ESTANDARIZACIN DE UNA TCNICA DE PCR MLTIPLE (mPCR) PARA LA DETECCIN DE Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp.

Y Listeria monocytogenes EN PRODUCTOS CRNICOS DE AVE Snchez Chaparro M.M.1, Meza Velzquez F1, Gmez Escobedo I.A1* Unidad de Genmica Aplicada. Escuela de Ciencias Biolgicas. Universidad Autnoma de Coahuila. Blvd. Torren-Matamoros Km. 7.5 Ciudad Universitaria U. A. de C. Campus Torren, Coahuila, Mxico. Telfono: (871)75717 85. Correspondencia: anali_gamez@yahoo.com.mx Palabras clave: Estandarizacin, PCR mltiple, deteccin de patgenos RESUMEN En el presente trabajo se propuso desarrollar un ensayo de PCR mltiple (mPCR) para la deteccin simultnea de Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en muestras de alimentos crnicos. La mPCR emplea primers especie-especficos para los genes Stx2A, Its y Hly de cada una de las bacterias antes mencionadas. Los productos de amplificacin fueron de 553, 312 y 210 pares de bases (bp) respectivamente y fueron detectados mediante electroforesis en gel de agarosa. Las bacterias enteropatgenas, se cultivaron y se inocularon en diferentes productos crnicos procedentes de aves de corral para su anlisis por mPCR; fue posible detectar por esta tcnica las bacterias propuestas en el presente estudio. La sensibilidad del ensayo se determin aislando ADN de las tres cepas puras para las cuales se estandariz la tcnica, con el fin de determinar la concentracin mnima detectable de ADN, la cual fue de 50 ng/l. Por ltimo, se realizaron pruebas en muestras de alimento inoculadas artificialmente y se utiliz un cegamiento sencillo en el cual fueron realizados los protocolos de extraccin y de amplificacin estandarizados, donde se logr identificar las bacterias. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la tcnica de mPCR es hace viable a ser validada para la identificacin rpida y confiable de tres patgenos contaminantes en alimentos derivados de carne de ave. ABSTRACT The aim of this work was to develop a multiplex PCR assay (mPCR) for simultaneous detection of Escherichia coli O157: H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes in food samples of meat. This technique uses specie-specific primers for Stx2A, Its, and Hly genes from each aforementioned bacterial species. Amplification products were 553, 312 and 210 bp, respectively and they were detected by agarose gel electrophoresis. Enteropathogenic bacteria were grown and inoculated in different poultry meat products and then analized by mPCR; it was possible to realize bacteria by the technique proposed in this study. The sensitivity assay was carried out by DNA isolating from the three inbred strains for which the technique was standardized in order to determine the minimum detectable concentration of DNA, which was 50 ng/ml. Finally, tests were performed on artificially inoculated food samples and a simple blinding was performed in which extraction protocols and standardized amplification were used, from which the bacteria were identified. The results indicated that mPCR technique is feasible to be implemented for a rapid and reliable identification of three food borne pathogens in poultry products.

Introduccin Las enfermedades de transmisin alimentaria (ETAs) es un rea de creciente inters dentro del rea de la microbiologa, debido al consumo generalizado de alimentos preparados o empaquetados y a la gran responsabilidad que implica para los establecimientos dedicados a la preparacin y distribucin de los mismos, puesto que normativamente se requiere mantener altos estndares de calidad en materia de inocuidad y prevenir la contaminacin por organismos comnmente encontradas en los alimentos como E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus, etc. (1) Son infecciones activas resultantes de la ingestin de un alimento contaminado por un patgeno o la ingesta pasiva de toxinas. Los alimentos frescos son alterados por una variedad de microorganismos; en el caso de la carne, las bacterias entricas son patgenos que viven en el intestino de los animales y que en los mataderos, pueden contaminar la carne (2).

