Tema 11: Protenas. Estructura primaria.

Sntesis de pptidos

1 Hidrlisis qumica total y anlisis cuali-cuantitativo de aminocidos

2 Determinacin de grupos terminales

3 Reduccin u oxidacin de puentes disulfuro

4 Hidrlisis parcial

5 Secuenciacin de pptidos

6 Establecimiento de secuencia

7 Localizacin de puentes disulfuro Localizaci

1 Hidrlisis qumica total y anlisis cuali-cuantitativo de aminocidos

Protena HCl 6N

Separacin resina de intercambio catinico

H2 C CH

H2 C CH

H2 C CH

H2 C CH

SO3

SO3

105-110C 24h

HPLC

OH O OH HS OH + OH OH H3N O O R R N S H C OH O

Isoindolaminocido (fluorescente)

o-ftaldehdo

2 Determinacin de grupos terminales

NO2

NO2 NO2

NO2 F HF NH2 H3C CH C NH H CH C Pep O O H pH 8 H3C CH C NH CH C Pep O O NH

NO2 NO2 + NH Aminocidos libres H3C CH C OH 2,4-dinitrofenilaminocido O

H3O

3 Reduccin u oxidacin de puentes disulfuro

Oxidacin
cido cisteico

Reduccin

Bloqueo de sulfhidrilos libres

4 Hidrlisis parcial

Hidrlisis enzimtica

Exopeptidasas

H3N Gly

Arg Ala

Ser Phe

Gly Asn

Lys Trp

Glu Val

COO

Carboxipeptidasa H3N Gly Arg Ala Ser Phe Gly Asn Lys Trp Glu COO H 3N Val COO

Endopeptidasas
H N H3N 3

Tripsina

Arg Ser Gly Lys Glu COO Arg Ser Gly Lys Glu COO Gly Ala Phe Asn Trp Val Gly Ala Phe Asn Trp Val

Quimotripsina

H3 N Gly

Arg COO

H3 N Ala

Ser Phe

Gly Asn

Lys COO

H3 N Trp

Glu Val Glu

COO

H3 N Gly

Arg Ala

Ser Phe

COO H3N

Gly Asn

Lys Trp

COO

H3N

COO Val

Clivaje qumico selectivo para metionina

Pep O Pep HN CH CH2 N CH2 S CH3 C Br CH33 CH Pep Sal de sulfonio Sal de sulfonio C NH Pep Pep Pep HN HN CH C CH C H22C HC H22C HC O O CN CN S S Br Br S CH3 HN CH H2C C H2 C O HN CN + H2C C H2 Pep O NH NH Pep Pep HN CH C NH Pep

Pep HN CH H2 C C H2 C

O + O Pep
Pep HN

H2O H2O H O CH H2C C H2 C O

NH3

NH

Pep

Lactona de la homoserina

5 Secuenciacin de pptidos

Degradacin de Edman
SS CC NN RR HHNN 22 HH N H2O O O HH NN Pep Pep pH=8 Ph Ph N N H H S R R O H N N Pep Pep Ph N N H H S R O H N Pep

H H HO S Ph N H N H H O R
Ph N N H H S HO O

H3N 3 O

Pep

O S

Ph
R

R N N H H

Tiazolinona

Feniltiocarbamilaminocido max EtOH = 245 nm H2O O H R Ph N N H 3-fenil-2-tiohidantona-5-sustituda max EtOH = 266 nm S

Espectrometra de masas Mtodos de ionizacin MALDI-MS (matrix assisted

laser desorption ionization-mass spectrometry)

Espectrometra de masas Mtodos de ionizacin

ESI-MS (electrospray
ionization-mass spectrometry)

Determinacin de estructura primaria Espectrometra de masas Determinacin de la masa molecular de la protena ESI-MS

Es una familia de picos donde la diferencia entre picos sucesivos (de derecha a izquierda) corresponde a especies que incrementan en 1 su masa y su carga

Inserto: transformacin computacional del espectro

Espectrometra de masas
As para un pico 2

Determinacin de la masa molecular de la protena: M

Y para su vecino 1

Dnde:

M: masa de la protena n2: nmero de cargas X: masa agregada (masa del H+)

