Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

EVALUARE A EFIICIIENEII DEZIINFECTANIILOR EVALUARE A EF C ENE DEZ NFECTAN LOR

Dezinfecia este procesul prin care sunt distruse cele mai multe, sau toate microorganismele patogene (n proporie de 99,99%), cu excepia sporilor bacterieni, de pe obiecte din material inert. Dezinfecia se aplic n cazurile n care curenia nu elimin riscurile de rspndire a contaminrii cu microorganisme, iar sterilizarea nu este necesar. n orice activitate de dezinfecie trebuie s se aplice msurile de protecie a muncii pentru a preveni accidentele i intoxicaiile. Norma tehnica din 06/03/2003 Publicat n Monitorul Oficial, Partea I nr. 194bis din 26/03/2003

n procesul de dezinfecie sunt utilizate produse de dezinfecie cu activitate de omorre a microorganismelor pentru a distruge germenii de alterare a produselor alimentare sau germenii periculoi pentru consumatori de pe suprafee. Rezultatele obinute n urma dezinfeciei sunt limitate la germenii prezeni n momentul executrii operaiunii, din aceasta cauza fiind necesar o frecven regulat de realizare a acesteia. n general, pentru igienizare n industria alimentar, dezinfectanii trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s nu fie toxici pentru om n dozele folosite; s nu confere gust sau miros strin produselor alimentare; s nu aib aciune coroziv; s fie stabili n ap i s fie eficieni, indiferent de calitatea apei; s posede un spectru larg de aciune asupra microorganismelor; s se caracterizeze printr-o bun capacitate de ptrundere; s fie ieftini. Alegerea dezinfectantului implica utilizarea unui produs autorizat pentru sectorul respectiv de activitate precum i cunoaterea speciilor de microorganisme care trebuie distruse. Activitatea dezinfectantului poate s fie bactericid, sporicid, fungicid, virucid.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Sulfatul de cupru are proprieti fungicide. Sulfatul de cupru este o substan solid, cristalin i albastr. Varul, cu toate c este un dezinfectant, i menine aceast aciune numai n mediu uscat, n timp ce n mediul umed, i pierde efectul antimicrobian. Pe acest considerent, unii prefer n loc de vruire trimestrial, o vruire efectuat o dat pe an, cu var stins proaspt, n care se adaug una dintre substanele urmtoare: sulfat feros 3%, sulfat de cupru 3-5%, cloramin 2%, hidroxid de sodiu 2%, pentaclorfenolat de sodiu 0,1%. n cadrul lucrrii de laborator, se va testa influena sulfatului de cupru asupra tulpinii de Cladosporium izolat de pe perei umezi, utilizndu-se urmtoarea schem de lucru:
Prelevare 1 ml proba dup 15 min Adugare mediu de cultura (Malt Extract Agar MEA)

9.8 ml CuSO4

0.2 ml suspensie Cladosporium herbarum

Prelevare 1 ml proba dup agitare

CuSO4 4%

4%, 6%, 8%

9 ml Ser Fiziologic Steril (SFS)

Termostatare 25C/3-5 zile

Fig.1.1 Aciunea sulfatului de cupru asupra lui Cladosporium Dup termostatare rezultatele se trec n tabelul de mai jos:
Concentraie CuSO4, % ufc/cm3 Observaii

4% 6% 8%

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Principiul metodei Un disc cu diametru cunoscut este imersat n dezinfectant i este depus pe suprafaa unui mediu de cultur agarizat, preinoculat cu o bacterie de referin. Concomitent se produc dou fenomene: difuzarea dezinfectantului i creterea bacteriei. Dezinfectantul difuzat n mediu va influena vizibil dezvoltarea bacteriilor, aspect materializat prin apariia n jurul discurilor, a unor zone clare datorit absenei creterii bacteriilor, denumite ZONE DE INHIBIIE A CRETERII. Metoda este indicat pentru laboratoarele care testeaz un numr relativ mic de tulpini bacteriene cu cretere rapid la 35-37C, fr diferene semnificative, de la tulpin la tulpin, a ratei de cretere (Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus). Scopul metodei este acela de a distruge sau cel puin de a mpiedica multiplicarea unui agent patogen. Dintre multiplele metode i procedee existente se recomand metoda difuzimetric. Aceasta este mai uor de executat, mai economic i asigur o reproductibilitate de aproximativ 90% daca se respect strict toate condiiile de lucru. Modul de lucru Mediul de rspndire repartizat n eprubete sterile, fluidificat i temperat este inoculat cu un volum cunoscut din suspensia de bacterii de referin i repartizat uniform n plci Petri. Se depun discurile cu substane dezinfectante la distana de minimum 15 mm de marginea plcii i de 30 mm ntre centrele a dou discuri vecine. Dup repartizarea discurilor, plcile se termostateaz imediat, la 37C, timp de 16 -18 ore (Fig. 2.1).

Fig. 2.1 Schema de lucru a testului Kirby Bauer

3

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Citirea si interpretarea rezultatelor n primul rnd aspectul Zonei de Inhibiie trebuie s fie clar i cu contur net. n situaia n care se observa chiar i o singura colonie n interiorul zonei de inhibiie, se va considera rezistent la acel dezinfectant, indiferent de diametrul zonei de inhibiie (fig. 2.2).