Afecciones del tipo de las ETAs son originadas a partir de una fuente puntual y pueden afectar a cientos de personas, la Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) report que durante la ejecucin del Proyecto de calidad microbiolgica de los alimentos en el 2005, se registraron cerca de 2 millones de casos de salmonelosis, adems que alrededor de 6,000 muestras provenientes de carne y derivados estaban contaminadas (3). La contaminacin de estos alimentos por patgenos, puede conducir a su transformacin como alimento infeccioso o txico segn sea el microorganismo que llegue a contaminar (1). La carne de ave de corral es un alimento propenso a sufrir una contaminacin superficial producida por microorganismos que causan su alteracin e incluso intoxicaciones alimentarias. La Direccin General de Epidemiologa (DGE) report que en el 2003 hubo cerca de 800,000 de casos de enfermedades gastrointestinales atribuidas al consumo de alimentos derivados de aves. La contaminacin se genera por los microorganismos presentes en las plumas, piel, conductos intestinales y respiratorios de las aves, entran en contacto con las instalaciones, lo que permite el paso de los microorganismos a la carne produciendo una contaminacin cruzada (4). Los mtodos microbiolgicos desarrollados y aplicados actualmente para determinar inocuidad de alimentos involucran el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de la bacteria con un tiempo mnimo de siete das, lo que podra ser una desventaja si comparamos estas tcnicas con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la cual es considerada como un mtodo alternativo usada en inocuidad alimentaria y con el cual se puede determinar la presencia de patgenos en una muestra en un tiempo de veinticuatro horas y con alta sensibilidad el uso de la PCR. Estos procedimientos apoyaran al control sanitario en las empresas Tipo Inspeccin Federal (TIF) que exportan carne, con lo cual ayudara a cumplir con las regulaciones establecidas por el Servicio de Seguridad de Alimentos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (FSIS/USDA), adems de que se obtendrn mejores procesos de diagnstico que conducirn a una mayor seguridad alimenticia (5). Por lo mencionado anteriormente, se realiz un mtodo estandarizado para la rpida y confiable identificacin de cuatro patgenos de relevancia en el rea de inocuidad alimentaria, utilizando la tcnica de PCR en su variante de amplificacin mltiple, la cual implica la deteccin simultanea de E. coli O157:H7, L. monocytogenes y Salmonella spp., con lo cual se logra tener un mtodo de identificacin ms eficaz y sensible que las tcnicas actuales de identificacin. Metodologa El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Genmica Aplicada la Escuela de Ciencias Biolgicas, de la Universidad Autnoma de Coahuila Unidad Torren (U. A. de C.), en la ciudad de Torren, Coahuila., Mxico. Microorganismos usados en el estudio Se emplearon tres gneros bacterianos distribuidos de la siguiente manera: 1 cepa de Escherichia coli O157:H7, 1 cepa de Listeria monocytogenes y 1 cepa de Salmonella spp., siendo un total de tres microorganismos de estudio a analizar. Las cepas fueron obtenidas del Centro Regional de Enfermedades Contagiosas (CRECEI), perteneciente al Departamento de Microbiologa, de la Facultad de Medicina de la Universidad Autnoma de Nuevo Len (UANL). Todas las cepas a estudiar, se preservaron en medio Luria-Bertani (LB) suplementados con glicerol a una concentracin de 30% (v/v) y almacenadas en nitrgeno lquido. Las condiciones de crecimiento empleadas para estas bacterias fue en cultivos de caldo LB durante 24 horas a 37C y 150 rpm. Extraccin de ADN cromosomal a partir de cultivos puros Se estandariz el protocolo universal de aislamiento de ADN total en bacterias, propuesto por Graves y Swaminathan (2000) (6), el cual fue modificado para lograr optimizar el tiempo empleado para la obtencin del producto. Para la determinacin de la concentracin de ADN de las muestras obtenidas, se utiliz un espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 a una longitud de onda de 260 y 280 nm, y para la calidad de la muestras, se utilizaban geles de agarosa al 1%, teido bromuro de etidio (0.5 g/l).

Condiciones de PCR mltiple en cepa pura Para la reaccin de mPCR se emplearon diferentes pares de primers, un par por bacteria; cada par amplifica un gen especfico de cada bacteria. A continuacin de muestra un cuadro sobre estos datos: Tabla 1. Genes blanco amplificados y secuencias de oligonucletidos empleados

Los ciclos de amplificacin para las cepas puras, E. coli, Salmonella y Listeria, se ajustaron los parmetros de reaccin que correspondan a la temperatura de alineacin (Tm) de los primers, as como en la duracin de cada una de las fases de desnaturalizacin, alineacin y extensin en cada uno de los ciclos; para lo cual en el primer parmetro a considerar que es la fase de alineacin, se realizaron gradientes de temperaturas, abarcando un rango de 52 a 63C. Para la determinacin de los nmeros de ciclos y el tiempo en cada una de las fases de la PCR, se bas en la bibliografa donde se citan estos parmetros y partiendo de esto, se decidi obtener una media en el nmero de ciclos, as como con los lapsos de tiempo, por lo cual los parmetros finales establecidos fueron en el nmero de ciclos un total de 30 y los tiempos en los pasos de la PCR fueron los siguientes, desnaturalizacin previa de 94C por 3, desnaturalizacin a 94C por 40, de alineacin se usa el gradiente de temperaturas por 45 y de extensin de 72C por 45, se agreg anafase de extensin final de 72C por 3.

