Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS.

Nguyễn Thị Lan

BÀI MỞ ĐẦU: MÔ PHỎNG THÍ NGHIỆM

1. Mô phỏng điện di protein trên điện di đứng.

2. Mô phỏng điện di protein bằng phương pháp điện di 2 chiều.
3. Mô phỏng các phương pháp lai.

BÀI 1: CHIẾT TÁCH ADN TỪ TẾ BÀO LÁ NON

1. Vật liệu và hóa chất

1.1 Vật liệu sinh học
Lá non
1.2 Hóa chất
Dung dịch đệm 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide)
1.5% CTAB
75mM Tris-HCL
15mM EDTA
1.05M NaCl
Đệm kết tủa CTAB
1% CTAB
50mM Tris-HCL
10mM EDTA
Đệm TE
10mM Tris-HCl
1mM EDTA
Đá khô
Nitơ lỏng
Chloroform: isoamylalcohol (24:1)
10mg/ml RNase
99.5% , 70% ethanol
1M NaCl
10% CTAB

1
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

2. Dụng cụ thiết bị
Máy xay
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml
Ống dùng để quay li tâm loại 50 ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Bình tam giác
3. Nguyên tắc
Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào
và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong
dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa ADN bằng cồn. Tủa sau khi thu
được được hòa tan lại trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy
theo mục đích nghiên cứu.
Khác với tách mô động vật, khi tách mô thực vật thì ta phải tiến hành loại
bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực vật. Ở đây ta dùng phương pháp
tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách ADN ra khỏi mô thực
vật. Chất này chỉ hòa tan ADN chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà
có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách ADN.
3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân
Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa
học hay cơ học. Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơ học, nghiền nát bằng
máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào lá lúa.
3.2 Chiết ADN và loại bỏ protein
Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để
hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận
được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây
thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm
biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng
làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra
khỏi phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa
hai pha nước và pha chloroform.

2
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

3.3 Kết tủa CTAB và ADN

Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan
ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này.
3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN
Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN
bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm
dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần
tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có
thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần
tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau này
nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%.
4. Các bước tiến hành
4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật
- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông
lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn.
- Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi
cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.
4.2. Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách ADN và loại bỏ protein
- Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử
lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ.
- Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt
độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để
quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút)
- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml
dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt
độ phòng.Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút).
Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới.

3
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

4.3 Kết tủa CTAB và ADN

- Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên) đệm kết tủa
CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA màu trắng đục nổi
lên.
- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng
thu phần kết tủa.
4.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN
- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56 oC NaCl 1M và
cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA .
- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN.
- Quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.
- Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô ADN. Lúc này
ADN sẽ chuyến sang trong suốt không màu
- Hòa tan ADN thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20 oC cho thí
nghiệm tiếp theo.

4
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

BÀI 2: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA ADN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THỤ

1. Nguyên tắc
1.1 Đo hàm lượng ADN
Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định.
Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng
purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260 nm
trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230 nm-240 nm và
không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm. Dựa vào tính chất này mà
người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường
độ ion. Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí
nghiệm này pha loãng ADN trong dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng.
Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của ADN.
Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD260 (1)
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với
ADN biến tính sợi đơn hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260
nm tăng lên và được tính bởi công thức sau:
Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD260 (2)
Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD260 (3)
Trong đó
HSPL : hệ số pha loãng
OD260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
OD280 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
1.2 Đo độ tinh sạch của ADN
Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm
tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của
dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai
bước sóng 260nm và 280nm.Được tính bằng công thức sau:

5
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4)

Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là
tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch
ADN sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính
hay bị phân hủy.
1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN
biến tính tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt.
Khi tăng nhiệt độ của ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi
sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai
sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt cặp lại khi làm
lạnh đột ngột sau khi biến tính.
2. Dụng cụ và hóa chất
Mẫu ADN: mẫu được tách ra từ lá mía ở bài trước
Nước cất tuyệt trùng
Đá lạnh
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy soi màu
Máy lắc Vortex
Bếp
3. Các bước thí nghiệm
Biến tính ADN
- Hút 5µl ADN mẫu cho vào 2 eppendorf loại 1.5ml. Chú ý trước khi hút
mẫu cần phải vortex để trộn đều mẫu.
- Đun cách thủy mẫu ADN trong vòng 10 phút .
- Làm lạnh đột ngột một ống bằng cách đặt trên đá đang tan trong 10 phút.
Ống còn lại thì làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị mẫu
- Pha loãng 100 lần mẫu ADN bằng nước cất tuyệt trùng (5µl ADN + 495µl
nước cất tuyệt trùng).
- Pipetting hoặc Vortex chộn đều dung dịch pha

