Professional Documents
Culture Documents
Oleh : TIM PENYUSUN Dr. rer. nat. Ari indrianto, S.U. Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc. Eko Agus Suyono, M.App.Sc.
LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011
Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Fakultas Biologi - Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2011
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat rahmat dan hidayahNya, Petunjuk Praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan (BIO 3002) ini dapat kami susun dan selesaikan tepat pada waktunya. Buku ini disusun dengan tujuan untuk memenuhi kebutuhan praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan yang diselenggarakan oleh Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buku ini disusun dengan memperhatikan dan mengakomodasi teknik-teknik dasar dalam ilmu Kultur Jaringan Tumbuhan semaksimal mungkin. Tim penyusun mengucapkan terima kasih kepada segenap pihak yang telah dengan senang hati membantu proses penyusunan buku petunjuk ini. Kami menyadari sepenuhnya bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu tim penyusun selalu mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan buku petunjuk ini. Akhir kata, semoga buku ini dapat berguna bagi kemajuan ilmu pengetahuan pada umumnya dan bagi pihak-pihak yang memerlukan pada khususnya.
ii
Matakuliah
iv
JUDUL ACARA PRAKTIKUM (3 poin) 1. Pendahuluan (15 point) a. Latar Belakang b. Permasalahan c. Tujuan Berisi pernyataan yang menjelaskan tujuan acara praktikum yang akan dikerjakan. 2. Tinjauan Pustaka (15 point) Berisi kajian materi yang relevan dengan acara praktikum yang dikerjakan. Pada dasar teori ini harus disertakan acuan/sitasi, dengan penulisan sistem nama dan tahun. 3. Metode (10 point) a. Alat b. Bahan c. Cara kerja 4. Hasil dan Pembahasan (40 point) Hasil (20 point): Berupa Grafik, Tabel atau Gambar. Pembahasan (25 point) : Berisi uraian hasil, analisis dan diskusi/kajian dari pustaka lain 5. Kesimpulan (5 poin) Berupa pernyataan (paragraf) yang merupakan simpulan dari hasil dan pembahasan. Pernyataan kesimpulan harus sesuai dengan tujuan. 6. Daftar pustaka (5 poin) Berisi pustaka acuan yang digunakan dalam penyusunan laporan. Daftar pustaka setidaknya terdiri 5 pustaka acuan berbahasa Inggris 7. Lampiran (2 point)
v
b.
Matakuliah
Disusun untuk melengkapi praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan Semester I 2011/2012 Yogyakarta, ..................... 2011 Menyetujui, Asisten
(...............................)
vii
JUDUL KESELURUHAN ACARA PRAKTIKUM (3 point) 1. Pendahuluan (15 point) a. Latar Belakang b. Permasalahan c. Tujuan 2. Tinjauan Pustaka (15 point) a. Pembuatan Medium b. Perkecambahan Biji c. Induksi Kalus d. Organogenesis e. Embriogenesis 3. Metoda : (10 point) a. Alat 1) Pembuatan Medium 2) Perkecambahan Biji 3) Induksi Kalus 4) Organogenesis 5) Embriogenesis b. Bahan Idem alat c. Cara kerja Idem alat 4. Hasil dan Pembahasan (40 point) 5. Kesimpulan (5 poin) 6. Daftar pustaka (5 poin) 7. Lampiran (2 poin) Format lengkap dan tepat waktu: 5 poin Total nilai laporan praktikum: 100 poin
viii
8. Penilaian Penilaian praktikum meliputi hasil test (tes pendahuluan, pre&posttest, dan responsi), aktivitas (kebersihan, keaktifan selama pelaksanaan praktikum, dan hasil praktikum), dan laporan (laporan sementara dan laporan akhir) Keberhasilan (min. 50%) Jika tingkat kontaminasi melebihi 50%, maka praktikan (individu) harus mengulangi percobaan tersebut (hari ditentukan kemudian). Bila terjadi kontaminasi pada kultur: kultur yang terkontaminasi tersebut segera dikeluarkan dari ruang inkubasi dan dibersihkan (dicuci) maksimal 1 x 24 jam. Pengamatan: pengamatan harian dilakukan untuk mengetahui terjadinya kontaminasi pada hasil kultur praktikum. Pengambilan data dilakukan berdasarkan waktu yang ditentukan saat praktikum. Hari penanaman eksplan merupakan hari ke-0. Data pengamatan: dimasukkan ke dalam map masing-masing golongan dan diletakkan di tempat yang disediakan di laboratorium (tidak diperkenankan dibawa pulang!)
