LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PERCOBAAN IX AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROBA

OLEH NAMA STAMBUK KELOMPOK ASISTEN : NIA SASRIA : F1C1 09 042 : V (LIMA) : SUMARLIN

LABORATORIUM KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALUOLEO KENDARI 2011

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Mikroba seperti makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam mengkultivasi, mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba. Mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba. Media adalah substansi yang memenuhi kebutuhan nutrisi mikroorganisme. Pertumbuhan suatu mikroba beserta koloninya dalam suatu media dapat dipercepat dengan menggunakan mikroorganisme lain yang bertindak sebagai enzim atau katalisator. Enzim ini memiliki aktivitas-aktivitas tertentu sesuai dengan media tumbuhnya. Oleh karena itu, pada percobaan kali ini dilakukan beberapa uji aktivitas enzimatis suatu mikroba. B. Rumusan masalah Rumusan masalah yang perlu dikaji pada praktikum kali ini yaitu teknikteknik apa saja yang dapat digunakan untuk menguji aktivitas enzimatis mikroba. C. Tujuan Berdasarkan rumusan masalah, maka tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatis mikroba.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA Medium pertumbuhan adalah tempat untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energi dan untuk bahan pembangun sel, untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroba mempunyai sifat fisiologi tertentu, sehingga memerlukan nutrisi tertentu pula. Susunan kimia sel mikroba relatif tetap, baik unsur kimia maupun senyawa yang terkandung di dalam sel. Dari hasil analisis kimia diketahui bahwa penyusun utama sel adalah unsur kimia C, H, O, N, dan P, yang jumlahnya + 95 % dari berat kering sel, sedangkan sisanya tersusun dari unsur-unsur lain (Anonim, 2008). Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakkan campuran menjadi biakan murni. (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel individu). Mikroorganisme dibiakkan dilaboratorium pada bahan nutrien yang disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai bergantung pada beberapa faktor salah satu diantaranya ialah macam organisme yang akan ditumbuhkan (Schegel, 1994). Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksi-reaksi kimia didalam sistem biologi. Katalisator mempercepat reaksi kimia. Walaupun katalisator ikut serta dalam reaksi, ia kembali ke keadaan semula bila reeaksi telah selesai. Enzim adalah katalisator protein untuk reaksi-reaksi kimia pasa sistem biologi. sebagian besar reaksi tersebut tidak dikatalis oleh enzim. Berbeda dengan katalisator nonprotein (H+, OH-, atau ion-ion logam), tiap-tiap enzim mengkatalisis sejumlah kecil reaksi, kerapkali hanya satu. Jadi enzim adalah katalisator yang reaksi-spesifik karena semua reaksi biokimia perlu dikatalis oleh enzim, harus

terdapat banyak jenis enzim. Sebenarnya untuk hampir setiap senyawa organik, terdapat satu enzim pada beberapa organisme hidup yang mampu bereaksi dengan dan mengkatalisis beberapa perubahan kimia. Walaupun aktivitas katalik enzim dahulu diduga hanya diperlihatkan oleh sel-sel yang utuh (karena itu istilah enzyme, yaitu, dalam ragi), sebagian besar enzim dapat diekstraksi dari sel tanpa kehilangan aktivitas biologik (katalik) nya. Oleh karena itu, enzim dapt diselidiki diluar sel hidup. Ekstrak yang mengandung enzim dipakai pada penyelidikan reaksi-reaksi metabolik dan pengaturanya, struktur dan mekanisme kerja enzim dan malahan sebagai katalisator dalam industri pada sintetis senyawa-senyawa yang biologis aktif seperti hormon dan obat-obatan (Indah, 2004). Enzim adalah biokatalisator yang merupakan molekul biopolimer dan tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memiliki peranan yang sangat penting dalam berbagai reaksi kimia yang terjadi di dalam sel yang mungkin sangat sulit dilakukan oleh reaksi kimia biasa. Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau berfungsi menghidrolisis ata memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah ikatan -1,4 glikosidik rantai glukan pati dari sebelah dalam (Darmajana et al, 2008). Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi dampak pencemaran dan pemborosan energi karena reaksinya tidak membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun. Protease menupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasinya yang sangat luas. Industri pengguna protease diantaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil,

makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan limbah. Oleh karena itu, tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia. Protease alkalin merupakan jenis protease yang paling banyak diaplikasikan dalam bidang industri (Akhdiya, 2003).