6
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

Đo độ hấp thụ trên máy soi màu

- Rửa sạch cuvet thạch anh rồi tráng bằng nước cất để khô ráo.
- Nước cất tuyệt trùng (nước dùng pha loãng ADN) để làm chuẩn chuẩn
chỉnh cân bằng máy.
- Lắc đều dung dịch mẫu đo trước khi tiến hành đo mẫu.
- Đo ở bước sóng 260nm và 280nm.
4. Kết quả
Bảng 1 : Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN
Bước ADN không biến ADN biến ADN phục hồi sau biến
sóng tính tính tính
260 nm
280 nm

7
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

BÀI 3: XÁC ĐịNH HÀM LƯỢNG ADN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI NGANG

1. Khái niệm về điện di

Điện di là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm
sinh học, hóa học, đặc biệt là sinh học phân tử để tách các hạt tích điện như là
ADN, ARN, protein...Như chúng ta đã biết các phân tử nucleic acid tích điện âm
và khi đặt chúng trong một điện trường thí các phần tử tích điện này sẽ di chuyển
từ cực âm sang cực dương. Khi tiến hành điện di trên bản gel (gel agarose hoặc
là gel polyacrylamid), các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để đến cực
dương. Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có
kích thước lớn thì di chuyển chậm hơn. Chính vì vậy mà có thể phân tách các hạt
tích điện này theo kích thước bằng cách điện di trên gel.
Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel
polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đôi có kích
thước từ 100 đến 10000 bp. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân
tử ADN sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotid và còn có thể tách riêng
từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích thước
đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau.

Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li

(bp)

0.6% 1000 - 20000

0.7% 800 - 10000
1% 500 - 7000
1,2% 400 - 6000
1,5% 200 - 3000
2,0% 100 - 2000

Trong điện di ADN thường sử dụng hai loại đệm đó là đệm TBE và đệm
TAE. Đệm TAE dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước lớn còn đệm
TAE thường dùng để phân tách các phần tử ADN có kích thước nhỏ. Nhưng

8
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

trong trường hợp cần làm sạch ADN thì phải dùng đệm TAE vì đệm TBE có
chứa boric acid làm ảnh hưởng đến qúa trình làm sạch sau này.
Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử ADN trên
gel. Đối với gel Agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm ethidium bromide. Chất
này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử ADN và phát huỳnh quang khi
chiếu tia tử ngoại.Đối với gel polyacrylamid các phần tử được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng được phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự
ghi.
Máy điện di ngang HOEFER HE33
Máy HOEFER HE 33 là thiết bị điện di trên gel agarose loại nhỏ, có cấu
tạo dạng nằm ngang. Máy HE 33 được chế tạo dựa trên ý tưởng cần tiến hành
điện di nhanh với một lượng nhỏ ADN trên gel agarose. Thiết bị gồm có các bộ
phận chính sau:
- Nắp: là phần trên của thiết bị có thể tháo rời.
- Các dây dẫn: gồm hai dây dẫn màu đen và màu đỏ nối vào cực dương và
cực âm của bộ điện di với nguồn điện.
- Điện cực: cắm trong gel gồm hai điện cực dương (có màu đỏ), âm (có màu
đen)
- Khuôn đổ gel: dùng để đổ gel chạy điện di. Khuôn gồm khay, giá đỡ, các
miếng gạc hút bọt và lược.
- Buồng điện di: dùng để chạy điện di, gồm buồng chạy λHinIII digest
điện di, điện cực, buồng làm lạnh. bp
23130
Thang ADN (maker)
9416
Khi điện di thì người ta thường điện di với thang ADN
6557
chuẩn hay còn gọi là maker để dựa vào đó mà ta có thể xác
định được mẫu ADN đem đi điện di. Trong bài thí nghiệm 2322
2027
này chúng ta sử dụng λ-HinIII, các phân tử ADN của phase λ
sau khi được cắt bởi enzyme cắt hạn chế HinIII. Kích thước
của các phần tử có trong thang được biểu diễn ở hình bên.
564
2. Dụng cụ và hóa chất
2.1 Vật liệu sinh học
ADN tách từ lá lúa ở bài 1 125

