencia. Electrodo de Referencia: debe mantener el voltaje constante, en condiciones controladas durante un tiempo significativo. De esta forma, se transforman las diferencias de potencial relativas, segn el par Redox que se utilice, a tablas de potenciales absolutos al enfrentarse los pares Redox con un par de referencia al que se le asigna un valor cero de potencial. Los electrodos de referencia ms usados son: 23

Electrodo Estndar de Hidrgeno: consiste en un electrodo de Platino sumergido en una disolucin de iones Hidrgeno. Tiene pH = 0, T = 25C. Se elige el par Redox del Hidrgeno: 2H+ + 2e- H2 A este se le asigna de forma arbritaria el valor 0, de tal forma, que conectando cualquier semiclula a sta y midiendo el E desarrollado se obtiene el E relativo de la segunda semiclula. El electrodo de Hidrgeno no se utiliza habitualmente en los sistemas de medida porque es de muy difcil mantenimiento.

Electrodo de Calomelanos ( Hg2Cl2 = calomel): est compuesto por Mercurio metlico en equilibrio con una disolucin saturada de Cloruro Mercurioso y una concentracin conocida de Cloruro Potsico. La reaccin de oxid-red es la siguiente: Hg2Cl2 + 2e- 2Hg0 + 2Cl Electrodo de Plata-Cloruro de plata: est constituido por un asa de Ag recubierta de AgCl: AgCl + e- Ag0 + Cl-

Electrodo indicador: responde proporcionalmente a la concentracin de la sustancia de inters. Lo que se mide realmente es la variacin de potencial con respecto al electrodo de referencia. (19/10/01)

4. TIPOS DE SISTEMAS ELECTROQUMICOS

4.1 MTODOS EN LA INTERFASE DEL ELECTRODO CON LA FINA CAPA DE DISOLUCIN ADYACENTE: A. Estticos o potenciomtricos: son los que miden el potencial existente entre dos electrodos en solucin sin que haya paso de la corriente elctrica. Potenciometra analtica: Mide la actividad de los iones de la disolucin que est relacionada con la concentracin por un Factor de Actividad, segn la siguiente frmula: ai = Ci . fi

a : actividad de los iones de una solucin.

i

Ci: concentracin de los iones medidos. Fi: Factor de Actividad. B. Dinmicos o amperomtricos: se basan en la medida de la cantidad de corriente elctrica que fluye cuando se aplica un voltaje constante al electrodo de medida. Columbimetra: es una tcnica que mide la carga total necesaria para la oxidacin o reduccin total de una especie. Se usa fundamentalmente para la determinacin de Cloro en lquidos biolgicos, utilizando el clormetro de Cotlove. Amperometra.

4.2 MTODOS EN EL SENO DE LA DISOLUCIN A. Conductimetra.

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MEDIDAS DEL PH

pH-metro: es el aparato que mide el pH y que consta de dos electrodos, el de

2Referencia y el Selectivo. Electrodo de Referencia: es un electrodo de calomelanos. Electrodo Selectivo: es un electrodo que est lleno de una solucin de pH constante. La conexin a un medidos de voltaje se realiza por medio de un hilo de Ag cubierto de AgCl e inmerso en una solucin de HCl 0,1M. Lavar el electrodo con agua destilada. Colocar un tampn de calibracin de pH cercano al pH que se quiere medir. Ajustar el valor del pH. Colocar otro tampn de pH conocido. Suelen ser tampones fosfato (pH = 6,8) y ajustamos el pH de nuevo. Colocar la solucin cuyo pH se quiere medir. -

Los pasos a seguir en la medida del pH son los siguientes: -

6 MEDIDA DE LA PRESIN PARCIAL DE CO2: Se utiliza el electrodo de Severing-Havs, que es una modificacin de la medida del pH cuyos electrodos estn separados de la muestra por una membrana que deja pasar el CO2 selectivamente. 7. MEDIDA DE LA PRESIN PARCIAL DE O2: Se utiliza el electrodo de Clark: las molculas de O2 disueltas en una solucin acuosa determina la corriente elctrica, que es la que mide el electrodo y, que es proporcional, a la presin parcial de O2.

8.

ELECTRODOS SELECTIVOS

Concepto: son sistemas electroqumicos que tienen mecanismo de seleccin asociado al electrodo, que lo hace solo sensible a variaciones de potencial debidas a la concentracin de un determinado in. La selectividad ideal se consigue con electrodos de polmeros orgnicos porosos. Tipos: Electrodo de vidrio para medir hidrogeniones (H+) Electrodo de vidrio para medir Sodio Electrodo de Polivinilcloruro/Valinomicina: se usa para la determinacin de Potasio Electrodo de Sulfuro de Plata/Cloruro de Plata: para medir Cloro Electrodo recubierto de un enzima (Ej. Ureasa, para medir Urea-Amonio) 9. (22/10/01)

ANALIZADORES DE PH Y GASES

9.1 CONCEPTO: Miden automticamente el pH, la presin parcial de CO2 y la de O2. Estas medidas las hacen directamente y, el resto de medidas se calculan por microprocesadores incorporados a los autoanalizadores. Tenemos como parmetros asociados, por ejemplo el bicarbonato plasmtico (CO3H-); CO2 total; exceso de base; etc. Las medidas se realizan con electrodos selectivos. 25

9.2 COMPONENTES Sistema de aspiracin: la muestra (sangre arterial) es aspirada por una bomba peristltica que coge normalmente de 50-250 L. Cmara de medida: donde se localizan los electrodos. Est a temperatura constante. Electrodos: de pH, CO2 y O2. Tampones de calibracin: se calibran con 2 puntos, uno a pH = 7,382 y otro a pH = 6,838, establecindose entre ambos una recta. Gases con sistema de humidificacin: para la calibracin de la presin parcial de CO2 y O2. Contenedor de desechos Microprocesador: encargado de dirigir la operacin Impresora 9.3 ERRORES MS FRECUENTES 1. muestra: (22/10/01) Procesamiento inadecuado de la

La entrada de aire en la muestra, bien en el recipiente de extraccin en la cmara de medida (aire ambiental: la presin parcial de O2 = 160 mmHg y la de CO2 = 0 mmHg). Demora en la realizacin del anlisis. Esto determina el consumo de O2 por parte de las clulas sanguneas y consiguiente formacin de CO2. 2. Alteraciones en los electrodos: Se pueden contaminar con las protenas de la muestra. Para evitarlo, se debe pasar una solucin desproteinizante con frecuencia. El envejecimiento de la membrana del electrodo de CO2, que se hace entonces permeable a los hidrogeniones. Se debe cambiar peridicamente la membrana. Alteracin del electrolito de relleno. 3. Contaminacin de los tampones: Se debe vigilarlos, comprobndolos peridicamente y cambiarlos.

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UT. 6 MTODOS DE SEPARACIN DE MOLCULAS

1. INTRODUCCIN
Uno de los objetivos principales de los Laboratorios es la separacin de mezclas de sustancias en sus componentes, ya sea con fines cualitativos o cuantitativos.

2. CENTRIFUGACIN
2.1 CONCEPTO: Es un mtodo que utiliza la fuerza centrfuga para separar elementos de densidades distintas o de pesos moleculares distintos. 2.2 FUNDAMENTO: La FCR (Fuerza Centrfuga Relativa) es la fuerza requerida para que se produzca la separacin. Las unidades de esta fuerza se expresan como el nmero de veces mayor que la fuerza de la gravedad y se calcula mediante la frmula: FCR = 1,118 . 105 . r . n2 r: distancia horizontal del radio en centmetros desde el centro de rotacin hasta el fondo del tubo durante la centrifugacin. n: Velocidad de rotacin del motor (r.p.m) Es fundamental observar el principio de equilibrio. Para ello se colocarn tubos y cubetas de igual forma, peso y tamao en posiciones opuestas en la cabeza de la centrfuga, buscando una disposicin geomtricamente simtrica, utilizando tubos de agua si fuera necesario. 2.3 DESCRIPCIN DE LA CENTRFUGA ROTOR O CABEZAL: Es el lugar donde se colocan las muestras. Hay dos tipos

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- Cabezal oscilante u horizontal: los contenedores oscilan libremente entre las ramas del rotor. Las muestras, dentro de los contenedores, oscilan hasta ponerse en posicin horizontal, en ngulo recto con el eje de rotacin y adoptan la posicin vertical o de reposo cuando la centrfuga est parada.

- Cabezal angular o de ngulo fijo: los tubos de muestra estn en posicin fija formando un ngulo de entre 25-40 con el eje de rotacin. Solamente forman un ngulo de 90 en una centrfuga especial para el estudio del hematocrito.

(24/10/01) EJE: Es el vstago que soporta el rotor y que acta como eje de rotacin. MOTOR: Acciona el vstago y el rotor. ACCESORIOS: El rotor est incluido en una cmara que generalmente lleva tapadera con una cerradura de seguridad que impide abrirla hasta que haya terminado la centrifugacin. Otros accesorios son el temporizador, control de velocidad (r.p.m), refrigerador para disminuir la temperatura de la cmara, freno,... Separacin de suero o plasma. Concentracin de clulas: en lquidos biolgicos se concentran las clulas para facilitar su estudio microscpico (Ej. Sedimento de orina). Separacin de sustancias: Ej. Para el estudio del HDL colesterol, se precipitan previamente las lipoprotenas LDL y VLDL. Aclaracin de lquidos orgnicos: separando las fases lquidas de distinta densidad. Separar quilomicrones del suero o fraccionar las distintas lipoprotenas: para esto se necesitan ultracentrfugas (alcanzan grandes velocidades).

2.4 UTILIDADES

2.5 CONTROL Y MANTENIMIENTO Se deben tener en cuenta las siguientes precauciones: Utilizar tubos resistentes a la FCR 28

No debe sobresalir el tubo del portatubos Equilibrar correctamente la centrfuga. Tapar los recipientes para evitar la evaporacin por el aumento de la temperatura. No forzar el paro de la centrfuga. Chequeo de la velocidad de centrifugacin cada 3 meses con un tacmetro externo. Limpieza peridica de la cmara y los contenedores.

3. ELECTROFORESIS
3.1 PRINCIPIOS Concepto: es el movimiento de partculas cargadas por aplicacin de un campo elctrico externo. Movimiento de una partcula cargada en el seno de un campo elctrico: cuando una partcula cargada se coloca dentro de un campo elctrico se mover hacia el polo positivo (nodo) si est cargada negativamente (anin), hacia el polo negativo (ctodo) si la partcula est cargada positivamente (catin). La fuerza que ejerce el campo elctrico sobre la partcula cargada es proporcional a la carga de la partcula (Q) y al voltaje del campo elctrico aplicado (V): F=Q.V Sin embargo, existe otra fuerza opuesta al movimiento de la partcula que es proporcional al tamao y forma de la misma, y a la viscosidad del tampn (v): Fr = f . v Siendo f el coeficiente de friccin, que es una caracterstica de cada partcula. Estas dos fuerzas (F y Fr) se equilibran cuando la partcula comienza a migrar y hacen que alcance una velocidad constante. La velocidad de migracin por unidad de campo elctrico se llama movilidad electrofortica ( ) y tiene como unidades cm2 / V . seg (centmetro cuadrado/Voltios por segundo) Factores que afectan a la migracin de las partculas: La carga neta de la partcula: La carga neta de las partculas en solucin est determinada por el pH del tampn en que se encuentran, que es lo que decide el grado de ionizacin de las mismas. El grado de ionizacin es el balance entre las cargas positivas y negativas de una partcula en solucin. Las protenas son anfteras (tienen cargas positivas y negativas) y stas dependen del pH del medio. Existe un pH para el cual, el nmero de cargas positivas es igual al nmero de cargas negativas, dando como resultado una carga neta cero. Este pH recibe el nombre de Punto Isoelctrico. La mayora de las protenas tienen un punto isoelctrico cido, que oscila entre 4,6 para la Albmina y 6,2 para algunas globulinas. A un pH superior al del punto isoelctrico la partcula posee ms cargas positivas que negativas comportndose como un catin. Si el pH es inferior al punto isoelctrico tendra ms cargas positivas que negativas, comportndose como un anin.

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La fuerza inica del tampn: A mayor concentracin del tampn, ste transportar ms corriente y, por tanto, las partculas transportarn menos corriente y migrarn ms despacio. La concentracin del tampn debe ser la suficiente para que ste cumpla sus funciones, que son dos: mantener un pH constante y transportar la corriente. Tamao y forma de las partculas: La importancia es relativa, es ms importante cuando se emplean soportes de electroforesis que permiten el paso selectivo de las molculas segn su tamao reteniendo las ms grandes y dejando pasar las ms pequeas. (26/10/01) Potencial del campo elctrico: Cuanto ms alto sea el potencial mayor es el movimiento de la partcula. Esto viene determinado por: V=R.I Siendo V = voltaje; R = Resistencia del medio; I = Intensidad de corriente. Al aumentar el V aumentamos tambin la temperatura y esto determina la desnaturalizacin de las protenas y la evaporacin del tampn o buffer. Por lo tanto, los voltajes de trabajo estn limitados y slo se utilizarn voltajes altos si el aparato tiene sistema de refrigeracin.

3.2 REALIZACIN DE LA ELECTROFORESIS Preparacin de la muestra: Las principales muestras son suero, plasma, sangre total, orina, lquido cefalorraqudeo,... Suero y plasma no suelen necesitar preparacin. Para la electroforesis de hemoglobina hay que utilizar un hemolizado de hemates. Para la de protenas urinarias se utiliza una orina que se debe preparar mediante concentracin, etc. Seleccin del soporte: La electroforesis se lleva a cabo sobre soportes tomando el nombre de electroforesis de zona zonal. Los principales soportes utilizados son de dos tipos: No restrictivos: Papel Acetato de celulosa: se utiliza en forma de tiras que estn formadas por fibras de este compuesto y que engloban aire entre ellas. Cuando se van a usar se sumergen en el tampn de tal forma que ste ocupa los huecos. El tampn es el encargado de transportar la corriente elctrica a travs de la tira. Ventajas: es de fcil manejo, de fcil lectura, son de rpida ejecucin y son econmicos. Gel de agarosa: se utiliza a una concentracin de entre 0,5-1 gramos por 100 cm3 de tampn. Su aspecto es claro y transparente y se puede medir por fotodensitometra. Restrictivos: El soporte ejerce algn tipo de impedimento al desplazamiento de las partculas de la muestra. Este desplazamiento depende del tamao del poro del gel y, por lo tanto, del tamao de las partculas. Hay dos tipos fundamentales: -

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Gel de almidn: Tiene como ventaja que aumenta el nmero de fracciones separadas. Tiene muchos inconvenientes: preparacin extratempornea del gel, preparacin complicada para obtener una capa de espesor y porosidad uniformes, prcticamente imposible medir por densitometra,... Gel de poliacrilamida: Es el soporte ideal si se quieren conseguir ms y mejores separaciones electroforticas. Se usa solo en laboratorios de investigacin. Aplicacin de la muestra: Se puede

aplicar segn tres tcnicas:

Aplicacin sobre la superficie del soporte dejando que la muestra penetre (Ej. Suero en electroforesis con acetato de celulosa) Practicar orificios o ranuras en los geles (Ej. En inmunoelectroforesis se trabaja con geles que tienen las concavidades excavadas o preparadas) de polimerizacin del gel. Se requiere una instrumentacin: Incluir la muestra en el proceso Proceso electrofortico:

Fuente de alimentacin: se usa para aportar la energa elctrica al proceso. Cubeta: consiste en una cmara que contiene los electrodos de carga opuesta. Los electrodos estn situados en dos receptculos separados entre s que se conectan por un puente salino cuya funcin es permitir el paso de la corriente. La cubeta se encuentra tapada para minimizar la evaporacin. En algunos casos lleva un sistema de refrigeracin.

Revelado: Tiene por objeto la localizacin de las distintas fracciones de la muestra. Esto se consigue mediante la tincin de la tira. Previamente a este paso se debe parar el proceso de difusin que se consigue con distintos mtodos. El colorante empleado depender del compuesto que queramos localizar (Ej. Para protenas, el negro amido). Una vez sumergida la tira en el colorante se debe eliminar el exceso mediante lavados con una solucin aclarante. Lectura y evaluacin: Se puede leer de dos formas: 1) Elucin: Cada zona se recorta y se eluye en un disolvente adecuado al colorante. Se obtiene as una disolucin coloreada que se mide en el espectrofotmetro. 31

2) Densitometra: Consiste en la lectura directa de la tira mediante un fotodensitmetro. En este aparto se elige la longitud de onda adecuada, se hace pasar un haz de luz a travs de la tira y, dependiendo de la densidad de color de cada fraccin se absorber ms o menos luz. Un detector recibe el haz de luz y dependiendo de la intensidad de la luz recibida se determina la concentracin. El aparato es capaz de elaborar una grfica de registro del recorrido de la luz. En esta grfica, cada banda aparece como un pico cuya altura depende de la densidad de color que a su vez depende de la concentracin de la sustancia.

3.3 TCNICAS ELECTROFORTICAS Electroforesis en acetato de celulosa: es una de las tcnicas ms utilizadas en la rutina diaria por diversos motivos: se trata de un soporte econmico, es de fcil manejo, fcil aplicacin de la muestra, supone una rpida separacin, es de fcil lectura por densitometra y tiene una buena resolucin. La tira ms empleada es el cellogel que es acetato de celulosa gelatinizado y que tiene como ventaja que se puede transparentar previamente a la lectura en el densitmetro. Electroforesis en gel de agarosa: es de muy amplia difusin en el LDC. Puede venir preparado o bien fabricarlo en el laboratorio. La muestra se sita en posillos excavados en el gel. Electroforesis en gel de almidn Electroforesis en gel de poliacrilamida: es un gel restrictivo. Depender de la carga y el tamao de las partculas. Cuando transcurre el proceso electrofortico, las partculas comienzan a migrar de acuerdo con su carga elctrica, pero son frenadas en su avance segn su tamao. Con esto se consigue una separacin ms completa y un mayor nmero de bandas. Los geles de pueden emplear en placas o en tubos y pueden ser de dos tipos: Continuos: el tamao del poro vara de forma gradual. Discontinuos: el tamao del poro vara en zonas bien diferenciadas. Isoelectroenfoque: se basa en la separacin de sustancias conforme a su punto isoelctrico, por lo tanto, sirven para separar sustancias anfteras como las protenas. Sobre un medio soporte se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de anfolitos. El gradiente de pH aumenta desde el nodo (+) al ctodo (-). Cuando una protena se introduce en este gradiente migrar de acuerdo con su carga neta. Si su carga neta inicial es positiva migrar hacia el ctodo. A medida que avanza 32

hacia el ctodo va recorriendo una zona en la que el pH cambia y, por lo tanto, tambin cambiarn sus cargas, perdiendo cargas positivas y ganando cargas negativas. Llegar un momento en el que las cargas positivas y negativas se igualen, resultando su carga neta 0 (punto isoelctrico). En este punto permanecer esttica. De esta manera se alcanzar una posicin de equilibrio formando una banda definida. El voltaje empleado para crear el gradiente de pH con los anfolitos tiene que ser muy elevado. Se emplean voltajes de hasta 2000 V lo que determina la formacin de calor en gran cantidad (ser necesario un sistema de enfriamiento de la cubeta). Ventaja principal: tiene gran poder de resolucin. Permite separar sustancias cuyos puntos isoelctricos se diferencian en 0,02 unidades de pH. 3.4 APLICACIONES CLNICAS (05/11/01) La Electroforesis en acetato de celulosa es la ms utilizada habitualmente en el LDC y se usa fundamentalmente para la separacin de las protenas sricas y separacin de aminocidos. La Electroforesis en gel de agarosa se utiliza para la separacin de las lipoprotenas, para la separacin de isoenzimas y en la inmunoelectroforesis. La Electroforesis en gel de poliacrilamida se usa para la separacin de isoenzimas de la fosfatasa alcalina, para determinar pesos moleculares de protenas y para investigacin. El Isoelectroenfoque se utiliza para el estudio de las inmunoglobulinas y para estudiar algunos isoenzmas. 3.5 ASPECTOS PRCTICOS Problemas con el tampn: El tampn se contamina muy fcilmente y, para evitarlo, se debe guardar refrigerado. Si el volumen de tampn utilizado es pequeo se deber desechar, mientras que si es grande se deber guardar en una botella a 4C. Fuente de alimentacin y cubetas: La cubeta debe estar en posicin horizontal con los dos receptculos de tampn nivelados y llenos por igual. Los dos extremos del puente salino deben estar bien impregnados en tampn. Las cubetas se deben mantener limpias y siempre tapadas. Aplicacin de la muestra: Los aplicadores deben estar perfectamente limpios antes de cada uso y hay que respetar la cantidad de muestra de la tcnica indicada. Voltaje y calentamiento: Si se incrementa el voltaje se incrementa la movilidad de las partculas pero se genera un calentamiento. Este calentamiento puede traer como efecto no deseado la aparicin de bandas arqueadas debido a la desecacin de los bordes de la tira que hace que en ellos la movilidad sea ms lenta. Tincin y lectura: La tira debe tener un fondo transparente y uniforme, para poderla leer por fotodensitometra.

4. CROMATOGRAFA
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4.1 PRINCIPIOS GENERALES Es un mtodo de anlisis en el cual, una fase mvil (gas o lquido), que contiene la muestra provoca la separacin de sus componentes mediante la distribucin diferencial entre esta fase y una fase estacionaria (slida o lquida). De esta forma, un compuesto que tenga ms afinidad que otro por la fase estacionaria se retrasar en su avance a travs de sta, mientras que el que tiene poca afinidad la atravesar antes. 4.2 CLASIFICACIN Segn las caractersticas fsicas de las fases mvil y estacionaria Mvil: Lquida Gaseosa Estacionaria: Slida Lquida Segn el mecanismo fsico que lleva a la separacin de los solutos: Adsorcin Particin Intercambio inico Afinidad Exclusin molecular Segn la forma fsica de los sistemas: En columna En soportes planos CROMATOGRAFA LQUIDA SLIDA (L / S) Mecanismos LQUIDA (L / L) Mecanismo Particin SLIDA (G / S) Mecanismo Adsorcin GASEOSA LQUIDA (G / L) Mecanismo

Exclusin Molecular Particin Adsorcin Intercambio inico

La cromatografa de gases se lleva a cabo siempre en columna. La cromatografa lquida se puede llevar a cabo en soporte plano o en columna. 4.3 FORMAS DE CROMATOGRAFA Cromatografa en papel: Caractersticas Fsicas de las fases: L / L Mecanismo: Particin, que es un proceso por el cual un soluto se distribuye entre dos fases inmiscibles. Soporte: plano. Consiste en una hoja de papel de celulosa Fase estacionaria: constituida por la hoja de papel recubierta de una capa de agua.