Figura 2.2 Citirea i interpretarea metodei difuzimetrice Dup trecerea perioadei de termostatare se msoar cu rigla gradat n mm diametrul zonelor de inhibiie complete n lumina reflectata pe fond negru mat. n caz de urgenta plcile pot fi citite la 5-6 ore de incubare, cu condiia verificrii diametrelor zonelor de inhibiie dup 16-18 ore. n cazul mediilor transparente, msurarea se face pe spatele plcilor, iar n cazul mediilor cu snge pe suprafaa agarului din cauza opacitii. Coloniile mari din zona de inhibiie trebuie identificate i retestate. Acestea pot fi constituite din variante rezistente sau contaminani (inocul mixt). Metoda poate fi aplicat pentru a testa eficiena unui dezinfectant asupra mai multor tulpini sau sensibilitatea unei tulpini la mai muli dezinfectani. Rezultatele se pot interpreta dup cum urmeaz: Diametrul zonei de inhibiie peste 6 mm tulpina se considera sensibil (S) la dezinfectantul respectiv

Diametrul zonei de inhibiie cuprins intre 2-5 mm tulpina se considera cu sensibilitate intermediar (SI) la dezinfectantul respectiv

Diametrul zonei de inhibiie este 1 mm sau absent microorganismul testat se considera rezistent (R) la acel dezinfectant

Dup termostatare rezultatele se trec n tabelul de mai jos:

Nr. crt. Dezinfectant Simbol Tulpina de referin Diametrul zonei de inhibiie S/SI/R

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

ANEXA

Evaluarea eficienei dezinfectanilor prin metoda difuzimetric

Sensibilitatea la dezinfectani a bacteriei E. coli

Sensibilitatea la dezinfectani a bacteriei S. aureus

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

CONTROLUL STRIIII DE IIGIIEN A M IINIILOR CONTROLUL STR DE G EN A M N LOR

Dezinfecia prin mijloace chimice urmrete distrugerea microorganismelor patogene. Tehnicile de dezinfecie care utilizeaz substane chimice dezinfectante realizeaz de cele mai multe ori o sterilizare. Substanele dezinfectante sunt folosite pentru dezinfecia minilor, meselor, duumelelor, precum i pentru dezinfecia unor produse patologice. Substanele dezinfectante de obicei au o toxicitate mare din aceast cauz nu se recomand s fie utilizate pe esuturi vii, ele se aplic numai pe substraturi inerte. n laboratoarele de microbiologie sunt utilizate diferite substane cu aciune dezinfectant: Mertiolatul de sodiu se utilizeaz pentru dezinfecia minilor, a instrumentelor contaminate, etc., n soluie de 1/2000; Alcoolul etilic (spirtul medicinal) se utilizeaz frecvent pentru dezinfecia minilor sau a unor instrumente se folosete alcool de 70, care este eficient i care se obine din 1000 ml alcool 96 + 400 ml ap distilat; Permanganatul de potasiu (KMnO4) se prezint sub form de cristale mari de culoare violet. Pentru dezinfectarea minilor se utilizeaz o soluie de 1 , pentru mucoasa bucal de 1/5 000, iar pentru cea ocular de 1/10 000; Acidul boric are o aciune dezinfectant relativ slab. n concentraie de 5% se utilizeaz pentru dezinfectarea pielii i a mucoaselor; Spunurile sunt sruri ale unor acizi grai. Sunt utilizate n special pentru ndeprtarea murdriei i emulsioneaz grsimile. Unele au i aciune antimicrobian; Eficiena msurilor sanitare ntr-o unitate de industrie alimentar, este exprimat i prin igiena minilor celor care vin n contact direct cu produsul alimentar. Personalul trebuie sa fie instruit sanitar, pentru respectarea regulilor de igien individual i s dispun de mijloace materiale necesare (ap, spun, soluie dezinfectant, prosop de hrtie sau aparat de uscat minile dup splare). Splarea minilor poate fi realizat astfel: 1. Splare simpl - realizeaz eliminarea murdriei i a microorganismelor de tranziie. Cuprinde urmtoarele etape: contactul cu spunul; distribuirea uniform a spunului pe suprafaa minilor; cltirea; uscarea. 2. Splare igienic - realizeaz eliminarea murdriei, ndeprteaz microflora de tranziie i diminueaz microflora rezidual. Cuprinde urmtoarele etape:
1

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

splare simpl; utilizarea unui antiseptic fr a se mai face cltirea sau uscarea. 3. Splarea igienic profund (chirurgical): prin acest procedeu se elimin murdria, se ndeprteaz microflora de tranziie i aproape n totalitate microflora rezidual. se realizeaz splarea simpl un timp mai ndelungat. Suplimentar se realizeaz o periere a minilor i unghiilor; utilizarea unui antiseptic fr cltire i uscare. Controlul igienei minilor se poate efectua att nainte de nceperea lucrului, ct i n timpul lucrului. Una din metodele de control practicate se bazeaz pe analiza apei de cltire a minilor. Modul de lucru ntr-un recipient de sticl cu deschiderea mai larg, n care se gsete 400 ml de ap steril se introduce mna i timp de 1 min se nchide i se deschide pumnul, pentru a se favoriza trecerea microorganismelor de pe mn n apa steril. Apoi din apa de cltire se fac inoculri pentru a se stabili: Numrul total de microorganisme/cm3 ap de cltire