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL KATA PENGANTAR TATA TERTIB PRAKTIKUM PETUNJUK PEMBUATAN LAPORAN DAFTAR ISI ACARA I ACARA II ACARA III ACARA IV ACARA V DAFTAR PUSTAKA i ii iii viii 1 10 15 21 27 32
terlalu pekat akan mengalami pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontaminasi tidak dapat dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan stok terlalu banyak (Indrianto, 2002). Tujuan Meningkatkan pemahaman dalam mengembangkan protokol pembuatan medium MS yang efisien dan aman. Alat dan Bahan 1. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS, 2. Universal indikator pH, HCl 1N, dan atau KOH 1N 3. Alumunium foil, kertas timbang, tissue dan label, 4. Erlenmeyer 1000 mL, Gelas piala 600 mL, gelas ukur 1000 mL 5. Erlenmeyer 100 mL, 50 mL, atau botol kultur (botol infus dan botol saus), 6. pipet, pengaduk, 7. Magnetic stirrer dengan hotplate dan magnet, 8. Timbangan analitik 9. autoclave
BAHAN
STOCK
Untuk 1 L medium mg/L 1.650 1.900 440 370 170 ambil 5 mL stok (37,3) (27,8) ambil 1 mL stok (22,3) (8,6) (6,2) (0,83) (0,25) (0,025) (0,025) ambil 4 mL stok (2) (0,5) (0,5) (0,1) (1-5) M (1-5) M (1-10) ppm 100 mg 30.000 mg 8.000-10.000 mg 5,6 6,3
3
I. MAKRONUTRIEN NH4NO3 KNO3 CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4 II. BESI mg/200 mL (40X) Na2EDTA 1.492 FeSO4 7H2O 1.112 III. MIKRONUTRIENT mg/100 mL (100X) MnSO4 H2O 2.230 ZnSO4 4H2O 860 H3BO3 620 KI 83 NaMoO4 2H2O 25 CuSO4 5H2O 2,5 CoCl2 6H2O 2,5 IV. VITAMIN mg/200 mL (50X) Glycine 100 Nicotinic acid 25 Pyridoxine-HCl 25 Thiamine-HCl 5 V. ZAT PENGATUR TUMBUH BA NAA 2,4-D VI. Myo-Inositol VII. Sukrosa VIII. Agar pH
I. Pembuatan larutan stok untuk medium MS A. Stok besi (IRON): dalam 200 mL (40 kali konsentrasi) Prosedur kerjanya sebagai berikut : 1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O. Kedua bahan tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah. Larutan Na2EDTA dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian masukkan larutan Fe2SO4.7H2O sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan magnetic stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades sampai volume menjadi 200 mL. Masukkan dalam botol khusus berwarna gelap, beri label: IRON. MS 40X, 5 mL/L 2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 mL larutan stok besi. B. Stok Mikronutrien: dalam 100 mL (100 kali konsentrasi) Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Prosedur kerjanya sebagai berikut: 1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik, masing-masing: MnSO4.H2O 2.230 mg ZnSO4.4H2O 860 mg H3BO3 620 mg KI 83 mg NaMoO4.2H2O 25 mg CuSO4.5H2O 2,5 mg CoCl2.6H2O 2,5 mg
2. Masukkan satu persatu dalam gelas piala 200 mL yang berisi akuades kurang lebih 80 mL. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera dilarutkan (diaduk), baru kemudian bahan berikutnya. Jangan memasukkan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetic stirrer, 3. Akuades ditambahkan kedalam larutan yang sudah jadi sampai volume menjadi 100 mL, 4. Masukkan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: MIKRO MS. 100X, 1 mL/L 5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 mL stok mikronutrient. C. Stok Vitamin: dalam 200 mL (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Prosedur kerjanya sebagai berikut: 1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini: Glycine 100 mg Nicotinic acid 25 mg Pyridoxine-HCl 25 mg Thiamine-HCl 5 mg 2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades (steril) kira-kira sebanyak 150 mL, 3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 mL, 4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: VITAMIN MS. 50X, 4 mL/L 5. Simpan dalam lemari es, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 mL stok vitamin.
