MANUAL

MANUAL DE PRCTICA DE BIOLOGA MOLECULAR
MANUAL DE PRCTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
UNIVERSIDAD CATLICA DE SANTIAGO DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE MEDICINA
ROTACIONES DE BIOLOGA MOLECULAR
BIOLOGO. GUSTAVO ESCOBAR V.
Estudiante: ______________________ Paralelo: _________________ Grupo: ______________
2009-2010
UNIVERSIDAD CATOLICA DE SANTIAGO DE GUAYAQUIL Bilogo. GUSTAVO ESCOBAR.
NDICE
INTRODUCCIN OBJETIVO ALCANCE REA DE TRABAJO RECOMENDACIONES TCNICAS
3 4 4 4 5
REGLAS BSICAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR 7 PRCTICA 1: EXTRACCIN DE ADN, EN SANGRE PERIFERICA. 9
PRCTICA 2: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR), DIAGNOSTICOO MOLECULAR PARA ENFERMEDADES INFECCIOSAS 14 PRCTICA 3: ANALISIS DE PATERNIDAD 22
PRCTICA 4: CULTIVO EN SANGRE PERIFERICA PARA CARIOTIPO HUMANO Y OBSERVACIN DE CROMOSOMAS 29 BIBLIOGRAFIA 34
INTRODUCCIN
Este folleto esta relacionado con el manejo del Sistema de Gestin de Calidad, de algunas tcnicas de Biologa Molecular que han sido modificadas e
implementadas en el Laboratorio de Biologa Molecular de la Universidad Catlica de Santiago de Guayaquil.
OBJETIVO Presentar recomendaciones bsicas y tcnicas previas a las prcticas de laboratorio. ALCANCE Recomendaciones para tener en cuenta, durante y despus de cada prctica de laboratorio.
reas de trabajo Superficie donde se genere, practica y se ejecute cualquier actividad propia del laboratorio, en el laboratorio de biologa molecular existen seis reas de trabajo debidamente sealadas e identificadas como son: rea de Extraccin de ADN (Laboratorio General) Pre-PCR (laboratorio # 1), PCR (Laboratorio #2) y Post-PCR laboratorio (general y laboratorio #3), Cultivo celular Laboratorio 6, y Microscopia (laboratorio #5).
RECOMENDACIONES TCNICAS. 1. Presentarse cinco (5) minutos antes del comienzo de la prctica. 2. Iniciar la prctica de laboratorio lo ms pronto posible al ingreso de los estudiantes. 3. Ubicarse en grupos de trabajo de forma equitativa, igual nmeros de alumnos por grupo. 4. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 5. Si presenta heridas o rasguos en la piel cubrir esto con una cura o un vendaje apropiado e informe al docente a cargo. 6. Antes de iniciar las practicas colocarse la bata de laboratorio, la cual debe ser manga larga y 30 centmetros por debajo de la cintura. 7. Despojarse de todo tipo de joyas y adornos. 8. Usar calzado cerrado de material resistente e impermeable. 9. Utilizar siempre y correctamente la bata de laboratorio para estar cubierto totalmente. 10. Usar guantes de ltex limpios y estriles, y desecharlos una vez terminada la practica. 11. Lavar bien las manos antes de empezar a comenzar la practica de laboratorio 12. Efectuar limpieza y desinfeccin del rea de trabajo una vez haya concluido la prctica, empleando soluciones desinfectantes (Alcohol al 70% y Hipoclorito de sodio al 0.05%) 13. Nunca transporte reactivos o muestras abiertos, fuera del laboratorio. 14. No pipetear con la boca los reactivos, utilice los dispositivos para tal fin. 15. No corra o grite dentro del laboratorio. 16. Al finalizar la jornada de prcticas asegrese que todas las llaves y controles de agua estn cerrados y verificar si existen fugas, en tal caso avisar al departamento de mantenimiento.
17. Despojarse de la bata y guantes una vez halla terminado la practica, no salir al exterior del laboratorio con la bata puesta. 18. Mantenga las luces y equipos elctricos apagados y desconectados cuando no estn en uso.
REGLAS BSICAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Normas administrativas bsicas
1. Colocar seales de advertencia en reas de contaminacin potencial. 2. Elaborar un organigrama del personal de laboratorio, incluyendo un oficial de seguridad, Responsable de la coordinacin en cualquier caso de accidente. 3. Capacitar adecuadamente a todo el personal con respecto a las normas de seguridad y el Funcionamiento detallado del laboratorio y sus equipos. 4. Todo accidente, sin importar su tipo o magnitud, debe ser informado al oficial de seguridad o a la persona responsable del manejo de estos casos. 5. Los procedimientos de seguridad y los materiales de laboratorio deben ser revisados peridicamente para asegurar su eficacia en caso de accidente y/o contaminacin.
Proteccin del personal

1. Toda persona debe usar ropa adecuada para su rea de trabajo (mandil, guantes, mascarilla, gorra). 2. Se debe evitar la circulacin por varios recintos desde zonas potencialmente contaminantes. 3. Es recomendable una actualizacin peridica de las fichas mdicas del personal, poniendo nfasis en los riesgos que se corren en el lugar de trabajo. 4. Se debe evitar el ingreso de personas enfermas o heridas a las reas de laboratorios. 5. Se debe evitar que personas embarazadas ingresen a los laboratorios si hay alguna posibilidad de riesgo para el nio o la madre.
Prohibiciones expresas
1. No fumar, no comer, no tomar y no usar cosmticos dentro del laboratorio. 2. No usar el laboratorio para otras actividades que no sean las especficas. 3. Ningn extrao puede entrar en reas de laboratorios.
