Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004) ISSN 1410-9379

Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat

67

Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari Daerah Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat
Risa Nofiani, Gusrizal
Jurusan Kimia, FMIPA (Persiapan), Universitas Tanjungpura, Pontianak 78124 Diterima 04-02-2004 Disetujui 03-03-2004

ABSTRACT
There are 18 mercury-resistant bacterias narrow spectrum have been isolated from ex illegal gold mining area with tailing 6 years. This isolation was carried out in September 2002. Mercury-resistant bacterias narrow spectrum is cultivated on solid selected medium refer to Canstein et al, (2002) which is added with 10 mikrogram/mL HgCl2. After identified followed Bergeys Manual of Determinative Bacteriology System, there were found 14 mercury-resistant bacterias narrow spectrum as Enterobacter hafniae and 4 of them as Enterobacter cloacae. Based on antibiotic resistance assay, there were found 8 isolates are resistant ampicillin, 7 isolates are resistant chloramphenicol, 17 isolates are resistant tetracycline, and 18 isolated are sensitive rifampicin. Keywords: Enterobacter hafniae, Enterobacter cloacae, mercury, organomercury

PENDAHULUAN
Pencemaran logam berat merkuri (Hg) pada tanah dan air sangat membahayakan lingkungan dan kesehatan manusia. Senyawa merkuri dalam bentuk Hg(II) dapat terikat pada residu sistein protein/enzim manusia/binatang sehingga protein/enzim kehilangan aktivitasnya. Selain Hg(II), senyawa merkuri paling berbahaya bagi kesehatan manusia adalah senyawa organomerkuri, khususnya metilmerkuri dan fenilmerkuri. Senyawa ini bersifat sangat reaktif dan mempunyai mobilitas tinggi dibanding dengan Hg(O) atau Hg(II). Hal ini disebabkan gastrointestine manusia dapat menyerap sekitar 95% senyawa metilmerkuri (Rugh et al, 2000), dan senyawa ini juga dapat menyerang syaraf manusia melalui peredaran darah (Bizily et al, 2000). Pada lingkungan perairan (aquatic) atau laut (marine) senyawa metilmerkuri mengalami biomagnification melalui jaringan makanan, khususnya untuk jaringan makanan di air (Bizily et al, 2000). Biomagnification terjadi jika metilmerkuri mencemari perairan atau laut. Sumber pencemaran merkuri dapat disebabkan oleh proses geologi dan biologi. Senyawa merkuri yang terdapat pada batu dan tanah dikikis oleh hujan dan angin. Meskipun demikian, hal itu tidak sebanding jumlahnya bila dibandingkan dengan pencemaran merkuri yang disebabkan oleh aktivitas manusia, seperti: pembakaran batubara, beberapa jenis produk minyak bumi, penggunaan fungisida merkuri,

katalisator merkuri dan penambangan emas yang menggunakan merkuri untuk ekstraksi partikel emas. Salah satu usaha untuk detoksifikasi merkuri dapat dilakukan menggunakan mikroorgansime resisten merkuri, misalnya bakteri resisten merkuri. Detoksifikasi merkuri oleh bakteri resisten merkuri terjadi karena bakteri resisten merkuri memiliki gen resisten merkuri, mer operon (Silver & Phung 1998). Struktur mer operon berbeda untuk tiap jenis bakteri. Umumnya struktur mer operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan organomerkuri liase (merB). Menurut Liebert et al, (1999), model mekanisme resisten merkuri bakteri gram negatip adalah sebagai berikut Hg(II) yang masuk periplasma terikat ke pasangan residu sistein MerP. Selanjutnya MerP mentransfer Hg(II) ke residu sistein MerT atau MerC. Akhirnya ion Hg menyeberang membran sitoplasma melalui proses reaksi pertukaran ligan menuju sisi aktif flavin disulfida oksidoreduktase, merkuri reduktase (MerA). Merkuri reduktase mengkatalisis reduksi Hg(II) menjadi Hg(0) volatil dan sedikit reaktif. Akhirnya Hg(0) berdifusi dilingkungan sel untuk selanjutnya dikeluarkan dari sel. Bakteri yang hanya memiliki protein merkuri reduktase (MerA) disebut dengan bakteri resisten merkuri spektrum sempit. Beberapa bakteri selain memiliki protein merkuri reduktase (MerA) juga memiliki protein organomerkuri liase (MerB). MerB

