NDICE DE CONTENIDO

GENERALIDADES DE LA MICROBIOLOGA ____________________________ 4

Membrana citoplasmtica bacteriana _________________________________________ 4 Pared bacteriana___________________________________________________________ 4 Endospora bacteriana ______________________________________________________ 4 Metabolismo microbiano ____________________________________________________ 5 Crecimiento microbiano_____________________________________________________ 5

INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL __________________ 6 MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL _______________________ 7 MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES ______________________________________________________ 9 BSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS ______________________________ 10 MEJORA DE CEPAS DE INTERS INDUSTRIAL ________________________ 12 SUSTRATOS PARAMICROBIOLOGA INDUSTRIAL _____________________ 15
Sustratos usados como fuentes de carbono ____________________________________ 15 Sustratos usados como fuentes de nitrgeno ___________________________________ 16

MTODOS DE FERMENTACIN A GRAN ESCALA______________________ 17

Modos de operacin del biorreactor __________________________________________ 17 Biorreactores_____________________________________________________________ 17 Tipos de biorreactores _____________________________________________________ 18 Instrumentacin y control del proceso ________________________________________ 18 Escalado_________________________________________________________________ 19 Tcnicas de esterilizacin___________________________________________________ 19
Del medio de cultivo _____________________________________________________________19 Del aire de fermentacin __________________________________________________________19

Proceso fermentativo ______________________________________________________ 19

RECUPERACIN DE PRODUCTOS FINALES ___________________________ 20

Separacin de las clulas ___________________________________________________ 20
Filtracin ______________________________________________________________________20 Centrifugacin __________________________________________________________________20

Rotura celular ____________________________________________________________ 20 Aislamiento preliminar ____________________________________________________ 21 Purificacin ______________________________________________________________ 21 Secado __________________________________________________________________ 21 Recuperacin de productos de ADN recombinante______________________________ 21 Rendimiento _____________________________________________________________ 22

PRODUCCIN DE ALCOHOLES ______________________________________ 23

Procesos de produccin de etanol ____________________________________________ 23

Preparacin del sustrato___________________________________________________________23 Fermentacin ___________________________________________________________________23 Purificacin ____________________________________________________________________24

Produccin de acetona/butanol ______________________________________________ 24

PRODUCCIN DE CIDOS ORGNICOS _______________________________ 25

cido ctrico _____________________________________________________________ 25
Medio nutricional _______________________________________________________________25 Procesos de produccin ___________________________________________________________26 Procesos en superficie (o koji, del japons). _________________________________________26 Procesos sumergidos o en profundidad. ____________________________________________26 Purificacin ____________________________________________________________________26

cido actico _____________________________________________________________ 26

Produccin_____________________________________________________________________27 Mtodo Orleans _______________________________________________________________27 Mtodo alemn _______________________________________________________________27 Generadores por goteo o reactor Frigs______________________________________________27 Procesos sumergidos ___________________________________________________________27

cido lctico _____________________________________________________________ 27 cido mlico _____________________________________________________________ 27 cido fumrico ___________________________________________________________ 28

PRODUCCIN DE NUCLETIDOS, AMINOCIDOS Y VITAMINAS________ 29

Nucletidos ______________________________________________________________ 29
Hidrlisis enzimtica del ARN._____________________________________________________29 Hidrlisis qumica del ARN. _______________________________________________________29 Fermentacin del IMP. ___________________________________________________________29 Fermentacin del GMP.___________________________________________________________29 Sntesis indirecta:______________________________________________________________29 Sntesis directa________________________________________________________________30

Aminocidos _____________________________________________________________ 30
Glutamato _____________________________________________________________________30 Otros aminocidos _______________________________________________________________30

Vitaminas________________________________________________________________ 30
Riboflavina (B2)_________________________________________________________________31 Cobalamina (B12)________________________________________________________________31 cido ascrbico (C)______________________________________________________________31

PRODUCCIN DE ENZIMAS _________________________________________ 32

Produccin comercial ______________________________________________________ 32
Seleccin de cepas_______________________________________________________________32 Procesos de produccin ___________________________________________________________32 Sobre sustrato slido (procesos Koji) ______________________________________________32 Procesos en biorreactores _______________________________________________________32 Aplicaciones ___________________________________________________________________33 Detergentes.__________________________________________________________________33 Produccin de quesos. __________________________________________________________33 Procesado del almidn__________________________________________________________33 Industria papelera. _____________________________________________________________33 Elaboracin de zumos.__________________________________________________________33 Elaboracin de vinos. __________________________________________________________33 Industria textil ________________________________________________________________34 Sntesis orgnica.______________________________________________________________34

PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE ANTIBITICOS __________________ 35

Antibiticos -lactmicos ___________________________________________________ 35
Penicilinas _____________________________________________________________________35 Cefalosporinas __________________________________________________________________36 Nuevos productos _______________________________________________________________36

Antibiticos peptdicos _____________________________________________________ 36 Antibiticos carbohidratados _______________________________________________ 36 Antibiticos macroldicos___________________________________________________ 37 Tetraciclinas _____________________________________________________________ 37 Antibiticos aromticos ____________________________________________________ 37
Cloranfenicol ___________________________________________________________________37 Griseofulvina ___________________________________________________________________37

PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE VACUNAS _______________________ 38

Mtodos de produccin ____________________________________________________ 38
Sistemas tradicionales ____________________________________________________________38 Vacunas de subunidades (tcnicas de ADN recombinante) _______________________________38 Vacunas peptdicas ______________________________________________________________39

PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE PROTENAS TERAPUTICAS _____ 40

DNAsa __________________________________________________________________ 40 Eritropoietina (EPO) ______________________________________________________ 40 Somatropina _____________________________________________________________ 40 Insulina _________________________________________________________________ 40 Interfern _______________________________________________________________ 41 Interleuquinas ____________________________________________________________ 41 Activador del tejido plasmingeno ___________________________________________ 41 Colgeno ________________________________________________________________ 41

PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE SCP ____________________________ 42

Produccin de protena unicelular ___________________________________________ 42
Sustratos ______________________________________________________________________42 Procesos de produccin ___________________________________________________________43

Produccin de levadura para panadera ______________________________________ 43

GENERALIDADES DE LA MICROBIOLOGA
Microorganismo es todo organismo vivo que no es visible a simple vista: bacterias, algas, hongos, protozoos,... Se subdividen segn los tipos de estructura celular: Procariotas, que son las bacterias y arqueas (consideradas como bacterias simples y, por tanto, las menos evolucionadas). Eucariotas, que son hongos, levaduras, protozoos, algas,... Los virus merecen una mencin aparte dentro de esta clasificacin, ya que no pueden ser considerados seres vivos en el sentido estricto (no poseen metabolismo, son incapaces de autorreplicarse, etc.) La principal diferencia entre procariotas y eucariotas es que los procariotas, a diferencia de los eucariotas, no poseen ninguna estructura nucleada que agrupe el material gentico en una sola regin, sino que ste se halla disperso por el citoplasma bacteriano. Adems, los procariotas poseen una menor informacin gentica y carecen de estructuras membranosas que delimiten orgnulos internos de funciones diferenciadas. As, constan de una nica macroestructura que desempea mltiples funciones.

Membrana citoplasmtica bacteriana

La estructura y composicin son casi las mismas que en el caso eucariota. Sus funciones son: Transporte de molculas, efectuado por protenas transportadoras embebidas en la membrana. Contiene la cadena de transporte electrnico, que permite la fosforilacin oxidativa y la produccin de ATP. Interviene en fenmenos de quimiotaxis (movimiento inducido por ciertos compuestos qumicos, llamados quimioefectores), debido a que contiene receptores para los quimioefectores. Juega un papel fundamental en la biosntesis de molculas como lpidos o polisacridos. Excreta protenas que cumplen determinadas funciones en el exterior celular.

Pared bacteriana
Su principal funcin es dar rigidez a la bacteria, previniendo efectos osmticos adversos, como la plasmlisis, adems de preservarla de otras condiciones adversas. De hecho, una bacteria sin pared slo puede sobrevivir en un medio isotnico con su citoplasma. La pared celular es una estructura tridimensional basada en la repeticin de dos azcares (Nacetilglucosamida y N-acetilmurano NAG y NAM-), as como de un tetrapptido. La principal diferenciacin aplicada a las bacterias atiende al tipo de pared bacteriana: grampositivas o gramnegativas, o sea, sensibles o no a la tincin de Gram. En bacterias grampositivas, la estructura repetitiva es de gran tamao y compacta, con pocas molculas de otro tipo embebidas en la pared; mientras que en las gramnegativas es de tamao notablemente menor, poseen muchas molculas embebidas y presentan un denominado espacio periplsmico entre la pared bacteriana y la membrana plasmtica. As, una pared gramnegativa posee ms funciones que una grampositiva.

Endospora bacteriana
Ciertas bacterias poseen dos estados en su ciclo vital: como clula vegetativa y como espora, no dndose ambos estados simultneamente. El proceso de esporulacin (formacin de la espora) es bastante largo (810 horas). A diferencia con otras formas de vida, la espora no es un medio de reproduccin, sino un cambio fisiolgico. Las caractersticas ms importantes de la espora son: - Presentan una mayor resistencia a condiciones extremas: altas temperaturas, compuestos qumicos, desecacin, radiaciones,... - Presenta una actividad metablica casi nula. - Presenta una serie de capas de recubrimiento caractersticas: el exosporio, 3 cubiertas y el crtex. El exosporio y las cubiertas son proteicas, mientras que la otra es similar a la pared celular. - Prcticamente carece de agua, lo que le dota de resistencia trmica. - Contienen cido dipicolnico, que asociado a iones calcio, permite mantener la estructura. Esta sustancia es tpica de la endospora, ya que no se presenta en la clula vegetativa.

Contiene pequeas protenas cido-solubles (SASPs), que unidas al material gentico, disminuyen los daos causados en ste por las radiaciones ultravioletas y disminuyen las mutaciones. El estado de espora, causado por la aparicin de condiciones adversas en el medio, puede mantenerse por un tiempo ilimitado, hasta que un medio favorable induzca la germinacin de la espora (proceso muy rpido, ya que dura slo unos minutos). La esporulacin presenta dos aplicaciones fundamentales: - En la rama sanitaria, ya que dota a las bacterias de mayor resistencia a los tratamientos, por lo que, por ejemplo, la esterilizacin debe realizarse en condiciones ms crticas. - En la industria, se usan para sintetizar productos de inters.

Metabolismo microbiano
La diversidad en cuanto a rutas metablicas entre las bacterias es enorme. As, pueden obtener la energa de la luz (fototrofos) o de reacciones de ciertos compuestos qumicos (littrofos o quimiotrofos). Asimismo, la fuente de carbono puede ser compuestos inorgnicos (autotrofos) u orgnicos (heterotrofos). De este modo, los microorganismos pueden ser fotoautotrofos, quimioautotrofos o quimioheterotrofos (son muy raros los microorganismos fotoheterotrofos). Existe un metabolismo muy importante, el del nitrgeno, ya que son ciertas bacterias los nicos organismos capaces de efectuar las reacciones que permiten fijar el nitrgeno atmosfrico y convertirlo en las formas en que pueden asimilarlo el resto de los seres vivos. La forma de obtencin del ATP por parte de los microorganismos es muy variada: los organismos fotosintticos obtienen el ATP por fosforilacin, bien sea cclica para organismos que no producen oxgeno, o acclica para organismos que s lo producen. Los organismos respiratorios obtienen el ATP por fosforilacin oxidativa, ya sean aerobios o anaerobios. Los organismos fermentativos obtienen el ATP a travs de fosforilaciones a nivel de sustrato, por procesos oxidativos parciales.

Crecimiento microbiano
Se refiere al aumento del nmero de clulas de un cultivo. Este proceso se caracteriza por el tiempo de generacin, que es el necesario para que la poblacin se duplique. Este tiempo es variable segn la especie y los factores ambientales y nutricionales. Independientemente del tiempo de generacin, la curva de crecimiento microbiano es siempre la misma, dividindose en cuatro fases: - Fase Lag, de retardo o de adaptacin. Representa un tiempo variable dependiente de las condiciones del medio, y representa el tiempo que tardan los microorganismos en adaptarse a las condiciones del medio. Cuando finaliza, la clula est preparada para desarrollar su actividad y multiplicarse utilizando los recursos que el medio le ofrece. - Fase de crecimiento. Consiste en el periodo de mayor actividad de las clulas, as como una explosin demogrfica debido a las condiciones favorables del medio. - Fase estacionaria. Debido a la acumulacin de excreciones txicas al medio por la gran poblacin microbiana, as como el paulatino descenso de los nutrientes del mismo, las clulas van muriendo, hasta alcanzarse un equilibrio entre el nmero de clulas que nacen y las que mueren, por lo que el nmero de clulas permanece aproximadamente constante. - Fase de muerte. El equilibrio entre clulas que nacen y clulas que mueren se rompe, de modo que va disminuyendo el nmero total de clulas hasta alcanzar un mnimo aproximadamente constante.

INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Desde tiempos ancestrales se han obtenido productos en cuya fabricacin han intervenido los microorganismos, aunque no se haya tenido conciencia de ello, como ocurra con la fabricacin de queso, vino, yogur, cerveza, etc. La primera prueba de la existencia de microorganismos se debe a los "animlculos que Leuweenhoek observ gracias a su sistema de lentes en el siglo XVIII. Sin embargo, no fueron estudiados hasta el siglo siguiente por Pasteur. Los primeros procesos industriales que aprovecharon la accin de microorganismos fueron procesos de obtencin de alcohol y cidos lctico y ctrico, entre otros, a principios del s. XX. La Primera Guerra Mundial potenci la fabricacin de otros productos necesarios para la guerra por va microbiana, como glicerol o acetona. Sin embargo, es en la Segunda Guerra Mundial donde la necesidad de antibiticos, descubiertos poco antes, da el impulso definitivo al estudio de las capacidades industriales de los microorganismos. As, en los aos 70 se perfeccionan las tcnicas de inmovilizacin de clulas para aumentar el rendimiento econmico de los cultivos (en medios slidos, la vida media de los cultivos es mucho mayor, adems de que facilita la separacin del producto), as como los cultivos en continuo y el conocimiento en procesos anaerobios. La Biotecnologa surge a finales de los 70 como punto de unin de diversas ciencias con el fin comn de aprovechar los organismos vivos y sus cualidades para obtener beneficios econmicos. Se aplica fundamentalmente a microorganismos, debido a sus peculiares caractersticas: Elevada tasa de desarrollo, o sea, que en poco tiempo de cultivo son capaces de iniciar la produccin al mximo de sus capacidades. Toman como base para su crecimiento sustratos econmicos. Contemplan una amplia diversidad metablica, lo que supone un alto nmero posible de productos y sustratos. Sencilla manipulacin gentica, debido al relativamente pequeo tamao de su ADN. Esto permite que, por tecnologas de ADN recombinante, se pueda mejorar la produccin, o incluso incorporar a los microorganismos de la maquinaria enzimtica suficiente como para producir sustancias ajenas a ellos, como hormonas humanas. Tambin con estas tcnicas se pueden obtener cepas capaces de degradar productos xenobiticos (productos no degradables de origen humano), entre los que destacan los Pseudomonas. Dentro de la biotecnologa, destacan dos ramas principales: La Biotecnologa tradicional, que se basa en la mejora de procesos ya establecidos, como la produccin de etanol, cidos orgnicos o antibiticos. La nueva biotecnologa, que se basa en tcnicas de ingeniera gentica para obtener nuevos productos, o bien para obtener productos ya conocidos por vas alternativas. La biotecnologa, sin embargo, supone un problema tico y legal importante, ya que la modificacin del material gentico de los microorganismos puede conducir a consecuencias inesperadas y potencialmente peligrosas. Por ello, la legislacin impone unas restrictivas medidas de seguridad con el fin de impedir la liberacin de cepas modificadas al medio ambiente, dado que se desconocen sus efectos a largo plazo. Existe una amplsima diversidad de microorganismos, entre los que se puede llevar a cabo casi cualquier reaccin metablica. Sin embargo, y a pesar de su abundancia, slo unas pocas presentan actualmente inters industrial, por lo que la bsqueda de una determinada especie con unas ciertas caractersticas es bastante compleja. Adems, las necesidades industriales son demasiado elevadas, por lo general, para los microorganismos. Es por ello que las cepas salvajes son sometidas a diversas alteraciones con el fin de inculcar a stas las caractersticas buscadas. Por ello, las cepas industriales pueden ser muy diferentes de las salvajes originales, y deben patentarse en alguna de las colecciones de cultivo existentes por el mundo.

MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL

La principal caracterstica de los microorganismos es su elevada razn superficie / volumen (debido a su reducido tamao). Esto supone una gran capacidad de absorcin y sintetizacin de sustancias; en definitiva, una mayor tasa metablica. Otras caractersticas importantes de los microorganismos usados en industria son: Disponibilidad de cultivos axnicos (o sea, de una especie pura, sin presencia de otras clulas de otras especies diferentes). Son estables genticamente en el tiempo, a pesar de que hayan sido modificadas genticamente en el proceso de obtencin de la cepa industrial. Esta caracterstica es importante, ya que una vez que se altera el material gentico, son frecuentes las mutaciones. Dado que las condiciones del medio de cultivo son variables (por tratarse de cultivos a gran escala), las cepas han de ser capaces de crecer aunque las condiciones no sean las ptimas ideales. Por lo general, son especies capaces de producir esporulacin, lo que facilita su manejo e inoculacin, adems de que facilita su conservacin al hacerlas ms resistentes. Son de rpido crecimiento, lo que permite iniciar la produccin en periodos cortos de tiempo. Pueden crecer en medios lquidos de bajo coste, que por lo general son residuos de otras industrias, como melazas. Sin embargo, esto presenta a su vez un inconveniente: son sustratos complejos y difciles de metabolizar, lo que requiere una modificacin gentica adicional de las cepas. Las cepas utilizadas han de carecer de carcter patgeno, para minimizar los riesgos en caso de que alguna clula viva escapara del fermentador al medio ambiente o al consumo. Es preferible que el tamao de las clulas sea el mayor posible, ya que esto facilita la separacin de las clulas del producto. Esto se debe a que los procesos de separacin son, por lo general, filtraciones o centrifugaciones, por lo que cuanto mayor sea el tamao, ms facilitada est la separacin. Deben ser ms o menos fciles de manipular genticamente, lo que permite una mayor facilidad de obtencin de las cepas industriales buscadas. As, ciertas especies, como Esclerichia coli, son bastante ms fciles de manipular que otras. Los principales usos de las distintas clases de microorganismos son: Industria panadera Bebidas alcohlicas Fuente de vitaminas y de protena unicelular (SCP, importante complemento diettico de bajo coste, de Levaduras gran importancia en zonas con carencias de alimentos). Sntesis de protenas de origen no microbiano, tales como ciertas hormonas. Setas, derivados de soja y ciertos quesos Produccin de diversas enzimas, como pectinasas (tiles para la elaboracin de zumos). Hongos Sntesis de cidos orgnicos (sobre todo, ctrico y filamentosos lctico). Sntesis de antibiticos, como la penicilina. Sntesis de alcaloides, con diversos fines teraputicos. Lcticos Embutidos y conservas Bacterias lcticas (el Probiticos (productos Bacterias grupo ms importante) de efectos beneficiosos para la salud) cido lctico

Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis

Aspergillus niger (sobre todo en sntesis de cidos orgnicos) Penicillium notatum

Actinomicetos (similares a hongos por morfologa y tipo de crecimiento, presentes en suelos) Bacillus

Antibiticos Enzimas Inhibidores enzimticos

Corinebacterias, utilizadas en industria quesera y en sntesis de potenciadores de sabor

Clostridium (organismos estrictamente anaerobios)

Antibiticos peptdicos Bacillus thuringiensis Enzimas proteasas Insecticidas Sntesis de disolventes Degradacin de sustratos complejos en combinacin con otras especies de microorganismos

MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN MICROORGANISMOS INDUSTRIALES

DE

Dado el alto coste de obtencin de las cepas industriales, se requiere la adopcin de tcnicas de conservacin apropiadas que permitan preservar sus propiedades. No existe un nico mtodo, ya que cada especie presenta sus preferencias de conservacin: Subcultivo. Consiste en el paso de un inculo de un cultivo agotado en otro fresco (preferentemente, slido). No es la ms apropiada para la industria, ya que presenta tres grandes inconvenientes: El tiempo de persistencia de las clulas es, por lo general, bastante bajo. Este tiempo puede aumentarse por refrigeracin a unos 4 C. Se puede producir contaminacin fcilmente, dada la alta frecuencia de manipulacin. Debido a la manipulacin continua, aumenta el riesgo de variabilidad gentica en la cepa. Desecacin. Consiste en la eliminacin de agua del microorganismo, reduciendo as el metabolismo. Para evitar que el proceso de desecacin dae las clulas, se aaden compuestos protectores. El proceso se produce a temperatura ambiente una vez aadidos los protectores. Finalizado el proceso, se sella el cultivo y se conserva en refrigeracin. Un mtodo alternativo es el del L-secado. Consiste en pequeos discos gelatinosos que se impregnan con el cultivo lquido y se secan por un proceso activo (temperatura, etc.). Al igual que antes, al finalizar el proceso, se sella y se lleva a refrigeracin. Congelacin. Segn la tcnica empleada, la temperatura de congelacin vara. Se usan congeladores normales (unos 30 C), industriales (-70 C) o nitrgeno lquido (hasta 200 C). Cuanto ms baja sea la temperatura, mejor es la conservacin, pero tambin es mayor el coste. Para evitar la formacin de cristales en el interior de las clulas, que pueden producir daos en sus estructuras, se usan dos tcnicas: Adicin de compuestos protectores, como dimetilsulfxido. Congelacin lenta, de modo que se formen primero los cristales en el medio exterior. Esto provocar la prdida de agua de la clula por smosis. El inconveniente de este mtodo es el gran aumento de la concentracin de sales en el proceso de descongelacin, a la que las clulas pueden ser muy vulnerables. Para evitarlo, se usan medios de congelacin poco salinos. Liofilizacin. Se hace una congelacin previa antes de pasar al liofilizador. En l, el agua se sublimar por bajada de presin y el cultivo microbiano queda en el seno de una matriz porosa protectora (que por lo general es leche descremada o sacarosa). Debido a las caractersticas del mtodo, se sella a vaco. Este mtodo, junto con la congelacin, es el ms valorado, ya que permite unos tiempos de conservacin bastante altos. Subcultivo Desecacin Congelacin Liofilizacin Escasa supervivencia y Saccharomyces - Para levaduras, 50 % - Para levaduras, hay una de supervivencia y alta supervivencia aceptable alta variabilidad cerevisiae. y alta estabilidad gentica. - Para esporas de mohos estabilidad gentica. y tambin - Para mohos, se usa la gentica. congelacin en - Para esporas de mohos, actinomicetos, da buenos resultados suspensiones en tierra, nitrgeno lquido. Actinomicetos y arena estril o silica gel. - En bacterias lcticas, - En tierra o arena da buenos resultados en clostridios. lquido estril, da resultados nitrgeno de una intermedios en precedida actinomicetos y desecacin. Actinomicetos y clostridios. clostridios

BSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS

Es costosa la bsqueda de nuevos productos o microorganismos capaces de producirlos; ya sean especies nuevas o especies modificadas. El potencial del mundo microbiano en este aspecto es enorme: slo el 1% aproximadamente de las especies microbianas es conocido con cierta profundidad como para conocer sus intereses potenciales. As, por ejemplo, cuando sometemos una cepa salvaje a mejora gentica para obtener la cepa optimizada para su uso industrial, no todas las clulas sufren el proceso de mutacin, y las que lo siguen, no lo hacen todas de la forma deseada. Por ello, es necesario emplear programas de seleccin, que permiten separar las clulas que nos interesan del resto del cultivo. Por definicin, la seleccin o screening consiste en la aplicacin de procedimientos altamente selectivos para detectar y aislar exclusivamente las clulas o metabolitos de inters a partir de una gran poblacin de microorganismos distintos. Presenta dos problemas principales: es muy complicado identificar el producto o cepa de inters, y una vez obtenida la cepa aislada, hay que mejorarla y preservarla de futuras alteraciones. Para este proceso, existen diversas tcnicas de seleccin (las dos primeras para seleccionar un microorganismo concreto y las otras dos para obtener un nuevo producto o una va alternativa de sntesis de un producto ya conocido, con rendimientos ms elevados y dotando a los productos de ciertas caractersticas importantes, como ismeros puros, etc.): 1. Seleccin ambiental. Es la ms tradicional. Consiste en obtener la cepa de su hbitat comn en la naturaleza. Una vez hallado el microorganismo en su hbitat, es necesario establecer los mtodos de separacin apropiados para obtener la cepa de inters de forma rpida y con la mayor selectividad posible. 2. Seleccin de cepas mejoradas genticamente. La creacin de nuevos genomas microbianos utiliza tcnicas de ingeniera gentica, y permite obtener cepas con nuevas caractersticas o con caractersticas propias mejoradas y potenciadas. Existen dos mtodos de separacin de cepas: a. Escrutinio al azar. Requiere realizar ensayos de cultivo de todas y cada una de las clulas tratadas, lo que supone un alto gasto econmico y temporal. Este gasto puede disminuirse si se efecta la siembra sobre discos de agar, lo que permite cultivar varias clulas, en discos separados, en la misma placa Petri y simultneamente, para poder separar las que presenten la cualidad buscada (aunque no sea posible analizar cuantitativamente dicha caracterstica, para lo que hay que pasar a cultivos lquidos individuales). b. Escrutinio racional. Consiste en la observacin de alguna caracterstica secundaria asociada a la actividad buscada y fcilmente observable, como resistencia a antibiticos o degradacin de compuestos cromgenos (como por ejemplo, los mecanismos de degradacin de la lactosa, a los que se pueden aplicar compuestos coloreados). A travs de factores ambientales a los que sean sensibles las clulas que no posean la caracterstica buscada, podremos ir eliminando las clulas no modificadas. La creacin de los nuevos genomas puede hacerse por diversos mtodos: Mutagnesis. Es una tcnica aplicable a cualquier tipo de microorganismo. Consiste en la adicin de una agente mutgeno, y esperar su accin sobre las clulas. El problema de esta tcnica es que la mutacin producida es al azar, por lo que puede darse cualquier tipo de variacin sobre cualquier gen (o sobre varios de ellos), por lo que puede no darse si quiera la caracterstica buscada. As, lo que interesa, al menos, es limitar la mutacin al gen que queremos modificar, lo cual no es fcil de conseguir. Reproduccin sexual. Sera la ms adecuada, debido a que es una fuente natural de variabilidad gentica. Sin embargo, es el medio de reproduccin menos frecuente entre los microorganismos, por lo que slo puede aplicarse a ciertos hongos. Reproduccin asexual. Se distinguen varios mtodos, en funcin del microorganismo al que se pretenda cambiar el material gentico. Estos procesos requieren que el DNA introducido y el celular sean de estructuras similares, y se favorece cuando hay coincidencias en la secuencia (se facilita el trabajo de las enzimas de restriccin usadas en estos procesos, que son las que usan bordes complementarios en los fragmentos unidos). Dichas tcnicas son: Consiste en la penetracin de DNA libre presente en el medio en Bacterias Transformacin el interior celular. (mecanismos que introducen material Consiste en la introduccin de DNA extrao en la clula a travs Transduccin gentico extrao en de su infeccin por un virus bacteriano.

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la clula)

Consiste en la formacin de un puente fsico entre dos bacterias (una de ellas debe tener pili para que esto sea posible). En general, se transfieren plsmidos entre las dos clulas; pero como en ocasiones los plsmidos estn fusionados con el cromosoma Conjugacin bacteriano, al producirse la escisin del plsmido, puede haber errores, intercambindose fragmentos del DNA bacteriano entre las bacterias. Esto genera mutaciones en las dos clulas por recombinacin del DNA. Hongos Recombinacin Se debe al proceso natural de reproduccin sexual que siguen filamentosos mittica estos microorganismos. Los protoplastos son clulas sin pared celular, ya que dicha pared es la principal barrera al paso de DNA. Sin embargo, son clulas mucho ms sensibles, sobre todo a fenmenos osmticos, por lo que hay que cuidar que el trabajo sea en medios isotnicos. Se obtienen por procesos qumicos o enzimticos (ms concretamente, con lisozimas). Fusin de Para que los protoplastos se fusionen, hay que disminuir las Especies con gran protoplastos repulsiones electrostticas entre sus membranas citoplasmticas dificultad para (con carga negativa), por lo que se hace necesario aadir agentes, modificar su como etilenglicol, que disminuyan dicha repulsin. Tambin se material gentico favorece dicho proceso adicionando Ca2+, de modo que las clulas pasan al llamado estado competente (mayor disposicin a la entrada de DNA). Es una tcnica muy rpida y de buenos resultados. Se aplican Electroporacin pequeas y breves corrientes elctricas al cultivo, con lo que (para hongos) aparecen temporalmente poros en las cubiertas celulares, lo que facilita la entrada de DNA. 1. Modificacin qumica. Consiste en usar un metabolito microbiano como precursor de una reaccin qumica ajena al microorganismo, a travs de la cual se convierte en producto mejorado. Biotransformacin. Consiste en sintetizar un producto qumico para que luego el microorganismo efecte alguna reaccin enzimtica sobre l y as transformarlo en producto.

2.