Normas para el manejo de muestras

1. Toda muestra y reactivo debe tener bien especificada su naturaleza, en recipientes seguros y con Etiquetas duraderas. Muestras recin tomadas o recibidas deben ser guardadas lo ms pronto posible en condiciones Adecuadas y bajo control.
2.
3. Debe evitarse el contacto fsico con las muestras. 4. Debe trabajarse, en lo posible, con una sola muestra al mismo tiempo. 5. Muestras inservibles deben ser esterilizadas adecuadamente antes de ser desechadas.
Normas de limpieza
1. El laboratorio debe contar con cabinas de flujo laminar y/o debe tener facilidades equivalentes. Se debe usar desinfectantes apropiados para el tipo de trabajo que se haya realizado (Fenol 1-5%, Hipoclorito 1%, Glutaraldehdo 2%). 3. Todo material debe ser esterilizado despus de su uso y antes de desecharlo. 4. Todo material contaminado irremediablemente debe ser incinerado. 5. Toda prenda protectora usada por el personal debe ser lavada dentro de la misma institucin. 6. El personal debe lavarse las manos frecuentemente, en especial antes y despus de manejar las Muestras. 7. Todo material contaminante debe ser esterilizado antes de lavarlo.
Prctica 1: EXTRACCIN DE ADN EN SANGRE PERIFERICA

OBJETIVO
1. Aprender la tcnica de extraccin de ADN humano a partir de sangre perifrica.
INTRODUCCIN. ESTRUCTURADEL ADN

El ADN (cido DesoxiriboNucleico) constituye el material gentico de las clulas del cuerpo humano. Con un tipo de excepcin, el ADN se encuentra exclusivamente en el ncleo de las clulas. En el genoma (conjunto integral y secuenciado del ADN) humano se estima que hay aproximadamente 40,000 ms genes. Los genes son trozos funcionales de ADN compuestos a su vez de1,000 hasta 200,000 unidades c/u llamadas nucletidos. Los nucletidos se encuentran organizados formando un par de cadenas apareadas que toman la forma tridimensional de un doble hlix. Hay ms de (3,000'000,000) tres mil millones de pares de bases que constituyen el genoma de una sola clula humana. Es precisamente de la hipervariabilidad (polimorfismo) de estas regiones del ADN de lo que se aprovecha para detectar diferencias (o semejanzas) entre un ser humano y otro Muchos cientficos se interesaron en descifrar la estructura del ADN, entre ellos, Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin, y Maurice Wilkins, a finales de la primavera de 1952, la cristalgrafa britnica Rosalind Franklin (1920-1958) obtuvo una fotografa de difraccin de rayos X que revel, de manera inconfundible, la estructura helicoidal de la molcula del ADN. A fines de Febrero de 1953, Rosalind Franklin, escribi en su cuaderno de notas que la estructura del ADN tena dos cadenas, ya antes haba deducido que los grupos fosfatos se encontraban en el exterior y que el ADN existe en dos formas. Considerado como el logro mdico ms importante del siglo XX, el modelo de la doble hlice del ADN abri el camino para la comprensin de la biologa molecular y las funciones genticas; antecedentes que han permitido llegar al establecimiento, en estos das, de la secuencia "completa" del genoma humano. Rosalind Franklin obtuvo una fotografa de difraccin de rayos X que revel, de manera inconfundible, la estructura helicoidal de la molcula del ADN. Esa imagen, conocida hoy como la famosa fotografa 51, fue un respaldo experimental crucial para que el investigador estadounidense James Watson y el britnico Francis Crick establecieran, en 1953, la clebre hiptesis de la "doble hlice" que es caracterstica de la estructura molecular del ADN (cido desoxirribonucleico), por la que en 1962, junto con Maurice Wilkins, se les concediera el Premio Nbel en Fisiologa y Medicina.
El ADN es una doble hlice, con las bases dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molcula (como los peldaos de una escalera caracol) y las unidades azcar-fosfato a lo largo de los lados de la hlice (como las barandas de una escalera caracol). Las hebras que la conforman son complementarias (deduccin realizada por Watson y Crick a partir de los datos de Chargaff, A se aparea con T y C con G, el apareamiento se mantiene debido a la accin de los puestes de hidrogeno entre ambas bases, tome nota que una purina con doble anillo siempre se aparea con una pirimidina con un solo anillo en su molcula.