D. Stok zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas. Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1mM. 1. Stok NAA: 1 mM (1.862 mg/100 mL) BM NAA= 186,2 gram/mol 1. Timbang bahan sebanyak 18,62 mg, tuangkan masing-masing bahan dalam gelas piala 100 ml yang berisi akuades kira-kira 70 ml. 2. Sambil diaduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larut benar (jernih). 3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. 4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label: NAA 1mM, 1 M = 1 ml/L 5. Simpan di dalam lemari es. 2. Stok BA: 1 mM (2.252 mg/100 mL) BM BA = 225,2 gram/mol 1. Timbang BA 22,52 mg, masukkan ke dalam gelas piala 100 mL berisi akuades kira-kira 70 mL, 2. Sambil diaduk, teteskan sedikit larutan KOH 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larutan menjadi jernih, 3. Setelah dingin, masukkan ke dalam labu takar 100 mL, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 mL, 4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 mL atau wadah lain yang bersih, tutup rapat beri label: BA 1 mM, 1 M = 1 ml/L 5. Simpan di dalam lemari es.
6
3. Stok 2,4-D: 500 mg/L (500 ppm) Prosedur kerjanya sebagai berikut : 1. Timbang bahan sebanyak 50 mg, tuangkan bahan dalam gelas piala 100 mL yang berisi akuades kira-kira 70 mL, 2. Sambil diaduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larut benar (jernih), 3. Pindahkan dalam labu takar 100 mL, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 mL, 4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label: 2,4-D 500 ppm, 1 mg/L = 2 ml/L 5. Simpan dalam lemari es. E. Myo-Inositol dan Sukrosa: karena jumlahnya cukup banyak, tidak dibuat stok, ditimbang setiap kali membuat media. LABEL MEDIUM
MS 0 19-3-2008 XX
Keterangan : MS 0 : kode medium dan zat tambahan 19-3-2008 : tanggal pembuatan medium XX : inisial nama pembuat medium
Be Sp 19-3-2008 XX
Keterangan : Be Sp : nama bagian dan spesies eksplan 19-3-2008 : tanggal penanaman eksplan XX : inisial nama penanam
II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter 1. Siapkan erlenmeyer 1000 mL yang berisi 500 mL akuades, 2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan tabel) dan larutkan satu persatu. Untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirrer, 3. Masukkan 5 mL larutan stok BESI, 4. Masukkan 1 mL larutan stok MIKRONUTRIEN, 5. Masukkan 4 mL larutan stok VITAMIN, 6. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukkan dalam erlenmeyer dan larutkan, 7. Timbang 30 g sukrosa, masukkan dalam erlenmeyer dan larutkan, 8. Masukkan zat pengatur tumbuh (bila diperlukan, sesuai kebutuhan), 9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 mL, 10. Ukur pH menjadi 5,6 6,3 dengan penambahan HCl atau KOH, 11. Timbang 8 g agar-agar (tergantung keterangan yang dicantumkan dalam kemasan produk), masukkan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil diaduk) sampai agar-agar larut, 12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 20 mL/botol, 13. Tutup rapat dengan alumunium foil dan beri label sesuai dengan perlakuan, 14. Masukkan ke dalam autoclave dan disterilisasi pada suhu 121C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi (1 atm), 15. Setelah tekanan turun sampai 0 atm, medium yang sudah steril segera dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin di dalam autoclave, karena pemanasan yang terlalu lama dapat merusak medium. 16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
10
merendam di dalam alkohol beberapa saat kemudian melalukannya di atas nyala api. Kontaminasi yang disebabkan oleh kurang sempurnanya prosedur sterilisasi biasanya segera terlihat dengan munculnya kontaminan (bakteri/jamur) disekitar medium yang berdekatan (kontak) dengan eksplan. Sedangkan kontaminan yang disebabkan karena kecerobohan kerja dan kondisi ruang kerja yang tidak steril, biasanya terlihat berupa bercak-bercak koloni jamur/bakteri di seluruh permukaan medium (Gamborg & Shylik, 1981). Tujuan 1. Melatih prosedur kerja secara aseptis dengan mengecambahkan biji dan menumbuhkannya secara in vitro. 2. Mendapatkan sumber eksplan yang steril. Alat dan Bahan 1. Biji jagung (Zea mays), dan wortel (Daucus carota) 2. Medium MS tanpa ZPT (MS 0), 3. Bleach 5,25% (Bayclin,Clorox,dsb), Akuades steril, Alkohol 70%, 4. Erlenmeyer 250ml, 100mL, dan pipet steril 5. Petridish berisi kertas saring steril, Pinset steril, 6. Hand sprayer berisi spiritus, Tisu, 7. Plastic seal, Alumunium foil steril, kertas label dan 8. Laminar Air Flow atau Entkas.
