UJI PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH FRAKSI AIR DARI EKSTRAK TEH HITAM DAN VITAMIN C SECARA IN VITRO

DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA Agnes Nora Iska Harnita

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

Intisari Mengingat besarnya kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas pada hampir semua molekul biologis seperti DNA, protein, dan membran lipid, maka saat ini banyak dikembangkan senyawa antioksidan. Namun, suatu senyawa dapat menjadi antioksidan pada suatu target, tetapi mungkin dapat menjadi prooksidan pada target yang lain. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas antioksidan dari bahan alam (fraksi air dari ekstrak teh hitam) dan senyawa sintetis (vitamin C) secara in vitro dengan metode deoksiribosa. Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subyek uji diberi perlakuan. Secara in vitro, pengujian penangkapan radikal hidroksil dapat dilakukan dengan metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan reagen Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil, gula deoksiribosa sebagai substrat, asam trikloroasetat (TCA) dan asam tiobarbiturat (TBA) untuk membentuk suatu kromogen berwarna merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan secara in vitro menggunakan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam effective scavenging 30 (ES30) menunjukkan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih kecil dibandingkan vitamin C. Kata kunci: radikal hidroksil, metode deoksiribosa, fraksi air dari ekstrak teh hitam, dan vitamin C.

Bab I. Pendahuluan Radikal bebas adalah spesies kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya, sehingga dapat menyerang senyawa-senyawa lain seperti DNA, membran lipid, dan protein. Radikal ini akan merebut elektron dari molekul lain yang ada disekitarnya untuk menstabilkan diri, sehingga spesies kimia ini sering dihubungkan dengan terjadinya kerusakan sel, kerusakan jaringan, dan proses penuaan (Halliwell and Gutteridge, 1999). Beberapa jenis radikal bebas yang termasuk dalam ROS (Reactive Oxygen Species ) adalah radikal superoksid (O2-), radikal hidroksil (OH), radikal peroksil (ROO), radikal peroksinitrit (O=NOO-), dan radikal oksida nitrit (NO). Diantara jenis-

152

jenis radikal tersebut, radikal hidroksil merupakan jenis radikal yang paling reaktif (Anonim, 2005). Mengingat besarnya kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas, saat ini banyak dikembangkan senyawa-senyawa antioksidan. Suatu senyawa antioksidan mungkin bisa melindungi suatu target dari kerusakan oksidatif, tetapi tidak dapat melindungi target yang lain, bahkan dapat memperburuk kondisi. Sebagai contoh, senyawa antioksidan sintetis seperti BHA (Butylated Hidroxy Anisole) yang merupakan suatu inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi pada dosis konsumsi yang berlebihan dapat memacu terjadinya kanker. Hal ini diduga adanya kerusakan oksidatif pada DNA sehingga memicu terjadinya mutasi. Beberapa literatur juga menyebutkan bahwa vitamin C dan vitamin E selain sebagai senyawa antioksidan tetapi juga bersifat prooksidan. Hal ini yang mendorong pengembangan senyawa antioksidan yang berasal dari bahan-bahan alami seperti teh hitam. Aktivitas antioksidan dari teh berasal dari senyawa-senyawa polifenol seperti katekin dan flavonoid flavonoid lainnya. Teh hitam merupakan salah satu minuman yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat. Jenis teh ini dibuat melalui fermentasi dengan mengoksidasi katekin dalam daun segar dengan katalis polifenol oksidase, sehingga memberi ciri khas teh hitam yaitu berwarna, kuat, dan berasa tajam. Metode in vitro yang dipilih untuk menentukan aktivitas antioksidan dari fraksi air teh hitam adalah metode deoksiribosa. Metode ini menggunakan reagen Fenton sebagai penghasil radikal hidroksil dan gula deoksiribosa sebagai model makromolekul yang didegradasi. Produk degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil dapat dilihat dengan spektrofotometer visibel karena produk senyawa yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat dalam suasana asam dengan bantuan pemanasan dan menghasilkan suatu produk berwarna merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm (Halliwell et al., 1987). Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antioksidan apabila senyawa tersebut dapat memperlambat atau menghambat proses oksidasi senyawa lain (McBridge and Kraemer, 1999). Pengujian aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam dimaksudkan untuk mengetahui seberapa besar konsentrasi yang dibutuhkan untuk