68

Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004)

Nofiani & Gusrizal. dan 6S digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri pada tahap berikutnya. Media seleksi padat yang digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri adalah media seleksi padat yang digunakan oleh Canstein et al, (2002) dengan variasi konsentrasi HgCl2. Komposisi media seleksi Canstein et al. (2002) terdiri dari NaCl 15 g/L, sukrosa 4 g/L dan yeast extract 2 g/L. Variasi konsentrasi HgCl2 yang digunakan adalah 1 g/mL, 5 g/mL, dan 10 g/mL. Sebelum dilakukan isolasi bakteri resisten merkuri maka dilakukan seleksi kultur bakteri yang akan digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri. Seleksi ini dilakukan dengan cara inokulasi 100 L kultur bakteri 1S dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 1 g/mL dan diinkubasi pada temperatur 30oC selama 16-24 jam. Kultur bakteri 1S juga diinokulasi pada media seleksi padat yang mengandung HgCl 2 5 g/mL dan 10 g/mL. Selanjutnya diamati jumlah koloni yang tumbuh. Sebagai kontrol kultur bakteri 1S ditumbuhkan pada media seleksi padat tanpa penambahan HgCl2. Setiap tahap seleksi kultur bakteri ini dilakukan triplo. Selain kultur bakteri 1S, seleksi ini dilakukan juga untuk kultur bakteri 3S dan 6S. Kultur bakteri yang tumbuh dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 dengan konsentrasi paling tinggi akan diisolasi untuk memperoleh isolat bakteri resisten merkuri. Hal ini dilakukan dengan cara kultur bakteri yang dapat tumbuh pada media seleksi dengan konsentrasi HgCl2 tertinggi diencerkan 10 kali. Selanjutnya 100 L kultur bakteri yang telah diencerkan diinokulasi triplo pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl 2 tertinggi dan diisolasi secara acak untuk memperoleh isolat bakteri resisten merkuri. Isolat bakteri resisten diberi kode RG1. Untuk isolat bakteri resisten merkuri selanjutnya diberi kode RG2, RG3, dan seterusnya. Identifikasi bakteri dilakukan di Unit Laboratorium Kesehatan Propinsi Kalimantan Barat dengan sistem Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Pada tahap awal identifikasi, bakteri resisten merkuri dilakukan uji morfologi dengan pewarnaan gram (Cappuccino & Sherman 1983). Isolat bakteri resisten merkuri dioles pada kaca slide dan ditambahkan 1 tetes kristal violet selama 1 menit kemudian dicuci dengan air mengalir. Isolat bakteri ditambahkan 1 tetes Grams iodine mordant (Emerck)

berfungsi dalam mengkatalisis pemutusan ikatan merkuri-karbon sehingga dihasilkan senyawa organik dan ion Hg yang berupa garam tiol. Bakteri yang memiliki kedua protein merkuri reduktase (MerA) dan organomerkuri liase (MerB) disebut dengan bakteri resisten merkuri spektrum luas. Mikroorganisme yang terdapat pada daerah tercemar merkuri berperan utama untuk detoksifikasi merkuri. Oleh karena itu, mikroorganisme yang terdapat pada daerah tercemar merkuri merupakan sumber untuk isolasi bakteri resisten merkuri. Adapun tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit dari daerah tercemar merkuri yaitu penembangan emas tanpa izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. Strain yang menunjukkan resiten merkuri dengan konsentrasi tertinggi selanjutnya diidentifikasi dan diuji resistensinya terhadap antibiotik ampisilin, rifampisin, tetrasiklin dan klorampenikol. Pengujian resistensi bakteri resisten merkuri terhadap antibiotik dilakukan untuk mengetahui fenotipe setiap bakteri resisten merkuri. Pada penelitian berikutnya, fenotipe ini akan digunakan sebagai marka untuk mengetahui kemungkinan lokasi gen mer operon bakteri resisten merkuri dengan mengunakan metode mating.