El sistema de dos ecuaciones presenta dos incgnitas: M y

n2

Para averiguar M puedo usar estas ecuaciones y los valores de m/z de dos picos cualquiera vecinos Los sistemas computarizados repiten el procedimiento con todos los pares de vecinos por lo que el mtodo es muy preciso (error 0.01%)

Espectrometra de masas
1. Protelisis

Determinacin de secuencia de pptidos

tripsina

2. Tandem MS

MS-MS

Tandem MS

MS-MS

Es una familia de picos donde la diferencia entre picos sucesivos es la relacin m/z que representa a un aminocido (la nica ambigedad es entre Leu e Ile que tienen la misma masa

6 Establecimiento de secuencia

7 Localizacin de puentes disulfuro

Sntesis de pptidos

PROTECCIN DE GRUPO AMINO

Grupo Z
Grupo Z
O O Z-Cl
Coroformiato de benzilo

Cl +

O H2N CHC OCH3

NaOH

CH3 CH OO N C H O 80% Z-Ala

DESPROTECCIN DE Z CH3 CH OO N C H O Z-Ala O CH3 H2, Pd-C + HO O CH3 CH ON C H O CO2 + O

+

H3N CH C OCH3

PROTECCIN DE GRUPO AMINO

Grupo BOC
Grupo Boc
Di-t-butiloxicarbonilo O (H3C)3CO O O

O
+ OC(CH3)3

CH3 N H CH C O-

(H3C)3CO

O + H2N CH C OCH3

i) NaOH ii) H+

Boc-Ala

O 84%

+ CO 2 + (CH 3)3COH

DESPROTECCIN DE Boc O (H3C)3CO N H CH3 CH C O Boc-Ala O+

O HCl F3C-COOH 25% H3N CH C OCH3 + CO2 + CH2=C(CH3)2

PROTECCIN DE GRUPO CARBONILO O H2N CHC OCH3 EtOH H2 N CH3 CH C O O

MTODO DEL ANHIDRIDO MIXTO

Objetivo: sntedis del dipptido alanilvalina
Materiales: Z-Ala y gliciletilester
O O CH3 N CH OH C H O CH2 C O O

H2N

1-Activacin de grupo carbonilo

H3C N Cl O Z CH3 O N CH O C H O O Anhidrido mixto

CH3 + N CH OH C H O

O O

N-metil morfolina

Isobutilcloroformiato

2-Unin peptdica
H2N Z CH3 CH O O N C H O O Anhidrido mixto CH2 C O Z O H N O CH3 N H CH2 O C O + CO2 + HO-CH2CH(CH3)2

Elongacin de cadena (Repetir pasos 1 y 2)

Desproteccin final i) H2/Pd ii) NaOH

Por qu?
a

NH2-R H 3C Z O O N CH C H C O O

1 *El carbonilo a es parte de un anhidrido *El carbonilo b es parte de un anhidridoy de un ester

2 *Impedimento estrico del isobutilo para la entrada del nuclefilo en b CH3 Nuclefilo Z CH3 H3C O N CH H C O O CH2 O

MTODO DE MERRIFIELD
Objetivo: sntedis del dipptido alanilvalina Materiales: Boc-Ala y Boc -Gli
O (H3C)3CO N H CH3 CH O C O O(H3C)3CO N CH2 OH C H O

1-Unin a la resina aa carboxilo terminal

Boc CH2 OH Cl C N C + H2 H O Cs+ DMF Boc N H CH2 O C O

Boc-Gly

Resina
F3C-COOH

H3 N

CH2 O C O

2-Activacin de grupo carbonilo

CH3 Boc N H CH C O O
-

CH3
N C N CH2Cl2

Boc

N H

CH

C O

HN C N

Boc-Ala

O-acilisourea
Diciclohexilcarbodiimida

3-Unin peptdica
CH3 Boc N H CH C O O HN C N Boc H N O CH2 CH3 N H O C

+
+

H3N

CH2 O C O

Elongacin de cadena hacia extremo amino terminal (Repetir pasos 1 y 2)

Desproteccin final i) F3C-COOH 25% ii) HF