BAB III METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Haluoleo. Waktu praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 15 Oktober 2011. B. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu gelas kimia, gelas ukur 100 ml, kaca objek, mikropipet, jarum ose, erlenmeyer, cawan petri, bunsen, pipet tetes, Laminar Air Flow, korek api, dan alat semprot. 2. Bahan Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu alkohol, susu skim, pati, twin, minyak goreng, Rodhamin-B, media NA, media SMA (Skim Milk Agar), isolat bakteri, lugol iodin, H2O2 10%, fenilhidrasin klorida 1%, aluminium foil, isolasi, dan tissu.

C. Prosedur Kerja 1. Pembuatan Reagen dan Media a. Pembuatan reagen lugol iodin Padatan KI - Ditimbang 3 gr - Dilarutkan dalam 100 ml akuades Padatan Iodin - Ditimbang 6 gr

- Dicampurkan dalam gelas kimia - Dipanaskan sampai iodnya larut - Dimasukan dalam botol gelap Reagen lugol iodin b. Pembuatan reagen fenilhidrasin klorida 1% Padatan fenilhidrasin klorida Dimasukan dalam gelas kimia Ditimbang 0,3 gr Dilarutkan dalam 30 ml akuades Diaduk Dimasukan dalam botol gelap

Reagen fenilhidrasin klorida 1% c. Pembuatan media NA (Nutrient Agar) Amilolitik 0,05 g pepton + 0,45 g agar-agar dimasukkan dalam erlenmeyer ditambahkan 30 mL akuades ditambahkan pati 0,5 gr diaduk hingga homogen disterilkan dengan autoklaf

Media NA

d. Pembuatan media Lipolitik 0,05 g pepton + 0,45 g agar-agar dimasukkan dalam erlenmeyer ditambahkan 30 mL akuades ditambahkan 5 ml twin ditambahkan 2 sendok makan minyak ditambahkan Rodhamin-B diaduk hingga homogen disterilkan dengan autoklaf

Media lipolitik

e. Pembuatan media SMA (Skim Milk Agar) Proteolitik 0,05 g pepton + 0,45 g agar-agar Media SMA 2. Uji Aktivitas Mikroba a. Uji Amilolitik dimasukkan dalam erlenmeyer ditambahkan 25 mL akuades ditambahkan 2 gram susu skim diaduk hingga homogen disterilkan dengan autoklaf

NA yang mengandung pati Diinokulasi dengan bakteri isolat Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37C Ditetesi cawan dengan lugol iodine hingga seluruh permukaan media terkena Diamati perubahan yang terjadi

Terlihat zona jernih di sekeliling koloni (Uji positif)

c. Uji Katalase Media NA (Amilolitik) Media SMA (Proteolitik) - Diinokulasi dengan bakteri isolat - Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37C - Diambil satu ose koloni bakteri secara aseptis pada masing-masing media - Diinokulasikan pada kaca objek - Diteteskan H2O2 menggunakan mikropipet - Diamati perubahan yang terjadi pada kedua media Media NA (Amilolitik) : Terdapat gelembung (Uji positif) Media SMA (Proteolitik) : Terdapat gelembung (Uji positif) d. Uji Oksidase Media NA (Amilolitik) Media SMA (Proteolitik) - Diinokulasi dengan bakteri isolat - Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37C - Diambil satu ose koloni bakteri secara aseptis pada masing-masing media - Diinokulasikan pada kaca objek - Diteteskan fenilhidrasin klorida menggunakan mikropipet - Diamati perubahan yang terjadi pada kedua media Media NA (Amilolitik) : Tidak terdapat gelembung (Uji negatif) Media SMA (Proteolitik) : Tidak terdapat gelembung (Uji negatif)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan No. 1. Uji Aktivitas Enzim o Uji Amilolitik - Diinokulasi media NA
dengan bakteri isolat

Perlakuan

Pengamatan
Terlihat zona jernih di sekeliling koloni (Uji positif)

- Diinkubasi selama 48 jam

pada suhu 37C - Ditetesi cawan dengan lugol iodine hingga seluruh permukaan media terkena

zona bening 2. o Uji Katalase

1. Uji katalase amilolitik

- Diinokulasi media NA

gelembung gas
2. Uji katalase proteolitik

gelembung gas 3 o Uji Oksidase 1. Uji oksidase amilolitik

1. Uji katalase (Amilolitik) & SMA amilolitik (Proteolitik) dengan Media NA bakteri isolat (Amilolitik) : Terdapat - Diinkubasi selama 48 jam gelembung pada suhu 37C (Uji positif) - Diambil satu ose koloni bakteri secara aseptis pada 2. Uji katalase masing-masing media proteolitik - Diinokulasikan pada kaca Media SMA objek (Proteolitik) : - Diteteskan H2O2 Terdapat menggunakan mikropipet gelembung (Uji positif)