El ADN de los diferentes seres vivos

El ADN de todos los seres vivientes ya sea de un animal, una planta una bacteria o un virus, posee el mismo tipo de estructura, es decir una molcula de doble cadena (excepto algunos tipos de virus) constituida cada una de una sucesin de miles de nucletidos. Lo que difiere de una especie a otra es: El nmero de molculas de ADN en un virus o una clula. Su longitud, unos miles de nucletidos o unos billones repartidos sobre varios cromosomas. Su forma linear o circular Su localizacin en la clula
Su secuencia de bases
cidos Nucleicos Hay dos tipos de cidos nucleicos (ARN): el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (ARN), y estn presentes en todas las clulas. Su funcin biolgica no qued plenamente demostrada hasta que Avery y sus colaboradores demostraron en 1944 que el ADN era el ADN era la molcula portadora de la informacin gentica. Los cidos nucleicos son polmeros lineales de un monmero llamado nucletido (Figura de la derecha), cada nucletido est formado, mediante un enlace ster, por un c. Fosfrico y un nuclesido (zona sombreada de la figura), este ltimo se constituye por la unin de una pentosa (la D-ribosa o la 2-desoxi-D-ribosa), y una base nitrogenada (purina o pirimidina). Las bases nitrogenadas pueden ser purinas: ADENINA y GUANINA, las bases pirimidnicas son: CITOCINA, TIMINA y URACILO. La timina solo puede formar ADN y el uracilo solo est presente en el ARN
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Applications del ADN Diagnstico de enfermedades producidas por agentes infecciosos ( Virus, Bacterias y Parsitos) Caracterizacin de Especies (Animales, Vegetales etc.) Detecciones de anomalas genticas Casos forenses: comparacin del sospechoso con la evidencia Paternidad: identificacin de progenitores biolgicos Investigaciones histricas Investigaciones de personas perdidas Desastres en masa Bases de secuencias de ADN de delicuentes
MATERIALES: EXTRACCIN DE ADN DE SANGRE PERIFRICA - Dos muestras de 1 cc de sangre perifrica heparinizada - Agua bidestilada - Recipiente con cloro - Tampn de lisis de leucocitos: Tris (2M) EDTA (0,25M) qumicamente pura - HCl - SDS 10% - NaCl (6M) - Etanol absoluto - Etanol al 70% - Bao mara a 37 C. multitubos - Tubos cnicos precipitacin. - Tris-EDTA (TE) 1:0.1 pH 8 - Pipeta Pasteur - Guantes estriles
NaCl (5M) Agua - Proteinasa K - Isopropanol - Vortex - Centrfuga - Vaso de
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EXTRACCION DE ADN EN SANGRE PERIFRICA

(Sambrook y cols., 1989),
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Tomar de 5 ml de sangre perifrica con EDTA (tubo tapa lila) Ingresar los datos al cuaderno de registro y dar un cdigo a la muestra. de la muestra coger (250 uL, 500uL 1ml), y colocar en un tubo estril eppendorff de 1.8ml, previamente etiquetado. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM. Retirar el plasma, con una micro pipeta de 1000ul estril; sin agitar el tapn celular (cuidado con los glbulos blancos). Llenar el tubo con buffer de lisis de eritrocitos agua ultra pura (1ml), agitar suavemente hasta que se resuspenda el botn celular. Colocar la muestra a 4C por 5 minutos. Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM Descartar el sobrenadante (600uL) con micro pipeta estril, evitando tomar los ncleos Agregar buffer de lisis de eritrocitos agua ultra pura (1ml), dar Vortex por 10 seg, Centrifugar la muestra por 10 minutos a 10000 RPM, (Repetir este pas 3 veces, hasta que el botn celular quede limpio). Descartar el sobrenadante (600uL) con micro pipeta estril, evitando tomar los ncleos. Resuspender el tapn de ncleos en : a. 500 ul de buffer de lisis de leucocitos b. 10 ul de Proteinasa K (PK) 10mg/ml c. 50 ul de DUODECIL sulfato de sodio (SDS) al 10 % Incubar la muestra en bao de mara hmedo a 37C por toda la noche (o a 56 C por 2 horas) Al da siguiente Colocar 200 ul de Cloruro de Sodio (CLNa), 5 M, a la muestra Agitar suavemente la muestra (cabeza-cola) por 2 minutos, (no Vortex). Centrifugar la muestra por 10 minutos a 12000 RPM
11. 12.
13.
14. 15. 16.
El ADN se encuentra a partir de este paso en el sobrenadante. 17. Recuperar el sobrenadante (500uL)y pasarlo a un nuevo tubo estril previamente etiquetado (no llevar nada del precipitado). 18. Aadir Fenol (250uL) y Cloroformo-Isoamyl alcohol (250uL); dar vortex no ms de 10 seg, y centrifugar a 15 minutos a 12000 RPM. 19. Recuperar el sobrenadante (400uL) y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado y agregar un volumen = de cloroformo, dar vortex por 10 segundos y centrifugar por 2minutos a 12000 RPM (para limpiar el ADN). 20. Recuperar el sobrenadante y pasarlo a otro tubo eppendorff rotulado y aadir (300 ul) de Isopropanol (helado), Invertir la muestra suavemente hasta que la medusa del ADN se observe. 21. Centrifugar la muestra por 2 minutos a 10000 RPM. 22. Retirar el sabrenadante tener cuidado de no llevarse la medusa de DNA y aadir (500ul) de etanol al 70% (helado). 23. Centrifugar el tubo de Eppendorff por 2 minutos a 10000 RPM y descartar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder la medusa de ADN 24. Dejar evaporar el etanol a temperatura ambiente o bao de mara seco a 37C por 1 hora, resuspender la medusa en TE (100uL-150uL), por 15 min a 56C 30 min a 37C. Verificar la concentracin y pureza del DNA, en un gel de agarosa al 1%, guardar el DAN a -20C..
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RESULTADOS:
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Prctica 2: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Diagnostico de agentes infecciosos