Numrul total de microorganisme reprezint numrul de colonii care se dezvolt n urma inoculrii a 1 cm3 de apa n mediu de cultura, dup un timp de 48 h de termostatare la 37C. Determinarea bacteriilor coliforme

Analiza se efectueaz n dou etape (fig. 1), dup cum urmeaz: 1. Etapa de mbogire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezena bacteriilor coliforme i multiplicarea acestora, dac sunt n concentraii reduse, n vederea evidenierii lor facile n etapa urmtoare. 2. Etapa de confirmare certific prezena bacteriilor coliforme prin cultivare n condiii selective specifice. Calcul si interpretare Folosind, metoda titrului, in funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete cifra caracteristica (CC) si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunztor cifrei caracteristice se noteaz numrul probabil de bacterii coliforme/microorganisme (NPM).

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Fig. 2. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativ a bacteriilor coliforme prin tehnica numrului probabil1

Tabel1 tabel Mac Cready

CC 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200
1

NPM 0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1 1.5 1.6 0.9

CC 201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

NPM 1.4 2.0 1.5 2.0 3.0 2.0 3.0 3.5 4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0

CC 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

NPM 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0 9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110 140

Legend: Mediu selectiv de mbogire dublu concentrat (Mdc) + tub Durham 2) Mediu selectiv de mbogire simplu concentrat (Msc) + tub Durham 3) Mediu selectiv de confirmare + tub Durham 4) Temperatura de termostatare poate fi 30C, 35C sau 37C i este stabilit n funcie de scopul analizei i anume: scop tehnologic sau evaluarea riscului privind sigurana alimentar; n anumite cazuri testul pozitiv poate fi evideniat i dup o perioad de termostatare de 24 h 2h * Prob pozitiv: modificarea turbiditii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz n tubul Durham ** Prob pozitiv: modificarea turbiditii; virajul culorii mediului din verde n galben; acumularea de gaz n tubul Durham
1)

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

ANEXA

Splare simpla

Splare igienica

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

APRECIIEREA GRADULUII DE CONTAMIINARE MIICROBIIAN APREC EREA GRADULU DE CONTAM NARE M CROB AN A SUPRAFEELOR DE LUCRU A SUPRAFEELOR DE LUCRU
Controlul eficienei dezinfeciilor se bazeaz pe stabilirea prezenei sau absenei unor microorganisme. n ultimii ani au aprut numeroase propuneri de teste simplificate i mai rapide pentru aprecierea gradului de contaminare a suprafeelor: Hygicult (Enterobacteriaceae; Yeast & Fungi; Total Bacterial Count); Hycheck; Petrifilm (E. coli Count Plates; Coliform Count Plates), Chromocult Coliform Agar, Envirocheck Rodac, TMT etc. (Sala, 2000). 1. Hygicult

Testele Hygicult se prezint sub form de lamele, din material plastic, acoperite pe o parte cu mediu de cretere i nchise ntr-o fiol.

Tipurile de sisteme Hygicult utilizate pentru aprecierea gradului de contaminare a suprafeelor sunt:
Hygicult TPC (pentru determinarea numrului total de bacterii aerobe mezofile) Hygicult E (pentru determinarea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae) Hygicult Y&F (pentru determinarea drojdiilor i mucegaiurilor). Hygicult CF (pentru determinarea bacteriilor coliforme).

2.

Hycheck

Testele Hycheck sunt asemntoare cu cele Hygicult, caracteristica acestor teste fiind dat de paleta principal care se curbeaz pentru o prelevare uoar. Suprafaa de prelevare a testului este mprit in 7 zone, de cte 1 cm fiecare, pentru a permite numrarea direct a densitii microbiene. Tipurile de sisteme Hycheck existente pe pia sunt: Hycheck D/E Neutralizing Agar, Hycheck Disinfection Control, Hycheck Enterobacteriaceae, Hycheck Plate Count Agar TTC, Hycheck Total Count, Hycheck Yeasts Molds, Hycheck Yeasts Molds TTC.
1

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

3.

Petrifilme

Petrifilmele (n limba englez, Petrifilms), sunt sisteme comerciale n care mediul de cultur specific (n general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru i grosime variabil) pe un suport din carton plastifiat i acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul i prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor. Se poate utiliza pentru determinarea bacteriilor aerobe mezofile, drojdiilor i mucegaiurilor, bacteriilor coliforme si a Escherichia coli, enterobacteriilor, Staphylococcus aureus. Tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe pia sunt urmtoarele: PYM (Petrifilm Yeast/Mould), PAC (Petrifilm Aerobic Count), PCC (Petrifilm Coliforms Count), PHSCC (Petrifilm High Sensivity Coliforms Count), P 2000 CC (Petrifilm Rapid Coliforms Count), PEC (Petrifilm E. coli), Petrifilm Kit HEC Petrifilm Enterobacteriaceae Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk). 4. Hygiene SwabCheck

Testul de sanitaie Hygiene SwabCheck este compus dintr-un tija de recoltare si un tub cu mediu specific cu indicator de culoare. Dup recoltare de pe suprafaa de cercetat, tija se introduce in tub si se termostateaz corespunztor (24-48 ore). Testele sunt uor de utilizat. Testele arat o evidenta schimbare de culoare de la rou la galben. Timpul scurs pentru aceasta schimbare este o indicaie a nivelului de contaminare. Chiar si o singura celula este suficienta pentru a provoca schimbarea culorii mediului (testele de sanitaie SwabCheck sunt aproape de 1000 de ori mai sensibile dect metoda convenionala ATP).