Tabla 2. Parmetros de reaccin de PCR establecidos para las bacterias a estudiar

La mezcla para la mPCR contena 30 l con una mezcla comercial para PCR 2x (JumpStart REDTaq, Sigma A.), 1l de cada ADN templado de cultivo puro, que aproximadamente contenan de 70 a 400 ng, y 10 pM de cada oligonucletido para la amplificacin. Para analizar las amplificaciones realizadas se realizaron electroforesis en geles de agarosa al 1.5% con 1x TBE (Tris-Borato-EDTA) a 80 V por 1 hora y teido con bromuro de etidio; en la visualizacin de los geles se utiliz un fotodocumentador MiniBis-Pro DNR Biomaging-Systems bajo luz UV y se obtuvieron imgenes a travs de la computadora, con ayuda del programa GelCapture. Utilizacin de la mPCR en muestras alimenticias Al trmino de la evaluacin de las metodologas anteriores, se procedi a aplicar la tcnica en muestras de alimentos inoculadas artificialmente con los patgenos involucrados en esta investigacin. Las muestras usadas para esta fase fueron carne de pollo, utilizando la parte de la pechuga y embutidos de pavo (jamn y salchicha), las cuales fueron adquiridas en diferentes establecimientos comerciales. En el momento de la compra las

muestras se encontraban a temperatura de refrigeracin y debidamente empacadas y se transportaron a 4C hasta el laboratorio. Contaminacin artificial de las muestras empleadas en el estudio La metodologa de contaminacin artificial realizada para este estudio se bas en el protocolo reportado en el manual de procedimientos establecidos Codex Alimentarius determinado por la FDA para la deteccin de patgenos en carne (7), utilizando las muestras mencionadas en el apartado anterior. A 10 g de muestra, se homogenizaron en 85 ml de agua peptonada tamponada y 1 ml de una suspensin de cada una de las bacterias (OD = 600 nm) y se incubaba a 37C durante 24 h (enriquecimiento primario). Transcurrido el tiempo, de este medio se tomaba una alcuota de 1 ml del cultivo e inocular 9 ml de agua peptonada tamponada (fresca) y se incubaba nuevamente por 12 horas a 37C; las muestras para extraccin de ADN se toman al finalizar la segunda incubacin. Extraccin de ADN a partir de muestras contaminadas artificialmente A partir de un volumen de 1.5 ml de un cultivo de 12 horas de crecimiento, se centrifug a 7,000 rpm por 5 min, la pastilla obtenida se lav con 1.5 ml. de buffer de suspensin. Una vez homogenizada la suspensin se coloc a otro tubo evitando la toma de los slidos no disueltos (restos de alimento) y nuevamente se centrifug a 6,000 x 5 min y se descartar el buffer. El resto del procedimiento se continu a partir de la lisis celular, segn se describe en la seccin Extraccin de ADN cromosomal a partir de cultivos puros. Las muestras que fueron evaluadas, se inocularon al azar con las diferentes bacterias para luego ser diagnosticadas por la mPCR estandarizada y verificar la correspondencia entre las bandas obtenidas y las bacterias con las que previamente se contamin. Evaluacin de Repetibilidad Para cada fase de procedimiento ya estandarizado, se procedi a un experimento con 5 personas y tres repeticiones y realizar repeticiones y se llev a cabo un experimento de ciego sencillo en 5 personas para efectuar todo el protocolo estandarizado y propuesto en este trabajo y el resultado era determinado por la observacin de bandas de ADN en geles de agarosa sometidos a electroforesis. Las cuantificaciones de ADN extradas por esta tcnica fueron analizadas en programa Stata/SE 11.1, donde fueron analizadas utilizando un diseo de bloques al azar. Resultados y discusin Efectividad de protocolo de extraccin de ADN para su obtencin con calidad La concentracin de material gentico extrado de las cepas puras y en muestras alimenticias, realizando con el protocolo que se estandariz, oscilaban de entre los 400 a 1500 ng/l, en ocasiones se obtenan concentraciones mayores a los rangos que normalmente se obtenan. Los resultados fueron analizados en Stata 11.1 y se utiliz estadstica descriptiva con la finalidad de determinar la variabilidad con la que es obtenido el material gentico. En la tabla 3 se observa que los resultados obtenidos no tienen un grado de variabilidad, la cual es reflejada en el histograma resultante (Figura 1), en la que se observa que no existe una diferencia significativa, ni entre las muestras, ni las repeticiones. Esto fue comprobado con la realizacin de un anlisis de varianza de un diseo de bloques al azar (Figura 2), en que se obtuvo que los bloques (repeticiones), no presentaron diferencias estadsticamente significativas, con un nivel de confianza (=0.05), que representa un 95% de confiabilidad en que se toma la decisin correcta de la prueba, con lo cual de consolida que no existe variabilidad al momento de la extraccin. Tabla 3. Anlisis de cuantificaciones de ADN en bacteria pura