BAHAN DAN METODE

Sampling dilakukan dengan mengambil sedimen 1-5 cm dari permukaan tanah pada bulan September 2002 dari daerah bekas penambangan emas tanpa izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat. Sampel sedimen diambil pada 3 lokasi, yaitu: lokasi I dengan lama penambangan 1 tahun (1S), lokasi II dengan lama penambangan 3 tahun (3S), dan lokasi III dengan lama penambangan 6 tahun (6S). Setiap lokasi, sedimen diambil pada 3 titik. Jumlah sedimen yang diambil pada setiap titik kira-kira 2 kg. Sampel sedimen setiap titik pada lokasi 1S dicampur sehingga diperoleh sampel komposit. Sampel komposit disuspensikan ke dalam bufer salin 0,9%. Sebanyak 100L larutan jernih sampel yang telah disuspensi dalam buffer salin diinokulasi pada media nutrient broth (yeast extract 2 g/L, bacto pepton 5 g/L, NaCl 5 g/L) dan diinkubasi pada temperatur 30 o C selama 12-16 jam. Teknik perbanyakan kultur bakteri 1S digunakan juga untuk perbanyakan kultur bakteri 3S dan 6S. Selanjutnya kultur bakteri 1S, 3S,

Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya isolat bakteri ditambah etil alkohol 95% sampai kristal violet tidak larut lagi dan dicuci dengan air mengalir kembali. Akhirnya isolat bakteri ditambahkan safranin selama 45 detik dan dicuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dan diperiksa dengan mikroskop. Uji biokimia yang dilakukan meliputi tes fermentasi karbohidrat, tes pembentukan indol, tes produksi H2S, tes penggunaan sitrat, tes urease, tes dekarboksilase dan tes ONPG. Substrat yang digunakan untuk tes fermentasi karbohidrat adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sakarosa. Tes fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke 50 mL media pepton water (Kia Difco) yang mengandung 0,5 mL bromthymol blue 0,4% dan glukosa 1%, diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuk warna kuning dan tes negatif ditandai dengan warna biru. Hal yang sama dilakukan juga untuk tes fermentasi karbohidrat dengan substrat laktosa, manitol, maltosa dan sakarosa. Konsentrasi substrat yang digunakan adalah laktosa 0,5%, manitol 0,5%, maltosa 1%, dan sakarosa 2%. Tes pembentukan indol dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media water pepton selama 24-48 jam pada temperatur 300C selanjutnya ditambah 0,5 mL Kovacs reagent (Emerck) (Cappuccino & Sherman 1983; Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Tes produksi H 2 S dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media SIM (pepton 30 g/L, beef extract 3 g/L, fero amonium sulfat 0,2 g/L dan natrium tiosulfat 0,025 g/L, agar 3 g/L) selama 24-48 jam pada temperatur 300C (Cappuccino & Sherman 1983). Tes positif ditandai dengan terbentuknya endapan hitam. Hasil tes ini dapat juga digunakan untuk tes motilitas. Bakteri motil ditandai dengan bentuk koloni yang lebih besar dan keruh jika dibandingkan dengan koloni tidak motil. Tes penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media Simmons citrate agar (Sigma) dan diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 30 0C (Cappuccino & Sherman 1983). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna biru. Tes urease dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke

69

media padat urea Christensen (Sigma) selama 2448 jam pada temperatur 300C (Cappuccino & Sherman 1983). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna merah. Tes dekarboksilase dengan substrat DL-lisin dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media Decarboxylase broth base Moeller (Sigma) yang mengandung DL-lisin 2% dan diatur pH = 8 dengan penambahan NaOH 0,1 N selanjutnya diinkubasi selama 24-48 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu. Hal yang sama juga dilakukan untuk tes dekarboksilase dengan substrat DL-arginin dan DL-ornithin dengan konsentrasi 2% dan 2% secara berturut-turut. Tes ONPG dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media ONPG broth selama 24 jam pada temperatur 300C (Collins & Lyne 1985). Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Uji resisten antibiotik dilakukan dengan menginokulasi 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit pada 2 macam media seleksi padat. Pertama, media seleksi padat yang mengandung antibiotik dan diinkubasi pada suhu 300C selama 16-24 jam. Kedua. media seleksi padat yang mengandung antibiotik dan HgCl2 10 g/mL dan diinkubasi pada suhu 30 0C selama 16-24 jam. Antibiotik yang digunakan untuk uji resisten antibiotik pada kedua media adalah: ampicillin dengan konsentrasi 50 g/mL (Ausubel et al, 1995), tetracyclin dengan konsentrasi 200 g/mL (Smit et al, 1998), chloramphenicol dengan konsentrasi 50 g/mL (Smit et al, 1998) dan rifampicin dengan konsentrasi 150 g/mL (Smit et al, 1998) .