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Fase mvil: Es lquida y est formada por solventes cuya polaridad se elige segn la naturaleza de los componentes a separar.

Como la fase estacionaria es agua, las partculas de mayor polaridad se retendrn ms en la fase estacionaria y las de menor polaridad se movern ms. Tcnica general: 1. Aplicacin de la muestra: se hace sobre el papel, en un extremo, y se espera a que se seque. 2. Se introduce el soporte en la cmara, que es una cubeta que contiene el solvente, en posicin vertical, de manera que el solvente podr atravesarlo por capilaridad en sentido ascendente o descendente, arrastrando a su paso los componentes de la muestra. 3. Separacin de los componentes de la mezcla en funcin de su reparto entre las dos fases. Cuando el solvente ha alcanzado el frente del papel se quita el papel de la cmara y se deja secar. 4. Deteccin: Las sustancias separadas se detectan por distintos procedimientos fsicos o qumicos segn la naturaleza de las sustancias. Se obtiene un cromatograma que es una serie de bandas separadas o zonas detectadas ya sea visualmente o indirectamente. 5. Se puede hacer una determinacin bidimensional girando el papel 90 y ejecutando una segunda cromatografa.

Cromatografa en capa fina

(08/11/01)

Caractersticas fsicas de las fases: L / S Mecanismo: Adsorcin, que es un proceso por el cual una sustancia se adhiere a otra a causa de las fuerzas de atraccin de los tomos de las superficies de ambas. Soporte: Plano. Consiste en una capa muy fina de partculas situadas sobre una superficie de vidrio. Este soporte constituye la fase estacionaria. Fase Mvil: Es lquida y est formada por solventes de polaridad adecuada. Cromatografa en Columna LQUIDA LQDA / LQDA LQDA / SLIDA GASEOSA GAS / LQDA GAS / SLIDA

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Particin

Adsorcin

Particin

Adsorcin

Las columnas estn formadas por un tubo de longitud y ancho variables que llevan en su interior un soporte slido o bien puede ir asociado a un lquido, que seran la fase estacionaria. La fase mvil es un solvente en la cromatografa lquida o un gas en la cromatografa gaseosa. La muestra se introduce en la fase mvil. Una vez separadas las sustancias, stas salen por elucin, que es la separacin de cuerpos adsorbidos, por lavados progresivos. Se efectan lecturas sobre el eluido obtenindose un registro en el cual, los distintos componentes se detectan en forma de picos de distinta altura y anchura. En la actualidad se emplean 2 tipos fundamentales de cromatografa: HPLC: Es la cromatografa lquida de alta resolucin. Realiza separaciones en tiempos cortos. Esquema. Cromatografa liquida en columna.

Cromatografa de gases: La fase mvil es un gas que proviene de un tanque a presin. En el gas se inyecta la muestra y, la mezcla pasa por la columna, que se encuentra incluida en un sistema calefactor, que tiene como misin volatilizar la muestra.

4.4 FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN CROMATOGRFICA Coeficiente de Distribucin (Kd): Es la relacin entre la concentracin de soluto en la fase estacionaria y la concentracin de soluto en la fase mvil.

36

El valor de la Kd muestra la afinidad del soluto por las distintas fases. Cuanto mayor sea Kd mayor es la proporcin de soluto retenido en la fase estacionaria. Relacin al frente del solvente (Rf): En la cromatografa en placas (papel o capa fina) Rf es la relacin entre la distancia desde el punto de aplicacin de la muestra a la mancha (dm) y la distancia desde el punto de aplicacin al frente del solvente (ds).

Volumen de retencin (Vr): Es el volumen de elusin en el cual sale un compuesto de inters. (Vm es el volumen de la fase mvil para eluir un compuesto sin afinidad por la fase estacionaria. Por lo tanto, a mayor Kd de un soluto, mayor ser su Vr)

Tiempo de Retencin (tr): El tiempo de retencin para un soluto dado ser el tiempo en el que ste sale eluido. Est relacionado con el volumen de retencin segn la siguiente frmula: F = flujo de la elusin, es decir, la velocidad en mL/min de la elusin. Selectividad ( ): Es la relacin entre los coeficientes de distribucin de dos solutos (A, B) en estudio. Para estudiar dos sustancias nos interesa que sea lo mayor posible, habitualmente mayor de 1.

Resolucin (R): Es la capacidad para separar sustancias lo mejor posible. En los cromatogramas se mide: 1. Las distancias a las que aparecen los picos desde un punto de referencia, que suele ser la respuesta del detector (d1 , d2 , ...) 2. El ancho de la base de cada pico. Se miden en las misma unidades de las distancias (a1 , a2 ,...)

Las distancias pueden ser medidas como tiempos de aparicin de la sustancia (tiempo al que aparece el mximo del pico), como volmenes de retencin como distancias en medidas de longitud. 37

Se requiere un valor de R 1,25 para considerar que una separacin cromatogrfica es buena. Si R 0,4, la forma del pico no mostrar claramente la presencia de dos componentes. Clculos: A partir de los datos del cromatograma, podemos calcular Kd, segn la siguiente frmula:

4.5 MECANISMOS DE SEPARACIN Cromatografa de intercambio inico:

(09/11/01)

Caractersticas fsicas de las fases: L / S Mecanismo: el fundamento de la separacin de las sustancias est en las diferencias entre el signo y la magnitud de sus cargas elctricas. Fase estacionaria: Es una resina de intercambio inico, es decir, que tiene grupos cargados. Puede ser resina de intercambio aninico si la carga de la resina es positiva y, por lo tanto, separa aniones (carga-), puede ser de intercambio catinico si la carga de la resina es negativa y separar cationes (carga+). Intercambio aninico Intercambio catinico (M-R+) + F- M- + (R+F-) (M+R-) + F+ M+ + (R-F+)

Siendo: R = resina M = iones de la muestra F = iones del flujo de la fase mvil Fase mvil: es un lquido. Cuando se produce el paso de la fase mvil a travs de la fase estacionaria los iones de la muestra compiten con los iones de la fase mvil por los sitios de unin en la resina (fase estacionaria). De manera que, aquellos que tienen mayor fuerza de unin, son ms retenidos y saldrn ms tarde de la columna. La fuerza de unin con la fase estacionaria se puede modificar cambiando el pH. Por esta circunstancia, cuando se quiere terminar el proceso se puede cambiar el pH y eluir la muestra que fue ms retenida. Cromatografa de exclusin molecular: Caractersticas fsicas de las fases: L / S. Se utiliza para averiguar pesos moleculares, para separar inmunoglobulinas, etc. Mecanismo: El fundamento de la separacin se basa en el tamao molecular. La separacin se lleva a cabo por exclusin molecular: la solucin con las sustancias que queremos separar se introduce en la columna de tal forma que las sustancias de tamao mayor que el poro pasan sin ser retenidas, y las sustancias con un tamao menor que el poro quedan retenidas en el gel eluyndose ms tarde. Fase estacionaria: Es un gel que tiene poros que son de un tamao determinado. Los geles utilizados son muy variados. El ms conocido es el SEPHADEX.

UT.7 ANALIZADORES AUTOMTICOS PARA QUMICA CLNICA

38

ANTECEDENTES HISTRICOS
La Qumica Clnica hospitalaria inici un cambio hacia principios de los aos 60 por dos motivos fundamentales: La mecanizacin de las determinaciones La produccin industrial de los reactivos

El primer autoanalizador se utiliz en los aos 50 y era un autoanalizador de flujo continuo para la determinacin de Glucosa y Nitrgeno Ureico.

2.

CONCEPTO DE AUTOMATIZACIN

AUTOMATIZACIN Se aplica a aquellos procesos donde el instrumento lleva a cabo una serie de test con un mnimo de intervencin de los tcnicos. En el LDC los aparatos son regulados por los operarios, por lo tanto, se debera hablar se mecanizacin y no de automatizacin. ANALIZADOR AUTOMTICO Es un aparato que mecaniza las diferentes etapas del anlisis de la muestra. VENTAJAS DEL AUTOANALIZADOR anlisis Elimina el factor humano en etapas repetitivas y delicadas del Aumenta la precisin y la exactitud de los resultados. Son de coste alto pero se compensa con el ahorro de personal y reactivos.

3.

ETAPAS DEL ANLISIS DE UNA MUESTRA

Identificacin de la muestra Preparacin de la muestra Sistemas de carga de la muestra Sistemas de dispensacin de la muestra Reactivos y sistema de dispensacin de los reactivos Sistema de mezcla de reactivos y muestra Sistema de incubacin Cubetas de reaccin Sistema de deteccin Proceso de datos Directo: La muestra se une a unos identificadores que permiten asociarla con el paciente en cualquier momento. Los identificadores ms comunes son los cdigos de barras, que permiten el marcado electrnico de la muestra. Las etiquetas con el cdigo de barras se adhieren al tubo de extraccin y tambin a los recipientes donde se coloca la muestra para el anlisis. El problema de la identificacin es el de la separacin del suero en alcuotas, lo que requiere volver a marcar los tubos (ms errores). Esto se puede solucionar 39

3.1 IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA: Hay dos sistemas:

utilizando el llamado tubo primario, que consiste en realizar el proceso analtico a la muestra en el mismo tubo de la extraccin. Indirecto: La muestra se relaciona con la posicin que ocupa en una secuencia analtica segn indicar una lista de trabajo previamente realizada. 3.2 PREPARACIN DE LA MUESTRA La muestra ms frecuentemente utilizada es el suero, pero tambin se usan plasma, sangre total, lquido cefalorraqudeo, orina y otros lquidos biolgicos (Ej. Sinovial). Todas ellas, menos la sangre total, deben ser manipuladas previamente mediante diluciones, centrifugacin, etc. Es importante en la obtencin del suero que la coagulacin sea completa y la centrifugacin la adecuada para que no quede fibrina, que obstruye los sistemas de toma de muestra. 3.3 SISTEMAS DE CARGA DE LA MUESTRA Se suelen utilizar copas de plstico desechable, cuya forma y tamao depende del tipo del analizador. Se deben fabricar en material inerte, que no absorba ni desprenda ninguna sustancia. Se debe evitar la luz directa sobre las cubetas de carga porque pueden afectar a productos fotosensibles (Ej. Bilirrubina). Se pueden colocar en gradillas, en bandejas circulantes o en cadenas transportadoras. Actualmente es muy frecuente que se utilice el tubo primario en lugar de las copas de plstico. Existen dos tipos de carga de muestra: Se cargan las muestras en un dispositivo que se cambia cuando se han tomado todas las muestras. Se cambian continuamente los contenedores de las muestras, a medida que se van tomando. De Flujo Continuo: La muestra, impulsada por una bomba peristltica, es aspirada por una aguja hacia una corriente continua de reactivo. La proporcin resultante entre muestra y reactivo viene dada por la velocidad de flujo. La cantidad de muestra depende del dimetro interno del tubo. Analizadores Discretos: La muestra es aspirada a travs de una aguja llamada jeringa de desplazamiento lquido positivo y es colocada en una cubeta de reaccin, junto con el reactivo. Las jeringas pueden ser de un volumen fijo o variable, dependiendo del autoanalizador. Si realizan poca variedad de pruebas se podrn usar de volumen fijo, pero si tienen mltiples determinaciones distintas, han de ser de volumen variable. 3.5 SISTEMAS DE DISPENSACIN DE REACTIVOS Tipos de Reactivos: Reactivos lquidos de reserva: Son los ms empleados. Son reactivos en estado lquido que se adquieren de esta forma o en forma de polvos que 40

3.4 SISTEMAS DE SISPENSACIN DE MUESTRA

se reconstituyen con agua o con buffers (tampones). Se manejan en contenedores de vidrio o plstico. El volumen del contenedor depende de la estabilidad del reactivo y de la capacidad de trabajo del autoanalizador. Reactivos de unidad: Se utilizan para una sola determinacin. Se utilizan ms en autoanalizadores nuevos y son mucho ms caros. Dispensacin: Cada prueba utiliza 1 2 reactivos, aunque algunas permiten el uso de 3 ms. Se pueden dispensar de forma continua discreta., igual que la muestra. 3.6 SISTEMAS DE MEZCLA DE REACTIVOS Y MUESTRA Analizadores de flujo continuo: Los reactivos y las muestras se mezclan por intersecciones en Y de los tubos transportadores. Una vez en el mismo tubo se mezclan por accin del flujo. Analizadores discretos: La mezcla tiene lugar en las cubetas de reaccin. El mezclado se puede hacer por distintos mecanismos: Por movimientos rotatorios de los contenedores Por inyeccin de aire a presin Mediante agitadores magnticos Agitadores de barra, etc.

Analizadores centrfugos: La mezcla se lleva a cabo por accin de la fuerza centrfuga del rotor. Analizadores de qumica seca: La mezcla se produce por la difusin de la muestra a travs de los reactivos. 3.7 SISTEMAS DE INCUBACIN La incubacin pretende que la reaccin tenga lugar en un determinado tiempo y a una determinada temperatura. Flujo continuo: Los tubos en los que transcurre la reaccin estn inmersos en unos bloques de termostatizacin cuya temperatura se regula por la longitud del tubo y la velocidad del flujo. Discretos: La temperatura se puede alcanzar por baos de agua aire caliente a temperatura controlada. En estos baos se encuentran introducidas las cubetas de reaccin. Centrfugos: Los rotores con las cubetas se reaccin se encuentran inmersos en baos de aire caliente. Qumica seca: Las tiras de reaccin se encuentran en contacto con superficies metlicas calientes. 3.8 CUBETAS DE REACCIN Y LECTURA Flujo continuo: La reaccin se produce en los tubos y la lectura se produce en las cubetas de lectura o de flujo. Por estas cubetas van pasando las soluciones para ser ledas. Discretos: Las cubetas de reaccin pueden ser desechables o reutilizables. La lectura se realiza en las mismas cubetas de reaccin.

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3.9 SISTEMAS DE DETECCIN El sistema de deteccin ms frecuente es la espectrofotometra de absorcin. Tambin se pueden usar medidas nefelomtricas y turbidimtricas, medidas de fluorescencia, electroqumica, qumica seca (reflexin electroqumica), etc. 3.10 PROCESAMIENTO DE DATOS El detector crea una seal analgica que se transforma despus en digital. Transforma los datos digitales en resultados que luego se imprimen.

4. TIPOS DE AUTOANALIZADORES
Hay que definir una serie de conceptos para despus conocer los distintos tipos de autoanalizadores que hay: REPERTORIO DE PRUEBAS: Son las pruebas que puede llevar a cabo un autoanalizador. Hay que distinguir entre: realizar. Nmero de pruebas totales que el autoanalizador puede

Nmero de pruebas que puede realizar de forma inmediata, es decir, pruebas programadas en una serie tanda de anlisis sin necesidad de cambiar reactivos ni otras condiciones del aparato. TIEMPO DE RETARDO: Es el tiempo mnimo requerido para obtener un resultado despus del procesamiento inicial de la muestra. Depende de la determinacin solicitada y del nmero de determinaciones. CAPACIDAD: Es el nmero de determinaciones que se pueden procesar en 1 hora. Depender del tiempo de retardo. Tipos de Autoanalizadores Analizadores Selectivos: Tambin se llaman analizadores de acceso al azar. Pueden seleccionar para cada paciente las pruebas que se deseen del repertorio total sin tener que ejecutar en una muestra todas las determinaciones. Analizadores Discretos: Cada muestra es transportada en contenedores individuales. Los reactivos se adicionan discontinuamente por medio de dispensadores y utilizan para dispensar las muestras jeringas de desplazamiento lquido positivo. Hay tres tipos: Analizadores monoclonales por lotes: Realizan una nica determinacin de forma simultnea sobre varias muestras. Analizadores monoclonales selectivos: Realiza varias pruebas distintas, seleccionables sobre cada muestra, pero solo tienen un sistema de muestra y un solo canal de lectura espectrofotomtrica. Analizadores multicanales: Realizan varias determinaciones simultneas en una misma muestra.

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 Analizadores de Flujo Continuo: Son instrumentos que bombean continuamente reactivos a travs de tuberas para formar una corriente de flujo, bombeando despus la muestra a esta corriente. Para ello se utilizan bombas peristlticas.

UT. 8 INMUNOENSAYOS. MTODOS ISOTPICOS

1. CONCEPTO
Los inmunoensayos son tcnicas inmunolgicas de cuantificacin de Ag Ac. Emplean marcadores de los Ag o de los Ac, y los ms utilizados son: Istopos radiactivos Radio Inmuno Anlisis RIA Enzimas Enzimo Inmuno Anlisis EIA Compuestos fluorescentes Fluoro Inmuno Anlisis FIA Compuestos luminiscentes Lumino Inmuno Anlisis LIA

2.

TIPOS DE INMUNOENSAYOS
Concepto: El compuesto marcado se comporta de forma diferente segn est libre o ligado al Ag o al Ac, por lo tanto, no es necesaria la separacin fsica de las sustancias reaccionantes en dos fracciones, la libre y la ligada. Aplicacin: Se usan para cuantificar Ag y son de tipo competitivo. Ag: antgeno que queremos medir Ag*: antgeno igual que el anterior, pero marcado Ac: anticuerpo que se une especficamente a estos antgenos Incubamos Ag y Ag* con una cantidad insuficiente de Ac para unirse a todas las molculas de antgeno que tenemos. Los antgenos competirn entre s por unirse a este Ac, por lo tanto, a mayor cantidad de Ag mayor ser la cantidad de Ag* que quedar sin unirse al Ac. Principales inmunoensayos homogneos: E.I.A: Enzimo inmuno ensayo. El EIA ms importante es: EMIT (Enzyme Mediated Immunoassay Technique) F.I.A: Fluoro inmuno ensayo. Tipos: F.P.I.A (Fluorescent Polarization Immunoassay) S.L.F.I.A (Substrate Label Fluorescent Immunoassay) F.E.T.I (Fluorescent Excitation Transfer Immunoassay)

2.1 HOMOGNEOS

2.2 HETEROGNEOS Concepto: El compuesto marcado se comporta de forma anloga est libre o est ligado, por lo tanto requiere una separacin previa de las fracciones libre y ligada. Mtodos de separacin de las fracciones ligada y libre:

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Adsorcin: Se utilizan materiales insolubles como, por ejemplo, el carbn activo, resinas de intercambio inico, silicatomagnsico, etc, a los que se une el compuesto que se desea determinar cuando se encuentra en estado libre. Se centrfuga, quedando en el sobrenadante la fraccin lquida y en el sedimento la fraccin libre. Se usa frecuentemente en el RIA. Tiene una desventaja, que es que es fundamental el tiempo de contacto entre el adsorbente y la muestra.

Precipitacin: Se utilizan compuestos que precipitan las protenas, como por ejemplo, el Etanol, Sulfato Amnico, cido Perclrico,... Despus de centrifugar, en el sobrenadante queda la fraccin libre, y en el sedimento la fraccin ligada. Doble Ac: Se usa un segundo Ac que precipita el Ag unido (fraccin ligada), por lo tanto lo encontraremos en el sedimento y en el sobrenadante encontraremos la fraccin libre. Soporte Slido: Unen uno de los componentes de la reaccin inmunolgica a un soporte slido, que puede ser un tubo o una bola y, posteriormente, se separan las fracciones libre y ligada por lavado. Isotpicos: RIA (Radioinmunoassay) IRMA (Inmunoradiometric Assay) Enzimticos: ELISA (Enzyme linked inmunoabsorbent Assay) MEIA (Microparticle enzyme inmunoassay) Fluorognicos: DELFIA (Dissociation enhaced by lanthanum fruoroinmunoassay) Luminiscentes: SPALT (Solid phase antigen luminescent technique) ICMA (Inmunochemil inmunometric Assay)

Principales inmunoensayos heterogneos:

Tipos de inmunoensayos heterogneos: A. COMPETITIVOS: Son anlogos a los homogneos competitivos. Se emplean para molculas de tamao pequeo, que solo poseen un lugar antignico o eptopo. Ej. ELISA competitivo mediante conjugados Enzima-Ac:

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1 El Ag marcado y sin marcar compiten por el Ac. 2 Actividad enzimtica de fraccin ligada es directamente proporcional a la concentracin de Ag libre.

B. INMUNOMTRICOS DE TIPO SNDWICH: Se emplean para molculas grandes que poseen ms de un determinante antignico. Utilizan tambin soportes slidos.

1 El Ac en fase slida reacciona con el Ag 2 Lavado 3 Exceso de Ac marcado con E 4 La actividad enzimtica en la fase slida es directamente proporcional a la concentracin de Ag. Esta tcnica se puede utilizar para determinar Ac, uniendo el Ag a la superficie slida. El segundo Ac es especfico para el Ac de la muestra.

3. MTODOS DE AJUSTE DE CURVAS EN LOS INMUNOENSAYOS

Las curvas de calibracin de los inmunoensayos no son lineales y, por lo tanto, su representacin grfica es complicada y sometida a errores. Se realiza ajuste de curvas mediante complicados programas de ordenador.

4. RADIOINMUNOANLISIS
Concepto: Es un inmunoensayo que utiliza istopos radiactivos para marcar los Antgenos los Anticuerpos. Tipos: RIA: es un inmunoensayo heterogneo, competitivo. IRMA: es un ensayo inmunomtrico de tipo sndwich, heterogneo. Carbono 14: para pptidos pequeos, frmacos y esteroides. I125: para molculas grandes. Tritio (H3): para molculas pequeas.

Istopos radiactivos ms utilizados:

5. ENZIMOINMUNOENSAYOS
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Concepto: Utilizan enzimas como marcadores de Ag Ac. Pueden ser homogneos o heterogneos y constan de dos etapas, una primera inmunolgica (durante la cual tiene lugar la reaccin Ag-Ac) y una segunda etapa en la que se determina fotomtricamente la actividad de la enzima marcada. Enzimas que se utilizan como marcadores: Peroxidasas, Fosfatasa alcalina, Glucosa oxidasa, Glucosa 6-fosfato Deshidrogenasa, -Galactosidasa.

