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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

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Categories:Types, Research, Science
Published by: Jean Bressan Albarello on Nov 18, 2011
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 CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIAUNIDADE BENTO GONÇALVESLABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULARProf. Fábio Lius Maciel
CAMILA ECKERTGRAZIELA PILETTIJEAN BRESSAN ALBARELLOMARCEL RAMOS DA SILVA
RELATÓRIO EXPERIMENTO 02- REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) -Novo Hamburgo2011
 
 
1. Introdução
Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) éum método de amplificação de DNA sem o uso de um organismo vivo, porexemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras. O processo foi descrito porKary Mullis, em 1983, sendo patenteado em 1989, pela Hoffman La Roche &Perkin-Elmer Corporation. O método PCR é usado habitualmente noslaboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas,como a detecção de doenças hereditárias, a construção de árvoresfilogenéticas, a clonagem de genes, testes de paternidade, etc.O principal propósito da PCR é fazer um número imenso de copias deum determinado fragmento gênico, ao qual o tamanho pode variar de poucospb (pares de bases) até milhares de pb. A técnica explora função natural daenzima chamada de taq
 –
polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus,esta enzima é semelhante à enzima DNA
 –
polimerase que é capaz desintetizar DNA a partir de s
eus precursores no sentido 5’
 
3’. Para
catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presente sob aforma de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Parautilizar esta técnica é necessário ter um conhecimento prévio da seqüência dosgenes a serem amplificados, e a partir disso são sintetizados dois primers ouiniciadores, ou seja, é a partir deles que se inicia a síntese do DNA pela enzimataq
 –
 
polimerase. A síntese se desenvolve sempre no sentido 5’
 
3’.
 A Reação em cadeia da Polimerase é um método muito sensível deanálise e, por isso, é realizado com muito cuidado para evitar contaminações.O presente relatório descreve o experimento realizado no laboratório deBiologia Molecular da Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, unidade deNovo Hamburgo, no dia 10 de novembro de 2011, que teve como objetivo,amplificar um fragmento de DNA no vetor PETCKIB.
 
 
2. Materiais e Métodos
 
2.1. Reação em Cadeia da Polimerase 
Para a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foramutilizados os seguintes materiais:
 
Pipeta de 20,0 μl
 
 
Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5’ do molde)
Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde)
DNA-molde (pETCKIB)
dNTPs (desoxirribonucleotídeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Tampão da Taq DNA-polimerase
Taq DNA-polimerase
Água bidestilada
MgCl2O primeiro passo foi pipetar as soluções, na ordem e quantidadesindicadas na tabela 1, em dois tubos de centrífuga de 0,2 ml, identificadoscomo controle positivo e controle negativo.
Ordem Soluções Quantidade (
μl)
 Controle - Controle +
gua Bidestilada 12,4 13,4Tampão da Taq DNA-polimerase (10X) 2,0 2,0
Iniciador 5' (20 pmol/μl)
1,0 1,0
Iniciador 3' (20 pmol/μl)
1,0 1,0dNTP's (10 mM) 1,0 1,0
DNA molde (50 ng/μl)
1,0 -MgCl2 0,6 0,6Taq DNA-
polimerase (0,5 U/μl)
1,0 1,0
Tabela 1
 –
Soluções utilizadas para a PCR.

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