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit. Media seleksi yang digunakan untuk isolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit adalah media seleksi menurut Canstein et al, (2002). Media selaksi ini dapat mengurangi penggunaan konsentrasi HgCl2 dibandingkan dengan penggunaan media kaya lain seperti media Luria Bertani (LB). Hal ini disebabkan media seleksi Canstein et al. (2002) tidak mengurangi toksisitas Hg terhadap sel bakteri. Pada media kaya asam amino terutama asam amino sistein, toksisitas Hg berkurang, karena gugus sulfihidril sistein dapat mengikat Hg.

70

Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004)

Nofiani & Gusrizal. dibandingkan dengan 6S. Kemungkinan kultur bakteri 1S dan 3S hanya memiliki mekanisme respon dengan cara menghambat metabolisme sel (Smit et al, 1998) atau dengan sistem multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes (Nikaido 1996) sehingga kultur bakteri 1S dan 3S masih dapat hidup pada konsentrasi HgCl 2 1 dan 5 g/mL. Sistem multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes merupakan system yang dapat memompa keluar beberapa jenis obat-obatan, kation divalent atau nodulationsiganal lipooligosakarida. Pada konsentrasi lebih besar atau sama dengan HgCl2 10 g/mL kultur bakteri 1S dan 3S tidak dapat mentelorir keberadaan HgCl2. Bakteri yang dapat hidup untuk konsentrasi HgCl2 10 g/mL diduga hanya bakteri yang mengandung gen resisten merkuri. Oleh karena itu, diduga kultur bakteri 6S mengandung gen resisten merkuri spektrum sempit. Keberadaan gen resisten merkuri sampel bakteri 6S diduga berhubungan langsung dengan lamanya kandungan Hg pada lokasi penambangan. Tingginya kontaminasi Hg pada daerah tersebut akan menginduksi sel bakteri untuk menerima gen resisten merkuri dari lingkungan (Smit et al, 1998). Identifikasi Bakteri Resisten Merkuri. Delapan belas isolat bakteri resisten merkuri diidentifikasi dengan sistem Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Identifikasi dilakukan dengan uji morfologi dan aktivitas biokimia. Uji morfologi dilakukan dengan tes pewarnaan gram dan tes motilitas. Hasil pewarnaan gram delapan belas bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG4, RG5, RG6, RG7, RG8, RG9, RG10, RG12, RG13, RG16, RG17, RG19, RG20, RG21, dan RG22 yang diperiksa dengan mikroskop menunjukkan sel bewarna merah sehingga semua sel bakteri dikategorikan bakteri gram negatif (Tabel 2). Delapan belas bakteri resisten merkuri berbentuk batang (Tabel 2). Uji motilitas dengan menggunakan
Tabel 2. Uji morfologi bakteri resisten merkuri.
Hasil Uji Morfologi Kode Isolat RG1, RG2, RG3, RG4, RG5, RG6, RG7, RG8, RG9, RG10, RG12, RG13, RG16, RG17, RG19, RG20, RG21, RG22 Pewarnaan Gram Bentuk Sel Motilitas

Isolasi bakteri resisten merkuri spektrum sempit diawali dengan menginokulasi kultur bakteri 1S, 3S, dan 6S pada media seleksi padat dengan variasi konsentrasi HgCl2. Hasil inokulasi menunjukkan 6S tumbuh paling cepat pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl2 tertinggi yaitu 10 g/mL (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa bakteri 6S yang tumbuh pada media seleksi diduga adalah bakteri
Tabel 1. Kemampuan tumbuh kultur bakteri dalam media seleksi padat dengan variasi konsentrasi HgCl2. Stok Bakteri 1S 3S 6S Jumlah koloni rata-rata yang tumbuh dalam media seleksi padat yang mengandung HgCl2 Kontrol >500 >500 >500 1 g/mL >500 >500 >500 5 g/mL >500 6 koloni >500 10 g/mL Negatip Negatip >500

Negatip: tidak ada koloni yang tumbuh.