Inmunoensayos homogneos: El EMIT es el ms utilizado. Se usa fundamentalmente para la determinacin de frmacos, sobre todo antiepilpticos, drogas, cardiotnicos y antineoplsicos. El fundamento es el siguiente: La sustancia que se desea determinar se marca con una enzima. La sustancia marcada de une con un Ac especfico y esto determina que se inactive la actividad enzimtica debido a que ocupa el lugar que debera ocupar el sustrato. Se mezclan la sustancia marcada y la muestra y sta ltima compite con el Ac, de tal forma que a mayor cantidad de Ag en la muestra, ms se unir al Ac y ste dejar libre la enzima., manifestndose otra vez la actividad enzimtica. Por lo tanto, hay una relacin directa entre la concentracin de Ag de la muestra y la actividad enzimtica. Empleando soluciones de concentracin conocida (patrones o satndares) de la sustancia que se quiere medir se puede elaborar una curva de calibracin.

Hay una excepcin al mecanismo de inhibicin, que es la Determinacin de la Tiroxina, T4 (hormona tiroidea). Para ello se utiliza un enzima que es la Malato Deshidrogenasa (MDH). Este enzima se une a la Tiroxina y el conjugado Sustancia-Enzima es inactivo. Al unirse con el Ac especfico anti Tiroxina se Activa. Por lo tanto, a mayor actividad de la enzima significa que tenemos ms Ac fijado y menos concentracin de T4 en la muestra que competira con el Ac. Es decir, que la concentracin de T4 de la muestra es inversamente proporcional a la actividad enzimtica.

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Enzimoinmunoensayos heterogneos: El ms importante es el ELISA. Este sistema utiliza soportes slidos para la separacin de las fracciones ligadas y libres de la enzima. Los soportes ms utilizados son: placas de microtitulacin, bolas de poliestiremo y tubos. ELISA puede ser Competitivo y de tipo Sndwich. Se pueden usar Ac policlonales monoclonales.

6. FLUOROINMUNOENSAYO (FIA)
Utiliza compuestos fluorescentes como marcadores de los Ag de los Ac. Pueden ser homogneos heterogneos. Los marcadores ms usados son el Isotiocianato de Fluorescena y la Rodamina. Tipos de Fluoroinmunoensayos homogneos FPIA: Se utiliza para sustancias de bajo peso molecular. Se basa en la cantidad de luz fluorescente que se detecta cuando la sustancia unida al marcador se ilumina con luz polarizada. Es de tipo competitivo. SLFIA: Tambin es de tipo competitivo. Se une a la sustancia que se quiere medir un sustrato fluorognico de un enzima, que cuando se hidroliza da lugar a un compuesto fluorescente. FETI: Es de tipo competitivo. La sustancia marcada y la no marcada de la muestra compiten por un Ag que lleva unido un extintor de la fluorescencia (quecher, q). Cuando se unen a la sustancia y el Ac, la fluorescencia del compuesto marcado se extingue. La competencia de la sustancia libre de la muestra inhibe la unin y bloquea la extincin. A mayor fluorescencia medida, mayor concentracin de la sustancia estudiada. Tipos de Fluoroinmunoensayos heterogneos Suelen usar fases slidas a las que se unen los Ag los Ac para separar las fracciones ligada y libre. DELFIA: Usa un Ac marcado con un quelato de un lantnido (Europio) que es fluorescente. Puede ser competitivo de tipo sndwich.

7. LUMINOINMUNOENSAYOS
Utilizan compuestos luminiscentes como marcadores de los Ag los Ac. Los componentes ms utilizados son la Lucigenina, Luminol, Isoluminol, derivados de la Acridina, Pirogalol,...Pueden ser homogneos heterogneos, y stos ltimos a su vez pueden ser competitivos de sndwich. Tipos: SPALT (Competitivo) ICMA (Competitivo) 47

8. ANALIZADORES AUTOMTICOS PARA INMUNOENSAYOS

Para inmunoensayos homogneos: Se utilizan los autoanalizadores normales que se adaptan a este tipo de inmunoensayos fcilmente porque no hay que separar la fraccin ligada de la libre. Para inmunoensayos heterogneos: Existen autoanalizadores especficos: Analizador automtico para enzimoinmunoensayo ES-600 (Boehringer Mannheim) Para imunoensayo de particin radial, el STRATUS (Borxter) Utiliza la tcnica MEIA, el IMX (Abbot)

9. USO DE LOS Ac MONOCLONALES EN LOS INMUNOENSAYOS

Concepto de Ac Monoclonal: Son Ac uniformes y homogneos que se producen de manera continua a partir del mismo clon celular y se dirigen hacia un solo eptopo o determinante antignico. Ventajas: Exclusin de Ac con caractersticas no deseadas Reconocimiento de un nico determinante antignico Tiene menor interferencia de fondo Tienen mayor facilidad de estandarizacin porque se pueden producir en grandes cantidades sin que cambien sus propiedades La afinidad del Ac monoclonal suele ser baja Es imposible diferenciar entre un grupo de molculas que lleven el mismo determinante antignico -

Desventajas: -

_________________________________________________________________________

TCNICAS INMUNOLGICAS EN BIOQUMICA CLNICA

INMUNOELECTROFORESIS Es un mtodo cuantitativo. Aplicacin: Se utiliza para la identificacin de paraprotenas, es decir, incrementos monoclonales de una inmunoglobulina. Tcnica: Se realiza en dos fases: La primera es la separacin de los Ag por electroforesis La segunda consiste en la caracterizacin inmunolgica de cada una de las protenas separadas. Se difunden un antisuero general especfico para la protena que se identifica. Se produce la reaccin Ag-Ac que se visualiza por la precipitacin de los complejos inmunes. Los arcos de precipitacin se pueden ver directamente teirse con colorantes de protenas.

Ej.: Inmunoelectroforesis de suero general y suero humano

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 Muestras: Suero, orina y Lquido Cefalorraqudeo. El suero se aplica directamente, pero como la orina y el LCR tienen una concentracin de protenas baja hay que concentrarlos antes de su aplicacin. Patologas ms frecuentes: Gammapatas monoclonales como el mieloma mltiple, la macroglobulemia de Waldestrom, etc. INMUNOELECTROFORESIS EN CONTRACORRIENTE ELECTROINMUNODIFUSIN Los Ag migran en un gel de agarosa hacia el polo positivo y, los Ac se desplazan hacia el negativo. Los complejos Ag-Ac precipitan en el punto de equivalencia, formando lneas en forma de cohetes llamados Rockets y cuyas alturas son proporcionales a la concentracin de Ag. Es un mtodo muy rpido.

REACCIONES DE PRECIPITACIN La reaccin entre Ag y Ac forma complejos que se agregan entre s y precipitan. La cantidad de precipitado depende de las proporciones de Ag y Ac. Se puede representar la Curva de Precipitacin caracterstica:

INMUNONEFELOMETRA E INMUNOTURBIDIMETRA Se cuantifican Ag Ac al medir la dispersin de la luz que producen los pequeos agregados que enturbian la solucin. 49

Aplicaciones Determinacin cuantitativa de Protenas Especficas: Inmunoglobulinas como IgG, IgM, IgA,... 1-antitripsina 2-macroglobulina Ceruloplasmina Prealbmina Transferrina, etc. INMUNODIFUSIN SIMPLE Se incorpora el Ac a un gel de Agar en un tubo. Se incuba con el Ag a temperatura ambiente durante un tiempo que permita la difusin. Se producen zonas de precipitacin en el punto de equivalencia Ag-Ac. La distancia de la lnea de precipitacin desde el punto de aplicacin del Ag es directamente proporcional a la concentracin de Ag. Se construye una curva de calibracin con patrones (Estndares) de concentracin conocida y se obtendr la cantidad de Ag presente en una muestra problema. INMUNODIFUSIN DOBLE de OUCHTERLONY Es un mtodo cualitativo. Se usa para detectar protenas especficas no habituales en el medio que se ensaya. Se colocan el Ag y el Ac en 2 pequeos pocillos hechos sobre un soporte. Ambos difunden de forma radial en el gel, uno hacia el otro, de tal forma que cuando se ponen en contacto aparece un arco de precipitacin en el punto de equivalencia de Ag-Ac.

Se pueden obtener 3 PATRONES: PATRN DE IDENTIDAD: Ponemos en un pocillo el Ac y en otros dos pocillos el Ag1 y el Ag2. Si el Ag 1 y 2 son iguales, se unen las lneas de precipitacin, apareciendo un solo arco de precipitacin:

PATRN DE SEMIIDENTIDAD: Los Ag 1 y 2 estn relacionados pero no son idnticos. Las lneas de precipitacin se funden en un punto de corte:

PATRN DE DISPARIDAD: Los Ag 1 y 2 son diferentes y las lneas de precipitacin se entrecruzan: 50

INMUNODIFUSIN RADIAL El Ag est incluido en el Agar. Se practican unos pocillos donde se coloca la muestra. Se mide la distancia del arco de precipitacin. Se usa fundamentalmente para Inmunoglobulinas y otras protenas del suero.

UT 9. DETERMINACIONES ANALTICAS EN EL METABOLISMO BSICO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

1. FISIOPATOLOGA
1.1 CONCEPTO Y FUNCIONES Los Hidratos de Carbono son compuestos orgnicos formados fundamentalmente por C, H, y O, entrando estos dos ltimos elementos en la misma proporcin que en el agua 2:1. Son Polihidroxialdehidos polihidroxicetonas: (29/11/01)

Su frmula emprica es (CH2O)n. Son los compuestos ms frecuentes en la naturaleza. Funciones: Obtencin de E: es la forma ms rpida que tiene el organismo para obtener E. Reserva energtica en forma de glucgeno. Estructural: sobre todo en las plantas (Ej. Celulosa) 1.2 CLASIFICACIN

Monosacridos
Constituidos por una sola molcula de polihidroxialdehdo cetona. La frmula emprica es (CH2O)3 a) Aldosas: Cuando tienen un grupo aldehdo en la cadena n = 3 Gliceraldehdo n = 4 Tetrosas (Eritrosa, Terrosa) n = 5 Pentosas (Ribosa, Arabinosa, Xilosa) n = 6 Hexsosas (Glucosa, Galactosa) n = 7 Heptosas n = 8 Octosas

b) Cetosas: Tienen un grupo ceto en la cadena

n = 3 Cetotriosas (Dihidroxiacetona) n = 4 Cetotetrosas (eritrolosa) 51

n = 5 Cetopentosas (Ribulosa) n = 6 Cetohexosas (Fructosa) Estructura Qumica de los Monosacridos Formas L y D: estn determinadas por la posicin que ocupa, en el C5, el grupo -OH. As, las formas D son aquellas que tienen el OH en la derecha, mientras que las formas L son las que lo tienen a la izquierda (D-Glucosa es el azcar ms frecuente y ms importante en el organismo humano).

Formas Epmeras: son azcares que difieren en la posicin que tiene un grupo OH varios de algunos de sus tomos de carbono.

Hemiacetal: en solucin, los azcares estn en forma cclica de hemiacetal, que resulta de la reaccin de los grupos aldehdos o cetnicos con el grupo OH de una misma molcula. En disolucin hay equilibrio entre ambas formas (cclicas y no cclicas). Los grupos situados a la izquierda de la molcula se sitan hacia arriba del anillo y los de la derecha, en la parte inferior.

Formas y : Las formas cclicas pueden existir de dos maneras. Las alfa tienen el grupo OH del C1 hacia abajo, mientras que las beta lo tienen hacia arriba. Ambas formas desvan la luz polarizada de diferente forma y en solucin coexisten las dos.

Disacridos
Estn formados por dos monosacridos iguales o distintos entre s. Los monosacridos se unen por un enlace glucosdico, que se forma entre un grupo carbonilo de un monosacrido y un grupo OH del otro. Los ms importantes son: Sacarosa: D-Glucosa + D-Glucosa (azcar comn) Lactosa: D-Galactosa + D-Glucosa 52

Maltosa: D-Glucosa + D-Glucosa

Oligosacridos
Formados por la unin de 3 a 10 monosacridos.

Polisacridos
Formados por la unin de ms de 10 monosacridos. Pueden ser: Homopolisacridos: Estn constituidos por un nico tipo de monosacrido. El ms importante es el glucgeno, que es la forma de almacenamiento de la Glucosa en el hgado. Heteropolisacridos: Tienen 2 ms tipos de monosacridos. Pueden estar formados por aminoazcares denominndose entonces mucopolisacridos (heparina, cido hialurnico, cido condroitn sulfato). La alteracin del metabolismo de estos mucopolisacridos da lugar a enfermedades hereditarias de grave pronstico pero poco frecuentes. 1.3 METABOLISMO Ingreso en el organismo: Son ingeridos con la dieta diaria, sobre todo en forma de polisacridos (Almidn) y en forma de disacridos (Sacarosa y Lactosa) y, en menor proporcin, en forma de monosacridos (Glucosa, Galactosa y Manosa). Digestin: Actan los enzimas digestivos para transformar los Hidratos de Carbono en monosacridos. La digestin comienza en la boca, donde acta la Amilasa Salivar, que comienza a transformar el Almidn en Dextrina y disacridos. En el intestino acta la amilasa pancretica, que transforma el Almidn en Dextrina y disacridos. Tambin en el intestino delgado actan las disacaridasas que transforman los disacridos en monosacridos, fundamentalmente Glucosa. Absorcin/ Transporte/ Metabolismo: La Glucosa se absorbe en el intestino, pasando a la sangre y siendo transportada al hgado y al msculo donde se almacena en forma de glucgeno mediante una serie de reacciones que reciben el nombre de Glucognesis en la que se consume Energa, por lo tanto, forma parte del anabolismo donde de sustancias ms pequeas se crean sustancias ms grandes con consumo de E. Tambin la Glucosa puede ser transportada a las clulas que necesitan E en ese momento. La Glucosa entra e el interior de las clulas y tiene lugar una serie de reacciones denominadas Gluclisis que se puede llevar a cabo de forma aerobia anaerobia. Con estas reacciones la Glucosa se transforma en E (forma parte del Catabolismo). Si el organismo necesita Glucosa, recurre al Glucgeno que, mediante un conjunto de reacciones que reciben el nombre de Glucogenolisis se transforma en Glucosa (Catabolismo) Si la necesitad de Glucosa es muy grande, bien porque no se pueda utilizar la Glucosa sangunea, o bien porque no haya reservas, la propia clula es capaz de sintetizar Glucosa a partir de fuentes alternativas como, por ejemplo, los aminocidos, el lactato, los cidos grasos, los cuerpos cetnicos, glicerol,... mediante un proceso llamado Neoglucognesis (Anabolismo). La Neoglucognesis tiene lugar en las clulas hepticas, adiposas y musculares

53

Regulacin Hormonal del metabolismo de los Hidratos de Carbono: Los niveles de Glucosa se mantienen dentro de unos mrgenes estrechos y constantes y se encuentran regulados fundamentalmente por dos hormonas que son la Insulina y el Glucagn, ambas secretadas por el pncreas endocrino. ste est formado por pequeos y numerosos islotes de clulas llamadas Islotes de Langerhans, que tienen dos tipos de clulas: (Producen glucagn) y (Producen insulina). Estas ltimas son mucho ms abundantes.
INSULINA

Es una hormona proteica que sale a la sangre donde circula poco tiempo y es metabolizada en el hgado. Se sintetiza a partir de una molcula, que es la proinsulina que se escinde (divide) para dar lugar a la insulina y al pptido C. Influye tanto en el metabolismo de Hidratos de Carbono, como en el de los lpidos o el de las protenas:

a) Influencia sobre los Hidratos de Carbono: La insulina es la nica hormona

hipoglucemiante, es decir, que promueve la captacin, el almacenamiento y el uso de la Glucosa para la mayora de las clulas del organismo, disminuyendo su concentracin en la sangre. Es especialmente importante su efecto en el hgado, favoreciendo la entrada masiva de Glucosa para obtener E, pero no necesita insulina para la entrada de la Glucosa en las Clulas.

b) Influencia sobre los lpidos: Ahorra grasa para obtener E, por lo tanto,
disminuye la liplisis y aumenta la sntesis de cidos grasos.

c) Influencia sobre las protenas: Favorece la entrada de aminocidos en la clula,

por lo que aumenta la sntesis de protenas.
GLUCAGN

Es una hormona proteica que produce hiperglucemia, es decir, un aumento de glucosa en sangre. Este aumento se produce por dos motivos fundamentales: aminocidos La regulacin de la secrecin de insulina y glucagn viene determinada fundamentalmente por la Glucemia, es decir, por la cantidad de glucosa en sangre. En ayunas, con una glucemia normal, la secrecin de insulina es basal mnima. Como la insulina es hipoglucemiante se establece un mecanismo de retroalimentacin negativo (inhibicin de la insulina) 54 Favorece la glucogenolisis en el hgado Favorece la formacin de glucosa a partir de los

INSULINA Glucemia (-) Feed Back Con el glucagn ocurre lo contrario. Si hay hipoglucemia, el pncreas libera la produccin de glucagn.

Control de la Glucemia. La glucemia normal en ayunas es de aproximadamente 80-90 mg/100 mL. Se eleva despus de las comidas hasta aproximadamente 140 mg/100mL, volviendo a la normalidad a las 2 horas. Adems de la Insulina y el Glucagn, tambin el Hgado regula la glucemia: aumenta la glucogenolisis cuando la glucosa es baja y absorbe glucosa para formar glucgeno cuando la glucemia aumenta. Tambin el Sistema Nervioso interviene en la regulacin de la glucosa: la hipoglucemia determina un estmulo del Sistema Nervioso Simptico (SNS) que se manifiesta con un aumento de la Adrenalina y que determina un estmulo de la glucogenolisis heptica. 1.4 ALTERACIONES DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
HIPERGLUCEMIA: DIABETES MELLITUS

Concepto: Es una enfermedad plurietiolgica de base gentica que se caracteriza por la mala utilizacin de los Hidratos de Carbono, que determina un aumento de la Glucemia. Fisiopatologa: Aumento de la glucemia en ayunas por encima de los 140 mg/dL (7,8 mmol/L) Aumento exagerado de la glucosa a cualquier hora del da por encima de los 200 mg/dL (11,1 mmol/L). Aparicin de glucosa en orina (glucosuria) cuando la glucemia es superior a los 180 mg/dL (10 mmol/L), que es el umbral de filtracin para la glucosa. El aumento de la glucosa en orina determina un aumento de la osmolaridad de la orina y, por lo tanto, un aumento de la secrecin de agua en la orina, producindose una poliuria. El aumento de la glucemia aumenta la osmolaridad sangunea y, por lo tanto, un aumento del agua intravascular por dos mecanismos que determinan una hemodilucin de los elementos formes de la sangre y que son: 1. Por un aumento de la sed (Polidipsia), que obliga a beber agua en grandes cantidades. 2. Que exista un trasvase de agua desde el interior de la clula al exterior. La glucosa est muy aumentada en sangre pero es incapaz de ingresar en la clula y producir E por la falta de Insulina. Por ello, la sensacin de hambre no se aplaca 55

y el enfermo come mucho (Polifagia), a pesar de lo cual disminuye su peso corporal ya que se utilizan las reservas activndose la neoglucognesis con gran formacin de cuerpos cetnicos que pueden dar lugar a una acidosis metablica. Con el tiempo y con hiperglucemias prolongadas se producen trastornos vasculares que afectan a los vasos pequeos (Retina, Rin...) y a capilares de la circulacin general, pudiendo acabar el enfermo con ceguera, insuficiencia renal o gangrena de las zonas perifricas.

Tipos de Diabetes Mellitus Diabetes Mellitus Insulino dependiente (DMID) Diabetes Juvenil Diabetes Tipo I. Diabetes Mellitus NO Insulino dependiente (IMNID) Diabetes del adulto Tipo II: el dficit de insulina no es absoluto pero no hay insulina suficiente para mantener los niveles de glucosa dentro de los valores normales. Estos enfermos se tratan con dieta y con antidiabticos orales. Diabetes Mellitus Secundaria: puede aparecer un aumento de la glucemia, secundaria a muchas patologas, como por ejemplo, por enfermedades del pncreas o la ingestin de frmacos como los corticoides o los anticonceptivos orales.

HIPERGLUCEMIA: DISMINUCIN DE LA TOLERANCIA A LA GLUCOSA La Glucemia es menor de 126 mg/dL (valor normal). Cuando a estos pacientes se les administra por va oral una cantidad de glucosa, a las 2 horas los valores de la glucemia son valores intermedios entre los fisiolgicos y los de la diabetes. No existe clnica, suelen ser obesos y, muchas veces, disminuyendo el peso se corrige el problema. Estas personas tienen mayor tendencia a padecer Diabetes Mellitus en el futuro. HIPERGLUCEMIA: DIABETES DEL EMBARAZO Se diagnostica durante el embarazo, normalizndose los niveles de glucosa al terminar el mismo. Esta diabetes siempre es insulino dependiente. HIPOGLUCEMIA Los niveles de glucosa estn por debajo de 40-45 mg/dL. Puede ser: En ayunas: a su vez puede ser debida a 2 motivos principales: Ayuno prolongado Insulinoma: Tumor del pncreas (hiperplasia aumento del nmero de clulas) que da lugar a un aumento de la insulina. Hipoglucemia reactiva por comer o tomar medicamentos: la ms importante es la producida en los enfermos diabticos tras la administracin de insulina o hipoglucemiantes orales. Manifestaciones clnicas de la Hipoglucemia 56

 Manifestaciones Precoces: aparecen secundarias a la liberacin de Catecolaminas (Adrenalina y Noradrenalina) que se produce para aumentar la glucogenolisis y, por tanto, la glucosa en sangre. Estas manifestaciones son ms intensas cuanto ms rpidamente se instaura la hipoglucemia. Son las siguientes: Taquicardia; sudoracin intensa; temblores; Sensacin de ansiedad; sensacin de hambre; hipertensin;... Manifestaciones Tardas: son debidas a las alteraciones del sistema nervioso central y son las nicas que aparecen cuando la hipoglucemia se instaura lentamente. Son: Mareos; cefalea; alteraciones de la percepcin visual; confusin; convulsiones; y coma.

2. TCNICAS DE ANLISIS PARA VALORAR EL FUNCIONAMIENTO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

2.1 DETERMINACIN DE LA GLUCEMIA BASAL

a) Mtodos basados en el poder reductor de los H.C:

Reduccin del cobre (mtodo de Benedict) O Toluidina (no se usa) Mtodo de la Hexoquinasa: es el mtodo de referencia porque es el que proporciona el mximo de especificidad. Se basa en las siguientes reacciones: GLUCOSA + ATP GLU-6-P + ADP
Hexoquinasa

b) Mtodos enzimticos

GLUC-6-P + NADP Fosfogluconolactona + NADPH + H+ 6 Mtodo de la Glucosa-Oxidasa: se basa en la oxidacin de la glucosa por la enzima Glucosa Oxidasa. Dentro de este mtodo existen otros, siendo el ms utilizado el mtodo Trinder.