11
Cara Kerja A. Persiapan Laminar Air Flow (LAF) 1. Sebelum mulai bekerja, lepaskan asesoris tangan (jam, cincin, gelang, dsb), simpan ditempat yang aman, cuci tangan dengan sabun antiseptik. Matikan UV, bersihkan lantai dan dinding LAF dengan menyemprotkan alkohol 70%/spiritus serta melapnya dengan kertas tissue, kemudian baru LAF dihidupkan. 2. Masukkan alat-alat (satu per satu) ke dalam LAF, sebelumnya alatalat disemprot dengan alkohol 70%/spiritus pada permukaannya. Alat-alat diatur posisinya, jangan meletakkan alat-alat terlalu dekat dengan bagian luar dan letakkan di kanan kiri posisi duduk kita (lihat gambar 1 dan 2). Keterangan : a. Switch on/off UV lamp. b. Switch on/off neon lamp. c. Switch on/off blower.
Keterangan : a. Lubang untuk tangan/jalan untuk memasukkan alat dan bahan. b. Tablet formalin (untuk sterilisasi ruang). Gambar 2. Entkas
12
B. Sterilisasi dan Penanaman Biji In Vitro Prosedur kerja sterilisasi dan penanaman biji in vitro adalah sebagai berikut:
50 biji dicampur dengan bleach 5,25% lalu digojok selama 10 menit Bleach dibuang dengan pipet Akuades steril dimasukkan lalu digojok lima menit, dibuang dengan pipet, pencucian diulangi dua kali Alkohol 70% dimasukkan, digojok dan segera dibuang Dicuci dengan akuades steril tiga kali, masing-masing tiga menit Biji dipindahkan pada petridish yang berisi kertas filter steril Biji ditanam pada medium MS0. Tida biji per botol untuk Zea mays, dan secukupnya untuk D. Carota dan N. tabacum Botol kemudian ditutup dengan plastik segel, diberi label, dan diinkubasi di tempat terang.
13
C. Pengamatan Selama satu minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), diamati jumlah dan pertumbuhan (panjang) kecambah. Selain itu, perhatikan ada tidaknya kontaminasi, macam kontaminasi (jamur atau bakteri) dan letak kontaminan, apakah berasal dari eksplan, atau medium (akibat kecerobohan kerja).
14
pembelahan sel-sel mencapai maksimal; 3. fase pertumbuhan linier, pembelahan sel-sel melambat tetapi laju pembentangan sel-sel meningkat; 4. fase progressive deceleration, pembelahan dan pembentangan sel-sel menurun; 5. fase stasioner, periode dimana tidak ada pertumbuhan sel-sel karena tidak membelah lagi (George & Sherington, 1954). Tujuan Mempelajari teknik induksi kalus Alat dan Bahan 1. Daun tembakau (Nicotiana tabacum) dari greenhouse 2. Kecambah wortel (Daucus carota) in vitro 3. Medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 2 mg/L dan MS0 sebagai kontrol, 4. Petridish, kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset steril, 5. Na Hipoklorit (Bleach) 5,25 %, Tween, Akuades steril, 6. Plastic seal, alumunium foil steril, kertas label, pensil 7. Hand sprayer berisi alkohol, tisu 8. Erlenmeyer 250 mL, beker glass 250 mL, 9. Laminar Air Flow.