Figura 1. Histograma de cuantificaciones de muestras. Se encuentra indicado el grado de desviacin entre las muestras

Figura 2. Anlisis de Varianza (ANOVA) de cuantificacin de ADN

Especificidad y sensibilidad de la PCR mltiple (mPCR) en cepas puras. Para probar la especificidad de especie en la amplificacin se realizaron reacciones de PCR convencional cruzando los primers especie-especfico entre las distintas cepas bacterianas del estudio y con otras dos que se encontraban dentro del laboratorio, Brucella abortus y Mycobacterium bovis. En ninguna de las pruebas se observaron falsos positivos o patrones de bandeo. Adems de cruzar entre s los primers, se realiz un barrido de muestras con ADN de diferente naturaleza, extrado con la tcnica establecida en este trabajo, para luego determinar si otra fuente podra interferir (background) esto se realiz con ADN de distintos tipos de carne, sangre, planta y suelo. Ninguna de las muestras presento bandas de amplificacin de ADN (Figura 3).

Figura 3. Background de PCR con ADN de diferentes fuentes: M. Marcador, 1. Planta, 2. Suelo, 3. Sangre humana, 4. Carne de pollo, 5. Carne de cerdo

La temperatura elegida como ptima fue la de 55C, aunque se observ que tiene un excelente rango de temperatura de alineacin y mantenindose de manera uniforme las bandas ya que se logran observar una buena calidad de nitidez en el bandeo presentado para esta temperatura, adems de que corresponden con los tamaos de fragmento esperado para E. coli O157:H7, Salmonella spp., y L. monocytogenes, que son 553, 312 y 210, bp respectivamente. En el trabajo de estandarizacin realizado de Kim y cols. (2001) (8), utilizaron una temperatura similar (59C) a la propuesta por esta investigacin (Figura 4).

Figura 4. mPCR en cepas puras, con gradientes de temperaturas desde 52 a 61C. En todas las muestras se observa buena nitidez. *Error de manipulacin

En cuanto a sensibilidad de la tcnica se realizaron diferentes escalas de concentraciones de DNA desde 0.5 mM hasta 4 mM, obtenindose en todas las escalas, calidad en las bandas de amplificacin, al analizarlas mediante electroforesis en gel (Figura 5). Una vez determinados los parmetros se procedi a realizar 5 repeticiones de la tcnica, resultando positivas cada una de las pruebas.

Figura 5. Gradiente de concentracin de ADN para la mPCR estandarizada. M: Marcador; 1. 4.0 mM; 2. 3.0 mM; 3. 2.5 mM; 4. 2.0 mM; 5. 1.5 mM; 6. 1.0 mM; 7. 0.5 mM

Deteccin de productos por PCR mltiple en cepas puras Cada reaccin de amplificacin por PCR gener un fragmento de ADN nico de los tamaos que estaban esperndose. Los productos PCR fueron observados por electroforesis en gel de agarosa. Los diferentes tamaos de los productos de amplificacin, como se indica en la Tabla 1, fueron separados mediante electroforesis en gel con las condiciones ya especificadas. La Figura 6 muestra los resultados de un anlisis mPCR, junto con los productos PCR individuales. Los primers especie-especficos utilizados en este estudio lograron diferencia entre las especies de bacterias estudiadas. Estas mismas bandas fueron observadas por Kim y cols (2001) (8), en donde utilizaron los mismos diseos de primer que se utilizaron para esta investigacin, para la determinacin microbiolgica por mPCR en kimchi, y corresponden a las mismas bandas que se amplificaron, adems de que fue cotejado el tamao por medio de la bsqueda de las secuencias genticas de cada uno de los genes utilizados y se buscaron las secuencias de los primers, encontrndose los tamaos de fragmentos esperados.