2.2 HEMOGLOBINA GLICOSILADA La Hb Glicosilada es una fraccin de la Hb A unida de forma irreversible a la glucosa por enlaces covalentes. Su aparicin es proporcional a los niveles de glucosa en sangre y se mantiene hasta que son destruidos los hemates. No es til para el diagnstico de la diabetes porque es muy especfica pero no muy sensible, por lo tanto, la obtencin de Hb glicosilada normal no excluye la diabetes. Se utiliza para hacer el seguimiento de los enfermos diabticos porque permite conocer los niveles de glucemia de los 2 meses anteriores a la determinacin. Se emplea la fraccin de Hb A1c y los niveles de referencia estn alrededor de 4,5-5,7 %. Los mtodos para su determinacin son: HPLC; Cromatografa de intercambio inico; Cromatografa de afinidad; e Inmunoturbidimetra (la ms usada) 57

2.3 FRUCTOSAMINA Las protenas del plasma se glican (se unen a glucosa) por un mecanismo enzimtico de forma similar a la Hb glicosilada, por ello, la determinacin de la fructosamina se usa para el seguimiento de los diabticos. La vida media de las protenas plasmticas es de 17-30 das, por lo tanto, nos da informacin de la tasa de glucemia de 2 3 semanas anteriores a la determinacin. Se determina por espectrofotometra. 2.4 OTRAS DETERMINACIONES Insulina: Se determina mediante ELISA y RIA Pptido C: se utiliza para saber si una hiperinsulinemia es de origen exgeno o endgeno ya que los preparados comerciales de insulina no llevan pptido C. Para su determinacin se usa el RIA. Microalbuminuria: es la excrecin de protenas por la orina en cantidad inferior a los 20 mg/dL. Por debajo de esta cantidad no se detectan las protenas en orina con las tiras reactivas. Sirve para el control precoz de los diabticos, para detectar las lesiones renales por microangiopata. Se determina mediante mtodos inmunoqumicos, por nefelometra o turbidimetra, y nos permite detectar niveles de entre 2 a 20 mg/dL. Anticuerpos y Receptores: se pueden determinar Ac anti-insulina, Receptores de insulina y Ac contra las clulas productoras de insulina. Se pueden determinar por enzimoinmunoensayo y por inmunofluorescencia indirecta. 2.5 PRUEBAS FUNCIONALES Se llaman Test de Tolerancia a la Glucosa Oral (TTGO) o tambin Prueba de Sobrecarga de Glucosa. Consiste en los siguientes pasos: Durante los das inmediatamente anteriores a la prueba, generalmente 3 das, el paciente debe ingerir una dieta rica en carbohidratos. No es conveniente realizar esta prueba a personas que se encuentran hospitalizadas por una enfermedad grave por dos motivos: la inmovilizacin y la dieta. Al paciente se le da una sobrecarga oral de 75 g de Glucosa (puede ser entre 50-100 g de Glucosa en adulto). A los nios se les da 1,75 g por kilogramo de peso siempre hasta un mximo de 75 g. Al paciente se le hace una extraccin de sangre en condiciones basales y se le determina la glucemia basal. Debe haber estado en ayunas al menos 12 horas. Se le ofrece una solucin de Glucosa que debe beberse despacio (durante unos 5 minutos). Si se presentan nauseas, mareos, sudoracin o cualquier signo de hiperactividad del sistema nervioso vegetativo debe extraerse una muestra de sangre inmediatamente y suspender la prueba. A la hora y a las dos horas de iniciar la ingestin se extrae sangre venosa. Hay que tener en cuenta que la Glucosa es mal tolerada por algunos pacientes. Si vomitan lo anotaremos porque puede modificar la prueba.

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La tolerancia a la Glucosa disminuye con la edad, por eso la prueba es de difcil interpretacin en personas mayores. Evaluacin: segn la OMS se diagnostica Diabetes cuando: La Glucosa Plasmtica en ayunas es superior a 140 mg/dL El valor a las 2 horas debe ser superior o igual a 200 mg/dL El valor de Glucosa entre 0-2 horas debe ser superior a 200 mg/dL

Las pruebas de sobrecarga se realizan para establecer el diagnstico en los siguientes casos: Personas con glucosuria que tienen glucemia basal normal y no tienen sntomas clnicos de diabetes. Personas que tienen sntomas de diabetes, glucemias basales normales y no tienen glucosuria. Personas que tengan antecedentes familiares de Diabetes Mellitus. Mujeres que han tenido hijos con peso excesivo (Ej. 4,5 Kg.) Embarazadas.

UT 10. ESTUDIO BIOQUMICO DE LA ORINA

1. ANLISIS DE ORINA: OBJETIVOS
Obtener informacin del estado general de los riones y sus posibles alteraciones. Detectar la existencia de una alteracin a nivel de las vas urinarias. Detectar alteraciones funcionales de otros rganos teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan por va urinaria. Ej.: Urea; Creatinina; cido rico... Detectar alteraciones metablicas y del equilibrio cido-base e hidroelectroltico. Resumiendo, buscamos en primer lugar sustancias que no estn normalmente en orina (Ej. Glucosa, protenas,...) y, en segundo lugar alteracin en la concentracin por exceso o defecto de sustancias que habitualmente estn en la orina (Ej. Urea, cido rico,...).

PATOLOGA DEL APARATO URINARIO

I. ENFERMEDADES RENALES

a) Glomerulonefritis (GNF)
CONCEPTO: es una inflamacin del ganglio renal. ETIOLOGA (causas): Primaria: tiene un origen inmunolgico (Ej. Estreptococo hemoltico como Ag)

59

Secundaria: aparece como consecuencia de otra patologa (Ej. Lupus Eritematoso Sistmico LES Orina: Oliguria (disminucin del filtrado glomerular) Albuminuria Hematuria Aumento de la permeabilidad de la membrana Leucocituria Extrarrenal: Hipertensin Arterial HTA Edemas: aparicin de lquido en el tejido intersticial Azotemia: retencin de productos nitrogenados en sangre Acidosis Metablica

FISIOPATOLOGA: -

b) Sndrome Nefrtico
CONCEPTO: es un sndrome cuya clnica se caracteriza por Proteinria; Hipo y Disproteinemia (baja concentracin y distinta proporcin de protenas en sangre); Edemas e Hiperlipidemia. ETIOLOGA: Glomerulonefritis; LES, etc. FISIOPATOLOGA: - Orina: Proteinria muy elevada y selectiva y Cilindruria (aparicin de cilindros en orina) Extrarrenal: Hipoproteinemia; hiperlipemia; Edemas.

c)

Insuficiencia Renal (IRA) CONCEPTO: es una lesin aguda de las clulas tubulares ETIOLOGA: Disminucin del riego sanguneo (IRA Prerrenal) Glomerulonefritis y otras enfermedades renales (IRA Renal) Obstruccin de las vas urinarias (IRA Postrrenal) FISIOPATOLOGA: 1 Fase: Oliguria (9-11 das) orina escasa, isostenuria; Albuminuria; Hematuria; Piuria; cilindruria. 2 Fase: Polirica (2 3 semanas) Orina abundante e Hipostenuria (densidad baja) que se produce porque los tbulos renales se hacen insensibles a la hormona antidiurtica ADH.

AGUDA

CRNICA CONCEPTO: es la incapacidad para cumplir las funciones renales alcanzada lentamente por progresiva inutilizacin de las nefronas. ETIOLOGA: Enfermedades glomerulares; intersticiales; enfermedades vasculares; tumores; etc. enfermedades

60

FISIOPATOLOGA: al principio hay compensacin por las nefronas sanas. Progresivamente se produce oliguria con hipostenuria y finalmente se produce la descompensacin total dando lugar al cuadro llamado UREMIA que se caracteriza por Oliguria; Isostenuria; Azotemia; Acidosis, etc. ENFERMEDADES DE LAS VAS URINARIAS

II.

a)

Litiasis Urinaria Clico Nefrtico: es un cuadro doloroso por la formacin de clculos en las vas urinarias.

b)

Infecciones de las Vas Urinarias:

Cistitis: inflamacin de la vejiga urinaria, casi siempre por infecciones y cuya clnica consiste en Polaquiuria (aumento del nmero de micciones); Disuria (dolor al orinar) y Tenesmo Vesical (aumento de ganas de orinar). Uretritis. Tumores.

c)

2. ETAPAS DEL ANLISIS DE ORINA

A. CARACTERSTICAS GENERALES Y MEDIDAS A.1 COLOR Orina normal: amarillo-mbar. Vara en funcin de la concentracin de la orina Alteraciones: Orina incolora o amarillo muy claro: aparece en: *La Diabetes inspida: disminucin o falta de la Vasopresina o Antidiurtica ADH. * Poliuria: eliminacin de mayor cantidad de orina. Heptica. Orina amarilla-amarilla: o verdoso-amarillento: Signo de Ictericia (Bilirrubina aumentada que se elimina por la orina) Orina amarillo oscuro: Signo de fiebre aguda (eliminacin de cuerpos cetnicos). Orina lechosa, blanca: Signo de infecciones urinarias como la cistitis (presencia de leucocitos) 61 Orina marrn o pardo oscura: Signo de Hepatitis o Cirrosis

Orina rojiza: Significa siempre la presencia de sangre. Puede ser rojo turbio cuando es Hematuria (hemates en orina) o rojo claro cuando se trata de Hemoglobinuria (no hay hemates sino hemoglobina). Orina naranja: Se debe a la toma de algn tipo de antibiticos. Orina negra: Se deben a la existencia de melanina o cido Homogentsico.

A.2 TURBIDEZ La orina recin emitida es clara y transparente. Luego, con el tiempo se opacifica por la precipitacin de sales. La orina de los pacientes con infeccin pigena (infecciones bacterianas) de las vas urinarias es frecuentemente turbia recin emitida. Hay que diferenciar la turbidez por piuria (pus en orina = leucocitos) de la producida por la precipitacin de sales. Esto se hace de varias formas: Si hay uratos (sales de cido rico) al calentar la orina a 60C desaparece la turbidez. Si acidificamos la orina y no desaparece la turbidez significa piuria. Se mide el pH de la orina. Si es bsico, la turbidez es debida ms frecuentemente a Fosfatos y Carbonatos.

La aparicin de espuma resistente al agitar, significa presencia de protenas. A.3 DENSIDAD PESO ESPECFICO La densidad indica la relacin entre los slidos disueltos y el volumen total de la muestra. La densidad normal est comprendida entre 1010 1030 (1,010 1,030) Si la orina es la primera de la maana: 1020 1025 La densidad se puede medir con un urodensitmetro, por refractometra o mediante tiras reactivas. Este ltimo mtodo es el ms utilizado. Los Valores Anormales de peso especfico o densidad son: Densidad baja 1001 1003: Puede ser debida a una Diabetes inspida a una alteracin de la funcin renal que a su vez se puede deber a una glomerulonefritis GNF inflamacin del rin; a una pielonefritis inflamacin de la pelvis renal; al uso de diurticos; etc. Densidad alta > 1030: se debe a que el paciente padece patologas que conllevan una prdida de agua (diarreas, vmitos persistentes...) patologas que aumenten la cantidad de solutos pero que mantengan el volumen de lquido constante. Densidad fija: una orina con una densidad fija baja (aproximadamente 1010) se conoce con el nombre de Isostenuria e indica un dao renal grave. 62

A.4 PH URINARIO Los valores normales de pH urinario estn comprendidos entre 4,5 8,2, aunque el valor ms frecuente es el de 6. El pH urinario es ms bajo despus del ayuno nocturno y es ms alto despus de las comidas. Los valores anormales son: Acidez urinaria: - Dietas ricas en carne - Fiebre - Diabetes Mellitus - Acidosis metablica Alcalinidad: Dietas ricas en vegetales y ctricos lceras gstricas Tratamiento con anticidos Bacterias productoras de Ureasa (Ej. Proteus) Cistitis (inflamacin de la vejiga)

El pH urinario es importante en el caso de clculos urinarios (litiasis) ya que su formacin depende parcialmente del pH urinario. As, los clculos de Fosfato y Carbonato Clcico se desarrollan en orinas alcalinas. Los clculos de cido rico y de cistina aparecen en orinas cidas. El mtodo de medida del pH ms utilizado son las Tiras Reactivas, que utilizan como indicadores el Rojo de Metilo y el Azul de Bromotimol, y permiten diferenciar pH entre 5 y 9, obtenindose una gama de naranjas, verdes y azules.

A.5 VOLUMEN En adultos, la Diuresis normal oscila entre los 700 2000 cc/24h, aunque el volumen ms frecuente es de 1500 cc/24h. En nios hasta de 6 aos, lo normal es un volumen de entre 300 600 mL/24h, y de 6 12 aos entre 500 1100 mL/24h. A la diuresis normal influye fisiolgicamente la ingesta de lquidos y de sustancias diurticas (Ej. El alcohol, caf, frmacos diurticos, etc). Las alteraciones en el volumen son: Oliguria: disminucin del volumen urinario. 50-300 mL/24h Poliuria: aumento del volumen urinario superior a 2000 mL/24h Anuria: falta de formacin de orina o eliminacin inferior a 100 mL/24h

B. DETERMINACIONES QUMICAS

63

B.1 PARMETROS MS HABITUALES DETECTADOS EN EL EXAMEN BIOQUMICO DE LA ORINA Protenas Glucosa Cuerpos Cetnicos Hemoglobina Pigmentos Biliares Urobilingeno Nitritos En condiciones normales los mtodos de anlisis de orina no detectan estas sustancias debido a que su concentracin es menor que la sensibilidad de dichos mtodos, por ello se habla de Deteccin de Anormales. El estudio se hace de forma cualitativa o semicuantitativa mediante la utilizacin de la qumica seca, es decir, tiras reactivas de diferentes tipos. Si se precisan valores ms exactos se har la determinacin cuantitativa mediante los mtodos habituales (Espectrofotmetro, autoanalizador, etc) B.2 IMPORTANCIA CLNICA DEL ESTUDIO DE ANORMALES EN ORINA PROTEINAS: En condiciones normales estn en muy pequea cantidad. Aproximadamente entre 130 150 mg/da (Orina de 24 horas). En el recin nacido (3 primeros das de vida) los valores normales estn comprendidos entre 2 8 mg/100 mL de orina. Las protenas con peso molecular inferior a 50.000 60.000 D se filtran pero se reabsorben en el Tbulo Contorneado Distal TCD. Las protenas que habitualmente se eliminan por orina son: Albmina: constituye 1/3 del total de protenas que se eliminan. Tiene un peso molecular de 69.000 D. Es la llamada Albmina Fisiolgica. Globulinas Protena de Tamm-Horsfall: es una mucoprotena de estructura viscosa que no se encuentra en el suero, que se forma en el TCD y constituye la matriz de los cilindros. La Proteinria es la eliminacin de protenas en orina en cantidades superiores a lo normal. Tipos:

a)

En funcin de la cantidad de protenas: Proteinria Intensa (> 4 g /da) : tiene lugar en el Sndrome Nefrtico; en las glomerulonefritis;... en general, cuando hay un dao renal grave. Proteinria Moderada (0,5 4 g /da): se produce en las enfermedades renales menos graves. Proteinria Leve (< 0,5 g /da): aparece en enfermedades leves como los riones poliqusticos o lesiones renales incipientes o 64

tempranas; Mieloma Mltiple (tambin se puede incluir en enfermedad moderada).

b)

En funcin de la zona renal afectada: Proteinria de patrn glomerular: el glomrulo pierde su selectividad en la filtracin apareciendo en orina protenas de mayor peso molecular (Ej. Albmina). A mayor tamao de las protenas mayor lesin glomerular. Proteinria de patrn tubular: no se reabsorben las protenas de bajo peso molecular que son las que aparecen en la orina (Ej. Microglobulinas).

c)
renal -

En funcin de la duracin: Intermitente o Transitoria: aparece en pacientes sin causa Persistente.

GLUCOSA: La orina normal carece casi por completo de glucosa. La glucosa se filtra continuamente por el glomrulo pero se reabsorbe casi totalmente en el TCD. La mxima concentracin de glucosa en sangre que los tbulos son capaces de reabsorber se denomina umbral renal y es de 160 mg /dL. La Glucosuria es el aumento de la concentracin de Glucosa en orina por encima de los valores normales. Las causas de glucosuria son la Diabetes Mellitus, que aumenta la glucemia; y la Tubulopata, que mantiene una glucemia normal. CUERPOS CETNICOS: Se llaman cuerpos cetnicos al cido Acetil Actico Diactico; cido -hidroxibutrico y a la Acetona. En personas sanas, los cuerpos cetnicos se sintetizan en el hgado y en condiciones normales se metabolizan por completo, de tal forma que en orina aparecen en cantidades indetectables. La Cetonuria es la aparicin de cuerpos cetnicos detectables en orina. Las causas de que aparezca son fiebre alta, vmitos, diabetes mellitus,... HEMOGLOBINA: No aparece en orinas normales.

La hemoglobinuria es la presencia de hemoglobina en orina. Si la hemoglobina aumenta se ve a simple vista y las causas de que aparezca son las enfermedades renales de vas altas (rin, pelvis renal), anemia hemoltica, reacciones transfusionales... PIGMENTOS BILIARES: Son la Bilirrubina y la Biliverdina. Se forman en el hgado, en el bazo y en la mdula sea por degradacin fisiolgica de los hemates. El aumento de bilirrubina en orina aparece en disfunciones hepticas.

65

 UROBILINGENO: Es el resultado de la transformacin de la bilirrubina en el intestino. Da color a las heces y a la orina y aumenta en enfermedades hepticas. NITRITOS: Su aparicin en orina indica crecimiento bacteriano de grmenes capaces de reducir los nitratos a nitritos (Ej. Enterobacterias). Un resultado negativo no significa que no haya m.o ya que pueden ser no reductores de nitratos (Ej. Estreptococcus) y, adems, puede que no haya nitratos en la dieta. C. EXAMEN MICROSCPICO DEL SEDIMENTO C.1. CONCEPTO: el sedimento urinario comprende la investigacin e interpretacin de estructuras de distinto origen y composicin como clulas, cristales, cilindros, etc, utilizando el estudio microscpico. La muestra se prepara por centrifugacin de la orina. C.2. CLULAS: se buscan con el objetivo de 40x. Tenemos que hacer recuento de glbulos rojos y blancos y se informa como nmero de clulas por campo despus de haber observado 4 o 5 campos. Las clulas epiteliales y los m.o se suelen informar como ocasionales, escasos, frecuentes o muy numerosos. C.2.1 Hemates: Tienen formas circulares, ocasionalmente bicncavos, sin ncleo, refractan un poco la luz, tienen menor tamao que los leucocitos y clulas epiteliales. A veces se confunden con levaduras (hongos), pero stas tienen forma ovoide y suelen presentar brotes. En orinas de baja densidad los hemates se hinchan, incluso se lisan, dando lugar a lo que se llama clulas fantasma o corpsculos fantasma. En orinas de alta densidad pueden aparecer formas dentadas. Es normal la aparicin de 2 o 3 hemates por campo. El aumento de hemates en orina se llama hematuria y puede aparecer en distintas patologas como clculos renales, glomerulonefritis, infecciones, TBC, etc. C.2.2 Leucocitos: son ms grandes que los hemates pero ms pequeos que las clulas epiteliales. Contienen uno o ms ncleos. Los leucocitos polimorfonucleares tienen citoplasma punteado y bordes irregulares. Su aumento en orina se llama Leucocituria o Piuria y los valores normales son: Hombres >3 leuc. /campo Mujeres y nios 5 leuc. /campo

Las patologas en las que hay piuria son, por ejemplo, inflamaciones por infecciones urinarias (cistitis, uretritis...), tumores o en litiasis. C.2.3 Clulas Epiteliales: son varias veces ms grandes que los glbulos rojos o blancos. Tienen distintas formas segn su origen, pero su identificacin no es fcil porque presentan muchas alteraciones morfolgicas. Se distinguen 3 tipos: Clulas epiteliales escamosas o pavimentosas: proceden de la porcin distal del tracto urinario, es decir, de la uretra y del tracto genital en las mujeres. Son las ms grandes, de forma irregular, planas, con un gran citoplasma y un ncleo simple, pequeo y centrado. En general son muy poco significativas excepto que sean muy abundantes. 66

Clulas epiteliales de transicin: son de 2 a 4 veces ms grandes que los leucocitos. Tienen forma ovalada o piriforme (forma de pera). Tienen normalmente un ncleo grande (pueden tener dos). Revisten el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra. Si aparecen en grandes cantidades hay que hacer un estudio citolgico ms completo para descartar un calcinoma. Clulas tubulares: son un tercio mayores que los leucocitos. Tienen un ncleo grande y redondeado. Son de forma rectangular o cbica. No se detectan apenas en un sedimento normal. Su aumento indica dao tubular por distintas causas como, por ejemplo, pielonefritis, necrosis tubular aguda, rechazo del rin trasplantado, intoxicacin por salicilatos,... C.2.4 Espermatozoides: aparecen tanto en hombres como en mujeres y carece de significado patolgico. C.3. MICROORGANISMOS C.3.1 Bacterias: la orina es un lquido estril, pero se puede contaminar con facilidad. As, una orina alcalina con muchas bacterias y pocos glbulos blancos es caracterstica de muestras contaminadas. Si aparece bacteriuria hay que hacer un estudio microbiolgico. C.3.2 Levaduras: tienen una forma ovoidea con clulas en estado de gemacin. Tiene pared con doble refraccin y se parecen bastante a los hemates. El hongo ms frecuente en la orina es la Cndida albicans. La presencia de hongos indica contaminacin y pocas veces infeccin (Ej. Vaginitis por Cndida albicans) C.3.3 Parsitos: casi siempre indican contaminacin genital o fecal. La ms frecuente es la Tricomonas vaginalis, sobre todo en sedimentos de mujeres. El parsito es periforme, un poco mayor que los leucocitos y tiene una gran movilidad por la presencia de flagelos. Solo se deben informar si tienen movilidad, que es la caracterstica diagnstica. Otros parsitos son los oxiuros, huevos de parsitos, etc C.4. CILINDROS Son conglomerados alargados de material proteico constituidos por la protena de Tamm Horsfall. Se forman en los tbulos renales (TCD, TCP, TC). Pueden ser de distintos tamaos dependiendo se su origen, siendo ms estrechos los que proceden del tbulo contorneado distal y proximal y ms anchos los que proceden del tbulo colector. El sedimento urinario normal no tiene cilindros o escasos cilindros hialinos. Un nmero alto de cilindros en el sedimento indica enfermedad renal. Los cilindros, frecuentemente, se acompaan de proteinria. Para la formacin de los cilindros se requiere un pH de orina bajo, alta densidad o concentraciones de solutos altas y estancamiento de la orina que se produce casi siempre por una disminucin de la filtracin glomerular. C.4.1 Cilindros Hialinos: no tienen significacin clnica excepto que se vean en gran cantidad. Son poco refringentes, por lo tanto, se ven mejor con poca luz. Son plidos, transparentes y con matriz clara. Tienen extremos redondeados. Aumentan en la deshidratacin y en el ejercicio fsico.