Las clulas producen dos tipos de compuestos qumicos: metabolitos primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que la clula produce porque son imprescindibles para efectuar sus funciones vitales; mientras que los secundarios son aquellos que la clula produce y no son vitales para que ella realice sus funciones vitales, aunque en determinadas condiciones la sntesis de estas sustancias le confiera algn beneficio. En general, los productos de inters industrial son metabolitos secundarios, por lo que es importante conocer los detalles del proceso de sntesis, para poder mejorarlo y aumentar la produccin. Las principales caractersticas de los metabolitos secundarios son: Suelen ser producidos en exclusiva por un nmero limitado de especies, por lo general relacionadas entre s. Las condiciones ambientales determinan mucho su sntesis. En general, las rutas metablicas que los sintetizan estn reguladas por mecanismos distintos a los de los metabolitos primarios y son, por lo general, ms complejos. Algunos metabolitos secundarios se obtienen como una familia de sustancias estrechamente relacionadas. La teora ms aceptada sobre el origen del metabolismo secundario es la de Zhner. Segn sta, el metabolismo secundario es un campo de pruebas de la clula. As, cuando una determinada sustancia producida por dicho metabolismo resulta beneficiosa para la clula, se mantiene la informacin gentica que define la ruta metablica que la origina, dando lugar a una nueva caracterstica de la especie. De este modo, cuando un metabolito secundario otorga a una clula una gran ventaja sobre otras que no lo tienen, ste pasa a ser un metabolito primario.

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MEJORA DE CEPAS DE INTERS INDUSTRIAL

No todas las especies presentan la misma disposicin a la modificacin gentica, en funcin de la especie de microorganismo y la complejidad de la informacin gentica requerida por la caracterstica que queremos incorporar al microorganismo (nmero y tipo de genes; cuantos ms genes estn implicados, y ms dispersos se hallen en el genoma, ms complicada ser la regulacin y control del proceso). Las principales razones que llevan a realizar los procesos de mejora gentica, influyentes todos en la economa del proceso, son: Incrementar la baja produccin que se obtiene a partir de cepas salvajes. La dificultad de este proceso depende de la complejidad de modificar los genes que rigen el producto. Adecuar las caractersticas del microorganismo a las condiciones ambientales del lugar donde se lleve a cabo la fermentacin: requerimientos de oxgeno (ya que, por lo general, los microorganismos utilizados son aerobios, cuanto mayor sea el requerimiento de oxgeno, ms caros y complejos son los equipos, por lo que interesa disminuir el consumo de oxgeno o, al menos, optimizarlo al mximo), disminuir el tiempo de fermentacin (permite efectuar una produccin mayor en menos tiempo) o aumentar la capacidad del microorganismo para nutrirse satisfactoriamente de un sustrato ms barato. Eliminar la sntesis de compuestos colaterales para aumentar la pureza del producto, o a lo sumo, disminuir la produccin de stos, para facilitar su separacin. Obtencin de microorganismos capaces de sintetizar productos de inters biolgico que no sean de origen microbiano, mediante las tcnicas de DNA recombinante. La recombinacin es el proceso que permite aumentar la variabilidad gentica por medio de la unin de la informacin gentica contenida en dos genotipos. Esto se consigue mediante: - Sustitucin de alelos mutantes desfavorables tras diversos ciclos de mutacin. Dado que cuanto ms se manipula un microorganismo mutado, mayor es el riesgo de que la mutacin degenere. Por ello, es necesario mantener clulas mutadas originales en reserva sin utilizar, para poder cruzarlas posteriormente con las clulas alteradas para recuperar las caractersticas originales. - Unin de diferentes alelos que generan cantidades crecientes de metabolito, mejorando los resultados de la mutacin. Esto, sin embargo, obtiene resultados inferiores a los tericos posibles, debido a que posiblemente se alteren otras caractersticas celulares que hacen disminuir el rendimiento posible. - Recombinacin con cepas salvajes que suelen tener mejores caractersticas fermentativas. Esto se debe a que, en ocasiones, al alterar las caractersticas que nos interesan, se alteran caractersticas originales que afectaban a la eficiencia del proceso de fermentacin. As, por recombinacin con clulas de la cepa original, dichas caractersticas pueden recuperarse. Adems de alterar los mecanismos celulares para la obtencin del producto que nos interese, es necesario conocer las posibilidades de regulacin de la ruta que lo produce. Estos mecanismos pueden ser: 1. Regulacin de la actividad enzimtica. La regulacin a este nivel puede producirse, a su vez, a travs de varios mecanismos distintos: - Retroinhibicin. Consiste en que uno de los productos de la ruta metablica acta como inhibidor de una de las enzimas (por lo general, de las primeras de la ruta) una vez que alcanza cierta concentracin en la ruta. Cuando la ruta es ramificada, entonces puede darse de varias formas: i. El producto final de cada ruta hija acta como inhibidor de la primera enzima que ya no efecta una reaccin comn al resto de las rutas relacionadas. ii. La primera etapa de la parte comn de la va metablica est regulada por distintas isoenzimas, que estn reguladas de forma independiente. iii. En el caso de inhibicin multivalente, la inhibicin de la ruta se consigue slo cuando todos los productos finales en los que desemboca alcanzan la concentracin necesaria. iv. En el caso de la inhibicin acumulativa, la inhibicin sobre la ruta se produce tambin por todos los productos finales, pero no se requiere que

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todos alcancen la concentracin necesaria para detener la ruta, sino que el proceso es ms gradual. Carga energtica. Se define la carga metablica como:

C.E. =

ATP + 0.5ADP AMP + ADP + ATP

Cuando el valor de este cociente es prximo a 1, indica una gran cantidad de formas energticas del ATP, por lo que se activan las rutas que lo consumen (anablicas) al tiempo que se inhiben las que lo producen. Asimismo, cuando el valor se aproxima a 0, se inhiben las rutas anablicas y se activan las que lo producen (catablicas). - Degradacin de enzimas. Consiste en la degradacin de enzimas inducibles por medio de la accin de otras proteasas especficas. Las enzimas inducibles son aquellas que no estn siempre presentes en la clula, sino slo cuando, por determinadas circunstancias, se necesitan en un momento dado o aparece en la clula el sustrato sobre el que actan. Este mtodo de regulacin aparece, sobre todo, en clulas en la etapa de crecimiento estacionario. - Modificacin de enzimas. Consiste en la activacin o inhibicin de una enzima debido a cambios conformacionales reversibles causados por la unin o no de un determinado grupo qumico o molcula a la enzima. 2. Regulacin de la sntesis de enzimas. Existen tres mecanismos fundamentales de regulacin: - La induccin consiste en que el propio sustrato acta como activador del sistema gentico que codifica la enzima. Afecta, sobre todo, a enzimas inducibles. - La represin consiste en la detencin de la transcripcin de enzima por la accin inhibitoria del producto final que genera. - La atenuacin acta en conjunto con los 2 sistemas anteriores. Controla la sntesis de enzima modificando el ARNm que dara lugar a su sntesis. Afecta, por lo general, a las rutas de sntesis de aminocidos. 3. Exceso de produccin de metabolitos primarios. Los procesos de regulacin anteriores afectan, sobre todo, a metabolitos primarios, por lo que se usan para aumentar su produccin. Hay tres procesos para ello: - Eliminacin de la retroalimentacin: obtencin de mutantes auxotrofos. Un organismo auxotrofo para un determinado compuesto es aquel que no es capaz de sintetizar un producto que requiere para realizar sus funciones (algunos aminocidos, vitaminas,...), por lo que han de suministrarse en el medio de cultivo. As, si eliminamos la capacidad de la clula para sintetizar una sustancia que acta como inhibidor del proceso que nos interesa, impedimos la inhibicin de la ruta. As, hemos de aadir el compuesto eliminado al medio de cultivo en cantidad suficiente como para que no se detenga el crecimiento celular pero tampoco la ruta deseada. - Obtencin de mutantes resistentes a antimetabolitos. Un antimetabolito es una sustancia de estructura tan similar a la de un metabolito que es capaz de unirse a la enzima, pero sta no es capaz de usarlo como sustrato para su reaccin. As, el producto de inters debe ser anterior en la ruta al punto de insercin del antimetabolito. Para evitar la detencin del crecimiento celular, podemos hacer que la clula no requiera el producto final de la ruta o bien dotarla de capacidad para actuar sobre el antimetabolito. - Convertir una enzima inducible en constitutiva. Este proceso permite que un producto que no es siempre requerido por la clula salvo cuando aparece el sustrato en el medio est siempre activo. 4. Regulacin y superproduccin de metabolitos secundarios. Estos metabolitos son ms complejos de regular, ya que estn controlados por cuatro tipos de genes. A pesar de ello, se regulan por los mismos mecanismos que los primarios, destacando la obtencin de cepas auxotrofas y la eliminacin de compuestos colaterales. Los genes implicados son: - Estructurales, que codifican las enzimas implicadas en la sntesis del compuesto. - Regulatorios, que estn implicados en el metabolismo primario, pero pueden tener ciertos efectos laterales sobre el secundario. - De resistencia, que dan resistencia a la clula frente a la accin del metabolito secundario (en el caso de que ste presentara actividad antimicrobiana). - De permeabilidad, que controlan el transporte de sustancias hacia y desde la clula.

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Para evitar desechar cepas que puedan presentar caractersticas interesantes, es aconsejable efectuar tratamientos cclicos con distintos agentes mutgenos sobre las cepas mutadas. Para hacer una seleccin de mutantes selectiva, podemos adicionar antibiticos o antimetabolitos a los que slo la cepa mutada es resistente, por lo que slo ellas permanecen activas en el cultivo. Para el caso de auxotrofos se aplica la tcnica de los dobles cultivos: uno en medio completo (contiene todas las sustancias que pueda requerir la clula) y otro en medio mnimo, que no contiene los nutrientes necesarios para las especies auxotrofas (por lo que stas no se desarrollarn). La tcnica consiste en que las colonias de microorganismos estn en el mismo sitio en ambos medios; para ello, se usa un taco de madera de igual forma que el fondo del cultivo y recubierto de terciopelo. Una vez efectuado el cultivo sobre el medio completo, se impresiona ste en el terciopelo y se inocula ste en el medio mnimo. Por comparacin tras la incubacin de ambos cultivos, localizamos en el medio completo las colonias que no se han desarrollado en el mnimo, y que son las colonias auxotrofas. Para reducir el nmero de pruebas de este proceso y aumentar el nmero de auxotrofos de partida, es frecuente tratar primero la muestra con penicilina en medio mnimo. Como la penicilina acta slo sobre clulas en crecimiento, las cepas auxotrofas (que no se desarrollarn en medio mnimo) no se vern afectadas, mientras que el resto morirn. Otra forma de detectar los mutantes deseados es alterar algn carcter enzimtico que origine una propiedad fcilmente observable, lo que se consigue a travs de mecanismos genticos. La ingeniera gentica aplicada a la microbiologa industrial permite introducir secuencias especficas de DNA en una clula. Para ello, las etapas a seguir son: Obtener la secuencia gentica a clonar. Esto se realiza por accin de las endonucleasas de restriccin. Una vez delimitado el gen a clonar en el genoma, se hacen coincidir las zonas adyacentes al gen con las secuencias de corte de las distintas enzimas de restriccin, eligiendo la que mejor se ajusta al proceso. Insercin del gen en un plsmido, un fago o un csmido (plsmido que contiene los genes que codifican la sntesis de la cpsida de un fago ). stos sern los vehculos a travs de los cuales se introducir el DNA en la clula. Introduccin en la clula hospedadora. Para facilitar este proceso, se aumentar la competencia por presencia de iones calcio y/o electroporacin. Seleccin de mutantes. Las tcnicas de ingeniera gentica tienen diversas aplicaciones, sobre todo en biotecnologa (prevencin de enfermedades gnicas, obtencin de medicamentos,...) y proteccin ambiental (degradacin de productos xenobiticos, etc.).

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SUSTRATOS PARAMICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Las caractersticas de los procesos microbianos a escala industrial presentan grandes diferencias con los procesos a escala de laboratorio. Esto es particularmente crtico en lo referente a sustratos: en laboratorio, estn perfectamente definidos en cuanto a composicin, pureza, etc.; mientras que a escala industrial esto no es posible por no ser econmicamente viable, por lo que se utilizan generalmente residuos de otras industrias. Estos residuos han de cumplir los siguientes requisitos para poder ser usados como sustrato: Contener una fuente de carbono y nitrgeno suficientemente rica. Han de presentarse en formas asequibles por las clulas (no son vlidas todas las formas). Cierto contenido en oligoelementos y sales minerales, bsicos para que los microorganismos efecten sus funciones. Tamponadores de pH. Debido a la actividad microbiana, el pH del medio puede sufrir grandes variaciones, lo que puede llegar a inhibir el crecimiento microbiano. Para minimizar estos efectos, se aaden tampones. Su composicin ha de ser lo suficientemente equilibrada: sin exceso ni limitacin de ningn nutriente necesario. Si no fuese as, el metabolismo del microorganismo puede desequilibrarse hacia procesos que no son los habituales, lo que puede interesarnos o no, en funcin de si los productos producidos son los que buscamos. Los sustratos industriales presentan el gran inconveniente de que, por lo general, su composicin es desconocida y variable. Los sustratos se escogen, adems de por su composicin, por cercana a la zona, ya que as se disminuyen los costes de transporte.

Sustratos usados como fuentes de carbono

- Composicin muy variable, segn origen Presenta formas asimilables (caa o remolacha) y cultivo de la materia Residuos de las de carbono y nitrgeno, as prima (zona, clima, condiciones, etc.). plantas como sales y - Puede contener compuestos txicos de azucareras oligoelementos suficientes. microorganismos. Dada su composicin, se pueden producir condensaciones de Maillard durante el Proviene como Presenta fuentes de carbono proceso de esterilizado. Estas reacciones residuo del fcilmente asimilables se producen entre grupos amino y malteado de la (azcares sencillos), y carboxilo de protenas y azcares, dando cebada en la variadas y ricas fuentes de compuestos de degradacin muy fabricacin de nitrgeno (aminocidos, complejos. La consecuencia es la cerveza protenas y ppticos) disminucin de los nutrientes asimilables por los microorganismos. Es necesario degradarlos cuando los Son polmeros de azcares microorganismos carecen de las amilasas: que requieren la presencia por adicin de amilasas al medio de de amilasas especficas para cultivo, por hidrlisis qumica u obtencin su degradacin. de mutantes capaces de producir amilasas. Muchos de ellos son Al igual que el almidn, la celulosa directamente aprovechables requiere de un sistema enzimtico especial por los microorganismos, para su degradacin. Si el microorganismo pero otros, como la no lo posee, es necesario proporcionarlo en celulosa, requieren el medio, efectuar una hidrlisis qumica o tratamiento especial. usar cepas mutadas capaces de degradarla. No son vlidos como nica fuente de carbono, aunque s como complemento de medios con bajo contenido en carbono. Son pocos los microorganismos capaces de utilizarlo. Se usa en Metanol produccin de protena unicelular y de ciertas vitaminas. Se usa principalmente para la obtencin de cido actico, aunque se Etanol estn adaptando procesos para sintetizar diferentes sustancias usndolo como sustrato.