Similar exista teste specifice pentru Listeria, E. coli, bacterii aerobe mezofile, drojdii si mucegaiuri. 5. Stilourile HY-LITE Recharge

Un stilou HY-LITE pentru aprecierea igienei suprafeelor este o cuv conceput pentru utilizare cu luminometrul HY-LITE i conine reactivi gata preparai.
2

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Pot fi folosite pentru aprecierea strii de igien a suprafeelor ntlnite n spaiile de producie din industria alimentar, n buctriile destinate colectivitilor (cantine, restaurante) i n alte spaii n care igiena este extrem de important. Cu ajutorul lor i a luminometrelor se poate verifica starea de igien a meselor de lucru, instalaiilor, conductelor, recipientelor, mijloacelor de transport. Principiul determinrii Deoarece adenozin-trifosfatul este prezent n toate celulele vii, pe baza concentraiei lui se poate detecta att prezena reziduurilor alimentare, ct i prezena microorganismelor. Cea mai sensibil metod de determinare a ATP-ului este cea bazat pe bioluminiscena generat n urma aciunii luciferazei asupra luciferinei, reacie n care particip ATP-ul. Reacia este stoichiometric, permind ca lumina s fie folosit ca indicator pentru concentraia de ATP. Reactivi stilouri HY-LITE pentru controlul strii de igien a suprafeelor tampoane lipsite de ATP
un capion detaabil ce conine soluie de umectare; o tij de culoare alb protejat de capion pentru prelevarea unui volum definit de prob. Tija este acoperit la interior cu o substan chimic care are rolul de a pune n libertate ATP-ul celular. Tija mai are rolul de a transfera proba n camera de reacie i a deschide compartimentul cu reactivi. un compartiment ce conine soluie pentru diluarea, neutralizarea i tamponarea probelor; un compartiment cu reactivi nchis cu o folie de aluminiu. Reactivii sunt reprezentai de un amestec de luciferin i luciferaz sub form liofilizat i stabilizat.

Stiloul se compune din:

Modul de lucru 1. Se scoate tamponul din suportul su, apoi se deschide capionul stiloului HY LITE i se umidific tamponul prin imersare n soluia de cltire. 2. Se aplic un ablon steril cu un decupaj 10x10 cm pe suprafaa a crei stare de igien se evalueaz. Se terge suprafaa delimitat cu tamponul umidificat aplicnd o presiune constant, rotind tamponul i tergnd suprafaa delimitat de ablon de dou ori, o dat deplasnd tamponul de la stnga la dreapta i o dat de sus n jos. 3. Se cltete tamponul n soluia de cltire, timp de 10 secunde, rotind tamponul i apsndu-l de peretele tubului. 4. Se scoate cu atenie stiloul din capionul su, trgndu-l n jos i se imerseaz tubuorul de eantionare timp de 1 secund n soluia de cltire. Striurile tubuorului alb trebuie s fie umezite n ntregime. 5. Se plaseaz tubuorul de eantionare pe partea superioar a capionului sau pe alt suport dur i, meninnd o presiune constant, se introduce vertical n compartiment.
3

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

6. Se rotete partea superioar a stiloului n sensul acelor de ceasornic i se aps ctre partea inferioar, pn la capt (pn la suprapunerea celor dou zone filetate). Camera cu reactivi este astfel deschis i reactivul eliberat. 7. Se scutur energic stiloul, cel puin de 10 ori, (apare o coloraie galben verzuie i se formeaz spum) i se introduce imediat n luminometrul HY-LYTE pentru msurare. Atenie:
Deoarece ATP-ul este o substan ubicvitar, trebuie avut grij de a nu atinge cu degetele sau de a nu contamina n alt mod urmtoarele pri: vrful tamponului, capacul sau marginea capionului protector al compartimentului care conine soluia de cltire, tija alb de prelevare a probei. Nu inscripionai sau etichetai zona transparent a stiloului, deoarece este fereastra prin care se realizeaz citirea luminiscenei. Pentru a evita deteriorarea luminometrului, apsai tija alb de prelevare a probei n stilou i rotii ambele pri ale stiloului, pn ajung n contact. Nu inei rsturnat capionul negru al camerei de reacie, pentru a evita scurgerile de lichid din stilou.

6.

Metoda clasic de evaluare a strii de igien a suprafeelor

Pentru aprecierea strii de igien a suprafeelor de lucru, ustensilelor, ambalajelor, etc., se folosete examenul microbiologic aplicnd tehnici de lucru bazate pe inoculri n medii nutritive. Materiale necesare O eprubeta ce conine soluie de umectare; Tampoane sterile; abloane sterile cu un decupaj 10x10 cm; Medii de cultur specifice.