resisten merkuri dengan tingkat ketahanan merkuri yang tinggi. Hal ini berdasarkan hasil penelitian Canstein et al, (2002) yang menyatakan bahwa isolat bakteri resisten merkuri yang dapat tumbuh pada media seleksi padat dengan konsentrasi HgCl2 5 g/ mL dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut memiliki tingkat ketahanan merkuri yang tinggi. Beberapa isolat bakteri resisten merkuri dengan tingkat ketahanan merkuri yang tinggi yaitu HgCl 2 5 g/mL adalah Pseudomonas stutzeri Ibu8, Pseudomonas putida Spi3, Psedomonas putida Spi4, Pseudomonas putida Elb2, Pseudomonas putida Kon12, dan Pseudomonas aeruginosa Bro12 (Canstein et al, 2002). Hasil inokulasi bakteri resisten merkuri dari kultur bakteri 6S yang telah diencerkan 10 kali diperoleh kira-kira 50 koloni/cawan petri. Tiap cawan petri diisolasi secara acak sebanyak 7 koloni sehingga diperoleh 18 isolat bakteri resisten merkuri. Resistensi kultur bakteri 1S, 3S, dan 6S terhadap merkuri anorganik berbeda. Menurut Smit et al, (1998), perbedaan resistensi ini berhubungan dengan mekanisme respon populasi bakteri terhadap merkuri. Ada 3 mekanisme respon terhadap stres merkuri. Pertama, dengan cara menghambat metabolisme sel sehingga pertumbuhan sel lambat atau sel mati. Kedua, menginduksi sistem operon resisten merkuri untuk bekerja sehingga sel tetap hidup dalam kondisi stres. Ketiga, adanya plasmid yang mengandung gen resisten merkuri yang masuk ke dalam sel. Kultur bakteri 1S dan 3S menunjukkan resistensi merkuri anorganik lebih rendah

Bakteri Gram Negatip

Batang

Motil

Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat media semipadat SIM menunjukkan 18 bakteri resisten merkuri adalah motil (Tabel 2). Motilitas bakteri resisten merkuri disebabkan karena sel bakteri memiliki flagela. Identifikasi bakteri berdasarkan uji aktivitas biokimia dilakukan dengan cara membandingkan aktivitas biokimia setiap bakteri. Aktivitas biokimia setiap jenis bakteri berbeda. Hal ini disebabkan karena setiap bakteri mempunyai akivitas enzimatik yang berbeda. Tes fermentasi karbohidrat menunjukkan 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 mampu melakukan fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sakarosa tetapi 14 isolat bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21, dan RG22 hanya mampu melakukan fermentasi karbohidrat dengan substrat glukosa, manitol, maltosa dan sakarosa (Tabel 3).
Tabel 3. Uji biokimia bakteri resisten merkuri.

71

menyebabkan pH media fermentasi menurun sehingga indikator bromthymol blue yang terdapat pada media berubah dari biru menjadi kuning. Tes produksi indol bakteri bertujuan untuk memeriksa kemampuan bakteri mendegradasi asam amino esensial triptopan (Cappuccino & Sherman 1983). Enzim yang berperan dalam proses ini adalah triptopanase. Produk metabolit triptopan adalah indol, asam piruvat dan amonia. Keberadaan indol dideteksi dengan Kovacs reagent yang menyebabkan terbentuknya warna merah. Warna merah terjadi karena terbentuknya komplek antara indol dan pdimetilaminobenzaldehid dari Kovacs reagent. Delapan belas bakteri resisten merkuri menunjukkan bakteri tersebut tidak mampu mendegradasi triptopan atau tes negatif (Tabel 3). Beberapa bakteri mampu mereduksi sulfur organik yang terdapat pada asam amino sistein. Reaksi ini dibantu oleh enzim sistein desulferase

Kode Isolat

Fermentasi Karbohidrat Glukosa +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas +, gas Lak tosa + + + + Mani tol + + + + + + + + + + + + + + + + + + Mal tosa + + + + + + + + + + + + + + + + + +

RG1 RG2 RG3 RG4 RG5 RG6 RG7 RG8 RG9 RG10 RG12 RG13 RG16 RG17 RG19 RG20 RG21 RG22

Hasil Uji Biokimia Penggu Dekarbok Pemben Pro naan silase duksi tukan Urease Sitrat Lisin Arginin Orni Indol H2S Saka thin rosa + + + + + + + + + + + + + +, lambat + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +, lambat + + + + +, lambat + + + + + + + + + + + + + + + + +, lambat + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

ON PG

Kesimpulan

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

E. hafniae RG1 E. hafniae RG2 E. hafniae RG3 E. cloacae RG4 E. hafniae RG5 E. hafniae RG6 E. hafniae RG7 E. hafniae RG8 E. cloacae RG9 E. cloacae RG10 E. hafniae RG12 E. hafniae RG13 E. hafniae RG16 E. cloacae RG17 E. hafniae RG19 E. hafniae RG20 E. hafniae RG21 E. hafniae RG22

(+): hasil tes positif; (-): hasil tes negatif.