16
Cara kerja 1. Persiapan eksplan dan prasterilisasi Daun tembakau dicuci bersih dengan menggunakan sabun dan dibilas menggunakan air bersih. Daun yang telah dicuci diletakkan di dalam petridish kemudian ditutup dan segera dibawa ke dalam Laminar Air Flow atau entkas. 2. Sterilisasi eksplan a. Bersihkan permukaan meja kerja dengan menyemprotkan alkohol 70% dan melapnya dengan kertas tissue. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan Na Hipoklorit. b. Daun tembakau disterilisasi dengan merendam daun dalam larutan Na Hipoklorit (konsentrasi tergantung eksplan) yang ditambah dengan beberapa tetes tween selama 10 menit (tergantung eksplan), kemudian dicuci dengan akuades steril dua kali masing-masing 5 menit. Pastikan eksplan sudah tidak lagi mengandung sisa-sisa Na hipoklorit c. Kecambah wortel tidak perlu disterilisasi karena sudah steril. 3. Pemotongan eksplan a. Untuk daun tembakau pisahkan helaian daun (lamina) dengan ibu tulang daunnya (costae). Untuk costae dipotong dengan ukuran panjang kira-kira 0,5 cm. Sedangkan untuk lamina dipotong melewati pertulangan daun dengan ukuran (0,5 x 0,5) cm2. b. Untuk kecambah wortel, diambil bagian daun, kotiledon, dan hipokotilnya
17
4. Penanaman dan inkubasi a. Dengan pinset steril, masukan 3 potong eksplan untuk setiap botol kultur, harus dijaga jarak antara eksplan satu dengan lainnya, jangan saling berdempetan. b. Botol kultur yang telah berisi eksplan segera ditutup dan dibawa keruang inkubator, inkubasi dilakukan ditempat terang. 5. Pengamatan Selama empat minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), amati asal terbentuknya kalus, tekstur, dan warna kalus. Perhatikan juga keberadaan, macam, dan letak kontaminasi serta terjadinya browning.
18
STERILISASI
Larutan dibuang
daundaun
Helaian 0,5 cm2
daun
Dipotong
19
Prosedur Kerja Induksi Kalus pada Kecambah in vitro Wortel (Daucus carota)
20
aksiler. Cara ini dapat menghasilkan tanaman yang secara klonal relatif stabil. Yang kedua adalah dengan menginduksi meristem baru (de novo meristems) misalnya adventif dan embrio somatik (George & Sherington, 1954). Cara yang kedua ini ditempuh dengan melalui tahapan kalus terlebih dahulu sehingga lebih produktif, dalam arti tingkat multiplikasinya lebih tinggi. Sejalan dengan bertambahnya tahapan yang harus ditempuh untuk sampai pada tanaman lengkap, tingkat penyimpangan genetiknya juga menjadi semakin tinggi, sehingga lebih banyak menghasilkan variasi somaklonal (Gamborg & Shylik, 1981). Tujuan 1. Mempelajari teknik dasar mikropropagasi tanaman bawang putih (Allium sativum L.) dan kecambah tembakau (Nicotiana tabacum). 2. Mengamati proses morfogenesis in vitro. Alat dan Bahan : 1. Embrio bawang putih (Allium sativum L.) yang sehat, 2. Kecambah Tembakau (Nicotiana tabacum) in vitro, 3. Medium MS padat dengan variasi zat pengatur tumbuh NAA dan BA, dan MS0 sebagai kontrol. 4. Alkohol 70% 5. pisau/ cutter, 6. Erlenmeyer 250 mL, beker glass 250 mL, 7. Petridish dengan kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset steril, lampu spiritus, 8. Plastic seal, Alumunium foil steril, kertas label, 9. Hand sprayer berisi spiritus, Tisu, dan 10. Laminar Air Flow
22
Cara Kerja : 1. Persiapan Medium Kultur Pembuatan medium MS padat dengan penambahan zat pengatur tumbuh NAA dan BA yang dikombinasi sebagai berikut : Tabel 2. Kombinasi zat pengatur tumbuh yang digunakan KOMBINASI NAA (M) BA (M) I 0 0 II 1 5 III 3 3 IV 5 1
2. Persiapan Eksplan, Sterilisasi, dan Inokulasi. a. Umbi Bawang Putih Pisahkan umbi bawang putih satu persatu, kemudian kulitnya dikupas dengan pisau atau cutter. Masukkan umbi yang telah dikupas ke dalam beker glass, kemudian dibawa ke dalam LAF. Rendamlah umbi di dalam alkohol 70% selama beberapa saat. Ambil umbi dengan pinset, lalukan di atas nyala api, biarkan sampai api padam. Diulangi tiga kali. Letakkan umbi yang telah steril di atas petridish yang sudah dialasi kertas saring. Dengan skalpel tajam, pisahkan bagian embrio dari umbinya. Buatlah potongan melintang pada embrio, sehingga terbagi menjadi tiga bagian, yaitu bagian pangkal, tengah dan ujung. Tanamlah potongan umbi pada medium yang telah disiapkan. Tutuplah botol kultur, beri label dan inkubasikan dengan pencahayaan. b. Kecambah Tembakau Kecambah tembakau yang digunakan berasal dari percobaan perkecambahan in vitro, sehingga inokulan yang digunakan sudah steril (Tidak perlu melalui proses sterilisasi).