153

menangkap suatu radikal bebas sehingga efek negatif dari radikal bebas tersebut dapat dikurangi. Berdasarkan latar belakang di atas, maka penelitian dilakukan untuk mengetahui kekuatan aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam dibandingkan dengan vitamin C. Senyawa yang digunakan sebagai pembanding (kontrol positif) dalam uji aktivi tas penangkapan radikal hidroksil dalam penelitian ini adalah vitamin C. Menurut Halliwell dan Gutteridge (1999), secara in vitro vitamin C dapat berkhasiat sebagai antioksidan dengan menangkap radikal hidroksil dengan konstanta kecepatan reaksi lebih besar dari 109 M 1 s 1. Besarnya kemampuan penangkapan radikal hidroksil dinyatakan sebagai persen scavenging. Semakin besar nilai persen scavenging suatu senyawa/fraksi menunjukkan besarnya kemampuan senyawa tersebut dalam menangkap suatu radikal bebas. Pada penelitian ini aktivitas antioksidan fraksi air teh hitam dinyatakan dalam effective scavenging 30 (ES30). Nilai tersebut menyatakan besarnya konsentrasi fraksi yang dibutuhkan untuk menangkap radikal hidroksil sebanyak 30 %. Bab II. Metode Penelitian A. Preparasi Sampel Sampel berupa teh hitam merk X diambil sebanyak 80 bungkus dari 100 bungkus. Sebanyak 20 bungkus sampel dari jenis teh hitam dihomogenkan, digiling, dihaluskan dengan blender. Serbuk diayak dengan derajad halus serbuk 4/18. Penyarian dilakukan dengan cara perkolasi : timbang 300 g teh hitam, masukkan ke dalam perkolator, tambahkan etanol 70 % sebanyak 1 liter dan diamkan selama 3 jam dan dituangi dengan cairan penyari sampai cairan penyari yang keluar sudah jernih. Perkolat kemudian dievaporasi hingga mendapatkan ekstrak kental. Selanjutnya , ekstrak kental yang diperoleh diuapkan di atas waterbath sambil diangin-anginkan dengan kipas angin sampai diperoleh ekstrak kering (Anonim, 1986) Fraksinasi dilakukan dengan cara ekstraksi : timbang 75 g ekstrak kering dan dilarutkan dengan aquades 150 ml di atas penangas air sambil diaduk. Larutan tersebut diekstraksi dengan 100 ml kloroform, gojog selama 10 menit dan didiamkan selama 15 menit. Pisahkan fraksi air dari fraksi kloroform. Diulang sebanyak 3 kali . Fraksi air

154

diambil dan diekstraksi dengan 50 ml etil asetat, gojog selama 10 menit, diamkan selama 15 menit. Fraksinasi diulang dan selanjutnya fraksi air yang diperoleh dipekatkan dengan rotaevaporator suhu 50C sampai kental. Penguapan dilanjutkan di atas waterbath sambil diangin-anginkan dengan kipas angin hingga kering. Ekstrak kering kemudian disimpan dalam eksikator. Timbang seksama sebanyak 0,01 g serbuk fraksi air teh hitam, masukkan ke dalam beker gelas 100 ml dan tambahkan aquades secukupnya. Pindahkan ke labu ukur 10 ml dan tambahkan aquades hingga tanda. B. Optimasi Metode Deoksiribosa 1. Penentuan operating time (OT) Pada tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 300 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; 4200 l bufer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM. Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 C selama 30 menit, dinginkan dengan air mengalir selama 5 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimal teoritis (maks teoritis) 532 nm selama 1 jam (Kunchandy and Rao, 1989). 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (maks) Pada tabung reaksi bertutup, masukkan berturut-turut 200, 300, dan 400 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian ke dalam masing-masing tabung tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; bufer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 C selama 30 menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400 600 nm.