Melazas

Extracto de malta

Almidn y dextrinas

Desechos de madera e industrias papeleras Aceites vegetales Alcoholes de bajo nmero de carbonos

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Alcanos de 12 a 18 carbonos

Son subproductos del petrleo, por lo que su mayor inconveniente es que su precio est determinado por el precio del petrleo. Slo son vlidos para unos pocos microorganismos.

Sustratos usados como fuentes de nitrgeno

En ocasiones, lo que se hace es enriquecer los sustratos con especies qumicas ricas en nitrgeno, como urea o nitrato amnico. - Es el extracto ms usado Se obtienen de levaduras, para el aporte de nitrgeno. Presentan los mismos Extracto de por plasmlisis (debido a la - Contienen una gran inconvenientes de adicin de gran cantidad de variedad en fuentes de composicin que las levadura NaCl) o termlisis. nitrgeno (aminocidos, melazas. pptidos,...) y carbohidratos. - Son bastante caras. Estados intermedios de Son ms homogneas en su - Su composicin vara Peptonas degradacin de protenas composicin que el extracto segn el origen, pero dentro de diversos orgenes. de levadura. de una misma clase, hay pocas diferencias. Se usan mucho como sustratos para la produccin de Harina de soja antibiticos, ya que son muy indicadas para los hongos y actinomicetos que efectan dichos procesos Lquidos de Procede de industrias Contiene fuentes muy ricas de nitrgeno fcilmente maceracin del alimentarias asimilables. maz

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MTODOS DE FERMENTACIN A GRAN ESCALA

Es preciso conjugar los aspectos microbiolgicos del sistema de produccin con los puramente tcnicos. A tener en cuenta: Aspectos microbianos Aspectos tcnicos - Coeficientes de rendimiento de produccin. - Eficiencia de la conversin del sustrato en - Velocidad de crecimiento del microorganismo (en producto (bsqueda de las condiciones ptimas). muchas ocasiones, predominante sobre el - Productividad lo ms elevada posible. rendimiento). - Obtencin del producto en la mayor concentracin - Tasa de produccin. posible, lo que facilita la recuperacin y purificacin. - Transferencia de materia y calor, de gran importancia, ya que diferencias mnimas pueden alterar gravemente la produccin.

Modos de operacin del biorreactor

1. Discontinuo. Es el ms utilizado por su sencillez. Se trata de sistemas cerrados en los que no se varan externamente las condiciones iniciales (lo que supone que la composicin del medio va variando continuamente en el tiempo conforme se desarrolla el cultivo), con la excepcin de: a. Adicin de antiespumantes, debido a que la espuma puede generar diferencias de temperatura y concentraciones dentro del tanque. b. Adicin de oxgeno. c. Adicin de buffers, para evitar las variaciones de pH originadas por la actividad microbiana, que pueden alterar el desarrollo microbiano y la produccin. Semicontinuo. El sustrato se aporta de forma secuencial (no todo el sustrato es aadido al principio). Se debe a que, en ciertos procesos, la concentracin de nutrientes ejerce efectos inhibitorios sobre el proceso o el crecimiento del microorganismo; lo que se evita haciendo un aporte secuencial de los nutrientes. Continuo. Se retiran productos y sustrato agotado al mismo tiempo que se aporta la misma cantidad de sustrato fresco. Para ello, cuentan con diversos sistemas que permiten conocer cundo se obtiene el nivel de produccin adecuado, para poder empezar a retirar caldo fermentativo e introducir sustrato fresco. Las clulas que quedan actan como inculos. Aunque tericamente es el rgimen de trabajo ideal, presentan numerosos inconvenientes tcnicos. Estos inconvenientes son, entre otros, que slo podemos conocer el nivel de crecimiento del microorganismo, y ciertos productos slo se sintetizan en la fase estacionaria, por lo que no sabemos cundo se habr alcanzado el nivel de produccin deseado. Adems, las condiciones ptimas para el crecimiento y para la produccin sern diferentes, lo que complica an ms el proceso.

2.

3.

Biorreactores
Estn fabricados en materiales capaces de mantener las condiciones ptimas de presin, temperatura, etc., que en la mayora de los casos es acero inoxidable. Los criterios bsicos de diseo de un biorreactor son: Caractersticas bioqumicas del cultivo a realizar. Caractersticas hidrodinmicas del reactor: es necesario minimizar los fenmenos de transporte en el reactor, para evitar gradientes de nutrientes, temperatura,... Cintica de crecimiento y produccin del microorganismo. Asegurar la estabilidad gentica del microorganismo, impidiendo que se estimulen mutaciones. Esterilizacin lo ms barata posible, hasta el punto de que, a pesar de su importancia, y segn el proceso, se llega a obviar. Control de las condiciones ambientales. Diseo y modo de operacin. Potencial para el escalado creciente de produccin. Inclusin de sistemas de oxigenacin adecuados a las exigencias del microorganismo.

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Sistemas de muestreo para determinar las condiciones internas del biorreactor. Adopcin de refrigeradores, para mantener constantes las condiciones de temperatura (la actividad microbiana genera una gran cantidad de calor, que puede afectar negativamente a la produccin). Materiales no txicos (ni para el microorganismo ni para el consumo). Capacidad para soportar altas presiones. Resistencia a la corrosin.

Los principales inconvenientes de la produccin en continuo: En ocasiones, la demanda del producto es estacional, por lo que la produccin en continuo genera grandes cantidades en stock. La vida til del producto puede ser limitada, por lo que no es viable el almacenamiento por tiempo indefinido. Es ms difcil obtener concentraciones altas, necesarias para la recuperacin y purificacin. Favorecen la mutacin de las cepas, ya que un grupo de clulas puede participar en varios ciclos de produccin.

Tipos de biorreactores
1. De lecho fijo o empaquetado. Los microorganismos se encuentran en una matriz empaquetada. Por lo general, la alimentacin se produce de forma vertical en sentido ascendente. En columna de burbujas. El sustrato es el medio lquido en el que estn inmersas las clulas, aportndose ste por la parte inferior del reactor. Se insufla gas comprimido por la parte inferior que, junto con una serie de bucles externos, permite homogeneizar el interior del reactor, suprimiendo posibles gradientes. De lecho fluidizado. No son muy corrientes, dados su alto coste y complejidad. El microorganismo permanece suspendido (debido a burbujeo continuo, lo que no es fcil de conseguir) en el fermentador, como consecuencia del sustrato lquido ascendente. De lecho de goteo. Son los ms tradicionales (similares a los de lecho fijo). El sustrato se hace pasar lentamente por la matriz empaquetada que contiene al microorganismo (un proceso semicontinuo, aunque permiten trabajar tambin en discontinuo), lo que supone la consideracin de un tiempo de residencia en dicha matriz. De enzimas o clulas inmovilizadas. Son los ms interesantes y novedosos. Los de enzimas presentan grandes ventajas, pero es difcil aislar la enzima que nos interesa. Permiten reutilizar continuamente el biocatalizador, disminuyendo los costes. Dicha inmovilizacin puede efectuarse por medios fsicos (adsorcin, el ms usado, o atrapamiento mecnico en matriz o membrana) o qumicos (enlaces covalentes). Presentan el inconveniente de que, dado que las clulas pueden participar en varios procesos fermentativos, aumenta la inestabilidad gentica.

2.

3.

4.

5.

Instrumentacin y control del proceso

La informacin aportada por estas variables permite conocer la marcha del proceso fermentativo, y por lo tanto permite conocer las condiciones ptimas para la produccin. 1. Temperatura. Influye en la cintica de las reacciones, y la estabilidad y actividad enzimticas. En grandes fermentadores, es aconsejable disponer de diversos medidores. 2. pH. Afecta a la permeabilidad de la pared celular y al grado en que se producen las reacciones catalizadas por las enzimas presentes en ella. Los medidores son sencillos de manejar. 3. Oxgeno disuelto en el caldo de fermentacin. Los aparatos instrumentales son de difcil esterilizacin y baja fiabilidad, por lo que se mide como diferencia entre los flujos de entrada y salida. 4. CO2. Se usan electrodos de membrana o tcnicas espectrofotomtricas o cromatogrficas. 5. Sondas de enzimas inmovilizadas. Informan sobre el nivel de produccin de un determinado metabolito. Se usan sensores situados cerca de las enzimas inmovilizadas de inters. 6. Biomasa. Se obtiene indirectamente por balances de materia. La informacin suministrada por el procesado de los datos obtenidos permitir controlar el proceso de forma ms eficiente, aumentando la productividad, produccin y rendimiento.

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Escalado
Es el proceso de conversin de un proceso productivo de pequea escala a escala industrial. Las condiciones de produccin a pequea escala no son, por lo general, extrapolables a la escala industrial, debido a que la fluidodinmica del sistema, los procesos de transporte y el comportamiento celular son diferentes. Por ello, se aplica un proceso gradual, manteniendo una velocidad de transferencia de oxgeno constante, as como la potencia consumida por unidad de volumen, al tiempo que el tamao del cultivo se va aumentando en proporcin 1:10.

Tcnicas de esterilizacin
Del medio de cultivo
Se usan preferentemente mtodos trmicos y filtros. 1.- Esterilizacin discontinua. Consiste en la inyeccin de vapor a la camisa del fermentador o los serpentines internos, o bien la aplicacin directa del vapor sobre el medio de cultivo. Requiere grandes periodos de tiempo, es de alto coste (si no se puede reaprovechar el agua) y altera la composicin del medio. 2.- Esterilizacin continua. Consiste en la obtencin de altas temperaturas (140 oC) durante 120 s por inyeccin de vapor (intentando evitar su dilucin) o cambiadores de calor (evitando la formacin de depsitos de sales insolubles). Sus ventajas son que permiten reutilizar el agua y no alteran la composicin del medio.

Del aire de fermentacin

Se usan filtros profundos de lana de vidrio o de cartucho de fibra.

Proceso fermentativo
1. Preservacin del inculo por medio de prcticas de conservacin que permitan que las cepas mantengan su capacidad biosinttica. stas son, principalmente, el almacenamiento a baja temperatura (poco til), congelacin (aunque rpida, no es viable) o liofilizacin (consigue un mayor nmero de clulas viables al usar agentes protectores). Crecimiento del inculo, que consiste en la recuperacin de las clulas conservadas en condiciones adecuadas para su aplicacin industrial. Precultivo, que consiste en obtener la cantidad suficiente de clulas para poder usar como inculo en la fase de produccin. Si esto no se consigue, se producen menores concentraciones de producto y unos mayores tiempos de retardo de los esperados. Estas cantidades son entre 0.1 y 3% para bacterias, de 5 a 10% para hongos y actinomicetos y de 1 a 500000 esporas por litro de cultivo. Produccin. Se coloca el inculo en contacto con los nutrientes que le servirn de sustrato y las condiciones en las que crecer, estando stas en los rangos: Temperaturas para mesfilos (de 20 a 45 oC) y para sicrfilos (de 5 a 20 oC). Entre 0.25 y 1 vvm de O2. Sobrepresin (de 0.2 a 0.5 atm sobre la atmosfrica), lo que evita las contaminaciones. Agitacin en funcin del tamao del fermentador, ya que permite homogeneizar el medio de cultivo, pero si es demasiado alta puede inhibir el crecimiento bacteriano.

2. 3.

4.

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RECUPERACIN DE PRODUCTOS FINALES

Al finalizar la fermentacin, el producto de inters se encuentra en el caldo de fermentacin junto con numerosos compuestos que, en muchas ocasiones, presentan propiedades similares a ste, lo que complica la purificacin del compuesto final. Estas caractersticas de los fluidos biolgicos son: 1. Alta viscosidad y comportamiento no newtoniano del fluido, lo que dificulta la prediccin de propiedades. 2. Baja filtrabilidad, pobre sedimentacin y alta retencin de agua. 3. Baja estabilidad trmica y qumica. 4. Tendencia a formar emulsiones. As, los procesos de filtracin constaran, generalmente, de las siguientes etapas: Separacin y rotura de clulas para el caso de que el producto se genere de forma intracelular; si no es as, no es necesario. Aislamiento del producto. No se efecta de un modo muy estricto, por lo que slo consigue elevar en parte la concentracin del producto. Permite facilitar la posterior purificacin. Purificacin, donde se obtienen ya altas concentraciones de producto. Acondicionamiento, esto es, desecacin,... para comercializar o conservar el producto.

Separacin de las clulas

Filtracin
Se pueden usar dos tipos de filtros: de placa y malla (para volmenes pequeos) o continuos de tambor rotatorio a vaco (para volmenes grandes). Tambin hay que tener en cuenta el dimetro de las partculas; as, se usa la smosis inversa para partculas de 10-4 a 10-3 m o tamao molecular inferior a 1000; la ultrafiltracin para partculas de entre 10-3 a 0.1 m o tamao molecular superior a 1000; y microfiltracin para tamaos de partcula de entre 0.2 y 10 m. Las caractersticas de los filtros utilizados son: Resistentes, selectivos y de un determinado tamao de poro. Que permitan una alta velocidad de flujo. Con posibilidades de esterilizacin.

Centrifugacin
Es ms verstil, ya que se puede aplicar a ms casos y condiciones que la filtracin. Se usan sobre todo en panadera y produccin de protena unicelular (SCP). Los tipos de centrfuga ms usados son: De filtro de criba. En ellas, las suspensiones se proyectan sobre un material filtrante, lo que impulsa la filtracin a travs de la membrana. De cmara y disco, que separan las partculas en funcin de su gravedad especfica. Como las clulas son las ms pesadas, se depositan en la parte inferior. La gran ventaja de este tipo de centrfugas es que, adems, permiten efectuar separaciones lquido-lquido en funcin de la densidad.

Rotura celular
El proceso a seguir es: 1. Se diluyen las muestras en tampn. 2. Se efecta entonces la rotura: a. Tcnicas mecnicas (molienda). Consiste en molinos de cuchillo, bolas,...

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Tcnicas fsicas: ultrasonidos (rompen la estructura celular), desecacin violenta, homogeneizadores de alta presin o procesos cclicos de congelacin-descongelacin. c. Tcnicas qumicas: choque osmtico (plasmlisis de la clula al sumergirla en una solucin muy salina), detergentes, cidos, antibiticos, solventes,... d. Enzimas: lisozimas, autolisis (la clula sintetiza enzimas que degradan las cubiertas, lo que les provoca la muerte) o bacterifagos (provocan la lisis celular al infectar la clula). Las caractersticas fisiolgicas de cada organismo determinan el mtodo ms adecuado para su lisis (las bacterias Gram-, las levaduras y las clulas en fase estacionaria son ms resistentes); aunque en industria se prefieren los molinos de bolas y los homogeneizadores de alta presin.

b.