Modul de lucru Se umezete tamponul de vat n lichid de umectare steril, ndeprtnd excesul prin presarea tamponului pe peretele eprubetei. Apoi dup ce ablonul a fost aezat pe suprafaa luat n analiz, se terge cu tamponul suprafaa delimitat de ablon att pe direcie longitudinal ct i transversal. n acelai timp tamponul se rsucete astfel ca recoltarea s se fac pe toate feele acestuia. Dup recoltarea probei, se introduce tamponul n ser fiziologic i se agit pentru a se favoriza trecerea celulelor microbiene n lichid. Apoi se pot face inoculri, prin metoda incorporrii microorganismelor n medii nutritive. Dup o termostatare corespunztoare, se numr coloniile dezvoltate n plcile Petri i se stabilete numrul de microorganisme pe 1 cm2 suprafaa luat n analiz. Rezultatul obinut se interpreteaz n raport cu normele n vigoare. O suprafa bine splat i dezinfectat n condiiile unei fabrici nu trebuie s prezinte mai mult de 1 microorganism/cm2.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

CONTROLUL STRIIII DE IIGIIEN A AMBAL AJELOR CONTROLUL STR DE G EN A AMBAL AJELOR METALIICE II DIIN STIICL METAL CE D N ST CL
Pregtirea ambalajelor nainte de umplerea lor cu produs este o condiie esenial a asigurrii conservabilitii corespunztoare a produsului ambalat, termenul su de valabilitate depinznd foarte mult de starea de igien a ambalajelor. Pregtirea ambalajelor se realizeaz prin intermediul operaiilor de splare, igienizare si sterilizare. Splarea ambalajelor se realizeaz n mai multe etape: nmuierea i umflarea depunerilor (ndeosebi n cazul ambalajelor reutilizabile) se realizeaz printr-o cltire intern i extern cu apa, aciune ce ndeprteaz impuritile libere i prenclzete (tempereaz) ambalajele din sticl. desprinderea i antrenarea impuritilor se obine prin nmuiere alternat cu scurgere la trecerea ambalajelor prin unul sau mai multe bazine care conin cantiti mari de soluii de splare. cltirea ambalajelor se realizeaz prin stropire intern i extern cu jeturi puternice de ap n vederea ndeprtrii resturilor de soluie de splare i a rcirii ambalajelor la temperatura necesar pentru umplerea cu produs. Rolul operaiei de sterilizare a ambalajelor este de a asigura condiii optime ambalrii aseptice a alimentelor. In acest sens se supune sterilizrii ambalajul n ntregime sau partea care vine n contact cu produsul i accesoriile de nchidere utilizate. Principalii ageni de sterilizare sunt: soluia alcalin cu temperatur de 80-90C, ageni chimici (ap oxigenat sau acid peracetic), ageni termici (abur sau aer cald), ageni neconvenionali (radiaii ultraviolete, infraroii, ionizante i impulsuri ultrascurte de lumin) sau utilizarea combinat a acestora (sterilizare cu aer cald i abur sau cu ap oxigenat i radiaii ultraviolete). 1. Controlul eficienei dezinfeciei ambalajelor foarte mari

Pentru tancuri si bazine eficacitatea splrii i dezinfeciei se poate controla prin metoda tergerii cu un tamponul steril a unei suprafee delimitate de un ablon sau de o ram confecionat din tabl subire, maleabil. Tehnica de lucru este cunoscut: tamponul se umezete n lichidul de umectare steril i cu el se terge bine suprafaa luat n control delimitat de ablonul steril. Apoi tamponul se introduce n apa steril i se agit. Dup inoculare i termostatare, rezultatul se exprim n uniti formatoare de colonii raportat la suprafaa tears. Un recipient mare se consider corespunztor ca stare de igien, atunci cnd nu se depete limita de 1-5 microorganisme/cm2.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

2.

Controlul eficienei splrii i dezinfeciei bidoanelor

n vederea aprecierii strii de igien a unui bidon, se introduce n acesta 100 ml ap steril, se nchide cu capacul i apoi bidonul se aeaz n poziie orizontal. Pe aceast latur se efectueaz 10 micri de agitare pe direcie longitudinal, dup care se rsucete bidonul cu un sfert de cerc, se agit din nou de 10 ori i n mod similar se repet operaia i la celelalte laturi ale bidonului (n total 4 laturi). Lichidul de cltire se recolteaz ntr-un recipient steril i apoi se fac inoculri din proba ca atare i din diluia 10-1, folosind ca medii nutritive Plate Count Agar (PCA) i Malt Extract Agar (MEA). Se recomand ca mediul nutritiv temperat s se repartizeze ct mai repede (n max. 15 minute) n plci Petri, peste lichidul de cltire. Dup o termostatare optim se numr coloniile dezvoltate. Recipientul este corespunztor ca stare de igien dac nu depete limita de 1 microorganism/1ml apa de splare. 3. Controlul eficienei splrii i dezinfeciei ambalajelor din sticl

