Estudar as molculas de DNA e RNA

Caractersticas fsicas e qumicas dos cidos nucleicos, importantes para o seu estudo

Estabilidade da molcula de DNA

Pontes de hidrognio (entre as cadeias) Foras de Van der Walls (entre as bases empilhadas)
Emparelhamento de bases, devido complementaridade entre as bases tem um papel importante nas

Tcnicas de hibridao
(manipulao dos cidos nucleicos)

Medio da concentrao da dos cidos nucleicos em soluo

As propriedades de absoro da luz podem ser usadas para:

- deteco - quantificao - teste de pureza

Medio da concentrao da dos cidos nucleicos em soluo

As bases aromticas so menos acessveis luz UV quando em DNAds

Bases aromticas absorvem UV a 260 nm (cdo mximo). Pu>Py

RNA absorve mais luz logo o valor de absoro para uma dada e mesma concentrao de DNA e RNA, maior para o RNA DO260 (DNA)= 1 DO260 (RNA)= 1 50g/ml 40g/ml

Nucleic acids purity

- Pure dsDNA has

A260/A280 = 1,8 > 1,8 <1,8

RNA contamination Protein contamination

- Pure RNA has

A260/A280 = 2

Renaturao da molcula de DNA

Denaturation

Renaturation

Desnaturao dos cidos nucleicos Tm- temperatura de fuso

Tm (melting temperature)- temperatura qual metade da sequncia de bases de determinada molcula de DNA, est desnaturada. Melting point ou temperatura de fuso dos cidos nucleicos

% G/C em diferentes organismos

Factores que afectam a desnaturao/renaturao da dupla hlice % G/C Sequncia do DNA (DNA repetitivo) % incompatibilidade de pb Dimenso da molcula Concentrao do DNA Fora inica (Na+, neutraliza P-; logo quando a concentrao
salina mais baixa, a dupla hlice fica mais instvel, logo maior a restringncia quando se realizam hibridaes)

Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)

Alguns agentes de desnaturao dos cidos nucleicos

Temperatura (calor)- altera o estado tautomrico das

bases, ionizando-as e rompendo ligaes por pontes de H

Solues alcalinas (NaOH) Formamida Ureia

Agentes qumicos que destabilizam pontes de H

Aco de cidos, bases e sais sobre a molcula dos DNA

Bases: -Alteram estado tautomrico das bases, rompendo as interaces por ponte de H, desnaturando a dupla hlice, ou estruturas secundrias dos cidos nucleicos cidos: -Hidrolizam os cidos nucleicos nos seus componentes: bases, acares e fosfatos. Solues cidas moderadas, clivam ligaes glicosdicas, glicosdicas gerando locais apurnicos Sais: - Estabilizam os grupos fosfato com carga negativa

(tautomeric forms)

keto C=O

enol C-OH

keto

enol

amino -NH2

imino =NH

amino

imino

Isolar DNA (ex.)

Grande variedade de tcnicas consoante o tipo de estrutura que envolve o DNA: vrus, clula bacteriana, fungos e leveduras, clulas de eucariotas superiores (plantas e animais).

O lcool exclui as molculas de gua do DNA, precipitando-o

Exemplo de um mtodo de separao e purificao das diferentes conformaes da molcula de DNA

Protein and membrane

Linear and nicked circular DNA Covalently closed circular DNA

RNA

Ethidium bromide allows DNA visualization on agarose gels

Visualizao do DNA
Restrio do DNA Electroforese em gel de agarose

DNA restriction

CTODO plo ou elctrodo negativo para onde se dirigem os caties (ies de carga positiva)

nodo Plo ou elctrodo positivo para onde se dirigem os anies (ies de carga negativa)

Electroforese em gel de agarose

Restriction of a DNA fragment and migration on agarose gel of resulting products

Marcadores de peso molecular

DNA migration on agarose gel: DNA fragments dimension vs agarose concentration