Kemampuan bakteri resisten merkuri melakukan fermentasi karbohidrat ditandai dengan adanya produksi asam organik (asam asetat, asam laktat, asam formiat dan asam suksinat) dan gas (karbon dioksida dan hidrogen) (Cappuccino & Sherman 1983). Produksi asam organik

(Cappuccino & Sherman 1983). Kemampuan bakteri menghasilkan H 2S digunakan juga untuk melihat aktivitas biokimia bakteri resisten merkuri. Hasil tes produksi H2S pada 18 isolat bakteri resisten merkuri menunjukkan bakteri resisten merkuri tidak memiliki enzim sistein desulferase sehingga tidak mampu menghasilkan H2S atau tes negatif (Tabel 3).

72

Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004)

Nofiani & Gusrizal. arginin, dan ornithin. Tes dekarboksilasi lisin negatif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 dan positif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 (Tabel 3). Tes dekarboksilasi arginin positif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 dan negatif untuk bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 (Tabel 3). Tes dekarboksilasi ornithin positif untuk 18 bakteri resisten merkuri (Tabel 3). Keberadaan enzim -galaktosidase pada bakteri dapat dideteksi apabila bakteri diinokulasi dalam media cair ONPG. Bakteri yang mengandung -galaktosidase dapat menghidrolisa o-nitrofenil-Dgalaktopiranosida (ONPG) sehingga dihasilkan onitrofenil yang bewarna kuning (Collins & Lyne 1985; Barnett & Venghaus 1988). Tes ONPG 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan 18 bakteri resisten merkuri positip memiliki enzim -galaktosidase. Identifikasi spesies dari 18 bakteri resisten merkuri dilakukan dengan cara mencocokkan hasil uji morfologi dan uji aktivitas biokimia 18 bakteri resisten merkuri dengan tabel uji morfologi dan uji aktivitas biokimia spesies yang terdapat pada Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Hasil identifikasi 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan bahwa 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 diduga adalah bakteri jenis Enterobacter cloacae dan 14 bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22 diduga adalah bakteri Enterobacter hafniae (Tabel 3). Uji Resistensi Antibiotik Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit. Hasil uji resisten antibiotik dengan dua jenis media seleksi yang mengandung antibiotik dan media seleksi yang mengandung antibiotik dan HgCl 2 menunjukkan tidak ada perbedaan (Tabel 4). Strain bakteri yang resisten terhadap ampicillin dalam media seleksi yang mengandung ampicillin menunjukkan resisten ampicillin juga terhadap media seleksi yang mengandung HgCl2 10 g/mL dan ampicillin. Hasil uji resisten antibiotik menunjukkan bahwa 9 isolat resisten terhadap ampicillin, 7 isolat resisten terhadap chloramphenicol, dan 17 strain

