Bagian II

Teknik Aseptik
Definisi & Ruang Lingkup
„ Usaha untuk membebaskan lingkungan
dari kontaminasi mikroorganisme
„ Sumber Kontaminan :
„ Eksplan
„ Mikroba
„ Alat Kultur
„ Lingkungan kerja
„ Kecerobohan Pelaksanaan
Apa Saja yang perlu disterilkan ?

„ Lingkungan Kerja
„ Media dan Alat Kultur
„ Bahan Tanam (Eksplan)
TEKNIK ASEPTIK

MACAM BENTUK STERILISASI :

PANAS BASAH
PANAS KERING
KIMIAWI
UV
STERILISASI PANAS BASAH

…..DENGAN MENGGUNAKAN UAP AIR

AUTOCLAVE
HAMPIR SEMUA MIKROBA MATI PADA
SUHU 121 derajat
WAKTU TERGANTUNG VOLUME
Sterilisasi Media dan Alat

JENIS WAKTU SUHU

20 – 75 ML 15-20 MENIT 121 C

75 – 100 ML 20-25 MENIT 121 C

500 – 5000 ML 25-35 MENIT 121 C

ALAT GELAS/KERTAS 30 MENIT 121 C

STERILISASI PANAS KERING

MENGGUNAKAN OVEN

ALAT YANG TAK MUDAH TERBAKAR

(BAHAN GELAS)

(LAMA PEMANASAN 45 MENIT SUHU 160 C)

STERILISASI MEMAKAI NYALA

„ ALAT DICELUPKAN KE DALAM ALKOHOL 70 %

KEMUDIAN DIBAKAR

„ DIGUNAKAN SELAMA KEGIATAN INOKULASI

BAHAN KIMIA
„ DIPAKAI UNTUK MENSTERILKAN PERMUKAAN
SAJA EX. MATERIAL TANAMAN, INSTRUMEN,
TANGAN PEKERJA DAN RUANG ATAU KOTAK
TRANSFER

„ BAHAN KIMIA YANG BIASA DIGUNAKAN ADALAH

ALKOHOL, KALSIUM HYPOCHLORIDA, NATRIUM
HYPOCHLORIDA, HIDROGEN PEROKSIDA,
SUBLIMAT DAN CHLOROX
CAHAYA

„ DIGUNAKAN PADA RUANG DAN KOTAK

TRANSFER

„ MEMAKAI SINAR ULTRAVIOLET

Sterilisasi Lingkungan Kerja

„ Ruang Penabur
„ Sebelum dimanfaatkan disterilisasi dengan sinar UV
selama 1 – 1,5 jam
„ Entkas
„ Diberi formalin tablet terlebih dulu sebelum
digunakan
„ Dilakukan penyemprotan dengan formalin 10 % dan

alkoho 70 % (perbandingan : 1 : 1) selama 10 menit

Sterilisasi Lingkungan Kerja

„ R. Laminair air Flow

„ Disemprot dengan alkohol 70 %
„ Disinari lampu UV selama ½ - 1 jam sebelum penggunaan
Sterilisasi Media dan Alat
„ Dissecting set & Glass Ware :
„ Autoclave (121 C) sekitar 20 – 30 menit
„ Dissecting set lalu disimpan di oven dengan suhu

106 C selama beberapa menit

„ Dissecting set (pinset & Gunting)
„ Dicelupkan dalam alkohol 96% lalu dibakar terlebih

dulu sebelum digunakan

Sterilisasi Eksplan

„ Sterilisasi Secara Mekanis

„ Digunakan untuk eksplan yang keras
„ Dengan membakar di atas bunsen
„ Sterilisasi secara Kimiawi
„ Digunakan untuk eksplan yang lunak (jar. Muda)
„ Ex : daun, petiole, node, dll
Despatch Oven Company --- genus Bacillus

Rentang suhu yang mematikan : 120 C (40’)

hingga 140 C (180’)

Saran : 160 C selama 40 – 60 menit

Respon Kontaminan

„ Umumnya :
„ Bakteri : 2 x 24 jam
„ Fungi : 1 x 24 jam

„ Kontaminan Internal : hingga 1 bulan

Kontaminan
„ Bakteri
„ Jenis kontaminan yang sangat umum dijumpai
„ Umumnya terbawa melalui eksplan dan mampu
bertahan pada saat sterilisasi (surface sterilization)
„ Umumnya berada di dalam interior jaringan eksplan
„ Spora bakteri mungkin masih bisa survive meski
berada di permukaan eksplan

Bakteri dapat muncul setelah proses induksi

berjalan lama
 Kontaminan
„ Contoh Bakteri :
„ Agrobacterium, Bacillus,

Corynebacterium,
Enterobacter, Lactobacillus,
Pseudomanas,
Staphylococcus, and
Xanthomonas
„ Karakteristik dalam media :
„ Membentuk gumpalan lumpur

berwarna di permukaan media,

putih, kuning, pink
 Kontaminan
„ Fungi
„ Umumnya terbawa dengan

eksplan atau spora yang

beterbangan lalu masuk ke
dalam media saat inokulasi
„ Terbawa dengan eksplan :

sebagai patogen
„ Penampakan berupa bulu-

bulu halus yang tampak

kabur
„ Bermacam warna
 Jenis Kontaminan
„ Initial Contaminant
„ Terjadi karena proses sterilisasi yang kurang optimal
„ Atau karena material kultur yang terlalu kotor
„ Eksplan berasal dari lapang / greenhouse
„ Akan muncul beberapa hari setelah inokulasi
„ Bakteri : gumpalan lumpur ; fungi : bulu halus
„ Latent Contamination
„ Umumnya dari golongan bakteri
„ Terdeteksi dalam waktu yang lama
„ Keberadaannya bersifat endogen dalam jaringan eksplan
„ Introduced Contamination
„ Lingkungan kerja yang tidak steril
Laminair Air Flow
„ HEPA (High Efficiency
Particulate Air) :
„ partikel < 0,3 micrometer
 Alat Kultur dari Plastik

„ Ada yang tidak tahan terhadap panas dan tekanan

tinggi
„ Bahan Plastik tahan sterilisasi :
„ Polypropilene
„ Polymetilpentane
„ Polyallomer
„ Polycarbonat (selama 20 menit)
„ Bahan Plastik yg sama sekali tidak tahan :
„ Polystyrene
„ Polyvinyl Chlorida
„ Arcilic
„ Polyetilen