Figura 6. mPCR de las cepas estandarizada junto con sus PCR simple. M: Marcador; 1: mPCR (+), 2: mPCR (), 3: PCR simple E. coli O157:H7, 4: PCR simple Salmonella spp., 5: PCR simple L. monocytogenes

Utilizacin de la mPCR en muestras alimenticias contaminadas artificialmente Se realiz la mPCR en muestras de jamn de pavo, las cuales se separaron en varias alcuotas y cada una se mezcl con una cepa bacteriana en suspensin, de combinaciones diferentes. Al analizar los resultados se comprob que es posible la deteccin de las cepas bacterianas presentes ya sea de manera individual o en conjunto. Junto con las muestras de mPCR, se corri por electroforesis el ADN extrado previamente, observndose que aunque no se visualizaban en todos los casos, bandas de alto peso molecular correspondientes a ADN, si se lograban realizar las amplificaciones. Los resultados obtenidos del experimento de cegamiento con los diferentes analistas fueron positivos y confirmatorios en todos los casos, por no fue necesario realizar algn mtodo estadstico (Figura 8). Las pruebas realizadas fueron muy reveladoras, ya que en ocasiones no se lograba observar ADN sin amplificar, pero al realizar la PCR y el anlisis electrofortico, todos se mostraba el patrn de bandas esperado. Este comportamiento no se encontr reportado en los artculos revisamos pero se logra demostrar que con una mnima cantidad de ADN molde, la tcnica de mPCR es capaz de detectar presencia de naturaleza bacteriana.

Figura 10. Prueba de cegamiento de mPCR en muestras contaminadas artificialmente. M: Marcador; 1, 3, 5, 7 y 9: ADN extrados; 2 y 8: Muestra con las tres bacterias; 4: Muestra con E. coli O157:H7 y Salmonella spp; 6: Muestra con Salmonella spp. y L. monocytogenes; 10. Muestra con Salmonella spp.

Conclusiones Se logr estandarizar la tcnica de PCR mltiple para Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. y Listeria monocytogenes, tomando en cuenta las temperaturas de alineacin y concentraciones de ADN, dos parmetros esenciales a establecer en una tcnica de diagnstico molecular por PCR; adems al realizar el background para diferentes tipos de muestras de DNA diferentes a las de las especias detectadas y siendo todas negativas, se puede proponer que est tcnica puede ser utilizada para la deteccin de las bacterias mencionadas al inicio del prrafo para diferentes fuentes alimenticias, adems, no existe variabilidad estadstica en el uso de la tcnica por factores como manipulacin o diferentes manipuladores. Se recomienda que esta tcnica pase a la fase de validacin para ser evaluada en muestras reales, estudiar el anlisis de reproducibilidad y compararla con el estndar de oro para la deteccin de cada una de las bacterias. Esto permitir su aplicacin como una tcnica alternativa para la deteccin de patgenos en diversos alimentos. Bibliografa 1. Martnez-Vzquez, I. O., 2004. Manual para el diagnstico de patgenos en lctes y carnes mediante PCR. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. 5, 4 2. Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios. 2005. 6ta Reunin Nacional de Comunicacin Social de Salud. 3. Madigan, M. T., Martinko, J. M, Parker, J. 2003, Brock: Biologa de los Microorganismos. 10 Edicin. Pearson Prentice Hall. Estados Unidos. 4. Espinoza, A., 2004. Manual para el diagnstico de patgenos en lcteos y carnes mediante PCR. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. 5, 45 5. Investigacin y Gestin de la Innovacin y Tecnologa. 2004. Vigilancia Tecnolgica: de Agroalimentacin. 4. 12. 6. Morales, A., 2004. Manual para el diagnstico de patgenos en lcteos y carnes mediante PCR. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. 5, 45 7. Food and Drug Administration. 2009. Bad Bug Book: Introduction Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook.

8. Kim, Y. G., Park, Y. S. Lee S. R. 2001. Detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in Kimchi by Multiplex Polymerase Chain Reaction (mPCR). Journal of Microbiology, 44:92-97