Aislamiento preliminar
Se aplican tres mtodos principalmente: 1. Extraccin. Permite separar el producto en funcin de su solubilidad en diferentes lquidos inmiscibles. Dichos disolventes han de ser econmicos, de baja volatilidad y viscosidad, no corrosivos y no alteren el producto. 2. Precipitacin. Consiste en la adicin de alguna sustancia en alta concentracin o modificar las condiciones, de modo que se provoca la precipitacin de compuestos. As, por ejemplo, los polisacridos pueden precipitar por adicin de alcohol, las protenas por alteracin del pH ms all del punto isoelctrico y en ocasiones por temperatura, aunque puede provocar alteraciones sobre el producto. 3. Adsorcin. Se usa para metabolitos hidroflicos (con capacidad para ionizarse). Consiste en hacer pasar el caldo de fermentacin por resinas de intercambio inico.

Purificacin
Se utilizan principalmente tcnicas cromatogrficas, que aunque son caras, son muy eficientes e inertes para los compuestos. Los tipos de cromatografa usados son: De exclusin molecular. De afinidad (adsorcin selectiva). De inmunoadsorcin, que usa el carcter antignico de los productos y una matriz de anticuerpos especficos, lo que le permite una altsima selectividad. De isoelectroenfoque, que consiste en modificacin del pH hasta alcanzar el punto isoelctrico de la protena, que al no disociarse se fija a la fase estacionaria de la columna cromatogrfica.

Secado
Es el punto final de la purificacin en la mayora de los casos. En el proceso no debe haber prdida de actividad. El caso ms extendido es el uso de calor hmedo, para posteriormente desprender la humedad por una corriente de gas. En el caso de que se requiera la presencia de clulas en el producto, se usa la liofilizacin.

Recuperacin de productos de ADN recombinante

Los productos obtenidos por este tipo de tcnicas muestran caractersticas que dificultan su recuperacin, debido a que los mecanismos para obtenerlos son construidos de forma artificial, no han sufrido todas las transformaciones o tratamientos a los que seran sometidos en una clula normal, lo que obliga a un tratamiento posterior. As, son procesos de separacin muy complejos y costosos, pero dado el alto valor de los productos, son altamente rentables. Aun as, los microorganismos y condiciones de la fermentacin deberan ser tales que se minimice la complejidad del proceso.

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Rendimiento
Las prdidas producidas en la purificacin del producto dependen del nmero de etapas de la purificacin y la sensibilidad del producto frente a este tratamiento. Aun as, el coste del proceso de purificacin suele ascender al 20% del total.

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PRODUCCIN DE ALCOHOLES
Dado que los residuos agrcolas son buenos sustratos para producir etanol (excepto el destinado a la alimentacin), los pases con grandes superficies cultivadas son los principales productores de etanol por va microbiolgica (EE.UU., Canad, Brasil,...). A nivel industrial, se sintetiza por levaduras y bacterias: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis o Zymomonas mobilis. Especficamente, la sntesis de etanol requiere de medios anaerobios, pero el crecimiento de las levaduras productoras necesita del oxgeno. Por ello, es necesario efectuar primero el crecimiento de las clulas en un medio aerobio para luego introducirlas en otro anaerobio y as comenzar la produccin. Bioqumicamente, la sntesis se produce por accin de la enzima alcohol-deshidrogenasa sobre el acetaldehdo obtenido por reaccin del piruvato. Tericamente, el rendimiento de la reaccin es elevado: 0.5 g de alcohol por gramo de glucosa, con una efectividad del 91-95%. El etanol puede inhibir el crecimiento celular cuando se alcanzan concentraciones del 5%, o incluso el proceso de sntesis (cuando la concentracin es del 10%). Para evitarlo, se puede efectuar destilacin a vaco o limitar los nutrientes.

Procesos de produccin de etanol

Preparacin del sustrato
Si se usa Saccharomyces cerevisiae y se proporciona un sustrato almidonado, hay que adicionar amilasas o hidrolizar dicho almidn (este microorganismo no puede hacerlo). Otros materiales azucarados, como melazas, jugos azucarados,... son adecuados, pero se usan ms para otros procesos. Celulosa: son difcilmente hidrolizables. Se usan cultivos mixtos sobre el sustrato slido de la levadura en cuestin con Clostridium thermocellum, Clostridium thermosaccharalyticum o Trichoderma reesei, capaces de efectuar dicha degradacin. Si se usan sueros lcticos, no se puede usar Saccharomyces, ya que es incapaz de degradar la lactosa. Se usan entonces cepas modificadas de Torula cremoris y Candida pseudotropoicalis.

Fermentacin
Se dan principalmente procesos discontinuos en tres fases: 1. Desarrollo celular: se somete el cultivo a fuerte oxigenacin durante 12-24 horas. 2. Sntesis. Se reduce la oxigenacin, lo que produce la reduccin del crecimiento celular y el inicio de la produccin durante 24-36 h. Como consecuencia del proceso, se libera calor, que puede elevar la temperatura hasta los 40 oC. 3. Se detiene la sntesis por aumento de la oxigenacin, lo que vuelve a aumentar el crecimiento celular. Se puede prolongar hasta 72 horas. Las condiciones de operacin en este proceso son: 30-35 oC pH = 4.5 3% de inculo 600m3 Aumentos de temperatura y cantidad de inculo, pueden reducir el tiempo de fermentacin hasta lo 2 o 3 das. Debido a las condiciones anaerbicas, se puede producir contaminacin con bacterias lcticas, en particular, Leuconostoc, que sintetiza dextrano (un polisacrido), lo que aumenta la viscosidad y genera gradientes en el seno del caldo de fermentacin. Tambin se han desarrollado procesos en continuo (en desarrollo), siendo las condiciones en este caso: Se produce un mayor control de la temperatura y el pH. Se usan cantidades limitantes de glucosa (< 1g/l). Condiciones de microaerofilia (0.25-0.5 l/g de clulas). En estas condiciones, el proceso de produccin continuo dura unas 18 horas.

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Purificacin
El alcohol se obtiene por destilacin. Primero, han de extraerse las clulas por sedimentacin (generalmente) o centrifugacin y se elimina el CO2 tras etapas de lavado. Entonces, se destila el caldo en columnas de rectificacin.

Produccin de acetona/butanol
Aunque descubierta por Pasteur, fue Weizmann poco antes de la 1 G.M. quien estableci el proceso de produccin microbiano, al estudiar la produccin de butadieno para obtener caucho sinttico. Durante la guerra, se usa esta acetona de origen microbiano en la produccin de TNT, aunque tras la 2 GM se prefiere la sntesis qumica. Los microorganismos usados para la sntesis de butanol generan tambin acetona, por lo que se obtienen ambos compuestos conjuntamente. Las especies usadas son todas del gnero Clostridium, caracterizadas por ser: Bacterias anaerobias estrictas. Generan esporas. Sintetizan butanol y otro compuesto (convertible en etanol), dependiendo de la especie usada: C. acetobutylicum Butanol + acetona C. butylicum Butanol + isopropanol C. butyricum Butrico + actico En la actualidad, la produccin se efecta con C. Butylicum en fermentadores de 12 90 m3, usando CO2, que adems de proporcionar agitacin, desplaza al oxgeno, generando condiciones de anaerobiosis. El proceso es de 36 horas de duracin, y se produce en tres fases: 1. Formacin de cidos actico y butrico (18 h), lo que causa una drstica bajada del pH hasta 5.2. 2. Conversin de dichos cidos en acetona y butanol (18 horas), con lo que sube el pH. 3. Finalizacin del crecimiento y estabilizacin del pH (5.8): otras 18 horas. Se extraen los productos por destilacin fraccionada. Se pueden producir contaminaciones por bacterias lcticas, en especial Lactobacillus (lo que supone una disminucin del rendimiento) o por bacterifagos, que son ms complicadas de tratar, ya que matan las clulas y detienen el proceso.

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PRODUCCIN DE CIDOS ORGNICOS

Son ampliamente usados en alimentacin, como acidulantes, saborizantes o ingredientes qumicos. As tambin, pueden producirse por va microbiolgica, sntesis qumica o extraccin de productos naturales. La mayora de los obtenidos microbiolgicamente proceden del ciclo de Krebs, por lo que, en teora, son muchsimos los microorganismos capaces de sintetizarlos, aunque slo unos pocos en cantidades adecuadas para la aplicacin industrial. As tambin, slo unos pocos de estos cidos son ms rentables producidos por va microbiolgica que por va qumica. Los ms importantes son: cido ctrico El ms importante, ya que se obtiene nicamente por va microbiolgica. cidos actico y Son los segundos en importancia. Se pueden obtener tanto microbiolgica como lctico qumicamente. cidos mlico y Son de escasa demanda e importancia. fumrico cidos itacnico Se prefiere la sntesis qumica, ms sencilla y econmica, ya que es ms fcil obtener y glucnico de los microorganismos las enzimas que catalizan su formacin que el producto en s. Se obtiene en la fermentacin del vino. Actualmente, est en desarrollo la produccin cido tartrico a partir de Aspergillus o la bacteria Alcaligenes.

cido ctrico
Es el ms importante, ya que slo se obtiene por va microbiolgica y adems es el ms utilizado. Su sabor agradable y elevada solubilidad hacen que tenga diversidad de usos: Alimentacin: como acidulante, aromatizante, antioxidante y saborizante para productos dulces, como caramelos, helados, zumos,... Farmacia: como preservante de la sangre, debido a sus propiedades antioxidantes. Cosmtica, como integrante de diferentes preparados. Metalurgia, ya que muchos metales se extraen ms fcilmente como citratos. Detergentes, como sustituto de los polifosfatos. Esto es importante porque los polifosfatos son causantes de la eutrofizacin de las aguas dulces. La abundancia de N y/o P favorece un altsimo desarrollo de las algas, lo que causa una disminucin enorme de oxgeno en el agua y, por tanto, la muerte de los organismos de dichas aguas. Al producirse la descomposicin anaerobia de toda esa materia orgnica, los ros y lagos se acaban convirtiendo en pantanos. Por ello, se prefiere el cido ctrico (aunque ms caro). Qumica, como antiespumante y en la industria textil. Los procesos de fermentacin se llevan a cabo con cepas modificadas genticamente para aumentar la produccin y disminucin de compuestos colaterales, como los cidos oxlico y glucnico. Las especies usadas son: Aspergillus niger usando como sustrato sacarosa o melazas, hidrolizados de almidn, sueros lcteos, etc. Las condiciones de este sustrato son: o Limitacin del fosfato. o Ausencia de cationes metlicos, ya que stos pueden limitar la produccin al superar los niveles traza. Esto se consigue por adicin de ferrocianatos (con lo que los cationes precipitan como complejos) o usando resinas de intercambio inico. Candida lipolytica con parafina como sustrato, aunque est poco implantado.

Medio nutricional
La fuente de carbono ha de tener una concentracin de azcares del 15-25%. Para ello, se usan almidn de patata o hidrolizados de almidn (ambos requieren hidrlisis enzimtica), jarabe de caa de azcar, melazas o sacarosa. Minerales en las concentraciones adecuadas, sobre todo hierro, requiriendo unas condiciones diferentes para la fase de crecimiento y la de produccin. Si no se dan las concentraciones adecuadas, la morfologa del hongo no ser la ptima y la produccin se ver afectada.

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Los requerimientos de pH varan de la fase de crecimiento (trofofase, pH de 5) a la idiofase (de produccin, pH inferior a 3). Debido a las diferentes condiciones para idiofase y trofofase es difcil establecer un proceso de produccin en continuo.

Procesos de produccin
Procesos en superficie (o koji, del japons).
Son ms sencillos, pero requieren ms mano de obra. Como sustrato slido: Trigo u otro cereal Se dispone en capas delgadas (3-5 cm) donde se colocan las esporas Se mantiene a pH entre 4 y 5 y 28 oC durante 90 horas. Se procede a la extraccin del cido ctrico mediante 5 volmenes de agua caliente. Como sustrato lquido: Se usan sacarosa o melazas, complementadas con H2KPO4, MgSO4 y ZnSO4. Se inoculan las bandejas con esporas (2-5 107 esporas / m2) Se procede a incubacin a 30 oC con pH entre 4 y 5. Es necesario aportar suficiente oxgeno como para desplazar al CO2 producido, ya que ste inhibe la produccin por encima del 10% de concentracin. Se mantiene la etapa de crecimiento durante 30 horas, y la de produccin entre 8 y 14 das.

Procesos sumergidos o en profundidad.

Es ms complejo, pero permite una mayor mecanizacin. Se opera en discontinuo o semicontinuo con alimentacin fraccionada. Se usan fermentadores pequeos (menos de 250 m3), agitados o de columna de aire, construidos en materiales capaces de resistir pHs cidos sin liberar cationes metlicos (por lo general, se construyen en acero inoxidable). Dos factores importantes a tener en cuenta son: La relacin Fe/Cu ha de ser ms controlada que en procesos koji para que el micelio adopte la forma adecuada. Los niveles adecuados de oxgeno son menores (0.2-1 vvm).

Purificacin
Se efecta en pasos: Se retira el micelio del hongo. Como el cido ctrico estar atrapado en el micelio (debido a la alta densidad de ste), se efecta un lavado previo a la precipitacin o filtracin para retirar dicho micelio. Adicin de cationes calcio a pH 3, lo que hace que precipite oxalato clcico. Extraccin del cido ctrico a pH neutro con temperaturas entre 70 y 90 oC, lo que hace que se pierdan los componentes voltiles interferentes. Al adicionar ahora calcio, precipita citrato clcico. El citrato se purifica mediante resinas de intercambio inico, lo que permite obtener el cido ctrico.

cido actico
Es el principal componente del vinagre. Es sintetizado por dos gneros de bacterias: Acetobacter aceti Acetobacter Son cepas superoxidantes, capaces de oxidar el producto hasta CO2 y agua. pasteureanus Acetobacter peroxidans Gluconovbacter Finalizan el proceso con la obtencin del cido actico, sin una oxidacin oxydans mayor.

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Produccin
Mtodo Orleans
Es el ms tradicional. Son los ms costosos, y su produccin es baja.

Mtodo alemn
Basado en procesos tradicionales, su produccin es poco satisfactoria.

Generadores por goteo o reactor Frigs

Se usan capas de virutas de haya sobre las que se adhieren las bacterias (en cierto modo, es precursor de los sistemas de clulas inmovilizadas). Sobre dichas capas de virutas se gotea el sustrato El sustrato usado es: Un lquido de alto contenido alcohlico (vino, malta o sidra de baja calidad). Hidrolizados de patatas o cereales, o bien alcohol tcnico, que dado que son deficitarios en otros nutrientes, necesitan suplementos: o fosfato amnico o sulfato magnsico o citrato y pantotenato clcicos o hidrolizado de cereal Es de reducido coste y ocupamiento del espacio. Aporta un buen rendimiento (14%).

