Frotiul de snge

Frotiul este un preparat microscopic care se realizeaz prin etalarea materialului biologic n monostrat pe lame portobiect. Aceste preparate se efectueaz din snge, din secreii (mamare, bronice, vaginale), din celule provenite din descuamri epiteliale sau exfoliere i din sedimente celulare (urin, suc gastric, bil, LCR, lichid de ascit sau lichid pleural). Indiferent de materialul biologic utilizat, tehnica frotiului este o metod des utilizat n citologie, devenind prioritar att n domeniul cercetrii biologice ct i ca procedeu diagnostic n practica medical. Examenul morfologic al elementelor celulare se face pe: preparate proaspete necolorate Metoda : Pentru examinarea elementelor celulare sanguine pe preparate proaspete necolorate, se recolteaz cea de a doua pictur de snge aprut dup puncionare, pe partea central a unei lame portobiect degresat, se acoper cu o lamel i se examineaz imediat la microscop. Rezultate : hematiile apar colorate galben-verzui, aezate n fiicuri, leucocitele apar ca celule mai mari dect hematiile, mai rare i mai strlucitoare. preparate proaspete colorate supravital Metoda : Pentru examinarea preparatului proaspt colorat supravital, se procedeaz ca n cazul preparatelor proaspete necolorate, adugndu-se la marginea lamei portobiect, o pictur de albastru de metilen. Colorantul ptrunde prin capilaritate. Rezultate: Nucleii leucocitelor i unele din granulaiile acestora, se coloreaz n albastru. preparate permanente, fixate i colorate prin tehnici de colorare obinuite sau speciale, cea mai des folosit fiind tehnica May Grnwald Giemsa. Materiale necesare: lame obinuite degresate (se spla cu ap i detergent, apoi se degreseaz cu alcool-eter) lame rodate ace sterilizate mnui de protecie alcool, tampoane de vat hrtie de filtru stativ pentru aezarea lamelor

 Efectuarea frotiului permanent: 1. Recoltarea sngelui La adult se face prin puncionarea prtii laterale a pulpei mediusului sau inelarului de la mna stng. Se dezinfecteaz pulpa degetului cu un tampon de vat mbibat n alcool, se puncioneaz locul dezinfectat cu un ac steril, avnd grij s se perforeze numai pielea, fr a se ptrunde prea mult n adncime. Se terge prima pictur de snge aprut la locul nepturii, prin tamponare cu o hrtie de filtru, deoarece conine prea mult lichid interstiial i impuriti de pe piele. La noul nscut i la copilul mic, locurile de puncie sunt: tegumentul lobului urechii i pielea clciului. 2. Efectuarea frotiului permanent A doua pictur se recolteaz cu marginea mic a unei lame rodate i se aplic pe una din extremitile unei lame portobiect, aezat orizontal pe o suprafa plan. Pentru recoltarea celei de a doua picturi, se poate chiar exprima (stoarce) pulpa degetului, deoarece n rezultatul final formula leucocitar i aspectul morfologic al elementelor figurate sanguine nu sunt influenate de cantitatea de plasm. Cu lama lefuit pe a crei latur mic s-a recoltat pictura de snge, se imprim picturii cteva micri de lateralitate pe o lam portobiect, pentru ca sngele s se ntind pe toat linia de contact. Se imprim apoi lamei rodate o unic micare de translaie n lungul lamei portobiect. Se recomand ca unghiul realizat ntre cele dou lame s fie de 30-35 grade

3. Fixarea frotiului permanent Se realizeaz prin : metode fizice- uscare (desicare) la temperatura camerei, prin agitarea lamei pentru a se obine o uscare rapid (uscarea lent duce la ratatinarea celulelor). metode chimice cu alcool metilic timp de 2 minute sau alcol etilic i eter n pri egale, timp de 5-15 minute. ! Executarea unui frotiu permanent corect depinde de : -mrimea picturii de snge -unghiul dintre lama rodat i lama portobiect s fie de 30-35 grade -viteza de ntindere : la vitez mare se obin frotiuri groase.