23
Letakkan kecambah di atas petridish yang sudah dialasi kertas saring steril. Dengan menggunakan skalpel yang tajam, diambil bagian hipokotil, epikotil dan helaian daunnya. Untuk hipokotil dan epikotil dipotong dengan ukuran kira-kira 0,5 cm, sedangkan untuk helaian daun dipotong melewati pertulangan daun dengan ukuran (0,5 x 0,5) cm2. Dengan pinset steril masukkan masinh-masing eksplan ke dalam botol kultur. Dijaga jarak satu eksplan dengan yang lainnya agar jangan saling berdempetan. Botol kultur yang telah berisi eksplan segera ditutup dan dibawa ke ruang inkubator, inkubasi dilakukan di tempat terang. 3. Pengamatan Selama empat minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), amati kapan dan didaerah mana tunas atau akar terbentuk; pada perlakuan variasi hormon apa akar atau tunas terbentuk; dan berapa tanaman regenerasi (tunas atau akar) yang terbentuk pada setiap eksplan. Perhatikan juga keberadaan (ada tidaknya), macam, dan letak kontaminasi serta terjadinya browning.
24
Prosedur Kerja Organogenesis pada Umbi Bawang Putih (Allium sativum L.)
Dikupas kulitnya
Dicelupkan dalam alkohol 70%
Alkohol 70 %
25
26
Induksi embriogenik dilakukan dengan melakukan dedifernsiasi pada sel somatik. Sel soatik ditransfer ke dalam medium dengan kandungan auksin tinggi dan jika proses induksi embriogenesisnya benar, maka gen-gen yang bertanggung jawab terhadap totipotensi akan berfungsi, pembelahan sel-selnya menjadi terkendali, dan akhirnya terbentuk embrio. selain itu, induksi proses dediferensiasi juga dapat dilakukan debgan stress somatik. Keberhasilan akan tercapai apabila kalus dan sel yang digunakan bersifat embriogenik, yang bercirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti besar, vakuola kecil-kecil dan mengandung butir pati. Sel-sel yang telah mengalami proses dedifensiasi akan berubah menjadi embriogenik dan selanjutnya berkembang menjadi embrio. 2. Pendewasaan (maturation) Pra pendewasaan embrio somatik dilakukan dengan pemindahan embrio pada medium dengan pengurangan atau tanpa zat pengatur tumbuh sehingga menghambat proliferasi dan merangsang pembentukan serta perkembangan awal embrio somatik. Pendewasaan embrio somatik dilakukan dnegan mengkultur embrio pada merium yang mengandung ABA dan atau mengurangi potensial osmotik. Tahap pendewasaan meliputi tahap perkemabnagn embrio menjadi berbentuk globuler, jantung, torpedo, kotiledon, dan primordia akar. Proses pendewasaan embrio menggambarkan tiga proses penting, yaitu: a. zigot mengalami pembelahan asimetri, menyebabkan sel apikal lebih kecil dari sel basal. b. pembentukan pola spesifik sehingga embrio berbentuk globuler c. transisi dari tahap globuler sampaimenuju kotiledon di mana terjadi inisiasi primordia akar dan pucuk. 3. Perkecambahan Tahap perkecambahan adalah tahap pembentukan akar dan tunas. Pada media perkecambahan, konsentrasi zat pengatur tumbuh
28