Procesos sumergidos
En este caso, son menos interesantes que para el cido ctrico. Requiere unos fuertes niveles de oxigenacin, lo que constituye su principal problema, ya que el proceso se detiene si el nivel de oxgeno es inferior al 5%. Presenta la ventaja de que con un coste mnimo obtiene una elevada eficacia. Las clulas se eliminan por filtracin. Posteriormente, se aade ferrocianuro potsico, lo que permite sustraer los subproductos responsables de colorear el cido actico.

cido lctico
Fue el primer cido obtenido por fermentacin. Se usa principalmente en alimentacin (acidulante y saborizante, adems de hallarse de forma natural en productos lcteos) y en farmacia. Segn las caractersticas metablicas de los microorganismos productores, se distingue entre homofermentadores (slo producen cido lctico, por lo que son preferibles) y heterofermentadores (producen, adems, otras sustancias). Las especies utilizadas preferentemente son: Lactobacillus Usa residuos lquidos de la industria papelera (licor de coccin del sulfito) como pentosus sustrato. Lactobacillus Usa sueros o suero desproteinizado procedentes de la industria lctea, sobre todo bulgaricus de la produccin de quesos. Se usan procesos continuos, discontinuos y con clulas inmovilizadas, manteniendo altas temperaturas (45-50 oC) y pH entre 5.5 y 6.5.

cido mlico
Se usa en alimentacin como acidulante. Se obtiene por sntesis qumica (preferentemente, ya que es ms barata) o enzimtica (tradicionalmente, a partir de extractos de zumo de manzana, dada su riqueza en este compuesto) a partir de cido fumrico. La sntesis microbiolgica usa: Aspergillus Con glucosa, sales y carbonato clcico. Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium flavum

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cido fumrico
Debido a su baja higroscopicidad (tendencia a captar agua), se usa en bebidas deshidratadas y revestimientos de golosinas (evita la entrada de agua a alimentos), como colorante (fija el color de la carne), emulsificante, suavizante, acidulante y saborizante. Paralelamente, su baja solubilidad limita otras aplicaciones (lo que se evita por adicin de compuestos que aumentan su solubilidad). Se obtiene a partir del hongo Rhyzopus oryzae usando como sustratos derivados de soja o arroz.

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PRODUCCIN DE NUCLETIDOS, AMINOCIDOS Y VITAMINAS

Su principal uso se da en alimentacin, como potenciadores del sabor (nucletidos y aminocidos) y para aumentar la calidad nutricional. Su importancia es creciente, debido a la tendencia a sustituir los aditivos qumicos por otros naturales. Por ello, aunque los productos microbianos son ms caros, se usan con preferencia. Estos productos tambin podran obtenerse de los vegetales, con una produccin similar; sin embargo, la va microbiana presenta la ventaja de ser ms fcil de mejorar y optimizar. As, los esfuerzos se centran en incrementar la competitividad de las fermentaciones por mejora de procesos de fermentacin y purificacin.

Nucletidos
Por s mismos no confieren sabor, pero incrementan los sabores presentes (lo que se conoce como efecto umami). Sin embargo, no todos presentan esta cualidad, sino slo los derivados de la purina (las pirimidnicas no tienen esta propiedad), en concreto, el IMP (inosin-mono-fosfato) y el GMP (guanosin-mono-fosfato).

Hidrlisis enzimtica del ARN.

Es la ms utilizada, sobre todo en Japn. Se usan levaduras con alto contenido en ARN, que se cultivan hasta el final de la fase logartmica de crecimiento (principio de la fase estacionaria), ya que entonces detienen la biosntesis estructural. Las cepas usadas son principalmente Candida utilis o Saccharomyces cerevisiae. Se extrae el ARN usando agua caliente de pH alto (con lo que el ARN pasa a la disolucin), y posterior adicin de HCl (preferentemente) o etanol, lo que provoca la precipitacin de este ARN. Entonces se deshidrata el producto. Se produce entonces la hidrlisis enzimtica, con lo que tenemos los nucletidos sueltos en disolucin. Adicionamos carbn activo, con lo que se adsorben sobre ste. Por elucin selectiva con una solucin de metanol-amonio, eliminamos los nucletidos pirimidnicos, con lo que nos quedamos con AMP y GMP. El GMP es producto, y el AMP se desamina por cultivo con Aspergillus oryzae, con lo que se obtiene IMP. Se separan los nucletidos por cromatografa de intercambio inico.

Hidrlisis qumica del ARN.

El ARN se obtiene igual que en la hidrlisis enzimtica. Se degrada el ARN hasta obtener los nucletidos mediante Ca(OH)2 y 130 oC durante 3-4 horas. El resto del proceso es similar, con la salvedad de que es preciso efectuar una fosforilacin posterior.

Fermentacin del IMP.

Se produce la inosina usando auxotrofos de Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes y Microbacterium que tienen bloqueada la sntesis de nucletidos. Este proceso es de un alto rendimiento (se obtienen 30-35 g/L). El hecho de usar auxotrofos que slo sintetizan inosina es para evitar la regulacin por producto final. La inosina producida se somete a pH bsico (aprox. 11), con lo que precipita y cristaliza. Se produce la fosforilacin, con lo que se obtiene el IMP.

Fermentacin del GMP.

Sntesis indirecta:
Se obtiene AICAR (5-amino-4-imidazol carboxamida ribosa) con cepas auxotrofas para la purina y mutadas en determinadas actividades enzimticas (lo que facilita la acumulacin sin inhibicin). Se favorece la excrecin del AICAR (intracelular) al caldo fermentativo: Adicin de una fuente de purina, lo que permite que se siga sintetizando AICAR hasta que la clula lo va expulsando por exceso.

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Adicin de un inhibidor ante la esporulacin (como cido butrico o reduccin del oxgeno, que evita un rpido agotamiento de los nutrientes, por lo que evita la esporulacin).

Sntesis directa
Es el menos usado. Se usan mutantes de Bacillus subtilis en los que se ha aumentado el nmero de copias del gen que codifica la enzima del paso limitante de la ruta de produccin de guanosina (con lo que aumenta el nmero de enzimas del proceso y la produccin aumenta). Se obtiene guanosina, lista para el consumo tras fosforilarla.

Aminocidos
Se usan sobre todo en alimentacin (potenciadores de sabor, antioxidantes, edulcorantes, complemento nutricional,...) y en algunos productos cosmticos y farmacuticos. Todos se pueden obtener por va microbiana, destacando glutamato, metionina y lisina.

Glutamato
Se usa mucho como potenciador de sabor para la comida china. El proceso de produccin es: 1. Se usa Corynebacterium glutamicum (el ms usado) y Brevibacterium flavum, usando glucosa y sacarosa como fuentes de carbono. 2. En el caso del Corynebacterium, es incapaz de completar el ciclo de Krebs, lo que supone que muchos de los productos que de l se derivan siguen rutas alternativas y, como consecuencia, se acumula cido -cetoglutrico. Debido a su similitud estructural, se transforma fcilmente en cido glutmico, precursor del glutamato. 3. Se facilita la excrecin de cido glutmico por adicin de biotina al medio, con lo que se puede extraer el c. glutmico y purificar. 4. El proceso se realiza en discontinuo, a 38 oC y pH de 7.8. Con una duracin de 30-35 horas se obtienen del orden de 100 g/L.

Otros aminocidos
Aspartato Alanina Cistena Fenilalanina combinado con aspartato Triptfano combinado con histidina Metionina Lisina Treonina Triptfano Otros Se usan como potenciadores del sabor y edulcorantes, ya que endulzan pero no dan aporte calrico (sobre todo para zumos). Se usa sobre todo como antioxidante en zumos. Forman el aspartamo, un dipptido usado como edulcorante sin proporcionar aporte calrico. Se usa como antioxidante de la leche en polvo.

Se usan como suplementos en derivados de cereales o en complejos nutricionales.

Se obtienen: A partir de hidrolizados de protenas, aunque poco rentable, la nica va para obtener cistena, cistina, leucina, asparagina y tirosina. Por sntesis qumica, que requiere de separacin enzimtica posterior, ya que se obtienen mezclas racmicas y slo una de las formas es la activa. Biotransformacin enzimtica. Fermentacin microbiana con mutantes de Corynebacterium, Brevibacterium y Esclerychia coli, para permitirles degradar sustratos baratos (como glucosa, hidrolizados de almidn o n-parafinas) y mejorar la produccin.

Vitaminas
Hay muchos microorganismos capaces de sintetizar todas las vitaminas necesarias para los humanos, pero slo B2 y B12 son de sntesis microbiana rentable frente a la sntesis qumica.

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El organismo las utiliza principalmente como coenzimas en la mayora de los casos, por lo que son indispensables para muchos procesos.

Riboflavina (B2)
Interviene en reacciones metablicas redox y del metabolismo energtico. Se encuentra en lcteos, verduras, hgado y suplementos nutricionales. Se emplea en suplementacin de derivados de cereales y productos dietticos. Hay tres vas de sntesis: 1. Sntesis qumica completa. 2. Sntesis mixta (el ms usado), usando Bacillus subtilis como productor de ribosa, que se transforma qumicamente en riboflavina. 3. Sntesis microbiana. a. Con Ashbya gossypii (hongo), usando aceite de soja o maz complementados con glicina y purinas (estimulan la produccin). Es la ms tradicional, con rendimientos de 6-7 g/L. b. Con otros microorganismos (Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae o Bacillus subtilis), se adaptan a una fuente de carbono concreta, con lo que los procesos se hacen muy especficos, y la produccin es muy variable (de 21 g/L de Candida a 4.5 g/L de Bacillus).

Cobalamina (B12)
Slo se obtiene por va microbiana, ya que la sntesis qumica es muy compleja y poco rentable. Qumicamente, presenta una estructura central fija, pero los sustituyentes constituyen varias formas, de las que la activa es la cianocobalamina. 1. Propionibacterium. a. Primera fase: anaerbica. En ella se sintetizan los precursores de la vitamina. b. Segunda fase: aerbica. En ella se sintetiza la cobalamina siempre que se aplique el adecuado tratamiento trmico en presencia de cianuro. 2. Pseudomonas denitrificans. Se obtiene el mayor rendimiento. Sin embargo, est sujeto a patentes, por lo que no es rentable. 3. Bacillus megaterium, en experimentacin.

cido ascrbico (C)

Se utiliza como suplemento en bebidas y como antioxidante de productos envasados. La sntesis ms usada es: 1. La glucosa se convierte qumicamente en sorbitol. 2. El sorbitol es transformado en sorbosa por accin del Acetobacter suboxydans. 3. La sorbosa es modificada qumicamente hasta obtener cido ascrbico. Hay microorganismos capaces de sintetizar la vitamina completamente (el alga Chlorella pyrenoidosa y la levadura Candida norvegensis), pero son menos rentables que los procesos qumicos. En la actualidad, se estn ensayando procesos en los que obtener intermediarios a partir de desechos contaminantes como sustrato.

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PRODUCCIN DE ENZIMAS
El inters por los procesos enzimticos se debe a varios factores: No necesitan condiciones especiales de temperatura y presin (los valores ambientales). Requieren menos energa (tecnologas sencillas y ahorro al no necesitar altas temperaturas ni presiones). Presentan una mayor especificidad y con mayores rendimientos frente a estereoisomera, ausencia de compuestos colaterales, etc. Permiten el trabajo en sistemas no acuosos. Son de bajon impacto ambiental, ya que no generan ni compuestos colaterales ni residuos de riesgo. Se clasifican en: Oxidorreductasas Efectan procesos redox y transferencias de O, H o electrones. Transferasas Transfieren grupos qumicos. Hidrolasas Hidrolizan molculas. Liasas Rompen enlaces en procesos no redox ni hidrolticos. Isomerasas Interconvierten ismeros. Ligasas Forman enlaces mediante el gasto de ATP. Pueden tener distintos orgenes, pero es preferible el microbiano, ya que su produccin es mayor y ms econmica, y con menos problemas de purificacin. Los principales usos de las enzimas son: detergentes, lcteos, procesado del almidn, textil, papel, investigacin biotecnolgica (enzimas de restriccin, clonacin,...).

Produccin comercial
Seleccin de cepas
Los mtodos de seleccin utilizados deben permitir diferenciar las especies capaces de producir una enzima basndose en determinados medios de cultivo, dando informacin sobre las caractersticas de la enzima (condiciones ptimas de funcionamiento: temperatura, pH,...) y sus niveles de produccin. El grupo microbiano ms usado al respecto son los microorganismos termfilos o termorresistentes, que necesitan altas temperaturas para crecer (70-90 oC), por lo que sus enzimas son de gran inters, ya que pueden ejercer su funcin a estas temperaturas. Dentro de este grupo, es preferible buscar microorganismos de calidad GRAS, que son las autorizadas legalmente para utilizarse en alimentacin y medicina, dada su inocuidad para el organismo humano y el medioambiente. Hay que tener en cuenta la mejora y adecuacin de las caractersticas del proceso de produccin al microorganismo, sobre todo si la enzima producida no es de origen microbiano. Por ello, es necesario recurrir a manipulacin gentica para favorecer los inductores de la produccin (se prefiere intentar que la modificacin consiga obtener la enzima sin necesidad de presencia de inductores) e inhibir la produccin de otras enzimas y procesos.

Procesos de produccin
Sobre sustrato slido (procesos Koji)
No son muy apropiados, salvo para procesos con hongos, ya que el control de temperatura, aireacin y humedad es difcil, adems de que son muy propensos a las contaminaciones. Se usa como sustrato salvado, paja de trigo, cscara de arroz, pulpa de caa de azcar o bagazo (medios slidos o semislidos porosos y sin agua libre), dispuestos en bandejas.

Procesos en biorreactores
Son ms fciles de automatizar al tratarse de medios lquidos y, por lo tanto, ser ms fcil el controlar las variables ambientales. Se usan sustratos de bajo coste, como melazas, cereales, hidrolizados de almidn o lactosa, junto con soja, cacahuete, hidrolizados de levadura o geletina complementados con P, S y Ca. Para el control del pH, se adiciona algn tamponador, por lo general, solucin de fosfato (que a la vez acta como suplemento de fsforo).

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Aplicaciones
Detergentes.
Se usan proteasas principalmente, paa aumentar la eficacia del detergente para atacar manchas con componentes proteicos. Otras ventajas son la disminucin de los costes energticos (al requerir temperaturas menores) y su carcter biodegradable, a diferencia de los fosfatos, por lo que minimizan el impacto ambiental. Este uso de las enzimas comenz en los 50, aunque actualmente las utilizadas son ms resistentes a la temperatura y el pH. Las enzimas ms utilizadas son: Subtilisina (una proteasa), procedente de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. Amilasas. Lipasas.