OBJETIVOS
1. Usar el ADN extrado en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2. Conocer las aplicaciones de la PCR.
INTRODUCCIN La PCR es una reaccin bioqumica in vitro catalizada por una enzima, en la cual pequeas cantidades de un segmento especfico de ADN, que se hallan entre dos regiones de ADN de secuencia conocida, son amplificadas obtenindose una gran cantidad de ADN lineal de doble cadena. Debido a que la PCR est basada en la accin enzimtica de una ADN polimerasa (la ms comnmente utilizada es la Taq ADN pol I que es una de las enzimas ms extensamente caracterizada y aplicada en biologa molecular), la tecnologa de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias reas de investigacin, incluyendo la tecnologa del ADN recombinante, la expresin gnica, medicina general, medicina forense y evolucin. Actualmente, la tecnologa de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restriccin, con el clonaje del ADN y con el Southern blotting en el avance de la biologa molecular. Los primeros experimentos de amplificacin con PCR fueron realizados por el Dr. Mullis y el Dr. Fred A. Faloona, un matemtico quien desarroll el primer dispositivo automtico regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o mquina de PCR (Mullis y Faloona, 1987). El Objetivo de la PCR es Lograr duplicar cuantas veces sea necesario un fragmento de
ADN de inters para conseguir cantidades analizables y la estrategia utilizar los mecanismos de duplicacin del ADN en forma repetida durante muchos ciclos en un tubo de ensayo. Ciclos # Copias 0 1 1 2 2 4 3 8 9 1024 10 2048 11 4096 12 8192 . . . . . . 30 1073741824
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LA VENTAJAS DE LA PCR Tcnica rpida, reproducible y altamente sensible. Permite la amplificacin de un fragmento especfico de ADN. Posibilita la sntesis enzimtica in vitro de cantidades detectables de ADN a partir de mnimas cantidades del material de partida.
La amplificacin del ADN se obtiene por ciclos repetidos de PCR, cada uno de los cuales consta de tres estadios de temperatura distintos: 1) Desnaturalizacin del templado o "plantilla" de ADN (ADN que servir de modelo para su amplificacin) a una temperatura de 94 a 96 C. 2) Unin o annealing de los primers (conocidos tambin como cebadores). Los primers son oligonucletidos, formados por molculas de cadena simple de ADN que son complementarios a ambos extremos de una secuencia determinada de ADN que acta como templado o plantilla. Su funcin es servir al templado de ADN como punto de partida para la polimerizacin. Este paso requiere una temperatura que vara entre los 42 a 60 C Primers: F 5' GAT CCT GGC TCA GGA TGA A 3' (19) F 5' GGA CTA CCA GA G TAT CTA 3' (18)
FORMULA Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)
3) Extensin del primer por ADN polimerasa: Los primers son extendidos en una cadena templado de ADN de cadena simple (previamente desnaturalizado) gracias a la enzima ADN polimerasa en presencia de desoxinuclesidos trifosfato (dNTPs) bajo condiciones adecuadas de reaccin, esto da como resultado la sntesis de nuevas cadenas de ADN complementario a las cadenas templado. Para este paso se requieren temperaturas entre los 60 a 72 C. Luego de la extensin se obtienen molculas de ADN de doble cadena, sin embargo, la sntesis de nuevas cadenas de ADN puede ser repetida volviendo a desnaturalizar el ADN por calor (desnaturalizacin), seguidamente promoviendo el annealing o unin de los primers mediante el enfriamiento de la mezcla para finalmente conducir a la extensin de los primers gracias a la ADN polimerasa a la temperatura adecuada para cada reaccin. Cada repeticin de esta sntesis de nuevas cadenas constituye un ciclo de amplificacin. La reaccin de amplificacin contiene dos primers dispuestos de tal manera que puedan hibridizar con las cadenas opuestas de la secuencia "blanco" o secuencia a amplificarse. Debido a que el producto extendido incluye la secuencia complementaria a la del otro primer, el producto de cada reaccin sirve como templado en el nuevo ciclo de PCR verificndose as una reaccin bioqumica en cadena.
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El impacto de esta tecnologa (PCR) ha sido particularmente importante en algunos campos relacionados al anlisis del genoma humano, especialmente en el mapeo gentico y fsico de los cromosomas y anlisis de la expresin gnica.
Amplificacin de ADN mediante ciclos repetidos de PCR.
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PRINCIPALES TECNICAS DERIVADAS BASADAS EN PCR RT-PCR: Deteccin de mRNA PCR Nested: Amplificacin de una secuencia dentro de otra previamente amplificada PCR Multiplex: Varios targets diferentes en forma simultnea In situ PCr: Deteccin en tejido mismo, ubicacin del fragmento IC-PCR: Inmunocaptura previa a PCR PCR-RFLP: Polimorfismo gentico (usado ms que RAPDs) Real Time PCR: Cuantificacin de copias iniciales en tiempo real
APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA
Deteccin de cantidades mnimas (diagnstico temprano en pacientes asintomticos) Monitoreo de terapia (por ej. disminucin de carga viral) Evaluacin de terapia - pronostico de recada Deteccin de cepas resistentes a antibiticos Deteccin temprana de Citomegalovirus y otros patgenos en de rganos (por inmunosupresin pacientes con trasplante
y mayor riesgo a infecciones latentes)
MUESTRAS QUE PUEDEN SER EVALUADAS POR PCR Sangre Mucosa Orina Tejido Heces Lquido cefalorraqudeo
PATOGENOS QUE PUEDEN SER DETECTADOS POR PCR
Bacterias Hongos Parsitos Virus Mutaciones en Genes Ausencia / Delecin de genes
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USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR EN LA SOCIEDAD Medicina : Diagnstico Molecular: Enfermedades genticas Enfermedades infecciosas Identificacin gentica y filiacin (Pruebas de paternidad, medicina forense, pedigree de animales, etc...) Mejoramiento gentico en animales y plantas Productos biomdicos Terapia gnica MATERIALES
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) - Termociclador - Tubos eppendorf de 0,5 ml - Gradilla para tubos eppendorf - Parafilm - Micropipetas de 200 y 10 microlitros - Puntas para micropipetas (estriles) - Tubos eppendorf de 1,5 ml - Hielo picado - Master Mix: - Agua qumicamente pura - Taq polimerasa - Primers - ADN a ser amplificado PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA PCR 1. Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estril para preparar la - dNTPs - Buffer o tampn de reaccin 10X - MgCl2
master mix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseada para el objeto. * Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la mezcla y debern ser mantenidos sobre hielo picado antes y despus de ser usados. Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente.