yang ditambahkan sangat rendah atau bahkan tidak diberikan sama sekali 4. Hardening Tahap hardening yaitu tahap aklimatisasi bibit embrio somatik dari kondisi in vitro ke lingkungan baru di rumah kaca dengan penurunan kelembaban dan peningkatan intensitas cahaya. Tujuan 1. Mempelajari teknik dasar mikropopagasi tanaman wortel (Daucus carota L. ) melalui induksi embrigenesis somatik in vitro. 2. Mengalami fase-fase embriogenesis somatik secara in vitro Alat dan Bahan 1. Kalus wortel (Daucus carota L.) dalam medium MS + 2,4 D 2 mg/L 2. Medium MS padat dengan penambahan 2,4 D (1 dan 0,5) mg/L dalam petridish 3. Alkohol 70% 4. Petridish dengan kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset lampu spiritus 5. Plastic seal, kertas label 6. Hand sprayer berisi spiritus, tisu, dan 7. Laminar Air Flow 8. Mikroskop stereo Cara Kerja: 1. Pembuatan medium dalam petridish Medium MS steril padat dalam erlenmeyer dipanaskan di atas hotplate hingga mencair. Tunggu hingga suhu turun, sekitar 40-50C. Bawa masuk kedalam ruang steril (Laminar Air Flow atau entkas). Didalam ruang steril, tambahkan hormon steril sesuai kebutuhan. Goyang hingga homogen. Tuang ke dalam petridish steril.
29
Tunggu hingga menjendal. Segel petridish dengan seal plastik. Medium siap digunakan. 2. Induksi dan pemeliharaan kalus Kecambah wortel in vitro umur 9 hari diletakkan di atas petridish. Hipokotil kecambah dipotong menggunakan skalpel sepanjang satu cm dari pangkal kotiledon. Ditanam dalam medium MS+2,4 D 2mg/L untuk induksi kalus. Setiap petridish diisi empat eksplan. Kultur diinkubasi pada suhu 22-25oC dan cahaya 1000 flux secara terus-menerus selama lima minggu. 3. Induksi embrio somatik Kalus wortel berumur 5 minggu dari perlakuan diatas, diletakkan di atas petridish. Kalus dibagi menjadi dua bagian menggunakan skalpel. Setiap potongan disubkultur dalam medium MS+BAP 0,5 mg/L, MS+BAP 1 mg/L dan MS0 (sebagai kontrol) untuk induksi embrio somatik. Setiap petridish diisi empat irisan kalus. Kultur diinkubasi pada suhu 22-25oC dan cahaya 1000 flux secara terusmenerus selama tiga minggu 4. Pendewasaan embrio somatik Embrio somatik umur tiga minggu dari perlakuan BAP terbaik di atas di subkultur dalam medium MS+PEG 4000 7% + ABA 9 M, dan MS0 (sebagai kontrol) untuk pendewasaan embrio. Kultur diinkubasi pada pencahayaan 1000 flux secara terus-menerus selama 5 minggu. 5. Perkecambahan embrio somatik Embrio dewasa (fase torpedo) yang dihasilkan dari medium pendewasaan embrio somatik selanjutnya ditransfer ke medium perkecambahan berupa medium dasar tanpa zat pengatur tumbuh (MS0) 6. Pengamatan Embrio somatik yang terbentuk pada masing-masing perlakuan dihitung di bawah mikroskop stero pada perbesaran 40 kali. Diamati
30
terbentuknya embrio dari tiap fase baik globuler, jantung, maupun torpedo dan dihitung jumlahnya.
31
DAFTAR PUSTAKA
Dodds, J. H. and L. W. Roberts. 1983. Experiment in Plant Tissue Culture. Cambridge university Press. Sydney. Gamborg, O and J. P. Shylik. 1981. Nutrition Media and Characteristic of Plant Cell and Tissue Culture. In: Thorps T. A. (ed). Plant Tissue Culture Methods an Applications in Agriculture. Academic Press. San Fransisco. George, E.F. and P.D. Sherington, 1954. Plant Propagation by Tissue Culture: Handbook and Directory of Comercial Laboratories. Exegetics Ltd. Eversly, Basingstoke, Hants. England. Indrianto, A, 2002. Bahan Ajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan. Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta.
32