! Frotiul permanent corect executat trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii : s fie omogen s fie subire s aib margini drepte s fie mai mic dect suprafaa lamei s aib culoare roz-crmiziu dup uscare s se termine n franjuri

Frotiu corect executat Nu se utilizeaz frotiurile care nu ndeplinesc condiiile mai sus artate. n practica medical se noteaz numele celui de la care s-a recoltat produsul pe un capt al lamei, cu un ac subire sau cu creionul. Tehnica colorrii frotiului sanguin permanent Frotiurile de snge se pot colora cu tehnici de colorare obinuite (hematoxilin-eozin, tricromic) sau cu tehnici de colorare speciale. n practica medical curent se folosete tehnica de colorare panoptica May Grnwald Giemsa. Materiale necesare -cutii Petri sau cristalizoare cu capac -suporturi de sticl sub form de u sau v. -soluie May Grnwald (eozinat de albastru de metilen, colorant neutru, dizolvat n alcool metilic pur, neutru) -soluie Giemsa concentrat (amestec de eozinat de azur de metilen, azur de metilen, glicerin neutr, alcool metilic)

 -ap bidistilat -cilindru gradat -pipete Tehnica de colorare 1. Pe lamelele aezate cu frotiul n sus se picur 10-15 picturi din soluia May Grmwald pentru a acoperi toat suprafaa frotiului. Se las 2-3 minute, timp n care se produce o fixare a frotiului, alcoolul metilic din coloratul May Grnwald acionnd ca un fixator. 2. Se toarn apoi peste soluia May Grnwald, un numr egal de picturi de ap distilat neutr. Soluia May-Grnwald diluat acioneaz ca un colorant, colornd granulaiile acidofile i bazofile. Se las 1-2 minute. 3. Se ndeprteaz soluia May Grnwald diluat fr splare, prin nclinarea lamelelor, dup care se acoper frotiurile cu soluia Giemsa diluat 1:1 cu ap distilat neutr. Se las 15-20 minute. Tehnica de colorare 4. Se spal lama sub jet de ap. 5. Se sugativeaza usor, se usuc. 6. Se examineaz la microscop cu obiectivul cu imersie, pentru a observa morfologia eritrocitelor, frecvena i morfologia leucocitelor . Pentru a se studia frecvena i morfologia trombocitelor, frotiul se coloreaz 45 de minute cu soluie Giemsa i nu se spal sub jet de ap , deoarece jetul de ap antreneaz trombocitele. Rezultatele colorrii Hematiile (globulele roii, eritrocitele) Pe frotiul sanguin hematiile reprezint majoritatea elemetelor celulare i sunt rspndite pe toat suprafaa frotiului. Elesunt considerate echivalente celulare(celule anucleate), au form de disc biconcav, cu diametrul de 7.1-7.3 microni (figura 6). Micnd alternativ n sus i n jos viza micrometric, observm centrul hematiei mai subire, mai palid colorat (la periferie hematia este mai groas Aceste aspecte de mai sus, sunt datorate i faptului c hematia conine n citoplasm hemoglobin n cantitate mai mare n zona periferic (unde grosimea este mai mare) ; ncrcarea cu hemoglobin este uniform i proporional cu cantitatea de citoplasm. n aspectul normal denumim aceasta ca izocromie, iar ncrcarea inegal cu hemoglobin (n strile patologice), anizocromie.

Dimensiunile hematiei sunt constante (izocitoz), dar pot varia n plus sau n minus n diferite boli (anizocitoz). Forma poate i ea varia n stri patologice : aspect inelar, n rachet, (poikilocitoz).