* Para la adicin de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estriles y la
preparacin de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes. * Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel, etc. * La cantidad de master mix a preparar debe ser calculada segn el nmero de tubos de reaccin.
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MASTER MIX (Volumen final por tubo de reaccin = 25 microlitros)
Componentes del PCR M-MIX H20 bd Buffer MgCl DNTPs Primers 1 Primers 2 Taq Polimeraza ADN Ci Vi Cf Vf No. R
2. Colocar 19 microlitros de master mix en cada tubo de reaccin (tubos eppendorf 0,2 ml). Aadir a cada uno 1 microlitros del ADN extrado. 3. llevar los tubos al rea de PCR 4. Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reaccin en caso de no usarlos inmediatamente.
GEL DE AGAROSA - Cmara de electroforesis - Azarosa - TAE 1X: - Bromuro de etidio - 100pb - Azul de Bromofenol - Micropipetas - Puntas para micropipeta
GEL DE AGAROSA
1. Pesar 0,4 gr de agarosa. 2. Calentar la solucin hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se riegue la misma. 3. Dejar enfriar la solucin hasta aproximadamente 55 C y agregar. Preparar el molde del gel y verter la solucin en el mismo moviendo las burbujas hacia la orilla. 4. Colocar la peinilla en el gel y dejar que ste se solidifique, entonces retirar la peinilla con cuidado. 5. En un pedazo de parafilm limpio colocar 4 microlitros de tinta azul por cada tubo de reaccin y mezclar con 10 microlitros de ADN amplificado en el termociclador.
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6. Colocar el gel en la cmara de electroforesis y cubrirlo con TAE 1X. Colocar la
mezcla obtenida en el paso 5, en cada uno de los pocillos del gel preparado anteriormente. 7. Proceder a la electroforesis a voltaje constante (90 voltios). 8. Colocar el gel en la solucin Bromuro de Etidio. Por 5 minutos. 9. Lavar el Gel en abundante agua y observarlo en la cmara de UV. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin ms homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0,5 a 2%) poseen la propiedad de permanecer lquidas por encima de aprox. 50C y formar un gel, semislido. La electroforesis es un mtodo analtico semipreparativo, en el que se separan biomolculas fue empleado por primera vez por Tiselius en el ao 1937. Raymond y Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE). La agarosa polmero que funde a 80 - 90 C, el rango de concentracin oscila entre el 0,3 %, que puede separar molculas del orden de 5 a 60 Kb, el 2% que puede separar cidos nucleicos de 0,1 a 0,2 Kb. las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos. Es la tcnica por la cual mezclas complejas de molculas como protenas, ADN o ARN se separan en un campo elctrico de acuerdo al tamao y a su carga elctrica. La electricidad empuja las molculas a travs de los poros de un gel, molculas segn un rango especfico de tamaos y formas, las molculas ms pequeas migran ms rpido que las ms grandes.
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RESULTADOS:
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Prctica 3: ANALISIS DE PATERNIDAD

OBJETIVO
1.- Determinar la relacin biolgica de parentesco existente entre diferentes individuos. Anlisis de Paternidad Se basa en la identificacin con ADN o huella gentica se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la caracterstica de ser altamente variables o polimrficos entre los mismos. El anlisis de un determinado nmero de estas secuencias o fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad muy cercana al 100%. Adems de ser muy polimrfico, el ADN que se utiliza para la identificacin en Gentica Forense es un ADN no codificante o no expresivo, por lo que no revela caractersticas fenotpicas de los individuos; este hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creacin de las bases de datos genticas.
INTRODUCCIN Mediados de los aos 80 comienzan a desarrollarse sistemas de identificacin de individuos basados en el estudio de polimorfismos de ADN, los cuales reflejan la amplia variacin de secuencias localizadas en diferentes regiones del genoma. La variabilidad de estas zonas radica en diferencias exhibidas por el material gentico, en la secuencia nucleotdica misma a travs de sustituciones de nucletidos, o en la distinta longitud generada por una misma secuencia que se repite un nmero diferente de veces. Cuando fue posible conocer su localizacin y desarrollar una metodologa adecuada para ponerlas de manifiesto comenz a ser estudiadas mediante sistemas de anlisis cada vez ms precisos y sencillos. La enorme implicancia social, filosfica, psicolgica y biolgica de la identidad, hacen de ella un tema de mxima importancia en la sociedad moderna. Desde un punto biolgico, la identidad se define como una secuencia particular de ADN. Esta determina una estructura definida en s misma y determina, tambin, las reacciones biolgicas producto de su expresin. La principal caracterstica de la identidad biolgica es que es estable e invariable en el tiempo. Hasta 1970 inclusive, muchos cientficos crean que con las tcnicas existentes (grupos sanguneos, protenas del plasma y antgenos eritrocitarios) se poda excluir la paternidad de un hombre sobre determinado nio, pero nunca se podra probar una paternidad con un alto grado de certeza. Cuando se empez a utilizar la tcnica de HLA (antgenos de histocompatibilidad) qued en evidencia que era posible probar un determinado vnculo biolgico.