tidak ada gelembung gas 2. Uji oksidase proteolitik

1. Uji oksidase amilolitik (Amilolitik) & SMA Media NA (Proteolitik) dengan (Amilolitik) : bakteri isolat Tidak terdapat - Diinkubasi selama 48 jam gelembung pada suhu 37C (Uji negatif) - Diambil satu ose koloni bakteri secara aseptis pada 2. Uji oksidase masing-masing media proteolitik - Diinokulasikan pada kaca Media SMA objek (Proteolitik) : - Diteteskan fenilhidrasin Tidak terdapat klorida menggunakan gelembung mikropipet (Uji negatif)

- Diinokulasi media NA

tidak ada gelembung gas

B. Pembahasan Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat dan dapat tumbuh pada substrat yang murah. Reaksi-reaksi seperti hidrolisa dan oksidasi berlangsung sangat cepat di dalam sel-sel hidup pada pH kira-kira netral dan pada suhu tubuh. Ini dapat terjadi karena adanya enzim. Enzim disintesa di dalam sel, tetapi setelah diekstraksi di luar sel, enzim masih mempunyai aktivitas. Pada percobaan ini dilakukan beberapa uji aktivitas dari enzim amilase, katalase dan oksidase. Uji aktivitas tersebut dilakukan dengan menggunakan medium NA dan SMA yang merupakan substrat yang baik untuk mengisolasi bakteri penghasil enzim amilase dan protease yang digunakan dalam uji amilolitik, katalase, dan oksidase. Pertama, uji yang dilakukan yaitu uji amilolitik. Uji ini membutuhkan enzim amilase yang akan menghidrolisis amilum menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Mekanisme kerja dari enzim amilase adalah dengan cara memecah ikatan -1,4 glikosidik rantai glukan pati dari sebelah dalam sehingga menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik ini adalah lugol iodin, dimana amilum akan bereaksi dengan iodin membentuk kompleks berwarna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodin masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Sehingga akan terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni. Zona jernih ini menunjukan adanya aktivitas dari

enzim amilase dalam menghidrolisis pati. Hal ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dalam percobaan ini. Selanjutnya dilakukan uji katalase menggunakan kaca objek dengan suspensi bakteri amilolitik dari media NA dan bakteri proteolitik dari media SMA. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menambahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Dimana reaksi yang terjadi untuk uji positif yaitu :

Dari uji katalase yang dilakukan untuk bakteri amilolitik dari media NA diketahui bahwa bakteri ini dapat menghasilkan enzim katalase setelah penambahan H2O2, yang ditandai dengan adanya gelembung gas. Begitupun dengan bakteri proteolitik dari media SMA diperoleh hasil yang sama dengan bakteri amilolitik tersebut. Terakhir dilakukan uji oksidase, dimana perlakuannya sama dengan uji katalase, hanya saja pada uji ini reagen yang digunakan bukan H2O2 tetapi fenilhidrasin klorida. Kemampuan bakteri dalam memproduksi enzim oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkannya setelah pemberian reagen oksidase tersebut pada koloni bakteri. Tetapi dalam percobaan ini uji yang dihasilkan negatif karena setelah penambahan fenilhidrasin klorida, bakteri amilolitik dan proteolitik yang digunakan tidak dapat memproduksi enzim oksidase yang terlihat hanya kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen.

BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan Berdasarkan tujuan di atas, maka dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzimatis mikroba dapat diketahui dengan melakukan uji amilolitik yang ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni bakteri, uji katalase yang ditandai dengan adanya gelembung gas, dan uji oksidase yang juga ditandai dengan adanya gelembung gas.

DAFTAR PUSTAKA Akhdiya, Alina. 2006. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil. Jurnal Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Vol.9. No.2. Anonim, 2008, Nutrisi Dan Medium Kultur Mikroba. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum. Universitas Gadjah Mada. Darmajana, Doddy A., Wawan Agustina, Wartika. 2008. Pengaruh Konsentrasi Enzim -Amilase Terhadap Sifat Fisik Dan Organoleptik Filtrat Bubur Buah Pisang (Bahan Pembuatan Tepung Pisang Instan). Jurnal Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II. Indah, Mutiara. 2004. Enzim. Jurnal USU digital library. Schegel, H., 1994. Mikrobiologi Umum. UGM-Press. Yogyakarta.