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C.4.2 Cilindros Granulosos: predomina la estructura granular sobre la hialina. Se puede observar entre ellos glbulos rojos, blancos o grasa. Pueden ser ms anchos en un extremo que en otro. Su presencia indica nefropata. Hay dos tipos: Granulosos gruesos Granulosos finos: se pueden confundir con los hialinos pero los granulosos son ms refringentes. C.4.3 Cilindros de Clulas Epiteliales: siempre indican patologa. La matriz del cilindro engloba una serie de clulas epiteliales que se han desprendido de la luz tubular. Aparecen en lesiones tubulares producidas por txicos o por virus (Ej. Virus de la Hepatitis). C.4.4 Cilindros Hemticos o Eritrocitarios: aparecen en sedimentos con hematuria (hematuria renal). Son diagnsticos de enfermedad glomerular. Pueden ser incoloros o de color castao. Si los hemates se su interior estn intactos se habla de Cilindros Eritrocitarios, si los hemates se su interior se han degradado se transforma en un cilindro granuloso de color rojizo y se llaman Cilindros Hemoglobnicos o Hemticos. C.4.5 Cilindros Leucocitarios: aparecen en infeccin renal y otros procesos inflamatorios no infecciosos. C.4.6 Cilindros Creos: son altamente refringentes, duros, de aspecto rgido y brillantes. Los extremos pueden ser romos (redondeados) o cortados. Son grandes y sin grnulos. Son signo de lesin renal. C.4.7 Cilindros Grasos: son cilindros granulosos o celulares en los que aparecen inclusiones de grasa. Son amarillos, de alta refringencia. Son signo de enfermedad renal. C.5. CRISTALES La presencia de cristales en orina se llama cristaluria. Son habituales en la orina pero solo ocasionalmente tiene significado clnico. Se forman por precipitacin de sales cuando la orina se mantiene en la vejiga o en el recipiente de recogida. El pH de la orina es el factor ms determinante en la formacin de los cristales, as: CIDO RICO A un pH cido se forman URATOS y cristales de -

A un pH alcalino se forman los FOSFATOS TRIPLES, AMORFOS y CARBONATO CLCICO. A un pH variable se forman los OXALATOS CLCICOS, CISTINA, COLESTEROL, TIOSINA, LEUCINA, etc. C.5.1 Cristales poco significativos A. Cristales de Fosfato Triple (o de Fosfato Amnico Magnsico): aparecen en orinas neutras y alcalinas. Son incoloros, tienen de 3 a 6 caras con forma de ataud o sobre de carta. Pueden aparecer en orinas normales o en orinas de pacientes con infecciones del aparato urinario (Ej. Cistitis).

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B. Cristales de Fosfato Clcico: suelen aparecer en orinas alcalinas o neutras. Tienen forma de prismas largos y afilados. En ocasiones se unen unos con otros formando rosetas o estrellas. Suelen aparecer en orinas normales. Pueden dar lugar a clculos. C. Cristales de Oxalato Clcico: aparecen en orinas cidas y neutras. Son incoloros. Tienen forma de sobre cuadrado y al enfocarlos se observa una equis sobresaliendo del cristal. Aparecen en dietas ricas en oxalatos (Ej. Tomates, naranjas,...). No indican patologa pero de forma patolgica puede aparecer en hepatopatas y en litiasis renal. D. Cristales de Carbonato Clcico: aparecen en orinas alcalinas o neutras. Son poco frecuentes. Se ven como un material amorfo o granular con forma de pequeos lazos o esferas incoloras. No tienen inters clnico. E. Cristales de cido rico: aparecen en orinas cidas. Tienen un color amarillonaranja, con forma de diamante o roseta. A veces aparecen con 6 caras, como las de cistina. Su presencia no indica patologa necesariamente. Frecuentemente aparecen en un 16% de enfermos de gota. F. Uratos Amorfos: aparecen en orinas cidas. Se ven como un precipitado amorfo de color naranja o amarillento y carecen se significacin clnica. G. Uratos de Sodio: aparecen como agujas solas o en racimos, sin ningn significado clnico. C.5.2 Cristales significativos A. Cristales de Leucina y Tirosina: son productos finales del metabolismo proteico. Suelen aparecer juntos y aparecen en orinas cidas en enfermedad heptica grave. Los cristales de Tirosina aparecen como un manojo de agujas muy finas. Los cristales de Leucina son grnulos esfricos con estras radiales y concntricas de aspecto graso y muy refringente. B. Cristales de Cistina: son los nicos que tienen significacin clnica por s mismos ya que aparecen cuando se produce la eliminacin urinaria en exceso de dicho aminocido (Cistinuria). La cistinuria es un error metablico congnito poco frecuente. Tienen formas hexagonales regulares, transparentes. Cuando aparecen, es imprescindible confirmar la presencia de cistina en orina. C. Cristales de Colesterol: son placas planas, transparentes, con formas irregulares. Aparecen en nefritis e infecciones graves del tracto urinario y tambin en quiluria, que es la presencia de linfa en orina por obstruccin a nivel torcico y abdominal del drenaje linftico. D. Formas Cristalinas: solo son significativas cuando hay sospechas de toxicidad.

UT. 11 DETERMINACIONES ANALTICAS EN EL METABOLISMO CLSICO DE LOS LPIDOS

1. FISIOPATOLOGA DE LOS LPIDOS
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1.1 DESCRIPCIN: son molculas insolubles en agua y solubles en los disolventes orgnicos como el ter, cloroformo, etc. 1.2 FUNCIONES Funcin energtica: tienen mayor valor calrico que el resto de los principios inmediatos. Funcin de Almacenamiento: almacenan energa. Funcin Estructural: forman parte de las membranas celulares y de las lipoprotenas. Son Agentes Emulsificantes Son compuestos funcionales (Ej. Hormonas, vitaminas, prostaglandinas,...)

1.3 CLASIFICACIN

a)

Triglicridos: Valores normales en sangre: < 160 mg/ dL Son compuestos formados por esterificacin del glicerol con 3 cidos grasos. Pueden ser exgenos (provienen de la dieta) o endgenos (sintetizados en el hgado a partir de cidos grasos o a partir de los hidratos de carbono). La mayor parte de los lpidos entran en la dieta en forma de TG que, en el tubo digestivo, son transformados por la Lipasa Pancretica a glicerol y cidos grados. Su principal funcin es almacenar energa, por eso son movilizados rpidamente en situaciones de ayuno, de ejercicio, de fro, etc.

b)

Colesterol:

Valores normales de colesterol total: < 200 mg /dL Pueden ser exgenos o endgenos, en este caso es sintetizado por el hgado. Principales funciones: componente estructural fundamental de las membranas celulares; es precursor de las hormonas sexuales y de las hormonas de la corteza suprarrenal; y participa en la sntesis de los cidos biliares. Circula por la sangre unido a lipoprotenas

c)

cidos Grasos Libres:

Valores normales en sangre: 10 - 20 mg /dL 70

 Son los nicos lpidos que circulan por el plasma sin estar unidos a lipoprotenas Su principal funcin es servir de fuente inmediata de energa. En el ayuno prolongado, los cidos grasos se transforman en las mitocondrias de las clulas, en un proceso llamado oxidacin en acetil CoA que a su vez se transforma en cuerpos cetnicos dando lugar a un aumento de estos (acidosis). 1.4 LIPOPROTEINAS Son macromolculas que estn formadas en su estructura por lpidos apolares (TG y steres de colesterol) y, a su vez, estn formados por lpidos polares en su superficie (colesterol, fosfolpidos) y protenas. La parte proteica de las lipoprotenas se llaman Apoprotenas y se designan con las letras de la A a la F. Tipos de Lipoprotenas Quilomicrones: son partculas grandes que no presentan movilidad electrofortica. Aparecen en el plasma tras la ingestin de grasa y son sintetizados en el intestino a partir de TG, Fosfolpidos y de Colesterol. La vida media es inferior a 30 minutos. Su funcin es transportar los TG exgenos a los tejidos donde son hidrolizados por las lipoproteinlipasas a cidos grasos y glicerol. Los cidos grasos son utilizados o almacenados en forma de TG. VLDL (Very Low Density Lipoprotein): Son las protenas de muy baja densidad. Se sintetizan en el hgado y en el intestino a partir de los lpidos endgenos y exgenos. Migran en la zona pre- de la electroforesis. Su funcin principal es la de transportar los TG endgenos. Los TG son degradados por la lipoproteinlipasa y se transforman en unos residuos ricos en colesterol que pueden ser retirados de la circulacin o son transformados en otra lipoprotena que es la LDL. LDL (Low Density Lipoprotein): son protenas de alta densidad. Se originan de la degradacin de las VLDL en el torrente circulatorio. Su funcin es transportar el 80% del colesterol circulante hacia las clulas para la sntesis de las membranas celulares y de las hormonas. Tienen migracin electrofortica . HDL (High Density Lipoprotein): son protenas de alta densidad. Captan el colesterol libre de las clulas de los tejidos perifricos por accin de una enzima, la LCAT Lecitn Colesterol Acil Transferasa lo transforma en steres de colesterol. Este colesterol es una molcula hidrofbica que se sita en el interior de la lipoprotena y as es transportado al hgado donde es degradado transformndose en sales biliares y el eliminado. Lipoprotena A: tiene la apoprotena B-100, est en muy baja concentracin en el plasma, se sintetiza en el hgado, est regulada por gentica y tiene inters debido al carcter aterognico que tiene.

1.5 METABOLISMO DE LOS LPIDOS

71

Los quilomicrones estn en el torrente sanguneo. La grasa exgena proveniente de la dieta es transportada por el torrente circulatorio en forma de quilomicrones desde el intestino donde ha sido absorbida. Los TG endgenos, sintetizados en el hgado son transportados en forma de VLDL. Nada ms entrar en la circulacin son transformados por un enzima que est presente en la luz de los capilares, que es la Lipoprotein Lipasa, LPL que es activada por la APO C.II que se encuentra habitualmente en las partculas ricas en TG. La LPL va rompiendo los TG en cidos grasos y glicerol. Por accin de la LPL, las VLDL se transforman en una partcula de densidad intermedia que es la LDL. El quilomicrn, por accin de la LPL se transforma en quilomicrn vaciado o remanente, que se une a la superficie de los hepatocitos, se introduce en su interior y se degrada. Las HDL que provienen del hgado captan el colesterol libre de los tejidos y, por accin de la Lecitin Colesterol Acil Transferasa, LCAT esterifican el colesterol. Parte de los steres de colesterol son incluidos en las HDL y son transportados al hgado donde son eliminados. Otra parte de los steres de colesterol son transportados a las IDL que pasan a convertirse en LDL. Se degradan en el hgado del 30-50% de las LDL circulantes, el resto son ligadas o unidas por un receptor celular especfico que se encuentra en casi todos los tejidos extrahepticos y que reconocen a la APO B. El complejo Receptor-Protena entra en la clula y es degradado por los lisosomas.

1.6 PATOLOGA DE LOS LPIDOS: DISLIPOPROTEINEMIAS Concepto: Las dislipoproteinemias son alteraciones de las fracciones lipdicas circulantes. La importancia clnica de las mismas est relacionada con una patologa que es la Arteroesclerosis (formacin de placas de ateroma en las arterias). Tipos: Primarias: en este caso se deben a mutaciones en los genes que codifican la sntesis de lipoprotenas. Secundarias: acompaan a tras enfermedades como por ejemplo la diabetes mellitus, sndrome nefrtico, alcoholismo, mala dieta, etc. Estos se corrigen mejor al tratar la enfermedad primaria.

2. TCNICAS DE ANLISIS
72

2.1 ANLISIS DE COLESTEROL TOTAL El anlisis de colesterol se complica por la existencia de dos formas moleculares que son el Colesterol Libre (1/3 del total) y el Colesterol Esterificado. El mtodo ms utilizado es el enzimtico, en el que se hidrolizan inicialmente los steres de colesterol y se mide el colesterol libre total. Es un anlisis muy especfico. El colesterol se va a determinar mediante un mtodo enzimtico colorimtrico por espectrofotometra con autoanalizador. 2.2 ANLISIS DE TRIGLICRIDOS Se analizan por mtodos colorimtricos tanto qumicos como enzimticos mediante un autoanalizador. Todos los mtodos empleados implican 2 procesos: 1. Hidrlisis de los triglicridos para formar glicerol y cidos grasos. 2. Medida del glicerol liberado. 2.3 ANLISIS DE HDL COLESTEROL El mtodo que ms se usa consiste en eliminar las lipoprotenas que contienen APO B y que son: los quilomicornes, VLDL, LDL y Lipo A mediante precipitacin y medir posteriormente el colesterol en el sobrenadante. Se utiliza como precipitante el Fosfotungstato / Mg++ y se hace una medida enzimtica del HDL colesterol. 2.4 CLCULO DE LDL COLESTEROL Sus niveles se miden por ultracentrifugacin pero tambin se puede calcular con gran aproximacin mediante la frmula de Friedewald, que es la siguiente: LDL colesterol = Colesterol Total (TG / 5 + HDL colesterol) El error que se comete en esta frmula es inferior al 5-10%, excepto cuando el contenido de TG es superior a 400 mg /dL, en cuyo caso no puede aplicarse la frmula. 2.5 ANLISIS DE APO Y LIPOPROTENAS Ultracentrifugacin: al someter un suero a ultracentrifugacin, las distintas fracciones lipoproteicas se sitan a distintas alturas segn las densidades. Mtodos electroforticos: separan las lipoprotenas segn su velocidad de migracin en el campo elctrico. Los Quilomicrones, si estn presentes, permanecen en el origen. Las dems lipoprotenas se mueven hacia el polo positivo ya que a un pH de 8,6 tienen carga neta negativa: pre- Mtodos inmunolgicos: se puede utilizar el RIA, el EIA, Inmunodifusin radial, la Inmunonefelometra, etc. Las HDL se sitan en la zona de las -globulinas Las LDL en la zona de las -globulinas Las VLDL se mueven con las globulinas 2 localizndose en la zona

2.6 DETERMINACIN DE EXISTENCIA O NO DE QM EN AYUNAS 73

 Condiciones de la muestra: El paciente debe estar en ayunas 12 horas antes de la extraccin. Puede tomar agua y medicamentos pero hay algunos frmacos como los anticonceptivos orales y la heparina que pueden influir en las concentraciones de las lipoprotenas. El consumo de alcohol debe restringirse o eliminarse 2 das antes La muestra puede ser suero o plasma. Es importante que el anticoagulante elegido sea EDTA La centrifugacin de la sangre debe hacerse lo ms pronto posible, siempre antes de 3 horas. Valoracin de los resultados: El estudio de las Hiperlipidemias es importante por varios motivos: 1. Existen casos hereditarios en los que es necesario el control desde la infancia, siendo sumamente importante el consejo gentico. 2. Su relacin son las enfermedades vasculares (cardiopata isqumica, accidentes cerebro-vasculares) est ampliamente demostrada. La peligrosidad aumenta cuando se asocian tabaquismo, hipertensin arterial, diabetes y los anticonceptivos orales. Actualmente se consideran valores de colesterol a tener en cuenta los siguientes: vida saludable Colesterol Total 200 250 mg /dL se aconseja dieta y

Colesterol Total 250 300 mg /dL se requiere confirmacin y adems otros datos analticos como la HDL colesterol, apoprotenas, etc, y se le da tratamiento farmacolgico si las cifras no bajan con dieta. Colesterol Total > 300 mg /dL confirmado hay que determinar si el paciente presenta una hipercolesteronemia endgena o primaria.

74

UT 12. DETERMINACIONES ANALTICAS EN EL METABOLISMO BSICO DE LAS PROTENAS

FISIOLOGA DE LAS PROTENAS
1. COMPOSICIN: estn constituidas por la unin de aminocidos. Los aa poseen un grupo amino NH2 y un grupo carboxilo COOH.

Los aa integrantes de las protenas son 20, que se diferencian entre s por el grupo R. Son anfteros, es decir, que se pueden comportar como cidos o como bases dependiendo del medio en el que estn. En disolucin acuosa existe equilibrio entre el in dipolar y la forma aninica y catinica del aa:

La posicin de equilibrio depende del pH de la disolucin, llamndose punto isoelctrico al pH en el que tiene una carga neta 0, es decir, no es ni cido ni base sino que es neutro. El punto isoelctrico es caracterstico de cada aa. En general, en soluciones cidas, los aa estn presentes como cationes y en soluciones bsicas estn en forma de aniones. Las protenas estn formadas por la unin del grupo carboxilo de un aa al grupo amino de otro aa formando un enlace peptdico. La unin de aa da lugar a la formacin de pptidos que reciben en nombre de polipptidos cuando al menos se unen 100 aa. Se habla de protenas cuando se unen ms de 100 aa entre s. 2. ESTRUCTURA Estructura primaria: es la secuencia de zz Estructura secundaria: plegamiento de zz en el espacio sobre s mismos dando lugar a una estructura tridimensional. Hay 3 tipos: -hlice, lmina plegada y triple hlice. mismas. Estructura terciaria: las anteriores estructuras se pliegan a su vez sobre s

Estructura cuaternaria es la unin de distintas cadenas polipeptdicas que forman parte de una protena (Ej. Hemoglobina)

75

3. CLASIFICACIN Segn su forma:

a)

Fibrilares o Fibrosas: tienen las cadenas polipeptdicas dispuestas paralelamente entre s (Ej. Colgeno, -queratinas,...)

b)

Globulares: formadas por una o ms -hlices enrolladas formando una esfera (Ej. La mayora de las enzimas, hormonas y anticuerpos) Segn su composicin:

a) b)

Simples: compuestas solo por aminocidos (Ej. Albmina)

Conjugados: tienen en su composicin adems de zz un componente no proteico que se llama grupo prosttico. Estas protenas se subdividen de acuerdo con la naturaleza del grupo prosttico en Lipoprotenas; Glucoprotenas; Nucleoprotenas y Fosfoprotenas. Segn su funcin biolgica:

a)

Enzimas: son protenas que actan como catalizadores biolgicos (Ej. Coagulasa, transaminasa...)

b) c)

Hormonas: son protenas que actan como mensajeros (Ej. FSH,...)

Estructurales: mantienen unidas las estructuras del organismo (Ej. Colgeno, queratina,...)

d) e) f)

Transportadoras: transportan molculas o iones en el interior del organismo (Ej. Hemoglobina) Protectoras: encargadas de la defensa del organismo (Ej. Gammaglobulinas) Contrctiles: intervienen en la contraccin y relajacin muscular (Ej. Actina, miosina,...)

g)

Txicas (Ej. Venenos de serpiente)

4. DIGESTIN, ABSORCIN Y METABOLISMO Estmago Duodeno

PROTENAS POLIPPTIDOS
pepsina

PROTENAS POLIPPTIDOS aa
Tripsina Pancretica

Aminopeptinas

Se da en el Duodeno, en forma de aminocidos. Los aminocidos son utilizados para sintetizar protenas si son necesarias Si las protenas no son necesarias: 76

5. PROTENAS SRICAS La Concentracin de protenas sricas es de aproximadamente 7 g/ 100 mL Se Clasifican mediante tcnicas como la electroforesis en grupos o fracciones, fundamentalmente 5 fracciones: Albmina - globulinas - globulinas - globulinas Fibringeno

Sus Funciones son: nutricin celular, soporte, transporte, coagulacin sangunea, intervienen en el sistema tampn, etc. Alteraciones en la Concentracin: Elevacin de las protenas sricas: puede ser una elevacin relativa cuando hay una disminucin del agua corporal, o puede ser una elevacin absoluta en enfermedades crnicas como la cirrosis heptica. Disminucin de las protenas plasmticas: puede ser una disminucin relativa cuando hay un exceso de agua, o pueden ser disminuciones absolutas, que se producen en proteinurias importantes, enteropatas, prdidas de protenas por la piel en quemaduras graves, etc. Adems, hay una disminucin de protenas plasmticas por falta de sntesis de protenas y esto ocurre en un dficit grave diettico y en enfermedades hepticas graves. Cuando los niveles de protenas plasmticas son inferiores a 4 g/ 100 mL aparecen los edemas.

El Mtodo de referencia para la determinacin de protenas totales es el mtodo de Biuret (mtodo espectrofotomtrico muy especfico que permite la automatizacin) 6. ALBMINA Constituye ms de la mitad del total de las protenas plasmticas, por eso los cambios en la concentracin de Albmina son muy significativos. Se determina por espectrofotometra utilizando gran variedad de colorantes. Los valores normales de Albmina son aproximadamente 3,5 5,2 g /dL 100mL 7. PROTENAS URINARIAS TOTALES: los mtodos de determinacin son: Procedimientos turbidimtricos: son los ms utilizados Mtodos qumicos (Ej. Biuret): es muy poco utilizado porque es poco sensible. Actualmente se usa una tcnica modificada del Biuret que concentra previamente las protenas por precipitacin y posterior centrifugacin. Mtodos de fijacin de colorantes La concentracin de protenas urinarias normal es de aprox. 100 200 mL /dL

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8. PROTENAS TOTALES EN LQUIDO CEFALORRAQUDEO Los valores normales son de entre 15 45 mg /dL (muy baja) La mayor parte de las protenas son de bajo peso molecular, principalmente la Albmina que constituye del 55 al 75% de todas las protenas del LCR. La determinacin de protenas en LCR se utiliza sobre todo para conocer el estado de la barrera hematoenceflica, ya que estados patolgicos suelen aumentar su permeabilidad. Los mtodos para su determinacin son: mtodos turbidimtricos (+ usados) y dems mtodos utilizados en el anlisis normal de la orina. 9. FRACCIONES PROTEICAS Albmina: constituye el 55% de las protenas plasmticas. Su principal funcin es la de mantener la presin osmtica del plasma. Adems se encarga de la fijacin y el transporte de sustancias (Ej. Bilirrubina, cidos grasos, etc). - globulinas: constituyen aproximadamente el 14% de las protenas plasmticas. Tienden a aumentar cuando hay un dao en los tejidos. 2 tipos: 1 globulinas: constituyen entre el 1-4%. Estn constituidas por 1 antitripsina, transcobalamina y 1 lipoprotenas. 2 globulinas: constituyen entre el 6-10%. Son la haptoglobina (fijadora de la hemoglobina), la celuloplasmina (trasportadora de Cu), la 2 macroglobulina (inhibidora de proteasas) y las 2 lipoprotenas. - globulinas: constituyen aproximadamente el 13% de las protenas totales. Las alteraciones son poco frecuentes. Forman parte de ellas la Transferrina, la Hemopexina, el Complemento y las - lipoprotenas. - globulinas: constituyen el 11%. Son inmunoglobulinas, es decir, anticuerpos, por lo que aumentan en conjunto en procesos inflamatorios crnicos y en algunas enfermedades autoinmunes. En ocasiones aumenta solo un tipo de inmunoglobulina y esto recibe el nombre de Paraproteinemia. Pueden disminuir en el sndrome nefrtico, en enfermedades carenciales, en deficiencias inmunitarias, en inmunodeficiencas, en la edad avanzada,...