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Actualmente, utilizando el HLA junto al polimorfismo del ADN, se puede llegar a probabilidades de 1 contra 1000 millones de que un hombre comparta al azar un determinado patrn gentico con otra persona sin que exista un vnculo biolgico. En otras palabras, slo existiran en todo el mundo 2 personas que tuvieran ese patrn gentico por azar. Los seres humanos poseemos individualidad biolgica, lo cual permite diferenciar a una persona de otra. Dicha individualidad se debe a la combinacin nica de un 50 % de los genes paternos con un 50 % de los genes maternos en la fecundacin. Por lo tanto, la individualidad biolgica est determinada por el complemento gentico de los progenitores y en un sentido mucho ms amplio por el de los ancestros. El conjunto de genes heredados por un individuo se denomina genotipo y la expresin de stos se llama fenotipo. La molcula encargada de transmitir la informacin gentica es el cido desoxirribonucleico (ADN) Este domina todas las estructuras y funciones para el desarrollo y supervivencia de un organismo. Todas las clulas con ncleo del organismo poseen una copia de ADN, por lo que puede usarse para extraerlo: pelo, saliva, semen y generalmente clulas blancas de la sangre. Como se dijo anteriormente, el ADN es lo que nos hace qumicamente nicos. Con excepcin de los gemelos univitelinos, no existen dos personas iguales a nivel de la estructura qumica del ADN. ORGANIZACIN DEL ADN El ADN est organizado en estructuras discretas llamadas genes. En una forma simple se puede decir que cada gen codifica para una protena. Esta traduccin est mediada por otro cido nucleico: el cido ribonucleico (ARN). Como todos los seres humanos estamos formados de igual forma (dos brazos, dos piernas, etc.) la mayor parte del genoma es idntico (99%) para todos los individuos. La diferencia en un determinado carcter (por ejemplo, color de ojos) y por lo tanto en un mismo gen se denomina alelismo. Entonces, para el color de ojos existen varios alelos o variantes de un mismo gen. Por otro lado, en el ADN existen determinadas regiones hipervariables que son nicas en cada persona y presentan repeticiones en tndem de una misma secuencia. Estas se denominan VNTRs (Variable Number Tandem Repeats) o minisatlites y STRs (Short Tandem Repeats) o microsatlites; la diferencia est dada en el nmero de estas repeticiones en tandeo, y por ende en la longitud de estas secuencias. Las diferencias en una misma secuencia entre individuos se denominan polimorfismo. Las repeticiones en tndem al ser altamente polimrficas son las ideales para los casos de filiacin. Las repeticiones en tndem se encuentran generalmente en regiones no codificantes del ADN y dispersas por los 23 pares de cromosomas; Pueden estar en un sitio especfico de un cromosoma (locus) o dispersos en sitios de varios cromosomas (loci).
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Polimorfismos STR La mayora de nuestro ADN es idntico al de otras personas. Sin embargo, hay regiones heredadas de nuestro ADN que pueden variar de una a otra persona. Las variaciones de la secuencia del ADN entre individuos se denominan "polimorfismos". Como descubriremos en esta Actividad, las secuencias con grado mximo de polimorfismo son muy tiles para el anlisis de ADN en casos de medicina legal y en pruebas de paternidad. Esta Actividad se basa en analizar la herencia de un tipo de polimorfismos de ADN conocido como "repeticiones cortas en tndem" o, de forma abreviada, STR (del ingls Short Tandem Repeats). Las STR son secuencias cortas de ADN, normalmente con una longitud de 2 a 5 pares de bases, que se repiten muchas veces de forma consecutiva, cabeza con cola. D7S280 es uno de los 13 loci genticos STR del ncleo. Este ADN se encuentra en el cromosoma 7 humano. A continuacin se muestra la secuencia de un alelo representativo de este locus. La secuencia tetramrica repetida en D7S280, Alelos diferentes de este locus tienen entre 6 y 15 repeticiones en tndem de la secuencia.
PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA PCR
1. Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estril para preparar la master mix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseada para el objeto. * Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la mezcla y debern ser mantenidos sobre hielo picado antes y despus de ser usados. Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente. * Para la adicin de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estriles y la preparacin de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes. * Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel, etc. * La cantidad de master mix a preparar debe ser calculada segn el nmero de tubos de reaccin.
MASTER MIX (Volumen final por tubo de reaccin = 20 microlitros)
Componentes del PCR

M-MIX H20 bd Buffer MgCl DNTPs Primers Taq Polimeraza ADN Ci Vi Cf Vf No. R
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Los valores obtenidos mediante el anlisis por PCR, representan el alelo presente definido por el nmero de pequeas repeticiones en tandem (ej: 6,9 para TH01). Para cada locus gentico testeado, una persona tiene ms de dos fragmentos o alelos. Cada uno de estos alelos es heredado de uno de sus padres biolgicos, uno de su madre y otro de su padre. Si solo un fragmento es el resultado, los dos fragmentos estn determinados por el mismo tamao y el individuo es homocigoto para ese alelo. Exclusin - Para cada sistema gentico testeado, si el fragmento de DNA del padre alegado no concuerda con el hijo, esto es llamado una exclusin. Un padre alegado es considerado excluido de ser el padre biolgico cuando 3 o ms alelos no concuerdan. Inclusin - Si el fragmento de DNA del padre alegado concuerda con el/los fragmentos del hijo, esto es comparado contra una base de datos poblacional de individuos de la misma raza. La frecuencia de los alelos que concuerdan es obtenida de dicha base de datos y es usado para el clculo del ndice de paternidad. Este ndice representa la probabilidad de ser el padre biolgico.
Figura 1: Inclusin Madre H A A A A A Hijo Supuesto padre
En la figura 1 se ve como un set de el DNA del hijo (barra inferior, columna 2) concuerda con un set del DNA materno (barra inferior, columna 1). Por lo tanto, lo que queda del set de DNA del hijo (barra superior, columna 2) debe concordar con un set de DNA del padre. En este caso representado aqu, la concordancia entre el DNA del padre y el hijo es aparente (barra superior, columna 3) por lo tanto establece una paternidad probable.
Figura 2: Exclusin Madre A A A A A Hijo Supuesto padre A
Si un padre alegado es excluido, la probabilidad de paternidad es 0,0%. Si un padre alegado es incluido, entonces el ndice de paternidad para todos los sistemas genticos testados puede ser combinado.