9
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

Thang DNA (maker) : λHinIII

2.2 Hóa chất
+ Agarose (0.8%) : pha 4g agarose trong 50ml dung dịch đệm TAE
+ Đệm điện di TAE 1×
Tris base 0,4M 44,8g
Acetic acid 0,2M 11,4g
EDTA 0,01M 20,0ml
Định mức đến 1000ml
+ Đệm tải mẫu
Glycerol 30%
Brommophenol Blue 0,25%
Tris 200mM
Na2EDTA 20mM
+ Thuốc nhuộm ADN: dung dịch ethidiume bromide 10mg/ml
2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy điện di ngang HOEFER HE33
Bộ nguồn điện di điện thế từ 80 -150V
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Lò vi sóng
Bình tam giác
3 Các bước tiến hành thí nghiệm
3.1 Chuẩn bị gel
Trong bài thí nghiệm này tiến hành điện di ADN được chiết tách ra từ lá
mía ở bài 1 và điện di trên gel agarose 0.8% với đệm điện di là đệm TAE.
- Pha loãng 10 lần đệm 10×TAE bằng nước cất.
- Cân 0.8g agarose vào bình tam giác loại 300ml, có cho lắc từ vào
- Cho 100ml đệm 1×TAE đã được chuẩn bị ở trên.
- Bao miệng hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò vi sóng 30
giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn thì lại làm tiếp như trên

10
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chú ý không để cho gel trào ra miệng bình ra
ngoài vì gel agarose nóng chảy gây bỏng rất nặng.
- Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khoảng 60 - 50 độ (cho đến khi có thể
sờ tay vào thành bình trong vòng 1 phút, nếu nóng quá sẽ làm hỏng thiết bị điện
di còn nguội quá gel sẽ đông trước khi cho gel vào khuôn gel, hoặc gel đông
không đều)
- Cài lược và cho gel vào khuôn gel
- Chờ cho gel đông tụ hoàn toàn (khoảng 30 phút đến 1 tiếng) rồi sau đó đặt
gel vào buồng điện di rồi tháo lược.
- Sau khi gel đông tụ hoàn toàn, đổ đệm vào buồng điện di. Đổ cho đến khi
mức dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel khoảng 1cm.
3.2 Chuẩn bị mẫu và điện di
- Cho vào ống eppendorf 1,5ml 2µl mẫu ADN và 1µl dung dịch tải mẫu,
7µl nước cất tuyệt trùng.
- Trộn đều bằng pipetman (pipetting). Nếu dung dịch pha mẫu dính trên
thành ống thì li tâm để mẫu rơi xuống hết đáy (spin down).
- Dùng pipetman nạp mẫu và nạp chuẩn (2µl) vào giếng gel.
- Đậy nắp buồng điện di, cắm điện cực
- Điện di với hiệu điện thế 90V-120V trong vòng 30 phút
3.3 Nhuộm và hiển thị trên gel.
- Sau khi điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra
- Cho bản gel vào chậu dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong
vòng 30 phút. Chú ý phải đeo bao tay khi tiếp xúc với ethidium bromide vì chất
này gây ung thư.
- Vớt bả gel ra và xem kết quả trên đèn UV, hoặc chụp hình kết quả