Produccin de quesos.
La enzima utilizada es la renina o quimosina. Produce la proteolisis parcial de la leche, que conduce a la formacin de la cuajada y, posteriormente, al queso. Anteriormente, se obtena a partir del rumen de los rumiantes, con uan produccin bastante baja. Los microorganismos permiten obtener enzimas de las mismas caractersticas que las animales, obtenindose principalmente de hongos (Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusilis, Aspergillus nidulans o Aspergillus niger), debido a su mayor facilidad para la manipulacin gentica. Actualmente, se estudian procesos usando Esclerichia coli o Kluyveromyces lactis. Se utilizan tambin distintas lipasas, que al degradar cidos grasos generan compuestos que otorgan sabor a los lcteos.

Procesado del almidn

Los hidrolizados de almidn se utilizan en alimentacin como edulcorantes y en clnica, sobre todo. Los tipos de enzimas ms utilizados son: -amilasa, que degrada el almidn en glucosa, maltosa y maltotriosa, por lo que se usa para la fabricacin de siropes y en las industrias cervecera y panadera. Se obtiene principalmente de hongos y Bacillus. Glucoamilasa, que hidroliza el almidn totalmente hasta glucosa. Se obtiene a partir de Aspergillus niger y Rhizopus. Glucosa isomerasa, que convierte la glucosa en fructosa, por lo que se usa para producir edulcorantes bajos en caloras y jarabes de alto contenido en fructosa (HFCS). Se obtiene de Bacillus y Streptomyces. Invertasa, que hidroliza la sacarosa en fructosa y glucosa, y se usa para produccin de siropes y chocolates. Se obtiene de Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae. -galactosidasa, que degrada la lactosa en glucosa y galactosa, por lo que se usa en la fabricacin de alimentos para personas no tolerantes a la lactosa, edulcorantes y helados. Se obtiene de Kluyveromyces marxianus, Aspergillus niger y Aspergillus oryzae.

Industria papelera.
Se usan para degradar los principales componentes de la madera, lo que permite reducir el impacto ambiental de esta actividad (se generan residuos muy contaminantes) y mejoran la textura y aspecto del papel. Se usan celulasas, hemicelulasas, pectinasas y lipasas.

Elaboracin de zumos.
Se trata de pectinasas, que actan sobre la pectina, uno de los principales componentes de la materia vegetal, clarificando y licuando el zumo. Se obtiene de Aspergillus niger y Penicillium.

Elaboracin de vinos.
-glucanasas. Eliminan los -glucanos aparecidos en la fermentacin de vinos procedentes de uva infectada por Botrytis cinerea. Celulasas y glicosidasas. Degradan la materia slida presente en el caldo de fermentacin del vino (pellejos, restos de pulpa,...), mejorando el color y el sabor, respectivamente. Glucosa oxidasas evitan daos sobre vinos, cervezas y zumos por accin del oxgeno. Se obtiene de Aspergillus niger y Penicillium.

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Industria textil
Amilasas y celulasas se usan en el tratamiento de tejidos vegetales, para retirar el almidn. Celulasas se usan para dar el aspecto de lavado a la piedra de vaqueros. Proteasas y lipasas se usan para el procesado de pieles: lavado, pelado, desengrasado y pelado.

Sntesis orgnica.
Se usan para la sntesis de compuestos quirales puros, al obtener productos estereoqumicamente puros, evitando la separacin de mezclas quirales y compuestos colaterales, y aumentando la pureza. Tambin son muy tiles para la obtencin de productos farmacuticos.

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PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE ANTIBITICOS

Un antibitico es una sustancia producida por microorganismos, y derivada de su metabolismo secundario, capaz de inhibir el crecimiento de otros microorganismos en concentraciones relativamente bajas. Si el producto tiene el mismo efecto, pero no es de origen microbiano, se le llama quimioterpico. Se descubrieron accidentalmente hacia los aos 20, fecha en que Alexander Fleming descubri la penicilina por contaminacin de un cultivo de Streptococcus con Penicillium. Sin embargo, fue Florey quien, ms tarde, se propuso investigarlos. Durante la 2 G.M. se produjo un importante desarrollo, que ha ido ampliando el nmero de antibiticos conocidos, hasta llegar a los 8000 que se conocen hoy da. Slo 123 se obtienen actualmente por va microbiana; la mayora se obtiene por modificacin qumica de productos microbianos. Las principales especies productoras son bacterias (Bacillus), hongos (Aspergillus y Penicillium) y actinomicetos (Streptomyces). Los usos ms tpicos de los antibiticos son: Control de actividades infecciosas: o En plantas, no se suele usar porque es ms factible y econmico el uso de agroqumicos y fitosanitarios. o En animales, aparecen resistencias. Debido a las caractersticas reproductivas de los microorganismos, pueden aparecer mutaciones que otorguen a los microorganismos resistencia frente a la accin de los antibiticos, que se extiende rpidamente. Control de tumores, debido a la capacidad de algunos antibiticos de controlar el crecimiento de las clulas tumorales. Alimentacin, para evitar el deterioro de los alimentos. Sin embargo, esto puede hacer ms acusada la aparicin de resistencias, por lo que se impone una legislacin restrictiva. Por ello, se estn sustituyendo por bacteriocinas de origen microbiano, que son menos agresivas y, por tanto, crean menos resistencias. Investigacin bioqumica, para seleccin de poblaciones. La bsqueda de nuevos antibiticos es cada vez ms difcil y costosa, pero contina siendo rentable por la ausencia de compuestos efectivos frente a ciertas especies patgenas.

Antibiticos -lactmicos
Se caracterizan por contener un anillo de cido -lactmico, lo que los dota de actividad frente a bacterias gram+ por inhibicin de la sntesis de la pared celular. Sus principales caractersticas son: Presentan una baja toxicidad para el organismo, por lo que los efectos secundarios son inexistentes o muy leves. Presentan dos problemas acusados: 1. En condiciones cidas no son efectivos. 2. Ciertas especies son capaces de sintetizar -lactamasas, por lo que son resistentes a este tipo de antibiticos, ya que hidrolizan el anillo, la estructura activa principal de la molcula.

Penicilinas
Se obtienen de cepas de Penicillium y Aspergillus. En funcin de su origen, se clasifican en: 1. Naturales, obtenidas directamente de la fermentacin microbiana. 2. Biosintticas, caracterizadas por el aumento de la actividad por medio de la incorporacin de grupos qumicos al anillo central. Se obtienen aadiendo precursores del grupo a incorporar al antibitico en el caldo de fermentacin. 3. Semisintticos, obtenidos por modificacin qumica del producto microbiano. El proceso de sntesis ms destacado es el de las penicilinas G y V, obtenidos por va biosinttica, pero diferenciados por la cadena lateral (cido fenilactico para G y cido fenoxiactico para V). Las caractersticas del proceso (discontinuo) son: 1. Los volmenes de los biorreactores son pequeos, debido a que los microorganismos demandan una gran cantidad de oxgeno en la fase de crecimiento; los valores ms usuales son un volumen de 40 a 200 m3 con una oxigenacin de 0.5-1 vvm. 2. Recuperacin del Penicillium chrysogenum esporulado y liofilizado. Esta etapa es importante, ya que de ella depende el compactamiento o no del micelio: si el micelio es compacto, disminuyen los rendimientos en la fase de produccin. 3. Fermentacin, realizada en dos etapas:

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4.

Fase de crecimiento. Se aporta un gran volumen de oxgeno durante unas 40 horas. Produccin. Durante 120-160 horas. El sustrato es principalmente: i. lactosa y lquidos de maceracin del maz (o, en su defecto, glucosa o melazas y harina de soja, extracto de levadura o suero). ii. pH 6.4 y cido fenilactico (G) o fenoxictico (V). Extraccin del producto con acetato de amilo o acetato de butilo, a 0 oC y pH de 2.5-3.

a. b.

Cefalosporinas
Se descubrieron primero en Cephalosporium acremonium, aunque se obtienen tambin de Paecilomyces, Streptomyces (el ms usado actualmente) y Nocardia. Su principal caracterstica es, adems de su similitud con las penicilinas, su amplio espectro de aplicacin. En la actualidad, se usan derivados semisintticos de 2 y 3 generacin (una o dos modificaciones qumicas, respectivamente, lo que permite aumentar la eficiencia o recuperar una actividad perdida por aparicin de resistencias). El proceso de produccin es: El sustrato es glucosa y sacarosa, lquidos de maceracin del maz, extracto de carne (complemento) y acetato amnico. La fermentacin se produce a 24-28 oC y pH 7, con una fase de crecimiento de 90 horas con alta aireacin, seguida de otra de produccin de 90-160 horas.

Nuevos productos
Se obtienen por adicin de compuestos que confieren proteccin al anillo frente a las enzimas, manteniendo su actividad o reforzndola. Destaca el cido clavulnico, usado con la amoxicilina. Aunque no es un antibitico en s, este compuesto confiere resistencia a la degradacin. Se obtiene de Streptomyces clavuligerus.

Antibiticos peptdicos
Destacan los lineales y cclicos, sintetizados mayoritariamente por Bacillus y Streptomyces. Sus caractersticas son: Son activos frente a gram- por inhibicin de la sntesis de la pared celular. Son txicos, por lo que su uso est restringido a casos concretos. Destaca la bacitracina, producida por Bacillus licheniformis en procesos de superficie antiguamente, aunque ahora se sigue un proceso ms complejo. 1. Cultivo de mantenimiento a 37 oC durante 18-24 horas. 2. Recuperacin de las esporas. Se usan recipientes de 1 L con slo 200 mL de medio lquido (peptonas), debido al alto requerimiento de oxgeno necesario (aunque es una especie anaerobia facultativa, o sea, capaz de crecer anaerobiamente). Se aplica durante 6 horas. 3. Prefermentacin. Se pasa a reactores de 800 L con una fuerte agitacin (proporciona oxigenacin) con el mismo medio de cultivo. 4. Segunda prefermentacin. Se efecta en reactores de 3000 L, pero se usa como sustrato sacarosa, harina de soja, sulfato amnico y carbonato clcico. 5. Fermentacin con el mismo sustrato anterior (con el doble de glucosa), en fermentadores de 90 m3 durante 30 horas.

Antibiticos carbohidratados
Los ms destacados son los aminoglucosdicos (oligosacridos unidos a aminosacridos). Se caracterizan por: Son muy comunes: estreptomicina, ... Son especficamente activos frente a gram- por inhibicin de la sntesis proteica. Son txicos, y pueden causar daos en rin y odo. Desarrollan resistencias rpidamente. El proceso de produccin es: 1. Se usa glucosa complementada con almidn o dextrinas y harina de soja, adems de NaCl, Co, Zn o Mn, segn el antibitico. 2. Fermentadores de 150 m3, 0.5-1 vvm oxgeno, 28-30 oC y pH neutro durante 4-7 das.

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3.

El producto es extracelular, por lo que se separa por columnas de intercambio inico. Si est adherido a las clulas, se separa por adicin de cido sulfrico hasta pH 2-2.5.

Antibiticos macroldicos
Contienen un anillo lactnico, lo que les da su carcter hidrofbico y bsico. Son eficaces frente a gram+ y son poco txicos, pero son poco demandados porque se prefieren las penicilinas de tercera generacin. Actan inhibiendo la sntesis de protenas. Destaca la eritromicina. El proceso de produccin es: El sustrato es glucosa, harina de soja, sulfato amnico, cloruro sdico y carbonato clcico, aunque se puede emplear extracto de levadura, aceites o almidn. El proceso es aerobio y sumergido, usando Streptomyces erithreus. Por lo general, se efectan a pH bsico durante 3-7 das a temperaturas de 25-28 oC, con excepcin de la eritromicina (33 oC).

Tetraciclinas
El primero descubierto fue la tetraciclina, descubierta de Streptomyces viridofaciens, aunque actualmente se usa ms S. aureofaciens. Por lo general, se obtienen por procesos biosintticos. Son activos frente a gram+ y gram- por inhibicin de la sntesis proteica. La produccin se efecta en fermentadores agitados de 150 m3 con glucosa o almidn y alta oxigenacin (1vvm) durante las primeras 12 horas. Es importante limitar el fosfato en el medio, ya que acta como inhibidor.

Antibiticos aromticos
Cloranfenicol
Es muy activo y eficaz, pero puede causar lesiones en la mdula sea, por lo que su uso est restringido. Tiene un amplio espectro de aplicacin, debido a que detiene el proceso de traduccin (sntesis de protenas). Sus usos ms destacados son: Tratamiento de las salmonelosis. En biologa molecular, ya que detiene la traduccin, pero no la replicacin del DNA. En medios de cultivo para hongos, evitando el crecimiento de las bacterias.

Griseofulvina
Es uno de los pocos antibiticos efectivos contra hongos. Se obtiene de Penicillium patulum por procesos aerbicos. El sustrato es rico en glucosa, con nitrato de sodio y cloruro potsico. El proceso se efecta durante 7-9 das, a 25 oC, pH neutro y 1 vvm.

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PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE VACUNAS

Fueron descubiertas por Jenner hacia el siglo XIX por estudios de incidencias de la viruela en personas afectadas de vacuna, una enfermedad similar pero que afectaba a las vacas, de efectos ms leves. Esto supuso la aparicin de una idea intuitiva de inmunizacin frente a la viruela por padecer dicha enfermedad. La utilizacin de las vacunas presenta ciertas ventajas frente a los quimioterpicos, debido a que es ms barata su aplicacin en masa para prevenir que la de los quimioterpicos para curar; y adems permiten controlar la enfermedad de una forma mucho ms eficaz, pudiendo incluso erradicarla.

Mtodos de produccin
Sistemas tradicionales
Consisten en la obtencin de la vacuna mediante el cultivo del patgeno. 1. Vacunas vivas. Son clulas con la capacidad patgena atenuada, obtenidas bien por conservacin durante largo tiempo o por cultivo en medios no apropiados. Presentan un importante inconveniente: el acceso del patgeno al organismo puede desencadenar la enfermedad si, por alguna razn, recupera su capacidad patgena, debido a que el sistema inmunitario del hospedador sea demasiado sensible o el microorganismo est poco atenuado. 2. Vacunas muertas. Consisten en clulas muertas o protenas txicas (toxoides) desactivadas. El principal inconveniente es la posibilidad de aparicin de reacciones (ms leves que en vacunas vivas), debidas a: a. Posibilidad de que no todas las clulas estn muertas. b. La enfermedad no sea causada por la actividad de las clulas, sino por alguna sustancia de su estructura, como por ejemplo los lipopolisacridos de las bacterias gram-. Los principales problemas de estos sistemas son: No todos los patgenos se pueden cultivar en laboratorio. En las vacunas vivas existe el riesgo de la reversin (recuperacin de la capacidad patgena), lo que ocasiona la enfermedad. sta tambin puede producirse si se introducen otras especies patgenas (sobre todo en vacunas vricas, donde la contaminacin es muy difcil de controlar) o el hospedador presenta inmunodepresin (sistema inmune dbil). En las vacunas muertas, las endotoxinas de las bacterias gram- pueden provocar reacciones.