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STRs MARCADORES MOLECULARES Se estudian 13 marcadores genticos altamente polimrficos (microsatlites) ubicados en los distintos cromosomas para determinar que alelos de cada microsatlite portan cada uno de los individuos y as conocer su genotipo.
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Resultados. Cdigo: PA. 09SP00__. Muestra: Sangre Perifrica. Tcnica: Microsatlite STRs. Fecha de toma de la muestra: P. Padre: Menor: Madre:
METODOLOGA: Extraccin de ADN de sangre perifrica, y anlisis a travs de 12 regiones STRs. Perfil gentico. MARCADORES ESTUDIADOS F13A01 FESFPS Vwa TP0X D16S539 D7S820 D13S317 HPRTB LPL F13B CSF1PO HUMTH01 P.Padre Alelos Madre Alelos
Hijo Alelos
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INTEPRETACION DE LOS RESULTADOS
MARCADORES ESTUDIADOS F13A01 FESFPS Vwa TP0X D16S539 D7S820 D13S317 HPRTB LPL F13B CSF1PO HUMTH01
P. Padre INTEPRETACION Alelos
Hijo INTEPRETACION Alelos
Madre INTEPRETACION Alelos
CONCLUSIONES ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _______________________________________________
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Prctica 4: CULTIVO Y PREPARACIN DE LINFOCITOS PARA ANLISIS CROMOSMICO

OBJETIVOS
Poner en prctica la tcnica estndar para el cultivo y la preparacin cromosmica. Contar la cantidad de cromosomas presentes en la metafase.
INTRODUCCIN
Un cariotipo es una fotografa actual de los cromosomas de cada clula. Las clulas analizadas son habitualmente clulas blancas de sangre (leucocitos) tomadas de un anlisis normal o de una muestra prenatal. Despus de colorear los cromosomas pueden ser vistos como cadenas de bandas con una ampliacin de 1.000. Son analizadas por experimentados tcnicos citogenticos, doctores citogenetistas o mdicos genetistas.
Citogenetista es una palabra para el estudio de los cromosomas. Despus de un anlisis bajo el microscopio se imprime una fotografa (cariotipo).
En un cariotipo de cromosomas pueden aparecer inclinados o torcidos. Esto es normal y es simplemente como ellos estn reunidos en el porta objetos. Los cromosomas son estructuras flexibles hechas de DNA. El orden del cdigo de DNA hace los genes. Los cromosomas son analizados en el momento del ciclo de la clula cuando ellos estn compactos. Durante otros momentos del ciclo de la clula los cromosomas se desenvuelven en largas cadenas de DNA. En este momento nosotros no podramos verlos bajo el microscopio. Si separsemos todos los cromosomas en largas cadenas de DNA habra ms de 7 pies de DNA en cada clula. Esto es sobre 80.000 millones de DNA como promedio en el cuerpo de un adulto.
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Forma en que se realiza el examen: El examen se puede realizar en una muestra de sangre, de mdula sea, de lquido amnitico o de tejido placentario. Los cromosomas contienen miles de genes que se almacenan en el ADN, el material gentico bsico. La muestra se deja crecer en un cultivo de tejido en el laboratorio y luego las clulas se seleccionan, los cromosomas se tien y se observan bajo el microscopio. Las clulas se fotografan para obtener un cariotipo que muestre la disposicin de los cromosomas. Ciertas anomalas se pueden detectar a travs de la cantidad o disposicin de los cromosomas. La dotacin cromosmica normal de la especie humana es de 46, XX para las mujeres y de 46, XY para los varones. En el cariotipo humano los cromosomas se ordenan de mayor a menor. Hay cromosomas grandes, medianos y pequeos. Al ordenar los cromosomas se constituyen 7 grupos atendiendo no slo al tamao sino tambin a la forma de las parejas cromosmicas, dentro del cariotipo humano podemos encontrar cromosomas metacntricos (tienen los dos brazos aproximadamente iguales en longitud), submetacntricos (con un brazo ms pequeo que otro) y acrocntricos (con un brazo corto muy pequeo). Concretamente en el cariotipo humano hay 7 grupos de cromosomas. Dentro de cada grupo vamos a ordenar y reconocer los cromosomas con la ayuda de un ideograma: Un ideograma es la representacin esquemtica del tamao, forma y patrn de bandas de todo el complemento cromosmico, los cromosomas se sitan alineados por el centrmero, y con el brazo largo siempre hacia abajo.
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Los grupos que comprende el cariotipo humano son los siguientes:
Cromosomas grandes
Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), metacntricos. Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacntricos
Cromosomas medianos
Grupo C, (cromosomas 7, 8, 9, 10, 11, 12 y adems los cromosomas X), Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocntricos submetacntricos
Cromosomas pequeos
Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacntricos Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocntricos, Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacntricos MATERIALES - 3ml de sangre perifrica (Heparina) - 3ml de medio de cultivo PBMAX - 30 ul de Colcichina (Colcemid) - Solucin hipotnica (KCL al 0.54%) - Fijador o carnoy (metanol+Ac. Actico 3:1) - Porta objeto - Tubos cnicos 15 ml PROCEDIMIENTO PROTOCOLO DE CITOGENENTICA - Gradilla - Cmara de CO2 - Bao Mara - Centrfuga - Pipetas pasteur
La muestra de sangre peroferica y la alcuota del medio de cultivo ( PBMAX )se deben mantener fuera del refrigerador, 30 minutos antes de iniciar el proceso Fases I FASE SIEMBRA 1. Se rotula el tubo de 15 ml que contiene la alcuota del medio de cultivo PB MAX, con los siguientes datos Nombre del paciente Fecha de iniciar el proceso Hora de iniciar el proceso 1. Se adiciona al tubo de 15 ml ,que contiene el medio de cultivo la cantidad de 50 ul de antibitico antimictico, la relacion es 10 ul de antibiotico antimictico por cada ML de medio de cultivo 2. Se recolecta con la micropipeta de 1000 ul la cantidad de 500 ul de sangre periferica, la cual ser depositada en el tubo cnico que contiene el medio, por las paredes del tubo y de manera muy lenta. 3. Este tubo que contiene la muestra de angre junto con el medio de cultivo, ser colocada en la cmara NUAIRE (INCUBADORA) por espacio de 70 horas a una temperatura de 37, en una posicin de 90 grados.