n efectuarea controlului se iau 5-10 sticle i se nchid cu dopuri sterile. n laborator, n fiecare ambalaj de 1 L se introduce un volum de 20 ml ap steril, iar n cele de 0,5 L cte un volum de 10 ml ap steril. n scopul prelevrii microorganismelor de pe suprafaa interioar a ambalajelor, acestea se aeaz n poziie orizontal i se efectueaz 25 de agitri pe direcie longitudinal i 25 de rotiri. Apoi se fac inoculri prin metoda ncorporrii microorganismelor n medii nutritive (Plate Count Agar i Malt Extract Agar), urmnd o termostatare optim. n final se numr coloniile dezvoltate. Starea de igien a recipientului analizat este corespunztoare dac nu depete limita de 1 microorganism/1ml apa de splare. 4. Controlul eficienei splrii i dezinfeciei ambalajelor din sticl destinate mbutelierii buturilor rcoritoare Se iau n analiz 5-10 ambalaje care se nchid cu dopuri sterile, apoi n primul se introduce 100 ml ap steril, se agit de 25 de ori i n continuare lichidul de cltire se trece dintr-un ambalaj n altul i se agit ntr-un mod similar. Din lichidul de cltire ajuns n ultimul recipient, se fac inoculri pentru a se stabili valoarea indicilor de apreciere a igienei ambalajelor, folosind ca medii de cultur: Plate Count Agar (PCA), Malt Extract Agar i mediu selectiv pentru bacteriile coliforme. Dup o termostatare optim se interpreteaz rezultatele obinute, n baza crora n situaii necorespunztoare urmeaz a fi luate anumite msuri. Ambalajul de sticl pentru buturi rcoritoare se consider corespunztor atunci cnd: numrul total de microorganisme nu depete 1 microorganism/1ml apa de splare, cnd titrul bacteriilor coliforme este cel puin 100 (>100) i cnd nu sunt prezente bacteriile la 1 ml lichid de cltire recipient.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

O alt metod de control al strii de igien a ambalajelor de sticl se bazeaz pe trecerea mediului de cultur fluidificat n recipientul de analizat, astfel ca mediul s cuprind sub form de pelicul ntreaga suprafa interioar a recipientului. Dup o termostatare optim se numr coloniile dezvoltate pe recipient i se raporteaz la capacitatea acestuia exprimat n ml:

5.

Controlul capsulelor i al dopurilor

Cu o penset flambat se iau n analiz 10 capsule sau dopuri, fiind introduse ntr-un recipient cu 100 ml ap steril. Se agit 5 minute, iar din lichidul de cltire se fac inoculri. Cerine impuse: valoarea indicilor de apreciere (numrul total de microorganisme, numrul probabil de bacterii coliforme) s corespund apei potabile. De asemenea, se impune lipsa bacteriilor/1ml apa de splare.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

CONTROLUL STRIIII DE IIGIIEN A AERULUII CONTROLUL STR DE G EN A AERULU

Fiinele vii sunt importante generatoare de particule. Omul, de exemplu genereaz un numr de particule prin descuamarea pielii, respiraie, activitatea individului (cu ct este mai activ, numrul de particule crete). Biocontaminarea exogen are n special dou origini: rinofaringian i cutanata. Contaminarea rinofaringian se face prin agentul picturi Flgge. Acestea sunt particule care se rspndesc datorit unor acte fiziologice: vorbit, tuse, strnut. Contaminarea cutanata se face prin intermediul minilor, pielii, prului. Activitatea uman/industrial i aportul de aer exterior genereaz o cantitate mare de praf n spaiul de lucru. Numrul de particule de praf astfel depus poate atinge valori de zeci de milioane/m3. Particulele de praf reprezint o sursa de contaminare a produselor alimentare. Numrul de uniti formatoare de colonii (ufc) de microorganisme este mai mic i se exprim m3. Nivelul de contaminare a aerului este legat de tipul activitilor desfurate n spaiul dat. Surse productoare de particule sunt: mbrcmintea praful depozitat, antrenat n suspensie de curenii de aer aportul de aer din exterior sistemele de evacuare a apelor uzate ambalaje i materiale nealimentare materii prime alimentare brute

Bacteriile i/sau drojdiile predomin cel mai mult n industria alimentar, n special acolo unde umiditatea este ridicat. Mucegaiurile sunt totdeauna prezente, i pentru c sunt bine adaptate prin spori mediului aerian, se dezvolt n zonele uscate, n contact cu produsele alimentare. Lucrarea urmrete controlul cantitativ i calitativ al strii de igien microbiologic a aerului dintr-o ncpere. Pentru evidenierea microorganismelor prezente n aer se aplic mai multe tehnici de recoltare: Metoda filtrrii prin membrane Metoda aspiraiei Metoda sedimentrii Cea mai frecvent folosit metod pentru a determina cantitativ microorganismele din aer este metoda sedimentrii. 1.. 1 Metoda filtrrii prin membrane

Presupune trecerea unui volum de aer printr-o membran filtrant, dup care membrana se depune pe suprafaa unui mediu de cultur cu geloz, ntr-o plac Petri. Prin 1