INTERPRETACIN DE UN PROTEINOGRAMA
El resultado del proteinograma no es suficiente para obtener un diagnstico definitivo. Excepto la Albmina, las dems fracciones proteicas corresponden a grupos de protenas, pudiendo haber variacin porcentual de sus componentes, por tanto, para corroborar los resultados del proteinograma hay que hacer anlisis inmunolgicos ms especficos como la inmunoelectroforesis y la inmunodifusin radial.

78

Los principales patrones electroforticos patolgicos son: Patrn Normal

Cirrosis Heptica: hay un notable aumento de las - globulinas con solapamiento - . Adems disminuye la Albmina y la 2 globulina.

Sndrome Nefrtico: se produce una prdida selectiva de protenas. Hay una disminucin de la Albmina y de las - globulinas y un aumento de las - globulinas, sobre todo de la 2.

Gammapata Monoclonal (Ej. Mieloma mltiple): Es la presencia de una inmunoglobulina en cantidades elevadas debido a la proliferacin de un clon celular que produce dicha inmunoglobulina. Presenta generalmente un pico grande en las globulinas.

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UT. 13 ENZIMOLOGA DIAGNSTICA

1. FISIOPATOLOGA
DEFINICIN: la enzimologa es la aplicacin del conocimiento de las enzimas en el diagnstico, pronstico y tratamiento de la enfermedad. Las enzimas son las responsables de la mayor parte de las reacciones qumicas que tienen lugar en el organismo, encontrndose presentes en todos los tejidos. ESTRUCTURA DE LAS ENZIMAS: son macromolculas de origen proteico y peso molecular alto. tienen estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. la estructura espacial de los enzimas presenta unas regiones denominadas sitios activos que son los lugares donde se unen las molculas de sustrato para que la enzima pueda realizar su funcin de catalizador. La actividad cataltica de la enzima depende de las estructuras primaria, secundaria..., por lo tanto es muy sensible a los cambios de temperatura, pH y concentracin de sales del medio. FUNCIN: Son Catalizadores Biolgicos. Tienen como misin aumentar la velocidad de las reacciones qumicas sin ser destruidas en el proceso. El material con el que reacciona la enzima se llama sustrato que, despus de reaccionar con ella, se transforma en producto: E + S ES P + E Las propiedades de las enzimas son: Son eficaces en pequeas cantidades No se alteran en la reaccin Son muy especficos Solo afectan a la velocidad con la que se alcanza el equilibrio de la reaccin. -

Los enzimas pueden actuar en solitario o a travs de un complejo llamado Holoenzima que est formado por el enzima propiamente dicho (Apoenzima) y por un cofactor. Los cofactores pueden ser metales (Zinc, Cloro, Magnesio, etc) en cuyo caso se llaman activadores enzimticos, o pueden ser molculas orgnicas, llamndose entonces coenzimas. ISOENZIMAS: son enzimas diferentes pero que catalizan la misma reaccin qumica. SIGNIFICADO DE LAS ENZIMAS PLASMTICAS: en el suero de individuos sanos se detectan actividades enzimticas fisiolgicas que tienen distintos orgenes: Enzimas plasmaespecficas: que desarrollan su propia funcin en el plasma (Ej. Enzimas de la coagulacin como la protrombina; enzimas que intervienen en el aclaramiento de las lipoprotenas como la LCAT,...) Actividades enzimticas fisiolgicas que mantienen niveles constantes y bajos. Tienen su origen en la constante renovacin celular de los tejidos, en la actividad muscular y en el paso de enzimas de rganos secretores al torrente circulatorio. Cuando existe alguna lesin en la membrana celular, el contenido citoplasmtico de la clula y con l los enzimas intracelulares, son vertidos al exterior. Cuando 80

los enzimas llegan al torrente circulatorio existen sistemas encargados de captarlos, metabolizarlos y eliminarlos, por lo tanto, las enzimas permanecen en sangre un tiempo determinado. TERMINOLOGA. CLASIFICACIN: se siguen las directrices de la comisin internacional de enzimas de bioqumica, segn la cual todas las enzimas se denominan con las iniciales EC y cuatro nmeros separados por puntos. El primer nmero define la clase El segundo nmero indica la subclase El tercer nmero indica la sub-subclase El cuarto nmero es su nmero de serie especfico. (Ej. EC 1.1.1.27 es la Lactato Deshidrogenasa. El primer 1 nos dice que pertenece a la clase de las oxidorreductasas; el siguiente 1 nos dice que es de la subclase oxidasa; el tercer 1 que la sub-subclase es la de las citocromooxidasas y, por ltimo, el 27 nos dice que ocupa el lugar 27 de las citocromooxidasas) Existen 6 clases posibles de enzimas: CLASE I: Oxidorreductasas CLASE II: Transferasas CLASE III: Hidrolasas CLASE IV: Liasas CLASE V: Isomerasas CLASE IV: Ligasas ESTUDIO DE LAS ENZIMAS MS FRECUENTEMENTE DETERMINADAS EN EL LABORATORIO Fosfatasas: pertenecen a la Clase III y subclase Esterasas. Se incluyen principalmente:

a)

Fosfatasa Alcalina (EC 3.1.3.1): es una enzima intracelular que se encuentra prcticamente en todos los tejidos (si hay lesin del tejido aumenta en el plasma). Es un marcador muy sensible de la enfermedad obstructiva heptica, pero no es especfica porque tambin aumenta en enfermedades seas y en situaciones fisiolgicas como el embarazo y en el crecimiento. Tiene un pH ptimo de 9.

b)

Fosfatasa cida (EC 3.1.3.2): est en numerosos tejidos, pero el ms rico en fosfatasa cida es la prstata. Tiene varias isoenzimas pero slo son tiles la isoenzima 2 o prosttica que se determina por electroforesis, y las isoenzimas 1 y 5 del bazo humano en la enfermedad de Gaucher. La isoenzima que ms frecuentemente se estudia en el laboratorio es la 2, que se utiliza como marcador tumoral en los calcinomas metaestticos de prstata. En condiciones no patolgicas la tasa de fosfatasa cida prosttica es igual en hombres y en mujeres. Cretina Quinasa CK (EC 2.7.3.2): es una transferasa que cataliza la formacin de ATP requerido por los sistemas contrctiles o de transporte. Es una enzima citoplasmtica y mitocondrial ampliamente distribuida por los tejidos, pero en forma decreciente, sobre todo se localiza en msculo esqueltico, msculo cardaco, placenta, cerebro y otros tejidos. Est formada por dos subunidades, la M y la B. Estas a su vez se combinan formando tres isoenzimas que son: CK-MM; CK-BB; CK-MB. Se pueden identificar por distintos 81

mtodos , fundamentalmente por electroforesis, cromatografa de intercambio inico, inhibicin, aglutinacin y RIA. La CK-MM predomina en el msculo esqueltico, en el miocardio tambin predomina la CK-MM pero hay entre un 13-22% de CK-MB. En el cerebro hay un 100% de CK-BB. Aminotransferasas o Transaminasas AST (EC 2.6.1.1): Aspartato Aminotrasferasa (GOT glutmico oxalactica). Existen dos formas de AST, la mitocondrial que es la ms abundante y la citoplasmtica que se encuentra en menor cantidad y es soluble. La AST se localiza en el corazn, en el hgado, msculo esqueltico y rin. Su aumento en el suero indica dao tisular pero no de rgano especfico. ALT (EC 2.6.1.2): Alanina Aminotransferasa (GPT Transaminasa Glutmico Pirvica). Se distribuye principalmente en el hgado y, en menor proporcin en miocardio y otros tejidos. No es especfica de enfermedad heptica. GGT (EC 2.3.2.2): Gamma Glutamil Transferasa. Se distribuye por rin, pncreas, hgado y prstata. Se utiliza en el estudio de enfermedades de origen alcohlico debido a que es una enzima microsmica y el alcohol es capaz de provocar un aumento de este enzima. Lactato Deshidrogenasa LDH (EC 1.1.1.27): est ampliamente distribuida por todos los tejidos pero es ms abundantes en corazn, msculo esqueltico, rin e hgado. Est constituida por cuatro subunidades, que pueden ser de dos tipos: subunidad H, especfica del corazn y subunidad M del msculo. Estas subunidades se combinan de 5 formas diferentes dando lugar a 5 isoenzimas: LDH 1(4H), LDH 2 (3H/1M), LDH 3 (2H/2M), LDH 4 (3h/1H) y LDH 5 (4M). La LDH existente en el miocardio contiene ms isoenzimas LDH 1 y LDH 2, y en el hgado y msculo esqueltico mayor proporcin de LDH 4 y LDH 5. - Amilasa (EC 3.2.1.1): transforma los hidratos de carbono en componentes ms sencillos. En condiciones normales se produce en las glndulas salivares y en el pncreas exocrino. Tiene un bajo peso molecular por lo que se filtra fcilmente por los glomrulos renales, aumentando en orina cuando est aumentada en suero. Tiene dos isoenzimas: Amilasa P: producida en el pncreas Amilasa S: producida en las glndulas salivares

Las isoenzimas se pueden separar por electroforesis y se usa sobre todo para el estudio de pancreatitis.

2. TCNICAS DE ANLISIS
Las determinaciones enzimticas se basan en demostrar in vitro la actividad cataltica que un enzima tiene in vivo, por lo tanto, la cantidad de enzima que tenemos en el sistema en estudio no es lo que se mide sino que se mide su funcionalidad. La actividad de un enzima se mide mediante determinacin de la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo en condiciones precisas de temperatura, pH, etc. Las unidades en las que se miden las enzimas son Katal / L. 1Katal = 1 mol de sustrato catalizado por segundo. Estas unidades an no se utilizan en todos los laboratorios siendo expresada la actividad enzimtica en UI/ L. Las UI/ L se definen como la cantidad de 82

enzima que cataliza la conversin de 1mol de sustrato o coenzima por minuto en las condiciones de la prueba. 1UI = 16,7 nK (nanokatales).

3. ASPECTOS PRCTICOS
3.1 CONDICIONES DE LA MUESTRA No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces porque se puede desnaturalizar irreversiblemente la protena constituyente de la enzima. No poner los sueros en tubos lavados con detergentes porque pueden alterar la estructura de las protenas. Separar lo antes posible el cogulo del suero porque hay ciertas enzimas como la LDH y la Fosfatasa cida que se encuentran en los trombocitos y se liberan al medio si hay destruccin de las mismas. No trabajar con muestras hemolizadas porque en estas aumentan los componentes intraeritrocitarios como el LDH y AST. Evitar el stasis venoso prolongado durante la extraccin porque esta produce hipoxia y aumento de permeabilidad en las clulas sanguneas. Evitar en envejecimiento de las muestras, sobre todo para la CK y para la Fosfatasa cida, que son muy lbiles. Revisar siempre la fecha de caducidad de los reactivos, sobre todo la solucin de sustrato. Cuando se recibe un pedido de reactivos hay que comprobar que se reciben en las condiciones adecuadas. Revisar las condiciones de almacenamiento de los reactivos, sobre todo la temperatura de las neveras. Cuando se reconstituye el reactivo, anotar la fecha y seguir las instrucciones del fabricante respecto al almacenamiento y fecha de caducidad. El aparato para medir la actividad enzimtica, bien sea manual o automtico debe cumplir 2 requisitos: debe ser un espectrofotmetro fiable que mida de forma correcta a la longitud de onda del ensayo. Adems tiene que tener un buen sistema de regulacin de temperatura, de tal forma que permita mantener la temperatura de trabajo en un margen de 0,1 C. Si trabajamos de forma manual debemos trabajar con pipetas adecuadas, bien calibradas y de pequeo volumen.

3.2 CONDICIONES DE LOS REACTIVOS Y DEL INSTRUMENTAL

4. VALORACIN DE LOS RESULTADOS

INFARTO DE MIOCARDIO 83

Es una muerte de parte de las clulas del msculo cardaco que se produce secundaria a una isquemia (falta de riego sanguneo). Se determinan: CK y su coenzima CK-MB: se elevan de forma precoz, concretamente a las 6 horas del infarto. El pico de CK se da a las 36 horas y se normaliza al tercer da. AST (GOT): se eleva ms tarde y se mantiene elevada durante ms tiempo. El pico mximo ocurre alrededor de las 48 horas y se normaliza hacia el 5 da. LDH: se eleva despus que las anteriores, siendo su elevacin ms sostenida. Presenta el pico mximo alrededor del 3 da y se mantiene elevada ms all del 6 da. En las primeras horas del infarto es muy interesante ver los niveles de CK totales y, sobre todo, el aumento del isoenzima CK-MB. Se recomienda realizar un control enzimtico cada 6 horas. Una vez establecido el diagnstico se realizan anlisis cada 12-24 horas para poder observar los picos de la AST y de la LDH, y ver la normalizacin de las mismas que es un signo de buen pronstico. PANCREATITIS AGUDA Es la autolisis del parnquima del pncreas exocrino. Esto determina la liberacin a la circulacin de 2 enzimas: la Lipasa Pancretica y la -Amilasa. Las dos se filtran por el glomrulo renal pero la Lipasa se reabsorbe en el tbulo y la -Amilasa s aparece en orina. Para diagnosticar la pancreatitis aguda se determinan Lipasa y -Amilasa en sangre y -Amilasa en orina. Estas enzimas aparecen elevadas en el plasma a las 6-8 horas y alcanzan su mxima concentracin entre las 20-30 horas, normalizndose entre el 2-8 da. En la orina, la -Amilasa aparece elevada a las 5-8 horas despus de hacerlo en el plasma y se normaliza varios das despus de normalizarse en el plasma. HGADO Y ENZIMAS SRICAS Hepatitis vricas agudas: estn aumentadas la ALT (GPT), AST (GOT) y GGT. La que aumenta en mayor cantidad es la ALT. No existe apenas relacin entre la gravedad del dao heptico y la elevacin de las encimas. Las transaminasas se normalizan en un plazo de 3-5 semanas. Si la hepatitis cronifica no se normalizan. Si la hepatitis es fulminante las transaminasas descienden de forma brusca debido a la necrosis masiva del hgado que hace que no quede tejido heptico para liberar enzimas. Colestasis: es una obstruccin a nivel biliar que determina un estancamiento o stasis de la bilis en el interior del hgado. Se elevan sobre todo la GGT y la Fosfatasa Alcalina. Etilismo crnico: se determina GGT en plasma. Cirrosis heptica: hay una elevacin moderada de las transaminasas, siendo mayor el aumento de la AST que de la ALT. Si la cirrosis es de origen etlico estar tambin aumentada la GGT y si es de origen biliar estarn aumentadas las Fosfatasas Alcalinas.

NEOPLASIAS 84

Cncer de Prstata: aumenta la Fosfatasa cida total pero no es un marcador precoz de la enfermedad porque aumenta cuando ya hay metstasis Metstasis hepticas: aumenta la Fosfatasa Alcalina y la GGT Metstasis seas: si las metstasis son condensaciones aumenta la Fosfatasa Alcalina. Si son de tipo ltico aumentan las Fosfatasas cidas totales.

UT. 14 ESTUDIO DE LA FUNCIN ENDOCRINA

1. FISIOLOGA
1.1 CONCEPTO: El sistema endocrino es un conjunto de rganos glandulares que no utilizan conductos para liberar sus secreciones sino que las vierten directamente a la sangre, que las conduce a otros lugares del organismo para ejercer su accin. Las clulas donde ejercen esta accin se llaman clulas diana y en ellas se sitan los receptores donde acta la hormona para transmitir su mensaje. 1.2 RGANOS Y TEJIDOS SECRETORES DE HORMONAS: A. Eje Hipotlamo-Hipofisario: el hipotlamo y la hipfisis constituyen un sistema porque estn unidos por nervios y vasos sanguneos. La HIPFISIS se divide en dos lbulos: 1. Lbulo anterior o adenohipfisis: en el se producen las siguientes hormonas: MSH: Hormona Melanocito Estimulante. Promueve la pigmentacin. ACTH: Hormona Corticotropa. Tiene como funcin la de estimular la secrecin de glucocorticoides (Cortisol) actuando sobre la corteza suprarrenal. El aumento de cortisol determina un Feed-Back negativo sobre el hipotlamo, disminuyendo la secrecin de CRH y, por lo tanto, disminuyendo la secrecin de ACTH.

TSH: Hormona Tirotropa. Aumenta la produccin de hormonas tiroideas T3 y T4 actuando sobre la glndula tiroidea. El aumento de la T3 y T4 ejerce un Feed-Back negativo sobre el hipotlamo disminuyendo la produccin de TRH y, por tanto, de TSH.

FSH: Hormona Folculo estimulante. En hombres acta sobre los tubos seminferos estimulando la produccin de espermatozoides. En las mujeres madura el folculo, estimula la produccin de estrgenos y estimula la proliferacin del endometrio. LH: Hormona Leutinizante. Junto con la anterior forma parte de las Hormonas gonadotropas. En los hombres acta sobre las clulas de 85

Leydig estimulando la produccin de testosterona. En mujeres determinan la ovulacin en la mitad del ciclo, estimula en la segunda mitad del ciclo el mantenimiento del cuerpo lteo y adems estimula la produccin de estrgenos y progesterona. GH: Hormona del crecimiento. PROLACTINA: Hormona estimuladora de la secrecin lctica. Regulacin de las hormonas adenohipofisarias: la secrecin de estas hormonas es controlada por los factores liberadores e inhibidores producidos en el hipotlamo: SNC CRH ACTH TRH TSH GnRH FSH y LH GRH GH GIF PIF PROLACTINA MIF MSH

2. Lbulo posterior o neurohipfisis: las hormonas son secretadas en el Hipotlamo y se transportan posteriormente por las fibras nerviosas a la neurohipfisis. Son dos las hormonas neurohipofisarias: ADH o VASOPRESINA (Hormona Antidiurtica): promueve la reabsorcin de agua en los tbulos distal y colector del rin. OXITOCINA: su accin es la contraccin del tero. B. Tiroides: la glndula tiroidea est situada en la cara interior del cuello y est integrada por dos lbulos laterales unidos por un istmo. Se comprende de folculos que es la unidad funcional del tiroides. Cada folculo est formado por una sola capa de clulas que rodea a una cavidad llena de una solucin de protena llamada tiroglobulina, TG. El folculo capta el yodo inorgnico y los transforma en yodo molecular, unindose ste al aminocido tirosina (Tyr) de la tiroglobulina, formndose as la Diyodotironina, DIT. La unin de dos molculas de DIT da lugar a la T4 o Tiroxina La unin de una molcula de DIT con una molcula de MIT (monoyodotironina) da lugar a la T3 o Triyodotironina. La glndula tiroides sintetiza sobre todo T4 y una pequea cantidad de T3. Para que las hormonas salgan del tiroides deben ser transportadas por una protena producida en el hgado llamada TBG. En la clula, la T4 se transforma en T3 que es la forma activa. Funciones de las hormonas tiroideas: Estimulan el crecimiento y la diferenciacin Aumenta el metabolismo basal Estimular el trofismo de la piel 86

Estimular las funciones de los aparatos y sistemas del organismo Si disminuye la T3 y T4 por disminucin de su produccin en el tiroides, la TRH y la TSH estarn altas (Hipotiroidismo primario) Si disminuye la T3 y T4 por alteracin hipofisaria, la TSH estar baja y la TRH alta (Hipotiroidismo secundario). Si aumenta la T3 y T4 por patologa tiroidea, la TRH y la TSH estarn inhibidas (Hipertiroidismo)

Regulacin de la secrecin de las hormonas tiroideas:

C. GH: Su secrecin es pulstil, es decir, que se libera en porciones a lo largo del da con un mximo aporte en la primera fase del sueo. Ejerce su accin fisiolgica mediante unos factores de crecimiento llamados Somatomedinas siendo el ms importante la Somatomedina C. Se producen en todos los tejidos, pero sobre todo en el hgado. Regulacin: el hipotlamo segrega el factor liberador de la GH (GR.) que acta sobre el lbulo anterior de la hipfisis para que se sintetice y libere GH. Las somatomedinas ejercen un Feed-Back negativo sobre la hipfisis y el hipotlamo

Acciones: Accin Directa: es una accin antiinsulina. Provoca un aumento de la Glucemia y un aumento de la Lipemia. Accin Indirecta: la ejerce a travs de las somatomedinas y estimula el crecimiento esqueltico, la sntesis de protenas y la diferenciacin celular.

Factores reguladores del crecimiento Genticos Hormonales: GH, T3 y T4; hormonas sexuales; insulina; glucocorticoides Nutricionales Factores emocionales D. Pncreas: los islotes de Langerhans tienen 3 tipos de clulas. Las que producen el glucagn, las que producen la insulina, y las que producen la somatostatina. E. Glndulas Suprarrenales Son dos glndulas situadas en los polos superiores de ambos riones. Se dividen en dos zonas, que son la Corteza y la Mdula Suprarrenal: CORTEZA: secreta hormonas esteroideas y se divide a su vez en tres zonas:

87

Zona Glomerular: se producen los mineracorticoides de los cuales el ms importante es la Aldosterona. Esta aumenta la volemia y la retencin de Na. Favorece la eliminacin de potasio. Zona Fasciculada: produce los glucocorticoides de los cuales el ms importante es el Cortisol. La secrecin de cortisol est regulada por la ACTH y ambas hormonas tienen unos niveles variables a lo largo del da, tienen un ritmo circadiano. Alcanza el nivel mximo por la maana hacia las 8 horas y la de ACTH cuatro horas antes. El mnimo lo alcanzan a las 00 horas. Funciones del Cortisol: regula los niveles de glucosa en perodo de ayuno mediante un proceso de neoglucognesis a partir de las protenas; interviene en la distribucin de la grasa; disminuye los eosinfilos y linfocitos; tiene efecto antiinflamatorio, etc.