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COSECHA 4. Transcurridas las 70 horas, se retira de la INCUBADORA y se aade 30ul de Colcemid. Por espacio de 30 minutos y se lo devuelve a la INCUBADORA , que continua con la temperatura de 37 5. Transcurrido el tiempo antes indicado retiramos nuevamente el tubo conico que contiene la muestra y lo llevamos a la centrifuga. 6. Centrifugar la muestra por 5 minutos a 180g (1030rpm) 7. Con la ayuda de la pipeta pasteur procedemos a retirar el sobrenadante., quedndonos solo con el precipitado. 8. Se procede a disolver el botn celular con una solucin hipotnica, ( Cl K ), mezclando de manera continua y suave, cuidando de no provocar derramamientos. Nos podemos ayudar de las paredes del tubo cnico. 9. Una vez totalmente disuelto el botn celular, se lleva el tubo a la INCUBADORA, por espacio de 30 minutos. 10. A los quince minutos se saca de la incubadora y se mezcla nuevamente el contenido. 11. Al termino de los 30 minutos , se retira de la INCUBADORA 12. Se coloca 15 gotas de Carnoy y homegenizamos la muestra con la ayuda de la pipeta pasteur. 13. Luego colocamos en la centrfuga por 5 minutos. 14. Retiramos los tubos cnicos y procedemos a retirar el sobrenadante con cuidado de no llevarse el botn. FIJACION 15. Resuspender en 1ml de fijador CARNOY evitando que se haga grumos. Luego llevamos la solucin Carnoy hasta 6 ml. 16. Centrifugar por 5 minutos. 17. Repetimos estos dos ltimos pasos por 3 ocasiones mas 18. En la cuarta lavada el botn celular estar completamente transparente al igual que la solucin CARNOY. EXTENSION Los portaobjetos deben ser lavados con metanol al 100% , esto tiene el objetivo de eliminar la grasa que traen desde la fabrica. 19. Para poder realizar la extensin, resuspendemos el botn en medio milmetro de carnoy. Lo hacemos de manera continua lavando las paredes del envase para recoger los residuos que pudieran haber quedado, la informacin que se coloca en el porta es la siguiente Nombre del paciente (numero de caso) Numero de placa 20. Luego colocamos 3 gotas sobre el porta objeto balanceamos la placa para que la muestra se riegue por todo el porta. 21. Dejamos reposar el porta objeto por espacio de 4 dias, a ese periodo de tiempo se lo llama envejecimiento de placa
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TINCIN Giemsa al 4%: Para ver bandas oscuras .La solucin madre de giemsa es preparada al 1% p/v, disolviendo 1 gramo de giemsa en polvo con 50 ml. De glicerol y 50 ml. De metanol, agitando por 3 das, filtrando y dejando envejecer al menos por 1 semana; es necesaria durante todo el proceso protegerlo de la luz solar. La solucin de trabajo de giemsa es la que se obtiene al mezclar 4 partes de solucin madre de giemsa con 96 partes de buffer de Grr (4%v/v). El buffer de Grr se prepara disolviendo 1 pastilla de Grr en 1 litro de agua destilada. Son necesarios 100 ml. De giemsa al 4% para llenar un frasco coplin de tincin. Tripsina al 0.05%: Para ver bandas claras se prepara disolviendo 0.05 gramos de tripsina en solucin salina balanceada de Hanks 1X* (SSBH) ms 0.2 gramos de EDTA di sdico y 0.85 gramos de NaCl. El preparado debe congelarse a -20C, y antes de ser usado debe calentarse a 37C. Si no hay SSBH se reemplaza con una mezcla de buffer fosfatos: fosfato di sdico 0.067M (9.47 g. en 1 litro de agua), y fosfato monopotsico 0.067 (9.07g. en 1 litro de agua), los que se mezclan en igual cantidad.
RESULTADOS:
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BIBLIOGRAFA Len J., Garca J.M. 1992. Manual de Gentica Molecular. SINTESIS Ed. Madrid. Newton, C.R; Graham, A. 1994. PCR BIOS. Scientific Publishers Limited Oxford, United Kingdom. Strachan, T.; Read, A. 1996 Human Molecular Genetics. Bios Scientific Publishers Limited, UK. Thompson, N.W; McInnes, R.R; Willard, H.F. 1996. Genetics in Medicine.W.B.Saunders Company, Philadelphia, U.S.A. Verma, R; Babu, A. 1995. Human Chromosomes. Principles and Techniques. McGraw. Philadelphia. Gosden C.M; Davidson, C.; Roberstson, M. 1992. Lymphocyte culture. En: Human Cytogenetics A practical Approach, (D:E: Rooney y B:H Czepulkowski, eds.) Vol. I pp. 31-54. Irl Press Oxford, New York. Therman, E. 1980. Human Choromosomes, Springer- Velag, New York. U.S.A.
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