Bakteri coliform dapat meggunakan sitrat sebagai sumber energi apabila tidak ada glukosa atau laktosa. Hal ini dapat terjadi jika bakteri coliform memiliki enzim sitrat permease (Cappuccino & Sherman 1983; Barnet & Venghaus 1989). Sitrat permease berperan dalam membawa sitrat dari luar sel ke dalam sel. Sitrat yang telah berada di dalam sel akan masuk ke dalam siklus Krebs. Sitrat merupakan intermediet utama siklus Krebs. Pada siklus Krebs, sitrat akan diubah menjadi asam oksaloasetat dan asam asetat dengan bantuan enzim sitrase. Selanjutnya asam oksaloasetat dan asam asetat dirubah menjadi asam piruvat dan karbon dioksida. Karbon dioksida bereaksi dengan air dan natrium yang terdapat pada media Simmons citrate agar sehingga membentuk natrium bikarbonat. Keberadaan natrium bikarbonat mengakibatkan media bersifat basa sehingga merubah warna indikator bromthymol blue dari hijau menjadi biru. Tes penggunaan sitrat positif ditandai dengan adanya enzim sitrat permease pada bakteri. Hasil tes penggunaan sitrat menunjukkan bahwa 18 isolat bakteri resisten merkuri memiliki enzim sitrat permease atau tes positif (Tabel 3). Urease merupakan suatu enzim pemecah ikatan karbon dan nitrogen pada senyawa amida. Senyawa amida yang dapat digunakan untuk tes urease adalah urea (Cappucino & Sherman 1983; Barnett & Venghaus 1988). Urea dengan adanya enzim urease akan diubah menjadi karbon dioksida dan amoniak. Keberadaan enzim dideteksi dengan berubah warna media cair urea menjadi merah. Hasil tes urease untuk 18 bakteri resisten merkuri menunjukkan 4 bakteri resisten merkuri dengan kode RG4, RG9, RG10 dan RG17 memiliki enzim urease tes positip dan 14 bakteri resisten merkuri dengan kode RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21, dan RG22 tidak memiliki enzim urease atau tes negatif (Tabel 3) Reaksi dekarboksilasi dari suatu asam amino merupakan reaksi pemecahan gugus karboksil oleh enzim dekarboksilase, sehingga dihasilkan amin dan karbon dioksida (Collin & Lyne 1985). Keberadaan amin menyebabkan warna media dekarboksilasi Moeller menjadi warna ungu (tes positif). Tes dekarboksilasi asam amino dilakukan dengan menggunakan 3 substrat asam amino yaitu lisin,

Bakteri resisten merkuri dari PETI Kalimantan Barat resisten terhadap tetracycilin tetapi semua strain sensitif terhadap antibiotik rifampicin (Tabel 4). Tujuh belas bakteri resisten merkuri spektrum sempit resisten terhadap tetracyclin. Resistensi ini kemungkinan disebabkan karena jenis bakteri yang

73

diduga karena E. cloacae RG9 mengandung plasmid yang tidak mengandung gen resisten antibiotik atau E. cloacae RG9 tidak mengandung plasmid. Jika E. cloacae RG9 tidak memiliki plasmid berkemungkinan besar mer operon bakteri ini terletak pada kromosom.

Tabel 4. Uji resistensi antibiotik beberapa strain bakteri resisten merkuri.

Strain E. hafniae RG1 E. hafniae RG2 E. hafniae RG3 E. cloacae RG4 E. hafniae RG5 E. hafniae RG6 E. hafniae RG7 E. hafniae RG8 E. cloacae RG9 E. clacaae RG10 E. hafniae RG12 E. hafniae RG13 E. hafniae RG16 E. cloacae RG17 E. hafniae RG19 E. hafniae RG20 E. hafniae RG21 E. hafniae RG22

Resistensi Amp + + + + + + + + + Tet + + + + + + + + + + + + + + + + + Rif Chlo + + + + + + + HgCl2 +Amp + + + + + + + + + HgCl2 + Tet + + + + + + + + + + + + + + + + + HgCl2 + Rif HgCl2 + Chlo + + + + + + + -

Amp: ampicillin, Tet: tetracyclin, Rif: rifampicin, Chlo: chloramphenicol, +: resisten terhadap antibiotik, -: sensitif terhadap antibiotik.

diperoleh adalah bakteri gram negatif yaitu genus Enterobacter. Menurut Nikaido (1996) dan Hernandez et al, (1998), bakteri gram negatif lebih resisten terhadap obat-obatan dibandingkan dengan bakteri gram positip. Karena bakteri gram negatif mempunyai sistem efflux aktif untuk obat-obatan, yaitu multidrug, multication, atau nodulation signal efflux complexes. Kemungkinan lain adalah adanya gen resisten tetracyclin yang terdapat di dalam sel. Gen ini masuk ke dalam sel bersamaan dengan mer operon (Liebert et al, 1999). Contoh plasmid NR1 yang membawa mer operon dan bermacam-macam gen resisten antibiotik. Dari hasil penelitian ini ternyata isolat yang berasal dari spesies yang sama menunjukkan resistensi yang berbeda terhadap antibiotik chloramphenicol dan ampicillin. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya perbedaan jenis plasmid yang masuk ke dalam sel. Perbedaan jenis plasmid yang masuk biasanya ditandai dengan adanya penanda berupa antibiotik. E. cloacae RG9 menunjukan fenotipe resisten terhadap merkuri spektrum sempit tetapi sensitif terhadap semua jenis antibiotik yang diuji. Hal ini