Zona Reticular: produce andrgenos (tanto en hombres como en mujeres)

MDULA SUPRARRENAL: segrega las catecolaminas que son la Adrenalina (A) y la Noradrenalina (NA). Se sintetizan segn la siguiente cadena:
TIROSINA DOPA DOPAMINA NA A

La degradacin de catecolaminas da lugar al cido vanilmandlico que se elimina por la orina. La Noradrenalina interviene en la contraccin de las arterias, mientras que la Adrenalina aumenta la frecuencia cardiaca, aumenta el volumen del latido y dilata los bronquios. F. Hormonas Sexuales Andrgenos: son esteroides que se pueden sintetizar en las glndulas suprarrenales, en los ovarios y, sobre todo, en los testculos. El principal andrgeno es la Testosterona, que no circula libre en la sangre sino unida a una protena que es la SBG (Sex Binding Globuline). El hgado destruye estas hormonas, cuya principal funcin es regular los caracteres sexuales masculinos y la formacin de espermatozoides. Hormonas Sexuales Femeninas. Ciclo ovrico: 1 Fase: el primer da del ciclo es el primer da de la menstruacin. La FSH y la LH estimulan la maduracin del folculo y ste empieza a producir ESTRGENOS. Hacia el dcimo da el nivel de estrgenos es alto y se produce la liberacin de FSH y, sobre todo de LH que determinarn hacia el da 14 el pico de ovulacin, que es un aumento de la concentracin de LH que determina la mxima maduracin del folculo que hace que se rompa y se libere el vulo. 2 Fase: Disminuye la FSH y la LH. Comienza a sintetizarse la PROGESTERONA en grandes cantidades en el cuerpo lteo o cuerpo amarillo. Si no hay embrazo, hacia el da 28 disminuyen los estrgenos y la progesterona, producindose la descamacin del endometrio.

88

Si hay embarazo, el cuerpo lteo se mantiene, mantenindose altos los niveles de progesterona, inhibindose la sntesis de LH y de FSH.

G. Endicronologa de la gestacin Gonadotropina corinica o corigena HCG: est producida por el Sincitiotrofoblasto, una membrana externa del embrin. Esta hormona nos permite hacer el diagnstico del embarazo. Es necesaria para el mantenimiento del embarazo, sobre todo en el primer trimestre. Alcanza su mximo nivel hacia el tercer mes de gestacin, descendiendo luego lentamente hasta el quinto mes a partir del cual se mantiene en forma de meseta hasta el final del embarazo.

Lactgeno placentario: se sintetiza en la placenta y tiene como funcin preparar la mama para su funcin despus del parto.

2. PATOLOGA DEL SISTEMA ENDOCRINO

A. HIPFISIS ANTERIOR Hiperfuncin Autctona: se produce por una lesin a nivel de la glndula hipofisiaria. Puede ser: Por un aumento de la FSH y LH: Hipergonadismo Por un aumento de la ACTH: Sndrome de Cushing Por un aumento de la TSH: Hipertoriodismo (rara) Por un aumento de la GH: en los nios, antes del cierre epifisario (epfisis: cartlago del crecimiento) se produce el gigantismo hipofisiario en el que hay un aumento de la talla armnico (equilibrado). Adems se produce hiperglucemia secundaria al efecto de la GH. En el adulto, se da una patologa llamada acromegalia, que es un crecimiento excesivo de piel, huesos y vsceras. 89

 Por un exceso de Prolactina: se produce galactorrea (salida de leche) y amenorrea (no menstruacin). Reguladora: se producen aumentos de las hormonas hipofisiarias, que son secundarios a la disminucin de las hormonas de las glndulas hipofiso-dependientes (Ej. Disminucin de Cortisol Aumento de ACTH) Hipofuncin Autctona: podemos tener: Descenso de la GH: Enanismo hipofisiario. Es una disminucin de la talla de forma armnica. Tiene tendencia a la hipoglucemia. Descenso de la FSH y LH: Hipogonadismo que tiene su origen en la hipfisis Descenso Panhipopituitarismo: disminucin global de todas las hormonas hipofisiarias. Tambin se llama Sndrome de Simmons-Sheeham. Reguladora: se producen aumentos de la ACTH y del Cortisol.

B. HIPFISIS POSTERIOR Diabetes inspida que se produce por una disminucin de la ADH Sndrome de Schwantz-Bartter que se produce por un aumento de la secrecin de la ADH. Se suele producir por un tumor pulmonar que secreta un polipptido semejante a la ADH. Tambin se puede producir por tumores hipofisiarios secretores de ADH y su principal consecuencia clnica es la hiperhidratacin. Bociognesis: bocio simple, que es un aumento del tamao de la glndula tiroides y es secundario a la elevacin de TSH por la disminucin de T3 y T4. Hipertiroidismo: es el aumento de las hormonas tiroideas, T3 y T4, que puede ser primario o secundario: aumentadas. aumentadas. Hipotiroidismo: Primario: las hormonas tiroideas estn disminuidas y la TSH aumentada (aumento de la glndula) Secundario: la T3 y T4 estn disminuidas. La TSH tambin est disminuida. Primario: la TSH estar disminuida y la T3 y T4 Secundario: la TSH estar aumentada y la T3 y T4

C. TIROIDES

Cretinismo: faltan T3 y T4 durante la vida fetal

D. GLNDULAS SUPRARRENALES

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Hipofuncin Corticosuprarrenal: hay una disminucin de la funcin de la corteza suprarrenal. Puede ser: Primaria: se produce una afectacin de la corteza suprarrenal, por lo tanto, estara disminuido es Cortisol y la Aldosterona, y aumentada la ACTH. Tambin se producir un aumente de la pigmentacin de la piel (hiperpigmentacin). Si la hipofuncin es crnica se llama Enfermedad de Adisson. Secundaria: el problema est en la hipfisis. Habr una disminucin de la ACTH, se mantendrn los niveles de Aldosterona y disminuir el Cortisol. No hay hiperpigmentacin, la pigmentacin es normal. Si la aldosterona est normal es que no hay hormona para estimular la secrecin en la hipfisis.

Hiperfuncin Corticosuprarrenal: hay un aumento de la funcin de la corteza suprarrenal. Sndrome de Cushing: hay un aumento de Cortisol. Puede ser primario o secundario: Primario: la patologa est en la glndula suprarrenal. Casi siempre se debe a tumores funcionales en la corteza suprarrenal. Disminuye la ACTH.

Secundario: puede ser debido a dos motivos:

1. Alteraciones de la hipfisis. Aumento de ACTH. 2. Tumores pulmonares que producen un polipptido semejante a la ACTH. Sndrome Adrenogenital: es el aumento de los andrgenos. Puede ser: 1. De forma congnita. Cuando falta algn enzima necesario para la sntesis de corticoides esto hace que aumente la ACTH que lleva a una hiperplasia de la corteza suprarrenal y a un aumento secundario de los andrgenos 2. De forma adquirida: se produce por un tumor funcionante de la zona reticulada de la corteza. Hiperaldosteronismo: es un aumento de las aldosteronas. Puede ser: 1. Primario: debido a un tumor en la zona glomerular. 2. Secundario: debido a estmulos externos (Ej. Disminucin de bolemias que estimula la secrecin de aldosterona para segregar agua) . Hiperfuncin de la Mdula Suprarrenal: se produce por un tumor de la mdula suprarrenal llamado feocromocitoma que produce un aumento de las catecolaminas. 91

E. PATOLOGA DE LAS GNADAS Hipogonadismo: primario y secundario (igual que en casos anteriores) Hipergonadismo: primario y secundario.

3. MTODOS PARA EL ESTUDIO DE LAS HORMONAS

Radioinmunoanlisis (RIA) Enzimoinmunoanlisis Fluoroenzimoinmunoanlisis Quimioluminiscencia

ESTUDIO DE LA GH Se realizan fundamentalmente dos test farmacolgicos de estimulacin: 1. Test de Clonidina: se administra clonidina, que es un antagonista 2-adrenrgico que estimula la secrecin de GH a travs de la secrecin de GHRH. El procedimiento es el siguiente: Toma de muestra basal y administracin del frmaco Extracciones a los 30-60-90-120 y 150 minutos de la administracin del frmaco. Cuantificacin de la GH e interpretacin: Se considera deficiencia total de GH si ninguno de los picos es superior a 5 ng/ mL Se considera deficiencia parcial si se obtienen valores entre 5-10 ng/ mL. El test de la Clonidina tiene como efectos secundarios la hipotensin y la somnolencia. Se debe monitorizar la frecuencia cardiaca y la presin arterial. 2. Test de ejercicio. Propanolol: se administra propanolol, que es un -bloqueante que inhibe a la somastotatina y se le manda hacer ejercicio fsico. Procedimiento: horas Toma de muestra basal Se le da el frmaco y se le tumba en decbito supino 2

A los 120 minutos se hace otra extraccin y se le manda realizar ejercicio fsico intenso durante 20-30 minutos. Debe estar cansado pero no extenuado. Extraccin tras el ejercicio (150 minutos). Administrar soluciones azucaradas al finalizar. Los resultados se interpretan igual que en el otro test. Est contraindicado en pacientes con asma. Los efectos secundarios de esta prueba son hipotensin, bradicardia e hipoglucemia. ESTUDIO DE LA NEUROHIPFISIS Se hacen determinaciones basales hidrosalinas, como son la osmolaridad en sangre y orina, iones en sangre y orina, creatinina en sangre y orina y equilibrio cido-base. 92

Se hacen determinaciones basales hormonales Test de estimulacin de la ADH ESTUDIO DE LA FUNCIN TIROIDEA Determinaciones basales: Test dinmicos o funcionales: TRH se administra por va intravenosa una dosis adecuada de TRH sinttico. Se hace una toma basal y extracciones a los 20-60 y 90 minutos de la toma y se cuantifica la TSH. Interpretacin: se alcanza un valor mximo a los 20 minutos, debiendo producirse incrementos de 2 a 30 mUI /mL. ESTUDIO DE LA FUNCIN GLUCOCORTICOIDE Y MINERACORTICOIDE Ritmo de cortisol ACTH: sirve para estudiar la funcin glucocorticoide as como la mineracorticoide. No requiere estmulo. Se extraen muestras a las 8 de la maana y a las 20h de la tarde del mismo da y se determina Cortisol y ACTH. Interpretacin: se alcanza el mximo de cortisol a las 8 de la maana y un mnimo por la noche. Test de frenacin corta (NUGGENT): se les da dextrametasona y se hacen extracciones a las 8 de la maana del da que se toma la dosis y otra extraccin a las 8 de la maana del da siguiente. Se analiza el Cortisol y la ACTH. Interpretacin: el nivel de ACTH debe ser inferior a 10 pg/ mL en el da siguiente a la toma. Test de frenacin larga/ dbil y larga / fuerte Determinacin de hormonas libres T3, T4, TSH, etc Determinacin de protenas fijadoras como la TBG Determinacin de Ac anti-tiroideos

UT. 15 EQUILIBRIO HIDROELECTROLTICO Y CIDO-BASE

1. EQUILIBRIO HIDROELECTROLTICO
1.1 INTRODUCIN El agua es el componente ms abundante del cuerpo humano. Comprende el 60-70% del peso corporal total, pero vara dependiendo del sexo, edad, grasa corporal, etc. 1.2 DISTRIBUCIN DEL AGUA El agua total se distribuye en dos compartimentos: Compartimento Intracelular: es el compartimento ms grande. Supone aproximadamente el 40% del peso corporal total. Tiene neutralidad elctrica, es decir, tiene disueltas sustancias con carga negativa en igual cantidad que sustancias con carga positiva. 93

Compartimiento Extracelular: constituye aproximadamente el 20% del peso corporal total. Est formado a su vez por 3 compartimentos, que son: Plasma: es la fraccin de la sangre libre de clulas. Supone el 5% del peso corporal total. Tiene un alto contenido en protenas y forma lo que se llama el espacio intravascular. Lquido Intersticial: est localizado entre la membrana de las clulas y las paredes de los vasos. Supone aproximadamente el 14-15% del peso corporal total y se encarga de transportar las sustancias entre las clulas y el plasma sanguneo. Es pobre en protenas. Lquido Trascelular: constituye el 1% del peso corporal total, pero en situaciones patolgicas puede aumentar mucho. Est formado por LCR, lquido sinovial, lquido peritoneal, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido seminal, lquido intraocular y secreciones digestivas. 1.3 INTERCAMBIO DE AGUA EXTRACELULAR El intercambio de lquidos entre el plasma y lquido intersticial se produce a travs de las paredes de los vasos capilares y tiene lugar de la siguiente forma: Presin Hidrosttica Capilar: es la presin que determina la salida de lquido de los capilares. Es mayor en el extremo arteriolar que en el venoso. Permeabilidad Capilar: el endotelio capilar acta como una membrana semipermeable. Presin Osmtica: es debida a las protenas plasmticas y favorece la retencin de lquido dentro del capilar. Drenaje Linftico: es esencial cuando hay trastornos del equilibrio hdrico.

1.4 EQUILIBRIO DE AGUA E IONES EN LOS DISTINTOS COMPARTIMENTOS CORPORALES Homeostasis: es el mantenimiento de la composicin del medio interno (sangre). Electrolitos: son los iones libres en los lquidos corporales. Son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis porque influye en tres aspectos fundamentalmente: pH, estado de hidratacin y osmolalidad. Caractersticas del equilibrio hidroelectroltico: los iones y el agua del organismo estn en constante intercambio con el exterior, pero se mantienen en equilibrio, lo que es fundamental para la vida. Existe igualdad entre el total de aniones y de cationes en los compartimentos corporales, de tal forma que, si aumenta un anin, aumentar tambin un catin, mantenindose la neutralidad elctrica. Los principales electrolitos disueltos en el organismo son: Na+, K+, Mg+, Ca++, Cl-, HCO3-, HPO4-, y se distribuyen de la siguiente forma: Intracelularmente: Mg+, HPO4-, K+ Extracelularmente: Na+, Ca++, HCO3-, Cl94

Osmolalidad: es el nmero de partculas de soluto por unidad de volumen de una disolucin expresada en miliosmoles de soluto por litro de solucin (mosm / L). La osmolalidad del suero sanguneo es de 290 10 mosm / L, pero puede variar con el grado de hidratacin y la cantidad de partculas disueltas. Los electrolitos HCO3-, K+ y Na+ constituyen ms del 92% de osmolalidad. El 8% restante la aportan otros electrolitos del lquido extracelular, protenas sricas, glucosa y urea. La importancia de la osmolalidad en los lquidos corporales es que regula la distribucin del agua en los distintos compartimentos. En general el agua difunde de una zona de menor osmolalidad a otra de mayor osmolalidad. La osmolalidad aumenta el punto de ebullicin y disminuye el punto de congelacin, en esto es en lo que se basa la medida de la misma. Para ello se utiliza un osmmetro que mide el descenso del punto de congelacin de una solucin. Inters clnico de la osmolalidad:

a)

Osmolalidad Plasmtica: los estados hiperosmolares se producen cuando la osmolalidad es superior a 325 mosm/ Kg de H2O. Cuando la cifra alcanza los 350 mosm/ L la situacin es de extrema gravedad y el paciente suele estar en coma hiperosmolar. Las patologas que cursan con hiperosmolaridad son: - Diabetes mellitus descompensada Insuficiencia renal Nutricin parenteral Deshidratacin hipertnica, etc.

b)

Osmolalidad Urinaria: es una medida ms exacta que la determinacin de la densidad para controlar la concentracin urinaria. Los valores normales de osmolalidad urinaria son 100-900 mosm/ L. Despus de una restriccin de lquidos de ms de 12 horas, la osmolalidad urinaria debe ascender como mnimo a 800 mosm/ L. Sin embargo, en la insuficiencia renal no se superan los 400 mosm/ L (Hipoosmolalidad). Las principales patologas que cursan con Hiperosmolalidad urinaria son: Todas aquellas que determinen una prdida de agua Lesiones cerebrales (afectacin de la LDH), etc.

Para evaluar la funcin renal y, por lo tanto, diferenciar las causas renales de la poliuria de las causas extrarrenales, se utiliza la siguiente frmula: OSMOLALIDAD URINARIA / OSMOLALIDAD PLASMTICA = 1 a 3 1.5 MANTENIMIENTO DEL EQUILIBRIO HIDROELECTROLTICO El agua representa el 60% del peso corporal total El suero tiene un 93% de agua Hay igualdad de aniones y cationes en los lquidos corporales: Na+ 142 meq /L K+ 4 ClHCO3103 meq /L 27 95

Ca2+ 5 Mg2+ 2 ____________ 154 meq /L

HPO422 2SO4 1 c. Orgnicos 5 Protenas 16 __________ 154 meq /L

Balance de lquidos: al tubo digestivo llegan aproximadamente 9 L de agua cuya procedencia es la siguiente: Ingesta 1,5 L Saliva 1,5 L Jugo gstrico 3 L Bilis 0,5 L Jugo pancretico 1-2 L Jugo intestinal: Indeterminado Estos lquidos se absorben en el intestino delgado y en el colon, eliminndose por las heces aproximadamente 100 cc. Necesidades de electrolitos en la dieta: los electrolitos deben ingerirse en pequeas cantidades. El calcio y el potasio se eliminan continuamente por lo que deben consumirse regularmente. El exceso de consumo normalmente es compensado por una mayor eliminacin urinaria. Absorcin de los electrolitos: los electrolitos se absorben mediante un mecanismo de transporte activo, con gasto energtico. Tambin se absorben por difusin pasiva y facilitada. Regulacin del equilibrio hidroelectroltico: el principal regulador es el rin. Existen sustancias excretadas o ingeridas que estn en equilibrio de tal forma que se excreta la misma cantidad que se ingiere. As, el rin, el labora la orina en la cantidad que se necesita y con una concentracin variable de tal forma que: Si el organismo necesita retener agua, entran en funcionamiento los mecanismos de reabsorcin renal y se produce un aumento de la osmolalidad renal. Si hay un exceso de agua, aumenta el flujo urinario, aumenta la cantidad de agua en orina y disminuye la osmolalidad urinaria. -

La absorcin y la secrecin de agua y electrolitos son procesos mediados por hormonas de la siguiente forma: Un aumento de la osmolalidad en suero estimula la secrecin de ADH. sta acta sobre los tbulos renales aumentando la reabsorcin de agua y provocando un aumento de la concentracin de la orina. Si disminuye la osmolalidad del suero, se inhibe la secrecin de ADH, lo que da lugar a una disminucin de la reabsorcin de agua y la orina se diluye. Adems del rin, el aparato respiratorio tambin interviene en la regulacin del equilibrio hidroelectroltico variando la velocidad de la respiracin.

96

1.6 EVALUACIN DEL EQUILIBRIO HIDROELECTROLTICO EN EL ORGANISMO El equilibrio hidroelectroltico se evala estudiando la capacidad del rin como regulador y esto se hace determinando el peso especfico de la orina, la osmolalidad y los electrolitos en orina. De esta forma valoramos el estado de hidratacin de una persona, la funcionalidad de la ADH y la gravedad de un estado de coma. 1.7 ESTUDIO DE LOS ELECTROLITOS ORGNICOS MS IMPORTANTES SODIO: es el principal catin del lquido extracelular. Su concentracin srica normal es de 136-145 mmol /L, y en orina es de 30-280 mmol / da. Su metabolismo se regula de la siguiente forma: Existen receptores en las aurculas y en las arterias centrales que reciben cambios de presin o de flujo sanguneo de tal forma que, cuando disminuye el volumen sanguneo porque lo hace la cantidad de sodio, se reduce el riego sanguneo renal y se activa el sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona. Al disminuir el riego renal, disminuye la filtracin glomerular y, por lo tanto, disminuye tambin el sodio filtrado. Esto determina un aumento de la reabsorcin tubular de sodio por accin de la aldosterona. Si se ingiere o retiene sodio en exceso, se produce una hipernatremia transitoria ya que la sed hace que aumente la ingesta de agua. El lquido ingerido estimulara la secrecin de ADH de tal modo que el resultado final va a ser una aumento de volumen extracelular y no una hipernatremia. Alteraciones en el metabolismo del sodio: Hiponatremias: no se deben a una falta de sodio en la dieta sino a prdidas de sodio que pueden ser extrarrenales (Ej. A travs del tubo digestivo en caso de peritonitis, o a travs de la piel por sudoracin excesiva) o pueden ser renales (Ej. Insuficiencia renal; mal uso de diurticos, etc). Si la prdida de sodio es extrarrenal su concentracin est por debajo de 10 mmol /L en orina. Si la prdida tiene su origen a nivel del rin, su concentracin est por encima de los 20 mmol / L en orina. Hipernatremia: se debe a un dficit del agua corporal. La principal causa de prdida de agua es la diabetes inspida pero no determina grandes hipernatremias ya que la sed compensa la prdida de agua. POTASIO: es el principal catin intracelular. La concentracin normal de potasio est entre 3,5 - 5 mmol /L. Funciones: frecuencia cardiaca Regula la presin osmtica. El K se filtra libremente en el rin 97 Regulacin del metabolismo del K+ Interviene en el mantenimiento del equilibrio cido-base Interviene en la conduccin nerviosa Interviene en la contraccin muscular Regula el gasto cardaco controlando el volumen y la

Se reabsorbe en el TCP

Se secreta en el TCD: del 80 al 90% del K de las clulas se excreta por el rin, el resto lo hacen por las heces y el sudor. No hay umbral renal para el potasio, de tal forma que en estados carenciales de K podemos seguir eliminando potasio. (tomates y pltanos) Se necesita una ingesta diaria y regular de potasio

Alteraciones del metabolismo del K+ Hipokaliemia: niveles de potasio < 3,5 meq / L Causas: a) Digestivas: por falta de ingesta, vmitos, diarreas, etc b) De origen renal: utilizacin de frmacos diurticos, enfermedades tubulares renales, exceso de mineralcorticoides suprarrenal, etc. Consecuencias: cuando K+ < 2,5 meq / L aparecen problemas cardiacos (arritmias, alteraciones en la contraccin cardiaca, etc) Hiperkaliemia: niveles de K+ > 5 meq / L Causas: a) Disminucin de la excrecin renal (insuficiencia renal, diurticos ahorradores de potasio, insuficiencia suprarrenal aguda que disminuye al aldosterona,...) b) Aumento del aporte: Destruccin celular (aplastamientos, quemaduras, hemlisis masiva, intervenciones quirrgicas...) Perfusin K+ Acidosis metablica: el potasio es extrado de las clulas c) Uso de frmacos: como la penicilina potsica. Consecuencias: cuando los niveles de K+ > 6,5 meq / L aparecen problemas cardiacos. Pseudohiperkaliemia: se produce cuando se hace una extraccin sangunea con torniquete durante un tiempo prolongado. Tambin cuando se hace una extraccin con apertura y cierre del puo repetidas veces. CLORO: Es el principal anin extracelular. [ Cl- ] = 98 106 mmol / L meq / L Alteraciones metablicas del ClHipocloremia: valores inferiores a 98 meq / L. Estos descensos se deben a una prdida excesiva de Cloro que puede ser debida a prdidas gastrointestinales en forma de HCl, enfermedades renales que cursan con prdida de Na, etc. Hipercloremia: se da en la acidosis metablica, por prdida excesiva de bicarbonato. Es importante la determinacin de Cloro para el diagnstico de algunas patologas, siendo de gran importancia en el Test de sudor, en el que se estimula la piel por calor y piloecarpina, se toma el sudor y se analiza el cloro o cloruro sdico. Esta prueba es 98

fundamental para el diagnstico de la Fibrosis Qustica (patologa de las glndulas exocrinas). CALCIO (Ca2+): los valores normales de Calcio Total = 8,5 10,5 mg / dL. De todo el calcio plasmtico, solo la fraccin inica puede ser utilizada por el organismo en procesos vitales, es decir, es la fraccin fisiolgicamente activa. Los valores normales de Calcio Inico = 4,48 4,92 mg / dL (2,4 meq / L). Localizacin: El 98% del calcio se localiza en el esqueleto El restante 2% se localiza en el plasma, del cual: Un 46% es calcio inico Un 40% es calcio unido a la Albmina Un 14% forma sales de calcio

Influencia del pH sobre el calcio: la acidosis favorece la disociacin de calcio, por lo tanto favorece la creacin de calcio inico. La alcalosis disminuye el calcio inico. Metabolismo del calcio inico: El calcio se absorbe en el intestino (eliminacin por va renal) Para la regulacin metablica intervienen 3 hormonas, que son: PTH (Paratohormona): provoca un aumento de los niveles de Calcio en sangre y esto lo consigue porque provoca un aumento de la reabsorcin renal sea del calcio y favorece la reabsorcin en el intestino. CALCITOINA: se produce en la glndula tiroides. Tiene el efecto contrario a la paratohormona, es decir, que disminuye los niveles de calcio en la sangre. CALCIPRIOL: es la vitamina D3 activa. En algunos alimentos hay precursores de la vitamina D3 que, con los rayos ultravioletas sobre la piel, sintetizan la vitamina completndose la sntesis en el hgado y rin, formndose la hormona. Provoca un aumento del Ca2+ en sangre. Es un componente esencial del esqueleto Es imprescindible en la coagulacin sangunea Interviene en la excitabilidad neuromuscular y la transmisin

Funciones del calcio: nerviosa. Patologa: Hipercalcemia: se produce cuando el calcio total en sangre es superior a 10,5 mg /dL, siendo grave cuando pasa de los 13,5 mg / dL. Causas: insuficiencia renal crnica, alteraciones hormonales, inmovilizaciones prolongadas, tumores, aumento del aporte,... Hipocalcemia: disminucin del calcio total en sangre por debajo de 8,5 mg / dL.