Numrul hematiilor este constant (4-5 milioane hematii/ml. snge), iar numrtoarea hematiilor se face prin diferite metode. Variaiile n plus, peste limita superioar a numrului de hematii admis la omul normal, le denumim poliglobulie; aceasta poate fi fiziologic (la nounscut, la cei care triesc la mare altitudine), sau patologic. Scderea numrului de hematii sub limita admis ca normal, apare n stri de anemie, de obicei asociat cu scderea ncrcrii cu hemoglobin sau cu modificri de form celular. Uneori hematiile pot prezenta resturi nucleare, de exemplu : corpi Jolly, 1-3 granule bazofile sau resturi de membran nuclear, Inelele Cabot, mai numeroase n stri patologice.

Leucocitele (globulele albe) Aceste elemente figurate prezint nucleu, deci sunt celule. Pe un frotiu sanguin colorat May Grnwald Gimsa, se pot observa aspecte de structur, numr, .a Dupa forma nucleului i prezena (sau absena ) n citoplasm a granulaiilor specifice, leucocitele se clasific n : -leucocite polimorfonucleare sau granulocite - neutrofile - acidofile - bazofile

 -leucocite mononucleare sau agranulocite

- limfocite - monocite

Polimorfonuclearele neutrofile Aceste leucocite apar pe frotiul colorat May Grunwald Gimsa ca celule sferice, de 9-15 microni, cu citoplasma acidofil care conine fine granulaii specifice, colorate n violet.Aceste granulatii au dimensiuni mici, sunt foarte dese si rspndite egal n toat citoplasma. Nucleul lor este format din mai muli lobi unii ntre ei prin filamente de cromatin. Numrul lobilor unui nucleu arat gradul de maturitate al granulocitului. Cu ct sunt mai muli lobi , 5-6, cu att celula respectiv este mai btrn (formula Arneth) Polimorfonuclear neutrofil, col MGG, ob X40 1. nucleu polilobat, 2. granulatii specifice, 3. hematie

n sngele recoltat de la femei, 80% din neutrofile prezint un corpuscul cromatinian, sferic sau oval, ataat printr-un filament de unul din lobii nucleului. Acest corpuscul reprezint cromatina sexual i dup aspect se numete drumstick (beior de tob). Numrul neutrofilelor dintr-o sut de leucocite variaz ntre 62-68 ; cnd aceast proporie este mai mare, apare neutrofilia, ce caracterizeaz infeciile acute, iar cnd numrul lors cade, apare neutropenia.

Polimorfonuclearele neutrofile intervin activ n aprarea organismului, n procesele inflamatorii. Rolul lor este fie acela de a excreta fermeni proteolitici n focarul inflamator, ce vor aciona distrugnd microbii sau esuturile alterate, fie prin fagocitarea microorganismelor pe care le distrug apoi cu ajutorul fermenilor. Viaa unui polimorfonuclear neutrofil este foarte scurt, se admite c n sngele circulant ele nu depesc 3-4 zile.

Polimorfonuclearul acidofil (eozinofilul) Apare ca o celul sferic, de12-17 microni. Nucleul este n general bilobat, cei doi lobi fiind legai printr-o fin punte de cromatin (aspect de nucleu n desag). n citoplasm observm granulaii colorate n rou viu, egale ntre ele, rotunde, uniform rspndite, mai mari dect la neutrofile. Prin forma i culoarea lor, aceste granulaii amintesc de Icrele de Manciuria (figura 8). Granulaiile conin peroxidaze, diferite de mieloperoxidazele neutrofilelor i hidrolaze acide. Mobilitatea lui este sczut i au o slab capacitate de fagocitoz. Proporia de eozinofile la suta de leucocite este de 1-3. Creterea numrului lor poart denumirea de eozinofilie, ntlnit n stri alergice precum astmul, urticaria sau parazitoze, iar scderea numrului lor, eozinopenie.

Eozinofil, ME. n microscopie electronic, granulaiile(2) sunt voluminoase, de 0.5-1.5 min diametru i conin o matrice granular, iar nucleul este n general bilobat(1).