KESIMPULAN
Bakteri resisten merkuri telah diisolasi dari daerah bekas penambangan emas tanpa izin (PETI) yang berumur 6 tahun dari daerah Mandor, Kalimantan Barat. Media seleksi yang digunakan isolasi bakteri resisten merkuri adalah media seleksi padat Canstein et al, (2002) yang mengandung HgCl2 10 g/mL. Hasil isolasi bakteri resisten merkuri diperoleh 18 isolat bakteri resisten merkuri spektrum sempit. Hasil identifikasi 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit diperoleh 2 spesies bakteri, yaitu: E. cloacae untuk kode strain RG4, RG9, RG10, dan RG17, dan E. hafniae untuk strain RG1, RG2, RG3, RG5, RG6, RG7, RG8, RG12, RG13, RG16, RG19, RG20, RG21 dan RG22. Uji resistensi antibiotik terhadap 18 bakteri resisten merkuri spektrum sempit menunjukkan 17 bakteri resisten terhadap tetracyclin 100 g/mL , yaitu E. hafniae RG1, E. hafniae RG2, E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. hafniae RG6, E. hafniae RG7, E. hafniae RG8, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. hafniae RG16, E. cloacae RG17, E. hafniae RG19, E. hafniae RG20, E. hafniae RG21 dan E. hafniae RG22. Semua bakteri sensitif terhadap rifampicin 150 g/mL. Sembilan

74

Jurnal Natur Indonesia 6(2): 67-74 (2004)

Nofiani & Gusrizal.

Buchanan, R.E. & Gibbons, N.E. 1974. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: The William and Wilkins. Canstein, H.V., Li, Y., Leonhauser, J., Haase, E., Felske, A., Deckwer, W.D. & Dobler, I.W. 2002. Spatially oscillating activity and microbial succession of mercury-reducing biofilms in a technical-scale bioremediation system. Appl. Environ. Microbiol. 68: 1938-1946. Cappuccino, J.G. & Sherman, N. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. California: Addison-Wesley. Collins, C.H. & Lyne, P.M. 1985. Microbiological Methods. London: Butterworth & Co. Hernandez, A., Mellado, R.P. & Martinez, J.L. 1998. Metal accumulation and vanadium-induced multidrug resistance by environmental isolates of Escherichia hermanii and Enterobacter cloacae. Appl. Environ. Microbiol. 64: 43174320. Liebert, C.A., Hall, R.M. & Summers, A.O. 1999. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63: 507-522. Nikaido, H. 1996. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 178: 5853-5859. Rugh, C.L., Bizily, S.P. & Meagher, R.B. 2000. Phytoreduction of Environmental Mercury Pollution. New York: John Wiley and Sons. Smit, E., Wolters, A. & Elsas, J.D.V. 1998. Self-transmissible mercury resistance plamids with gene mobilizing capacity in soil bacterial populations: influence of wheat roots and mercury addition. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1210-1219. Silver, S. & Phung, L.T. 1996. Bacterial heavy metal resistance: new suprises. Annu. Rev. Microbiol. 50: 753-789.

strain resisten merkuri menunjukkan resisten terhadap ampicillin 50 g/mL, yaitu: E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. hafniae RG8, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. cloacae RG17, E. hafniae RG19 dan E. hafniae RG22. Tujuh bakteri menunjukkan resisten terhadap chloramphenicol 25 g/mL, yaitu E. hafniae RG3, E. cloacae RG4, E. hafniae RG5, E. cloacae RG10, E. hafniae RG12, E. hafniae RG16 dan E. cloacae RG19.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini di danai oleh Proyek Pengembangan Diri Forum HEDS tahun 2002. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Fadjar Riyanto dan Harald von Canstein atas saran yang diberikan pada penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA.
Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Sith, J.A. & Struhl, K. 1995. Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley. Barnet, M.E. & Venghaus, J.D. 1989. Microbiology Laboratory Exercise. Lowa: Brown Publisher Bizily, S.P., Rugh, C.H. & Meagher, R.C. 2000. Phytodetoxification of hazardous organomercurials by genetically engineered Plants. Nat. Biotechnol. 18: 213-217.