99

Causas: disminucin del aporte de calcio, sndromes de mala absorcin intestinal, etc. FSFORO: Valores normales en nios = 4 6,5 mg /dL, y en adultos = 3 5 mg / dL. Localizacin: Intracelular: el tanto por ciento ms alto es de fosfato orgnico, que est formando parte de las macromolculas como los fosfolpidos y las fosfoprotenas. Un tanto por ciento ms bajo est en forma de fosfato inorgnico formando parte de la molcula de ATP. Extracelular: un 85% est formando parte de la matriz sea del esqueleto y un 15% est en el plasma.

Alteraciones Metablicas: Hierfosfatemia: es grave cuando el fsforo est por encima de los 9 mg / dL. El aumento del fsforo va unido a la disminucin del calcio y tiene como consecuencias arritmias cardiacas y contracciones musculares. Hipofosfatemia: se considera grave con valores de fsforo inferiores a 1 mg / dL. La consecuencia de la hipofosfatemia es la alteracin en la contraccin de los msculos esquelticos, que determina una insuficiencia respiratoria. MAGNESIO (Mg2+): los valores normales son 1,5 2,5 meq / L. Funciones: Activacin de enzimas Interviene en la conservacin de la estructura del ADN, ARN y de los ribosomas 50% en los huesos 45% intracelular 5% extracelular

Distribucin:

Alteraciones Metablicas: Hipomagnesemia: es ms importante clnicamente que la hipermagnesemia. Se da en las siguientes circunstancias: Situaciones de mala absorcin intestinal Diarrea abundante Alcoholismo, etc.

Hipermagnesemia: son muy raras porque el rin excreta el exceso de magnesio. Se da en la insuficiencia renal crnica. COBRE (Cu2+): los valores normales son 70 140 g / dL en las mujeres y 80 155 g / dL en los hombres. Funciones: Sntesis de hemoglobina Construccin de enzimas y protenas 100

Metabolismo: el 80% del cobre va unido a las protenas plasmticas, concretamente a las 2 globulinas y dentro de ellas a la ceruloplasmina. Alteraciones: Enfermedad del Wilson: se produce por depsito del cobre en el hgado. Tiene el cobre plasmtico bajo. Aumentado en plasma en la enfermedad de Hodgkin.

2. EQUILIBRIO CIDO - BASE

2.1 INTRODUCCIN Los valores normales del pH del lquido extracelular (plasma) son de 7,25 7,45, lo que equivale a una concentracin de hidrogeniones (H+) de 35 45 mmol / L. El pH del lquido intracelular no se puede determinar con precisin, pero se le atribuye un pH de 6,9. Es imprescindible para el buen funcionamiento del organismo que se mantengan los niveles de pH y esto se controla por tres sistemas, que son: Los tampones cido base de la sangre Riones Pulmones

2.2 SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL PH CORPORAL Son soluciones que disminuyen al mximo las variaciones de pH cuando se aade un cido o una base. Tampn Bicarbonato/ cido Carbnico ( HCO3- / H2CO3 ): es el ms importante H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3pH = pKa + log [ HCO3- ] / log [ H2CO3 ] Si aadimos un cido fuerte, los H+ reaccionarn con el bicarbonato para formar cido carbnico. El cido carbnico es un cido dbil, que provocar slo un ligero aumento de la concentracin de hidrogeniones ( HCO3- + H+ H2CO3 ). Si aadimos una base, los OH- reaccionarn con los hidrogeniones del cido carbnico para formar bicarbonato y agua, de tal forma que el pH apenas se modificar. El H2CO3 se elimina muy fcilmente a travs de la respiracin en forma de CO2. El HCO3- se puede eliminar o se puede preservar si se necesita, por el rin. Tampn de Hemoglobina: es el segundo en importancia. Es intraeritrocitario. Se basa en los cambios que se producen entre las variaciones de Hb oxigenada y la Hb desoxigenada. Tampn de las protenas plasmticas: Se basa en la caracterstica de ser anfteras. Tampn fosfato el menos importante. 2.3 DETERMINACIN ANALTICA DEL PH DE LA SANGRE Y ORINA Los valores normales de pH son: 7,4) 101 pH en sangre total = 7,38 7,44 pH de sangre arterial = 7,36 7,41 (promedio =

Aspectos prcticos:

pH de sangre venosa = 7,37 7,45 El pH de la sangre recin extrada permanece invariable durante 3 horas si se guarda la sangre a 4C en un bao de agua de hielo. Si no el pH disminuye progresivamente despus de la extraccin. Por lo tanto, lo mejor es medir el pH dentro de los 30 minutos posteriores a la extraccin. Para fines clnicos, el pH de la sangre venosa tiene el mismo significado de la sangre arterial. El pH de la orina vara entre 4,6 y 8, y nunca se pueden medir orinas congeladas.

2.4 EQUILIBRIOS CIDO - BASE A. Acidosis: es un trastorno que tiende a retener cidos o a extraer bases de los lquidos corporales. a.1 Acidosis Metablica: se produce cuando hay una carencia primaria de bicarbonato. Datos de laboratorio: HCO3- pH Acidez H2CO3 NH3 urinario

Compensacin de acidosis metablica: se hace mediante la hiperventilacin, aumento de la eliminacin renal de cido y una retencin de base. Acta como compensador el tampn HCO3- / H2CO3 Causas: Insuficiencia renal crnica, envenenamiento por salicilatos, diarreas abundantes, acidosis lctica.

a.2 Acidosis Respiratoria: se produce por un exceso primario de H2CO3 , que se produce cuando el pulmn disminuye la eliminacin de CO2. Datos de laboratorio: HCO3- pH Acidez urinaria H2CO3 NH3 urinario pCO2

Causas: Epoc (enfermedad pulmonar obstructiva crnica), fibrosis pulmonar, enfermedad cardiaca, respiracin de aire con alto contenido en CO2 ,...

102

 Compensacin: interviene el tampn de hemoglobina y el de las protenas plasmticas. Se produce una hiperventilacin y el rin aumenta la reabsorcin de bicarbonato. B. Alcalosis: es un trastorno que tiende a extraer cido o a agregar base al medio interno. b.1 Alcalosis Metablica: es un exceso primario de bicarbonato. Datos de laboratorio: - HCO3- - pH - H2CO3 pH urinario pCO2

Causas: vmitos, tratamiento con diurticos, sndrome de Cushing, hiperaldosteronismo primario, ... Compensacin: Acta el tampn HCO3- / H2CO3, hay una hiperventilacin pulmonar y el rin disminuye la reabsorcin de bicarbonato. b.2 Alcalosis Respiratoria: se produce por un aumento de la eliminacin de CO2 por parte del pulmn. Esto determina una carencia primaria de H2CO3. Causas: se da en todos los procesos que cursan con un aumento de la frecuencia o de la profundidad de la respiracin, por ejemplo, en situaciones de fiebre alta mantenida, anoxia o hipoxia, histeria, etc. Datos de laboratorio: HCO3- pH pH urinario H2CO3 pCO2

Cuando el cuadro es grave tambin se produce un aumento de cuerpos cetnicos y fosfatos disminuidos. bicarbonato. sangre La determinacin de gases en sangre se denomina GASOMETRA. Para determinar gases en sangre hay que realizar una puncin arterial. El paciente debe estar sentado y en reposo al menos durante 10 minutos antes de la puncin. Debe abstenerse de fumar y de tomar broncodilatadores y vasodilatadores, as como oxigenoterapia antes de la extraccin, siempre que las condiciones lo permitan. Se recomienda realizar la puncin en la arteria radial a la altura del tnel carpiano. La muestra se prepara con un anticoagulante (heparina sdica) y debe permanecer siempre hermticamente cerrada. Compensacin: el rin disminuye la reabsorcin de

3. GASES EN SANGRE. Aspectos prcticos en la determinacin de gases en

UT 16. ESTUDIO DEL PERFIL DE LA FUNCIN HEPTICA

103

1. ANATOMO-FISIOLOGA DE LA FUNCIN HEPTICA

1.1 ANATOMA Anatoma Macroscpica: El hgado es una glndula impar, asimtrica, la ms grande del cuerpo, cuyo peso es de 1500 g., lo que supone el 2,5% del peso corporal. Se localiza en el hipocondrio derecho, debajo del diafragma. Est recubierto por una membrana fibrosa que se llama Cpsula de Gusson. Es un rgano muy vascularizado, recibe sangre de la arteria heptica y de la vena porta, recibiendo de 1400-1600 mL de sangre que supone el 25% de todo el gasto cardaco. La sangre sale del hgado por las venas suprahepticas derecha e izquierda que desembocan en la vena cava inferior.

Anatoma Microscpica (Histologa): la unidad funcional heptica es el Lobulillo Heptico. Estos estn separados entre s por tejido conectivo y cada uno mide de 1 a 2 mm de dimetro. Tienen forma hexagonal. En el centro del lobulillo se encuentra la vena centrolobulillar. En la periferia se encuentran unos espacios triangulares llamados Espacios Porta. Cada espacio porta tiene una rama de la vena porta, una rama de la arteria heptica y un conductillo biliar. Los hepatocitos o clulas hepticas se agrupan formando cordones que se disponen radialmente desde el centro del lobulillo hasta la periferia. Entre estas lminas o cordones se encuentran los Sinusoides Vasculares por los que circula la sangre procedente de las ramas de la arteria heptica y de la vena porta. La sangre circula por ellos dirigindose a la vena centrolobulillar. En las paredes de estos sinusoides estn las Clulas de Kupffer, que son clulas del Sistema Retculo Endotelial. Cada hepatocito, en su superficie de contacto con otro hepatocito, presenta una hendidura que con otra hendidura de la otra clula forma un conducto llamado Capilar Biliar y que recoge la bilis segregada por los hepatocitos conducindola a los conductillos biliares de los espacios porta. Los conductillos biliares se van uniendo unos con otros dando lugar al final a dos Conductos Biliares (derecho e izquierdo) que salen del hgado. Los dos se unen y forman el Conducto Heptico que se une al Conducto Cstico (viene de la vescula biliar) y ambos forman el Conducto Coldoco, que desemboca en la ampolla de Vater localizada en la segunda porcin del duodeno.

1.2 FISIOLOGA Formacin de la Bilis: la bilis est constituida por agua, bilirrubina, sales biliares, colesterol, fosfolpidos y electrolitos. La bilis interviene en la digestin y absorcin de las grasas en el intestino delgado. La Bilirrubina es un pigmento que procede de la destruccin de los eritrocitos viejos en el SER. La hemoglobina de los hemates se cataboliza y se obtiene la bilirrubina que recibe el nombre de Bilirrubina Indirecta o no conjugada, que pasa a la sangre donde circula unida a la albmina siendo transportada hasta el hgado. En el hgado se conjuga con el cido glucurnico y se obtiene la Bilirrubina Directa o conjugada que es soluble en agua. sta llega al intestino 104

por la bilis y por accin de la flora bacteriana se transforma en urobilingeno que es eliminado. Funcin Metablica: el hgado interviene en el metabolismo de los lpidos, protenas y glcidos. Funcin desintoxicadora: Intervienen en el catabolismo y la eliminacin de sustancias txicas para el organismo (Ej. Sustancias aminadas, alcohol, etc) Almacenamiento de vitaminas y metales como el hierro y el cobre. Inactivacin de hormonas que luego sern eliminadas Funcin de Sistema Retculo Endotelial a travs de las clulas de Kupffer.

2. PATOLOGA HEPTICA
2.1 DEFINICIN DE HEPATOPATA: las hepatopatas engloban los diferentes trastornos hepticos. Son de difcil clasificacin porque a menudo se desconoce su causa y su evolucin. 2.2 CLASIFICACIN 1. Enfermedades Parenquimatosas: son de localizacin intraheptica. Hepatitis: las ms frecuentes son virales pero pueden ser tambin txicas. Pueden ser agudas o crnicas. Cirrosis Heptica: es una enfermedad degenerativa del hgado, crnica y que lleva a unas lesiones anatomopatolgicas del hgado muy graves. Puede tener mltiples causas: 1. Origen alcohlico 2. Origen en un trastorno de las vas biliares 3. Hemocromatosis (acumulacin de hierro) 4. Enfermedad de Wilson Infiltrados: pueden ser de grasa, de glucgeno o de tipo amiloide. Otros infiltrados son las leucemias y los linfomas. Lesiones que ocupan lugar: Hepatoma (tumor maligno), Metstasis hepticas, Abscesos, Quistes. Trastornos funcionales con ictericia: Sndrome de Gilbert, Colestasis del embarazo.

2. Enfermedades Hepatobiliares: son el resultado de alteraciones en las vas biliares. Las dos ms frecuentes son: Obstruccin extraheptica de las vas biliares (litiasis biliar, tumor pancretico,...) Colangitis: inflamacin de los conductos biliares. Congestin pasiva crnica. El hgado lo sufre siempre que haya insuficiencia cardiaca derecha. Trombosis de las venas suprahepticas o de la vena porta.

3. Enfermedades vasculares: son de origen circulatorio.

3. MEDIDA DE LA FUNCIN HEPTICA

105

3.1 PRUEBAS BIOQUMICAS INDICADORAS DE LA FUNCIN EXCRETORA HEPTICA Una de las principales funciones del hgado es la eliminacin del organismo de sustancias exgenas y endgenas que son nocivas para la fisiologa humana. A. Determinacin de Bilirrubina y Urobilingeno: los niveles sricos normales de Bilirrubina son inferiores a 1 mg / dL. A partir de 2,5 mg /dL se habla de hiperbilirrubinemia, en este caso se produce ictericia. Ictericia: es la coloracin amarillenta de la piel y mucosas. Tipos: Ictericia NO conjugada: se produce por un aumento de la Bilirrubina Indirecta o no conjugada. Puede ser: Preheptica: Hemlisis Heptica: se produce por un transporte defectuoso de bilirrubina de la sangre al hepatocito.

Ictericia conjugada: se produce por un aumento de la Bilirrubina Directa o conjugada. Puede ser: Heptica: se produce por lesin del hepatocito (Ej. Cirrosis, hepatitis, etc) Colestsica: se produce por transporte defectuoso de bilirrubina en el canalculo biliar (Ej. Cirrosis biliar primaria) Postheptica: se produce por obstruccin mecnica de las vas biliares (Ej. Litiasis biliar, carcinoma de pncreas, etc)

Diagnstico diferencial de las ictericias:

1) Determinacin de bilirrubina total y bilirrubina directa en suero. 2) Bilirrubina en orina (Urobilina): la bilirrubina indirecta est unida a la albmina, por lo tanto, no se filtra por el glomrulo, es decir, que si est aumentada en sangre no estar aumentada en orina. La bilirrubina directa es soluble en agua y, por lo tanto, si est aumentada en sangre aumenta en orina. 3) Determinacin de Urobilingeno en orina y heces: se hace aplicando el reactivo de Erlich y se cuantifica por la intensidad de color. B. Medida de excrecin de colorantes: se basa en la capacidad que tiene el hgado para extraer colorantes de la sangre. Se usan colorantes como el Rosa de Bengala, la Bromo Sulfoftaleina o el Verde de Indocianina.

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3.2 PRUEBAS BIOQUMICAS INDICADORAS DE LA CAPACIDAD DE SNTESIS HEPTICA Y METABLICA Se basan en la medida de compuestos que son sintetizados habitualmente por el hgado. A. Medida de la Albmina y globulinas: la Albmina es la protena ms importante cuantitativamente, sintetizada por el hgado, por lo tanto, su descenso en sangre es un excelente indicador de la gravedad de una hepatopata. Las gamma globulinas se sintetizan en las clulas plasmticas y aumentan en las hepatopatas para compensar la disminucin de la destruccin de Ag por el hgado. B. Determinacin de factores de la coagulacin: los factores de la coagulacin sintetizados por el hgado son el I o Fibringeno, el II o Protrombina, el V, el VII, el IX y el X. Estos factores existen en exceso y slo en caso de hepatopatas muy graves disminuyen. Las pruebas indicadas para su control son: El Tiempo de Protrombina (TP) y el Tiempo de Tromboplastina Parcial (TTP). C. Medida de amonaco en sangre: el amonaco en sangre se encuentra en forma de in amonio. El hgado elimina la mayor parte del amonaco de la sangre en forma de urea. En las hepatopatas el amonaco no se elimina, aumenta en sangre y esto determina una importante alteracin neurolgica porque el amonaco es neurotxico. La medida de amonaco en sangre es muy til para la identificacin de la encelopata heptica y el coma heptico. Se producen aumento del amonaco precoz en el Sndrome de Reye, que aparece en nios de corta edad.

4. MARCADORES SRICOS DE LA ENFERMEDAD HEPTICA

Son pruebas bioqumicas tiles para estudiar la enfermedad heptica, pero no sirven para medir la funcin del hgado. Enzimas: Transaminasas (AST, ALT, GGT), LDH, Fosfatasa Alcalina, 5-Nucleotidasa. Esta ltima se utiliza para determinar la existencia de enfermedad hepatobiliar. Su principal utilidad es confirmar el origen heptico de un aumento de la Fosfatasa Alcalina en nios, embarazadas y pacientes con osteopatas. Marcadores serolgicos de Hepatitis Virales: Hepatitis A: est producida por el virus de la Hepatitis A. Se caracteriza porque tiene transmisin fecal-oral y porque no cronifica. Serologa: se utilizan para su diagnstico y se dispone de una vacuna efectiva para personas especialmente expuestas. IgM-anti VHA: est aumentada desde su aparicin hasta los seis meses. IgG-anti VHA: aumenta a las 6 semanas del inicio y se mantiene aumentada hasta el final de la enfermedad. 107

 Hepatitis B: se transmite por el virus de la Hepatitis B y tiene tres vas de contagio, la parenteral, sexual y materna-fetal. El virus de la Hepatitis B completo recibe el nombre de partcula Dane y se descompone en: Genoma viral Cpsula: es la parte exterior de la estructura y se llama Ag de superficie o HBs Ag Ncleocpside o Core: est formada por ADN y protenas y se llaman HBc Ag.

Cronifica en un 15-20% de los caos y en un 1% es fulminante. Serologa: - HBs Ag o Ag Australia: indica infeccin actual del virus de la Hepatitis B. Su negatividad no permite descartar la enfermedad. - HBs Ac: son los nicos marcadores en personas vacunadas y en hijos de madres con anti-HBs. - HBc Ac: tiene una concentracin alta en fases muy tempranas de la infeccin. Se mantiene en concentraciones muy bajas muchos aos en personas ya curadas. Las IgM anti HBc indican infeccin aguda (es el mejor indicador). Si son negativas permiten descartar la enfermedad. - HBe Ag: indica replicacin activa del virus y, por lo tanto, posibilidad de contagio de la enfermedad. - HBe Ac: indica junto con la desaparicin simultnea del Ag HBe buen pronstico. Hepatitis C: se transmiten por va parenteral Serologa: se determinan Ac anti-VHC que no sirven para la fase aguda pudiendo tardar meses en aparecer. Hepatitis D: se transmite por va parenteral a personas que padecen o han padecido Hepatitis B. Hepatitis E: se transmite por va fecal-oral en epidemias causadas por fuentes de agua contaminadas. HEPATITIS VIRAL AGUDA A HEPATITIS B AGUDA

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