3. Pembuatan kurva hubungan antara konsentrasi deoksiribosa dengan absorbansi kromogen MDA TBA

155

Pada tabung reaksi bertutup, masukkan berturut-turut 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian ke dalam masing-masing tabung tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; bufer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 C selama 30 menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time dan panjang gelombang maksimum hasil optimasi. C. Pengujian Aktivitas Antioksidan 1. Larutan kontrol Pada satu tabung reaksi bertutup, masukkan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, kemudian ke dalam tabung tersebut, tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; 4200 l bufer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM sehingga diperoleh volume akhir campuran adalah 6 ml. Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada water bath suhu 80 C selama 30 menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time dan panjang gelombang maksimum hasil optimasi. 2. Larutan sampel A(Vitamin C sebagai antioksidan). Pada empat tabung reaksi bertutup yang masing-masing telah dimasukkan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, tambahkan 200, 400, 600, dan 800 vitamin C 60 mM. Kemudian ke dalam masing-masing tabung, tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; bufer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume vitamin C yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi campuran tersebut dipanaskan pada waterbath suhu 80 C selama 30 menit, dinginkan, dan dibaca absorbansinya pada operating time dan panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

156

3. Larutan sampel B ( Fraksi air dari ekstrak teh hitam sebagai antioksidan) Pada tabung reaksi bertutup, masukkan sebanyak 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM dan fraksi air teh hitam 1 mg / ml sebanyak 200 l, 400 l, 600 l, 800 l dan 1000 l. Kemudian ke dalam masing-masing tabung tambahkan 300 l FeCl3 1 mM; 300 l EDTA 1 mM; 300 l H2O2 20 mM; buffer fosfat pH 7,4; dan 300 l vitamin C 1 mM (Penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi etil asetat teh hitam yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Inkubasikan pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu, tambahkan 1 ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. Tabung reaksi yang berisi larutan sampel tersebut dipanaskan menggunakan waterbath pada suhu 80C selama 30 menit. Kemudian didinginkan dengan air mengalir selama 5 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Buat juga larutan kontrol. Bab III. Hasil dan Pembahasan A. Preparasi Sampel Perkolasi dengan cairan penyari etanol 70% dimaksudkan untuk melarutkan senyawa-senyawa polifenolik yang terkandung di dalam teh. Perkolat yang didapat dievaporasi untuk menguapkan seluruh cairan penyari menjadi ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental dikeringkan dengan cara diuapkan di atas waterbath sambil diangin-anginkan dengan kipas angin untuk membantu penguapan. Penyimpanan ekstrak kering di dalam eksikator untuk melindunginya dari uap air udara. Fraksinasi ekstrak kering teh hitam yang telah dilarutkan dengan aquades dilakukan secara ekstraksi dengan corong pisah. Ekstraksi dengan kloroform untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang bersifat non-polar seperti lipid, klorofil, dll, sedangkan senyawa-senyawa polifenolik termasuk flavonoid tetap berada dalam fraksi air. Senyawa-senyawa polifenolik inilah yang diduga mempunyai aktivitas antioksidan. B. Optimasi Metode Deoksiribosa Menurut Halliwell dan Gutteridge (1999), reaksi degradasi gula deoksiribosa akan menghasilkan suatu produk karbonil dan dikarbonil diantaranya malondialdehid (MDA). Adanya MDA dapat dideteksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam

157

membentuk suatu kromogen yang berwarna merah muda. Jumlah kromogen MDA-TBA yang terbentuk sangat tergantung dari jumlah deoksiribosa yang didegradasi. Semakin tinggi konsentrasi deoksiribosa yang ditambahkan akan menyebabkan peningkatan absorbansi kromogen MDA-TBA
S H N O O O S N OH HO N SH

+
HN H H N N

OH

OH

Asam Tiobarbiturat

Malondialdehid

MDA-TBA (berwarna merah muda)

