Thí nghi
ệ
m Sinh h
ọ
c phân t
ử
Biên so
ạ
n : ThS. Nguy
ễ
n Th
ị
Lan1
BÀI M
Ở
ĐẦ
U: MÔ PH
Ỏ
NG THÍ NGHI
Ệ
M
1. Mô ph
ỏ
ng
đ
i
ệ
n di protein trên
đ
i
ệ
n di
đứ
ng.2. Mô ph
ỏ
ng
đ
i
ệ
n di protein b
ằ
ng ph
ươ
ng pháp
đ
i
ệ
n di 2 chi
ề
u.3. Mô ph
ỏ
ng các ph
ươ
ng pháp lai.
BÀI 1: CHI
Ế
T TÁCH ADN T
Ừ
T
Ế
BÀO LÁ NON1. V
ậ
t li
ệ
u và hóa ch
ấ
t1.1 V
ậ
t li
ệ
u sinh h
ọ
c
Lá non
1.2 Hóa ch
ấ
t
Dung d
ị
ch
đệ
m 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide)1.5% CTAB75mM Tris-HCL15mM EDTA1.05M NaCl
Đệ
m k
ế
t t
ủ
a CTAB1% CTAB50mM Tris-HCL10mM EDTA
Đệ
m TE10mM Tris-HCl1mM EDTA
Đ
á khô Nit
ơ
l
ỏ
ngChloroform: isoamylalcohol (24:1)10mg/ml RNase99.5% , 70% ethanol1M NaCl10% CTAB
Thí nghi
ệ
m Sinh h
ọ
c phân t
ử
Biên so
ạ
n : ThS. Nguy
ễ
n Th
ị
Lan2
2. D
ụ
ng c
ụ
thi
ế
t b
ị
Máy xayMáy li tâmEppendorf 1.5ml
Ố
ng dùng
để
quay li tâm lo
ạ
i 50 mlMicropipette 20, 200, 1000
µ
lBình tam giác
3. Nguyên t
ắ
c
Để
ti
ế
n hành tách ADN t
ừ
t
ế
bào thì ta ph
ả
i ti
ế
n hành phá b
ỏ
màng t
ế
bàovà màng nhân, sau
đ
ó bi
ế
n tính protein
để
lo
ạ
i b
ỏ
l
ượ
ng protein ch
ứ
a trongd
ị
ch tách, lo
ạ
i b
ỏ
RNA và sau cùng là k
ế
t t
ủ
a ADN b
ằ
ng c
ồ
n. T
ủ
a sau khi thu
đượ
c
đượ
c hòa tan l
ạ
i trong dung d
ị
ch
đệ
m TE ho
ặ
c n
ướ
c c
ấ
t vô trùng tùytheo m
ụ
c
đ
ích nghiên c
ứ
u.Khác v
ớ
i tách mô
độ
ng v
ậ
t, khi tách mô th
ự
c v
ậ
t thì ta ph
ả
i ti
ế
n hành lo
ạ
i b
ỏ
đườ
ng thành ph
ầ
n có nhi
ề
u trong mô th
ự
c v
ậ
t.
Ở
đ
ây ta dùng ph
ươ
ng pháptách CTAB t
ứ
c là dùng dung d
ị
ch
đệ
m CTAB
để
tách ADN ra kh
ỏ
i mô th
ự
cv
ậ
t. Ch
ấ
t này ch
ỉ
hòa tan ADN ch
ứ
không hòa tan
đượ
c
đườ
ng, nh
ờ
v
ậ
y màcó th
ể
lo
ạ
i b
ỏ
đườ
ng ra kh
ỏ
i d
ị
ch chi
ế
t tách ADN.
3.1 Phá b
ỏ
màng t
ế
bào và màng nhân
Ng
ườ
i ta có th
ể
phá b
ỏ
màng t
ế
bào và màng nhân b
ằ
ng ph
ươ
ng pháp hóah
ọ
c hay c
ơ
h
ọ
c.
Ở
đ
ây chúng ta dùng ph
ươ
ng pháp c
ơ
h
ọ
c, nghi
ề
n nát b
ằ
ngmáy xay và dùng nit
ơ
l
ỏ
ng
để
phá b
ỏ
t
ế
bào lá lúa.
3.2 Chi
ế
t ADN và lo
ạ
i b
ỏ
protein
Sau khi phá b
ỏ
màng t
ế
bào và nhân thì dùng dung d
ị
ch
đệ
m CTAB
để
hòa tan ADN. Nh
ư
ng trong d
ị
ch chi
ế
t có l
ẫ
n protein và ARN nên
để
thu nh
ậ
n
đượ
c ADN tinh s
ạ
ch ta ph
ả
i ti
ế
n hành b
ướ
c lo
ạ
i b
ỏ
protein và ARN.