Aceste celule acioneaz sinergic cu celelalte celule n reaciile de hipersensibilitate de tip imediat i ntrziat. Ele au rol esenial n distrugerea paraziilor prin intermediul proteinelor (Eosinophil Cationic Protein - ECP i Major Basic Protein - MBP) coninute n cistalele din granulaii . Membrana plasmatic are receptori pentru IgE i pentru histamin. Numrul eozinofilelor poate fi influenat hormonal. Granulocitul eozinofil are o via mai lung dect a neutrofilului, considerndu-se c ajunge pn la 9-12 zile. Polimorfonucleatul bazofil.

Este o celul sferic de 10-14 microni. Nucleul bazofilului este ovalar, mai puin lobulat, aprnd uor scobit, uneori ca o frunz de trifoi. Citoplasma dei uor acidofil, conine granulaii rspndite n citoplasma de culoare albastr, de form i mrime diferit, deseori suprapuse pe nucleu, mascndu-l (figura 9). Aceste granulaii bazofile sunt metacromatice. Bazofilul poate trece prin peretele capilar n esuturi, transformndu-se n mastocit. Proporia bazofilelor la suta de leucocite este de 0.25-0.50. creterea numrului lor, bazofilie, poate s ne indice o leucemie mieloid. Mobilitatea lor este scazuta si nu fagociteaza. Pot tri n snge 12-15 zile.

Polimorfonucleatul bazofil, ME. n microscopia electronic granulaiile (1) apar omogene formate din mici granule dense nconjurate de o membran. Aceste granulaii bazofile conin histamin i heparin, (glicozaminiglicani sulfatai)

Limfocitul

Este o celul sferic, de 7-16 microni, cu nucleul mare ce ocup aproape toat celula, sferic, intens colorat cu colorani bazici, datorit faptului c prezint o cromatin bogat dispus n grunji mari, conglomerai. Citoplasma este mult redus, (apare ca o banda ngust dispus n jurul nucleului), intens bazofil, colorat n albastru. Obiectivul cu imersie poate detecta inconstant n citoplasm, rare granulaii mici, azurofile, nespecifice. Dupa dimensiunile lor se clasific n : -limfocite mici ( 7-8 microni) -limfocite mijlocii ( 8-10 microni) -limfocite mari (10-14 microni) Fiecare dintre aceste limfocite prezint caracteristici morfofuncionale (vezi cursul)

Limfocit, ME. n microscopia electronic se observ c nucleul prezint cromatin dens i nu prezint nucleol(1). Citoplasma este sarac n organite(2)

Monocitul Este leucocitul cel mai mare din snge, 16-20 de microni, are form sferic sau ovalar, cu citoplasm abundent, slab bazofil, putnd prezenta granulaii nespecifice, azurofile. Nucleul este mare, deseori reniform, srac n cromatin, avnd aspect spongios. Cromatina este dispus sub forma unor reele fine , slab cromatic, nu conine nucleol (figura 11). Este socotit histiocit sanguin. Numrul lor este de 6-10 la 100 leucocite. Creterea numrului lor poart denumirea de monocitoz, apare n boli infecioase : sifilis, etc.

Monocit, ME. 1. nucleu reniform, 2. granulaii azurofile, 3. citoplasm abundent.

 Studiul sngelui se efectueaz prin tehnici cantitative (numrtori), calitative i biochimice. Caracterele morfologice ale elementelor figurate sanguine se studiaz prin tehnici calitative. Trombocitele Trombocitele - (plachetele sanguine) au dimensiuni care variaz ntre 2-5/lm i se gsesc n sngele periferic n numr de 150.000400.000/mm3. Trombocitele se formeaz n mduva hematogen, din citoplasma unui precursor, megacariocitul. Trombocitul adult este elipsoidal, cu form de lentil biconvex. Este anucleat, fiind alctuit din membran i citoplasm. Pe frotiu poate avea forme diferite: de stea, discoidal, poligonal, depinznd de gradul de uscare a frotiului, timpul scurs de la recoltare la fixare, etc Trombocite, col MGG, obX40