Gambar 1. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA

Pengukuran operating time kromogen MDA-TBA yang dihasilkan dari larutan kontrol dengan konsentrasi deoksiribosa absorbansi kromogen MDA-TBA telah stabil sejak menit ke nol sampai menit ke-60 dengan absorbansi 0,511 pada panjang gelombang teoritis 532 nm. Panjang gelombang maksimum dari kromogen MDA-TBA ditentukan dengan melakukan scanning terhadap kromogen MDA-TBA pada rentang panjang gelombang 400-600 nm. Rentang ini dipilih karena kromogen MDA-TBA memiliki panjang gelombang maksimum teoritis 532 nm. Dari ketiga seri larutan deoksiribosa tersebut diperoleh panjang gelombang maksimum secara berturut-turut adalah 531,8, 531,8, dan 531,6 nm. Panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA yang digunakan dalam penelitian adalah 531,8 nm karena panjang gelombang ini lebih mendekati panjang gelombang teoritis C. Pengujian Aktivitas Antioksidan Dari hasil uji penangkapan radikal hidroksil terlihat bahwa Konsentrasi yang menunjukkan penangkapan radikal hidroksil sebesar 30% (ES30) fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih kecil dari ES30 vitamin kecil (Tabel I). Harga ES30 berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan, sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi air dari ekstrak teh hitam mempunyai aktivitas antioksidan secara in vitro yang lebih besar dibandingkan vitamin C. Aktivitas antioksidan yang cukup besar ini karena di dalam fraksi air dari

158

ektrak teh hitam diduga mempunyai kandungan senyawa polifenolik yang besar seperti diantaranya senyawa-senyawa flavonoid Pada penelitian ini juga terbukti bahwa vitamin C selain bersifat antioksidan tetapi juga bersifat prooksidan. Sifat antioksidan ditunjukkan terjadinya penurunan absorbansi dibandingkan dengan kontrol (tanpa penambahan vitamin C ), sedangkan sifat prooksidan ditunjukkan pada penambahan konsentrasi vitamin C sebesar 1,00539 mM (0,17708 mg/ml) yaitu terjadi kenaikan absorbansi dari larutan uji dibandingkan dengan kontrol (tanpa penambahan vitamin C) (Tabel II). Hal inilah yang mendorong penelitianpenelitian untuk mendapatkan senyawa senyawa antioksidan dari bahan alam. Tabel I. Konsentrasi yang menunjukkan penangkapan radikal hidroksil sebesar 30% (ES30) oleh vitamin C dan fraksi air dari ekstrak teh hitam
Replikasi I II III IV V ES30 (mg/ml) Fraksi air dari Vitamin C ekstrak teh hitam 0,323 0,0740 0,331 0,0461 0,334 0,0515 0,344 0,0608 0,374 0,0494

Rata rata SD CV (%)

0,341 0,0196 5,75

0,0564 0,0113 19,97

159

Tabel II. Sifat antioksidan dan prooksidan vitamin C

Konsentrasi vitamin C (mg/ml) Replikasi I II

0 0,177 0,354 0,531 0,708 0,885 1,063 1,396 1,417 1,594

0,953 1,320 0,642 0,424 0,353 0,275 0,230 0,195 0,172 0,149 Bab IV. Kesimpulan dan Saran

0,954 1,319 0,662 0,436 0,347 0,268 0,222 0,197 0,166 0,160

A. Kesimpulan Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan secara in vitro menggunakan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam effective scavenging 30 (ES30) menunjukkan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih kecil dibandingkan vitamin C, sehingga aktivitas antioksidan fraksi air dari ekstrak teh hitam lebih besar dibandingkan dengan vitamin C. B. Saran Berdasarkan hasil dari penelitian yang telah dilakukan, peneliti memberikan saran untuk dilakukan penelitian lebih lanjut tentang senyawa-senyawa antioksidan yang lain yang berasal dari alam. Daftar Pustaka Anonim, 1986, Sediaan Galenik,1-28, Depkes RI, Jakarta. Anonim, 2005, Reactive Oxygen Species (ROS), http://users.rcn.com/jkimball.ma. ultranet/BiologyPages/R/ROS.html. Diakses pada 20 Agustus 2005. Halliwel, B. and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, Third Edition, 23, 36-49, 53-60, 106-206, 264-271, 366, Oxford University Press, New York. Halliwel, B., Gutteridge, J.M.C., and Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method: A Simple Test-Tube Assay for Determination of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radicals, Anal. Biochem., 165, 215-219, Academic Press, London. Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1990, Oxygen Radical Scavenging Activity of Curcumin, Int. J. of Pharm, 58, 237-240. Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1989, Effect of Curcumin on Hidroxyl Radical Generation Through Fenton Reaction, Int. J. of Pharm, 57, 173-176. 160

McBride, J.M., and Kraemer, W.J., 1999, Free Radicals, Exercise, and Antioxidant, J. Strength Cond. Research, 13(2), 175-183.

161