Ở
đ
âyth
ườ
ng dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác d
ụ
ng làm bi
ế
n tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform c
ũ
ng có tác d
ụ
nglàm bi
ế
n tính protein nh
ư
ng nó còn có tác d
ụ
ng lo
ạ
i b
ỏ
hoàn toàn phenol rakh
ỏ
i ph
ầ
n dung d
ị
ch có ch
ứ
a ADN. Isoamylalcohol có tác d
ụ
ng
ổ
n
đị
nh gi
ữ
ahai pha n
ướ
c và pha chloroform.
Thí nghi
ệ
m Sinh h
ọ
c phân t
ử
Biên so
ạ
n : ThS. Nguy
ễ
n Th
ị
Lan3
3.3
K
ế
t t
ủ
a CTAB và ADN
Để
lo
ạ
i b
ỏ
CTAB thì c
ầ
n ph
ả
i k
ế
t t
ủ
a CTAB và ADN r
ồ
i sau
đ
ó hòa tanADN trong dung d
ị
ch NaCl mà t
ủ
a CTAB không tan trong dung d
ị
ch này.
3.4 Lo
ạ
i b
ỏ
CTAB và làm s
ạ
ch ADN
Sau khi lo
ạ
i b
ỏ
CTAB b
ằ
ng dung d
ị
ch HCl 1M, ta ti
ế
n hành k
ế
t t
ủ
a ADN b
ằ
ng etanol nguyên ch
ấ
t l
ạ
nh,
để
t
ă
ng kh
ả
n
ă
ng k
ế
t t
ủ
a ta có th
ể
pha thêmdung d
ị
ch mu
ố
i CH
3
COONa 3M (2 th
ể
tích ethanol/th
ể
tích dung d
ị
ch c
ầ
nt
ủ
a, 0.1 th
ể
tích dung d
ị
ch mu
ố
i/ th
ể
tích dung d
ị
ch c
ầ
n t
ủ
a. Ngoài ra còn cóth
ể
t
ủ
a b
ằ
ng isopropanol (0.8-1 th
ể
tích Isopropanol/ th
ể
tích dung d
ị
ch c
ầ
nt
ủ
a. Mu
ố
i l
ẫ
n trong ADN s
ẽ
ả
nh h
ườ
ng
đế
n k
ế
t qu
ả
các thí nghi
ệ
m sau nàynên ng
ườ
i ta th
ườ
ng ti
ế
n hành r
ử
a t
ủ
a ADN b
ằ
ng dung d
ị
ch ethanol 70%.
4. Các b
ướ
c ti
ế
n hành4.1
.
Nghi
ề
n nh
ỏ
m
ẫ
u th
ự
c v
ậ
t
- B
ỏ
10 g
đ
á khô vào xay nhuy
ễ
n, sau
đ
ó cho 8 g lá lúa (
đượ
c làm
đ
ôngl
ạ
nh tr
ướ
c khi dùng) xay cho
đế
n khi thành b
ộ
t m
ị
n.- Chuy
ể
n b
ộ
t lá mía vào c
ố
c
đ
ã
đượ
c làm l
ạ
nh trên nit
ơ
l
ỏ
ng tr
ướ
c r
ồ
icho vào c
ố
c 50 ml nit
ơ
l
ỏ
ng.
Đặ
t
ở
-20
độ
trong vòng 6 ti
ế
ng.
4.2. S
ử
d
ụ
ng dung d
ị
ch
đệ
m CTAB
để
tách ADN và lo
ạ
i b
ỏ
protein
- Cho 20 ml dung d
ị
ch
đệ
m
đ
ã
đượ
c
đ
un sôi vào m
ẫ
u lá lúa
đ
ã
đượ
c x
ử
lí trên r
ồ
i ti
ế
n hành l
ắ
c nh
ẹ
.- Ngâm trong b
ể
n
ướ
c nóng
ở
56
độ
trong vòng 20 phút.- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào r
ồ
i l
ắ
c
đề
u
ở
nhi
ệ
t
độ
phòng. Sau khi l
ắ
c chuy
ể
n d
ị
ch chi
ế
t tách trên qua
ố
ng dùng
để
quay li tâm và ti
ế
n hành quay li tâm
ở
nhi
ệ
t
độ
phòng (2800 rpm, 20 phút)- Chuy
ể
n l
ớ
p n
ướ
c
ở
phía trên vào
ố
ng nghi
ệ
m m
ớ
i sau
đ
ó cho 2 mldung d
ị
ch CTAB 10 %
đ
ã
đượ
c hâm nóng
ở
70
độ
.Sau
đ
ó tr
ộ
n
đề
u.- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào r
ồ
i l
ắ
c
đề
u
ở
nhi
ệ
t
độ
phòng.Sau
đ
ó quay li tâm
ở
nhi
ệ
t
độ
phòng (2800 rpm, 20 phút).Thu l
ớ
p n
ướ
c trên vào
ố
ng nghi
ệ
m m
ớ
i.
Search History:
Result 00 of 00
00 results for result for
p.
Recommended
More From This User
Notes
Load more
