¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot
Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso paraidentificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventadapor
Edward M. Southern
en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, serealiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luegose utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó
Northern Blot
(en clara alusión alnombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuenciasespecíficas (
sondas
) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambasutilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principiosgenerales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que elARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas másprecauciones.Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que lasmoléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego setransfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidospueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia dedeterminadas secuencias.Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertassecuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, encambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto quedos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El SouthernBlot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentesgenes.Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de laelectroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez quela muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a unamembrana especial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba estamembrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica puedenobtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.
Southern Blot:
La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producirfragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular medianteelectroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Losfragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumergeen una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante quelas recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) alfiltro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tengauna secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava elfiltro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcajeno-radioctivo).
Southern Blot
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemploutilizando sonicación ó enzimas de restricción.Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel deagarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se deseaidentificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a lasecuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementariasde ácidos nucleicos.El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento debases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern delinvestigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.
Técnica de hibridación de Southern
La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de latécnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el problema nº 5. Las etapas experimentalesempleadas en un laboratorio de medicina legal o forense para el análisis del perfil de ADN son lassiguientes:
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentesde ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de unavíctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de laspruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con elextraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,habitualmente de la sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuenciacaracterística. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisislegal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan segúnsu tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante laelectroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migranhacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad demigración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculasmenores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayortamaño. Como resultado, se produce una separación continua de losfragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos
más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto deaplicaión de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("
Southern blot
")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizanmientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con unadisolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenarioresultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés
blot
,conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización ytransferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien loinventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papelcon la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante,el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribuciónespacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de laelectroforesis.
5. Hibridación con sonda radiactiva
Una
sonda de locus único
es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz dehibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN deun fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formaciónde la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de basescomplementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótoporadiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locusgenético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southernresultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sondaradiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración desales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el excesode sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en lamembrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana delensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película derayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra lasposiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y elrevelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern seconoce como autorradiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN envarios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía parala primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevadatemperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sondaradiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de unamisma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".
Northern blot
Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que soncomplementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARNmensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripciónde ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipodeterminado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARNen particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmentede cADN o rARN del gen de interés.
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Southern Northern Western Blot
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