Vacunas de subunidades (tcnicas de ADN recombinante)

En muchos casos, la capacidad para provocar la respuesta inmune no es la clula completa, sino una parte de su estructura (por lo general, protenas, de una o varias subunidades). El fundamento de estas vacunas es que, obteniendo dichas subunidades de las protenas, sera posible provocar la respuesta inmune sin necesidad de inocular el microorganismo entero. Este mtodo presenta ventajas: 1. Evita riesgos para el personal de produccin, debido a que no es necesario manipular organismos patgenos vivos. 2. Se pueden obtener mejores resultados que con las tradicionales, por efectos colaterales de otras sustancias. 3. Permite obtener vacunas para patgenos que no se pueden cultivar en laboratorio, ya que slo se requiere de ellos su material gentico. Sin embargo, presenta ciertas dificultades importantes: No se pueden obtener grandes cantidades de producto, debido a la baja traduccin del material gentico patgeno. Las protenas obtenidas no son suficientemente activas. Esto se debe a que las protenas obtenidas presentan plegamientos inadecuados, lo que origina una modificacin de la estructura original. Para evitarlo, se recurre al uso de hibridomas, que consisten en un hbrido entre una clula tumoral y otra de un tipo determinado. Esto supone una alta concentracin de protena activa (ya que se genera en el interior de una clula viva, no en laboratorio, lo que facilita que su estructura se acerque a la real), debido al rpido y constante crecimiento del hibridoma.

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En ocasiones, generan una escasa respuesta inmune, corta y dbil, por lo que no constituyen una vacuna efectiva. Para paliar este efecto: i. Aumento de la concentracin de antgenos, mediante el uso de adyuvantes. stos son sustancias portadoras del antgeno (en general, un adyuvante es una sustancia que favorece la accin de otro compuesto). En muchos casos, se usan estructuras del propio patgeno, ya que la unin entre ambas estructuras est ms favorecida. ii. Tembin se puede aportar el antgeno usando un virus o bacteria atenuados. Esto favorece la multiplicacin del antgeno, generando una mayor respuesta inmune. Sin embargo, vuelve a presentar el inconveniente del trabajo con patgenos vivos.

Vacunas peptdicas
Por lo general, el sistema inmune reconoce a los patgenos no por una estructura completa, sino por una pequea secuencia peptdica, denominada eptope. stas, como secuencia de aminocidos, se puede construir, lo que permitira generar la respuesta inmune sin necesidad de usar el antgeno completo, con la evidente ventaja de la reduccin de los efectos secundarios por la inoculacin de la vacuna. Presenta, sin embargo, varios problemas: La identificacin del eptope es compleja. Para ello, se usan hibridomas de linfocitos B, que reconocen el antgeno e inician la sntesis de anticuerpos monoclonales. Tembin se recurren a perfiles de hidrofobicidad, que permiten situar la protena en una zona especfica de la clula. Es difcil producirlos en grandes cantidades. Por un lado, es difcil que los eptopes adquieran la estructura necesaria sin interaccionar con otras estructuras (con las que interacciona al ser sintetizado por una clula); y por otro lado, al ser una secuencia pequea, es muy sensible frente a las mutaciones, dada la alta especificidad que se requiere para su identificacin.

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PRODUCCIN MICROBIOLGICA TERAPUTICAS

DE

PROTENAS

Las protenas teraputicas son producidas de forma natural por el organismo humano, pero ciertas enfermedades pueden disminuir la produccin de dichas protenas, generando enfermedades. Anteriormente, se usaban protenas obtenidas de origen animal, con dos problemas principalmente: su produccin era escasa (lo que las encareca) y suelen provocar efectos secundarios. Con las tcnicas de ADN recombinante, se posibilit la produccin microbiolgica de protenas humanas (ya que los microorganismos no las producen naturalmente, se tuvo que introducir en su genoma la maquinaria necesaria para ello, proveniente de informacin gentica humana). Las protenas obtenidas, al basarse en genes humanos, carecen de efectos secundarios (es prcticamente idntica a la protena humana) y se puede obtener en altas cantidades.

DNAsa
Es una enzima capaz de degradar el ADN, usada en el tratamiento de la fibrosis qustica. La fibrosis qusteca es una enfermedad gentica degenerativa, de diferente gravedad segn el rgano afectado. En los pulmones, el caso ms grave, genera el aumento de la produccin de mucosidad, taponando las vas respiratorias y favoreciendo las infecciones. Ante ello, el sistema inmune responde destruyendo las clulas, con la consiguiente liberacin de su ADN. ste aumenta la viscosidad y densidad de la mucosidad, crendose un crculo vicioso. La DNAsa acta hidrolizando el ADN liberado, disminuyendo la viscosidad de la mucosidad. Los preparados comerciales son muy especficos y eficaces (pulmozina de Genentech), pero sometidos a patentes farmacuticas.

Eritropoietina (EPO)
Es una hormona glicoproteica producida en el rin que interviene en la produccin de eritrocitos. Su carencia genera la cada del nmero de glbulos rojos, y su abuso un aumento (problemas de dopping en deportistas). Se obtiene mediante tcnicsa de ADN recombinante, y se usa para tratar enfermedades que causen inmunodepresin (cncer, sida,...) anemias e infecciones renales que afecten a su produccin.

Somatropina
Es la hormona del crecimiento, producida en la glndula pituitaria y usada en casos de enanismo por dficit hormonal y en enfermedades relacionadas con el envejecimiento. Inicialmente se obtena de cadveres humanos, pero presentaba problemas: Se requeran muchos cadveres para tratar un solo paciente, lo que disparaba el precio. Hay indicios de asociacin con la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (encefalopata espongiforme), provocada por priones y asociada al canibalismo (ingesta de cerebro humano, con la consiguiente transmisin del prin). Posteriormente, se obtuvo de animales, pero se obtenan bajas eficacias. Usando recombinacin gentica sobre Escherichia Coli (por transformacin con un plsmido que contiene el ADN de la hormona), se obtiene una somatropina idntica a la humana (slo se diferencian en un aminocido). Actualmente se investiga su produccin con otras especies (Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa).

Insulina
Es una hormona polipeptdica producida por el pncreas, relacionada con el metabolismo de la glucosa y la regulacin de su cantidad en sangre. Su carencia origina la diabetes. Tradicionalmente, se usaba isulina de origen animal (ovejas y cerdos), pero daban problemas de abastecimiento (baja produccin) y de pureza (por lo que solan producir efectos secundarios). Fue el primer producto obtenido por mtodos de ADN recomibnante aprobado para su empleo teraputico, en 1981. El proceso de produccin consiste en la produccin de las subunidades proteicas que la componen por hospedadores diferentes (Saccharomyces cerevisiae, E. coli) y de forma separada. Tras la sntesis, se combinan qumicamente las subcadenas independientes.

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Interfern
Es una protena de la familia de las citoquininas que itnerviene en la regulacin de la respuesta inmune. En humanos, existen tres tipos diferentes, usados en enfermedades que debilitan el sistema inmunitario: 1. El interfern , usado en casos de hepatitis C y tumores, como leucemia, cncer renal, melanoma, mieloma mltiple o tumor genital. Se obtiene de E. coli. 2. Los interferones y , usados en procesos de esclerosis mltiple (el primero) y otros cnceres (el segundo). Se obtienen tambin de Escherichia coli.

Interleuquinas
Son un grupo de citoquininas formado por 15 sustancias distintas. Slo una est comercializada actualmente, y se usa en el tratamiento de carcinomas renales.

Activador del tejido plasmingeno

Es una protena constituyente del complejo implicado en la dilucin de cogulos sanguneos, en concreto, activa el plasmingeno, que al transformarse en plasmina destruye la fibrina que mantiene unido el cogulo. Se comercializa desde 1987, para tratar enfermedades con riesgo de bloqueo de vasos sanguneos, como ataques cardiacos, embolias, trombosis y contusiones.

Colgeno
Se usa en suturas quirrgicas. Actualmente, se obtiene de cadveres y vacas, aunque hay procesos en investigacin de produccin con levaduras (Pichia augusta y Pichia pastoris) que eviten los riesgos de contaminacin por virus y priones.

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PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE SCP

Se usa principalmente para la produccin de piensos animales, cultivos iniciadores par alimentacin (levaduras para panadera) y consumo humano (poco extendido en occidente). Usa residuos de otras industrias como sustrato, lo que se explica teniendo en cuenta que su origen no fue la obtencin de la SCP, sino el tratamiento de residuos contaminantes. El producto en s es una torta compacta de clulas muertas completas, de alto contenido proteico (de ah el nombre).

Produccin de protena unicelular

Las caractersticas ms destacables del producto son: Rpida velocidad de crecimiento y elevada productividad. Alto contenido proteico (30-80%). Capacidad para utilizar una amplia variedad de fuentes de carbono. Posibilidad de alteracin gentica y seleccin de cepas de forma relativamente sencilla. Ocupacin de suelo baja. No es dependiente del clima ni la estacin. El producto es, en general, de alta calidad. Se aplica desde los 70, sobre todo, en pases en vas de desarrollo y como complemento diettico, as como ingrediente de piensos animales. Las caractersticas de los microorganismos usados son: Crecimiento a partir de sustratos de muy bajo coste. Tolerancia al pH y la temperatura. Buenas caractersticas de requerimientos de oxgeno, generacin de calor y formacin de espuma. Estabilidad gentica. Facilidad para la recuperacin de las clulas. Estructura y composicin del producto final: contenido proteico, perfil aminoacdico, sabor, aroma, color, textura y (muy importante) nivel de ARN (la degradacin de los cidos nucleicos genera purinas, que se transforman en cido rico, que puede generar enfermedades por acumulacin). Se prefieren, sobre todo, especies aerbicas (los fermentadores son ms baratos), y cada grupo microbiano presenta sus ventajas e inconvenientes: Las bacterias son de crecimiento ms rpido, pero son ms sensibles frente al pH (prefieren pH neutro). Las levaduras son de crecimiento ms lento, pero pueden trabajar a pH cido, lo que, adems, disminuye los riesgos de contaminacin. Los hongos son los qua ms fcil se recuperan del cultivo, pero presentan problemas durante el proceso. Los problemas a subsanar de este tipo de productos son, adems del contenido en cidos nucleicos: 1. En ciertos hongos (Aspergillus,...), regular la presencia de aflatoxinas. 2. Es necesario eliminar las sustancias txicas y/o cancergenas que pudieran generarse en el proceso.

Sustratos
Aunque son muchos los sustratos que pueden utilizarse, se elige el ms adecuado en funcin del precio de stos. 1. Residuos de otras industrias (residuos agrcolas, sueros lcteos o la industria maderera), con el fin de reducir los problemas ambientales que podran causar. 2. Alcoholes, muy empleados al principio, pero despus fue ms rentable usar residuos de otras industrias. Actualmente, se est recuperando. A la hora de buscar nuevos sustratos, se siguen los siguientes criterios: Baratos Alta produccin de biomasa. Su degradacin exija poca oxigenacin.

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No generen calor al degradarse, lo que favorece la no necesidad de utilizar cambiadores de calor, disminuyendo el coste. Fcil eliminacin de compuestos txicos, lo que tambin repercute en el precio.

Procesos de produccin
Existe una gran cantidad de plantas piloto, pero hay pocas plantas industriales, debido a que surgen problemas de escalado por la diferencia de condiciones: requerimientos de oxgeno, aparicin de gradientes trmicos y nutricionales, influencia del CO2 o la presin hidrulica. El empleo de sustratos ms econmicos, mejora de la eficacia, incremento del valor nutricional del producto, disminucin de los costes de purificacin o acoplado de procesos secundarios pueden contribuir a la extensin de estos procesos. En general, las etapas de estos procesos son: 1. Aplicacin de tratamientos previos al sustrato para su adecuacin. 2. Es uno de los pocos procesos que operan en continuo, manteniendo las condiciones lmite (ptimas) de crecimiento del organismo. Los biorreactores utilizados son pequeos. 3. Se efectan procesos de filtracin y purificacin, seguidos de tratamientos para reducir el contenido en cidos nucleicos (choque trmico y adicin de RNAsa) y acondicionamiento (pasteurizacin, deshidratacin y empaquetado). Los procesos ms comunes son: - Parte de suero lcteo con Kluyveromyces lactis o K. marxianus. - Se debe ajustar el contenido en lactosa del sustrato a 34 g/l, y complementarlo con La SCP obtenida se destina a consumo minerales. Bel - Las condiciones de fermentacin son: humano y animal Biorreactores de 22 m3. 38 oC y pH de 3.5. Aireacin de 1700 m3/h. - Se produce entre 0.45 y 0.55 g por g de lactosa. - Desarrollado en Suecia, utiliza Candida utilis (levadura). Se utiliza para disminuir los efectos - El sustrato contiene gran cantidad de almidn, ambientales de los residuos de patata, que que Candida no puede degradar, lo que exige un Symba necesitan un alto consumo de oxgeno tratamiento previo con Saccharomyces fibuligera. para degradarse. - Se obtiene un producto con un 45 % de protenas y el poder contaminante del sustrato se reduce un 90 %. El primer proceso con hongos, partiendo - Destinado a la produccin de piensos, el Finlands de residuos de papeleras y madereras. producto contiene un 59 % de protenas. - Los microorganismos metangenos son slo Importante en Noruega, donde los unas pocas especies, principalmente arqueas. El Con campos de gas del Mar del Norte ms utilizado es Methylococcus capsulatus. metano proporcionan el sustrato. - El producto contiene un 70 % de protenas, y se destina a la produccin de piensos. - Se efecta en condiciones aspticas y con nutrientes de grado alimentario. - Se emplea Fusarium venenatum por sus El primero aprobado para el consumo caractersticas de estructura y textura. humano, el nico destino de este ICI - El inconveniente del Fusarium es su alto producto. contenido en ARN, lo que obliga a la realizacin de un tratamiento de eliminacin a 64 oC durante 30 minutos.

Produccin de levadura para panadera

El iniciador en los productos de panadera es Saccharomyces cerevisiae. Su produccin se efecta en discontinuo: 1. Los lifilos se recuperan en medio slido, y por medio de un proceso de escalado en diferentes etapas (hasta 8) se llega a los cultivos lquidos.

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El sustrato utilizado son principalmente melazas provenientes de industrias azucareras, complementadas con compuestos nitrogenados (principalmente, sales de amonio) y aminocidos (que a su vez actan como factores de crecimiento), as como sales minerales. 3. Se efecta a pH cido (4-4.5). 4. Se requiere un gran aporte de oxgeno, durante media hora tras finalizar el proceso para adecuar las caractersticas de la clula (proceso de maduracin). 5. Las clulas se purifican por centrifugacin, lavado, enfriado (2-4 oC), desecado y conservacin en refrigeracin. Las caractersticas principales del producto son: Elevado poder glicoltico (capacidad para procesar azcares). Alta generacin de CO2. Altos niveles de osmotolerancia. Perfil metablico adecuado, lo que lleva a la produccin de sabor y aroma.

2.

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