11
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

BÀI 4: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CHỦNG E. coli

1. Nguyên tắc
Phương pháp PCR thường được dùng để phát hiện các khuẩn mang mầm
mống bệnh hay các chủng vi sinh vật có trong môi trường. Đem nhân dòng bằng
phương pháp PCR một gen đặc hiệu của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn
gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó có chứa trong mẫu cần
kiểm tra. Ở đây chúng ta sử dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E. Coli
để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích .
Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước
sau:
Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành
nhân dòng bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi.
Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu
ADN
Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phương pháp PCR
Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN
1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là phương pháp khuếch đại tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục
đích thu một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định. Đầu tiên ADN
đích (target ADN) được làm biến tính để tách mạch đôi thành mạch đơn
(annealing) Nhiệt độ sau đó được hạ thấp cho phép mồi (primer) có thể bắt cặp
với sợi khuôn. Với sự có mặt của các dNTP, DNA polymerase và trong môi
trường phản ứng thích hợp đoạn mồisẽ được nối dài để tạo ra mạch ADN
mới.Chu trình trên được lặp đi lặp lại nhiều lần từ một lượng ADN nhỏ ta có thu
được hàng triệu bản sao.
1.2 Mồi (primer)
Mồi là đoạn ADN ngắn khoảng trên dưới 20 nucleotid có khả năng bắt cặp
bổ sung với một đầu mạch khuôn ADN có mang một đầu 3'-OH tự do giúp ADN
polymerase khởi đầu sự tổng hợp một chuỗi mạch mới. Khi cung cấp hai mồi
chuyên biệt: mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer) để bắt cặp
bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN thì sau nhiều chu kì thì ta thu được
sản phẩm chủ yếu là đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Kết quả phản ứng PCR phụ

12
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

thuộc nhiều vào đoạn mồi được thiết kế. Mồi thiết kế phải tuân thủ theo các
nguyên tắc sau.
-Mồi thường khoảng trên dưới 20 nucleotid và có lượng GC vào khoảng
50-60%.
- Tm của mồi xuôi và ngược không khác nhau quá xa.
-Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không
trùng với trình tự lặp lại trên gen.
-Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ xung
giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cẩu trúc kẹp tóc do sự bắt
cặp bổ xung giữa các phần khác nhau của một mồi.
Muốn thực hiện được phản ứng PCR thì nhiệt độ annealing phải thấp hơn
nhiệt độ Tm của mồi.
Cách tính nhiệt độ Tm
Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính đơn giản
sau
Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n
n: tổng số nucleotid
G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A
Cách tính này đúng với các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid
1.3 Tag polymerase
Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước
nóng. Enzyme Tag Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các
acid nucleotid và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá
trình.
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hỗn hợp Primer
Nồng độ 2.5 pmol/µl
Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA
Trình tự Nucleotid:
5'-CCATGTACGCCAAAGAATTCCGGAT-3'
3'- CTCTCTTTGTTGAATTTTGAAGTGC-5'
2.2 Hóa Chất
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR

13
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl)

Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM
( NH4)2SO4 20mM
Tween 20 0,01%
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại
MgCl2 1,5mM
Các hóa chất dùng cho điện di ADN
2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy PCR
Máy điện di ngang80 -150V
Bộ nguồn điện di điện thế từ
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Tủ ấm
Máy lắc Vortex
3. Các bước thí nghiệm
3.1 Xử lí mẫu
- Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn. Chú
ý không để thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh
hưởng đến phản ứng PCR.
- Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt
trùng.
- Đun sôi trong vòng 5 phút
- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy
phần nước dịch lỏng có chứa ADN đem đi nhân dòng.
3.2 Phản ứng PCR
Thiết lập chương trình cho máy PCR
Step1. 94 độ 1min (Biến tính ADN)
Step2. 98 độ 20 sec (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn)
Step3. 60 độ 20 sec (Mồi bắt cặp với sợi khuôn)
Step4. 68 độ 1min (Phản ứng kéo dài)

14
Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan

Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần

Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
Step7 4 độ ∞
Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên
đá)
- Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó
cho 4µl dung dịch hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã
được xử lí ở trên.
- Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không
còn bám trên thánh ống ( Spin down)
- Đặt eppendof và máy PCR
- Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng)
3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%)
- Gel pha trong dung dịch đệm điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi
sóng cho đến khi gel được nóng chảy hoàn toàn.
- Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau
khi gel nguội đổ gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ
hoàn toàn.
- Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm
- Pha 2µl ADN mẫu + 1µl thuốc nhuộm + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng
pipetman tra hỗn hợp mẫu và 2µl maker vào từng giếng gel.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.

15