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

termostatare optima, microorganismele vor crete formnd colonii caracteristice pe suprafaa membranei, putnd fi evaluate calitativ i cantitativ. 2.. 2 Metoda sedimentrii (metoda Omelianski)

Presupune expunerea unui mediu de cultur specific, solidificat, n plci Petri, pentru sedimentarea microorganismelor din aerul corespunztor punctului de control. Timpul de sedimentare variaz invers proporional cu gradul de contaminare presupus al aerului analizat (5, 10, 15, 20, 30 minute). Dup termostatare corespunztoare, se apreciaz cantitativ numrul de microorganisme din aerul analizat cu formula: ufc/m3 aer n care: ufc - numrul de uniti formatoare de colonii; n - numrul de colonii rezultate prin sedimentarea celulelor pe suprafaa mediului; S - suprafaa plcii Petri, [cm2]; K - coeficient ce depinde de timpul de expunere: K
; = timp de expunere, [min]. 5

100 100 n S K

Analiza calitativ a microorganismelor din aer se face prin identificarea coloniilor obinute pe plcile Petri cu medii caracteristice pentru bacterii, drojdii i mucegaiuri. 3.. 3 Metoda aspiraiei

Principul metodei Aerul care trebuie prelevat este aspirat, cu o viteza constanta i pentru o anumita perioada de timp, prin capul de prelevare perforat ai aparatului Microflow 90. Impactul aerului aspirat are loc pe suprafaa unei placi Petri n care se gsete depus mediu de cultura. La sfritul perioadei de prelevare, se scoate placa Petri din aparat i se introduce intr-un termostat. Dup terminarea perioadei de termostatare, se numra unitile formatoare de colonii (ufc) i se evalueaz contaminarea biologica a aerului, pe baza volumului de aer prelevat. Pentru determinarea numrului de drojdii i mucegaiuri din aer, aparatului Microflow 90 i se vor ataa placi cu mediu Malt Extract Agar (MEA), iar termostatarea se va realiza la 25C, timp de 3-5 zile. Pentru determinarea numrului de bacterii aerobe mezofile, aparatului Microflow 90 i se vor ataa placi cu mediu PCA (Plate Count Agar), iar termostatarea se va realiza la 30C, timp de 2-3 zile. Modul de lucru Pentru determinarea contaminrii microbiologice a aerului, prelevarea probelor de aer se poate face manual, programat, programat cu pornire ntrziat sau ciclic. Prelevarea manuala a probelor de aer Dispozitivul de eantionare se deschide folosind tasta ON de pe panoul de comanda, apoi se apsa tasta Prog. i se alege Manual Sampling cu tasta Up sau Down. Se valideaz opiunea fcuta apsnd tasta Enter. 2

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Daca debitul afiat pe ecran este cel dorit, apsai tasta Enter, daca nu, selectai debitul de aer aspirat (L/min), n funcie de ncrctura microbiana presupusa a aerului ce se testeaz, folosind tastele Up sau Down (Up mrete valoarea i Down micoreaz valoarea). Se tasteaz ENTER pentru a confirma valoarea aleasa. Se desprinde capacul din aluminiu al dispozitivului de eantionare i se sterilizeaz folosind arztorul cu gaz. Se ndeprteaz capacul plcii Petri, se aeaz cu gura n jos pe o coala de hrtie, i se fixeaz placa n capacul din aluminiu al dispozitivului de eantionare. Se refixeaz capacul din aluminiu, n care a fost dispusa placa Petri, la dispozitivul de eantionare, prin rotire n sens orar. Se aeaz dispozitivul de eantionare pe o suprafaa plana iar operatorul apas tasta Start pentru a ncepe prelevarea. Cele doua leduri roii se aprind iar pe ecran va fi afiat timpul scurs i volumul de prelevare n cretere. Se apas tasta Stop pentru a termina prelevarea, se sting cele doua leduri, iar pe ecran apare mesajul Sampling end. Se apas apoi oricare tasta pentru a vizualiza primele doua afiri. Se nchide aparatul apsnd tasta Off de pe telecomanda. Se recupereaz placa Petri, se acoper cu capacul, se inscripioneaz i se transporta n condiii corespunztoare la laborator. Se decontamineaz dispozitivul de eantionare. Se termostateaz la 30C, pentru 3 zile, plcile Petri care conin mediu PCA, i la 25 C, timp de 5 zile, cele care conin mediu Malt Extract Agar (MEA). Se numra unitile formatoare de colonii (ufc) din plcile coninnd PCA i, pe baza lor, se calculeaz numrul de bacterii aerobe mezofile din aer. Se numra unitile formatoare de colonii (ufc) din plcile coninnd mediu Malt Extract Agar i, pe baza lor, se calculeaz numrul de drojdii i mucegaiuri din aer. Obinerea rezultatelor 1.1. Formula de calcul Pentru a corela numrul de uniti formatoare de colonii (ufc) prezente n placi cu numrul cel mai probabil de microorganisme dintr-un metru cub de aer, se aplica urmtoarea formula:

N - numrul de microorganisme dintr-un metru cub de aer; reprezint numrul de drojdii i mucegaiuri, cnd numrarea coloniilor se face de pe mediul Malt Extract Agar (MEA), sau numrul de bacterii aerobe mezofile, cnd numrarea se face de pe mediul PCA xi - numrul de uniti formatoare de colonii; - debitul de aer, L/min; t - timpul de prelevare, min;

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

1000 factor de transformare pentru exprimarea numrului de microorganisme din aer per metru cub. 1.2. Exprimarea rezultatelor Rezultatele calculate se rotunjesc la doua cifre semnificative. Ca rezultat se ia numrul de microorganisme per metru cub de aer, exprimat printr-un numr cuprins intre 1,0 i 9.9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuita lui 10. Rezultatul se da sub forma: sau mai puin de 1 ufc de drojdie sau mucegai per decimetru cub de aer. numr de ufc de bacterii aerobe mezofile estimat per metru cub de aer; numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per metru cub de aer; mai puin de o ufc de bacterii aerobe mezofile per decimetru cub de aer

Cnd plcile Petri nu conin nicio colonie, rezultatul se da sub forma:

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

TESTARE A ACIIUNIIII DE IIGIIENIIZARE A AERULUII TESTARE A AC UN DE G EN ZARE A AERULU

Pentru prevenirea i combaterea contaminrii aerului n unitile de industrie alimentar se pune baz pe curarea i dezinfecia aerului, aciuni care se realizeaz prin ventilaie, filtrare si sterilizare cu radiaii ultraviolete a aerului. Ventilaia natural i artificial contribuie de asemenea la reducerea numrului de microorganisme din aer n condiiile realizrii unui schimb suficient de aer. Filtrele de aer care rein suspensii i odat cu acestea i microorganisme, sunt controlate sub aspectul unei bune funcionari, pentru obinerea unei eficiene maxime n reducerea numrului de microorganisme. Dezinfecia aerului se poate realiza prin metode fizice i chimice. Procesul fizic se bazeaz pe aciunea bactericid a razelor ultraviolete, iar cel chimic pe aciunea antimicrobian a unor substane chimice sub form de vapori i aerosoli. Printre aceste substane se menioneaz: cloramina, hipocloritul de sodiu, clorura de var, acidul lactic, etilenglicolul, propilenglicolul, hexilrezorcina i altele. Aa cum se tie, sursa natural de radiaii ultraviolete (U.V.) o reprezint soarele. Radiaiile UV la suprafaa solului reprezint 1-2% din energia solar. n atmosfer aceste radiaii sunt absorbite de ozon i difuzate de ctre moleculele aerului i diveri aerosoli. Aciunea biologic a radiaiilor ultraviolete depinde de: doz, timp de expunere i lungimea de und (). innd seama de aciunea biologic, funcie de lungimea de und, radiaiile UV se mpart n 3 grupe: A. cu ntre 400 314 nm cu efect de pigmentare asupra tegumentelor; B. cu ntre 315 280 nm care provoac eritem tegumentelor; C. cu ntre 280 200 nm cu efect bactericid mai ales la lungimea de und de 250 nm. Aciunea bactericid a radiaiilor UV bazat pe reacii fotochimice deine o importan deosebit n reducerea impurificrii aerului, apei i solului; multe bacterii i chiar virusuri (virusul gripal, al rujeolei, variolei, poliomelitei, encefalitei, turbrii) prezint sensibilitate la aceasta aciune. Pentru dezinfecia aerului n unitile de industrie alimentar, se pot folosi lmpile cu ultraviolete (cu vapori de mercur) cu de 250 nm, care emit un spectru apropiat de cel natural. Avnd n vedere variaiile mari de dimensiuni ale particulelor contaminate din aer, proporia n care se reduce numrul total de microorganisme este constant.

Facultatea tiina i Ingineria Alimentelor Laborator Igiena

Modul de lucru n cadrul laboratorului se va testa eficiena reducerii impurificrii aerului cu microorganisme, n funcie de timpul de aciune al radiaiilor UV. I. Iniial se va realiza o prob martor. Aceasta const n pregtirea plcilor Petri cu medii de cultur adecvate pentru dezvoltarea microorganismelor (Plate Count Agar i Cloramfenicol Agar). Acestea se vor lsa deschise n spaiul/zona de analiz a aerului, n care lampa UV nu a acionat, pentru o durat de 10 15 minute. Apoi plcile Petri se nchid, se noteaz i se termostateaz la parametrii corespunztori. II. Se las s acioneze lampa n aceeai zon de lucru timp de 10 minute. Dup aceea se pregtesc alte placi Petri cu medii de cultur adecvate (Plate Count Agar i Malt Extract Agar). Acestea se vor aeza n zona n care a acionat deja lampa UV i se vor menine deschise timp de 10 15 minute. Apoi plcile Petri se nchid, se noteaz i se termostateaz la parametrii corespunztori. III. Se va realiza ca la punctul II, modificndu-se timpul de lucru al lmpii, de la 10 minute, la 20 minute de aciune. Dup termostatare rezultatele se trec n tabelul de mai jos:
Analiz aer ufc/m2aer Bacterii aerobe mezofile Iniial Dup 10 minute funcionare a lmpii Dup 20 minute funcionare a lmpii de de Fungi % Eficien n reducerea numrului total de microorganisme